CN102781469B - 用于生产流感疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物；(ii)在第一去污剂存在下裂解所述全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100?)加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将所述裂解病毒制备物过滤。

Description

用于生产流感疫苗的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2009年10月27日提交的GB 0918830.1和2010年4月29日提交的US 61/329230的权益。
依照 37 C. F.R. § 1.71(E) 的版权通告
本专利文件的部分公开内容包含受版权保护的材料。版权所有人不反对任何人传真复制专利文件或专利公开内容，因为它出现在专利和商标局专利档案或记录中，但除此以外在任何情况下均保留全部版权。
背景
发明领域。
本发明涉及用于制备适用于疫苗的流感抗原和包含所述抗原的药物组合物的方法。
相关背景描述
流感病毒是世界上存在的影响人和家畜两者的最遍在的病毒之一。流感导致显著的经济负担、发病率甚至死亡率。
流感病毒是一种RNA包膜病毒，其颗粒的直径大小约为125 nm。它基本上由以下组成：内部核衣壳或与核蛋白结合的核糖核酸(RNA)核心，外部环绕着具有脂质双层结构和外部糖蛋白的病毒包膜。病毒包膜的内层主要由基质蛋白组成，外层大部分由宿主来源的脂质物质组成。流感病毒包含两种表面抗原：糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，其在颗粒表面呈刺突，长为10-12 nm。正是这些表面蛋白质，特别是血凝素决定流感亚型的抗原特异性。病毒株是依据以下分类的：宿主物种的起源、地理位置和分离年份，序列号和对于流感A，依据HA和NA亚型的血清学性质。对于甲型流感病毒，已鉴定出16个HA亚型(HI-HI 6)和9个NA亚型(N1-N9) [Webster RG等. Evolution and ecology of influenza A viruses (甲型流感病毒的进化和生态学). Microbiol. Rev. 1992;56:152-179；Fouchier RA等. Characterization of a Novel Influenza A Virus Haemagglutinin Subtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls (新的甲型流感病毒血凝素亚型(H16)的表征). J. Virol. 2005;79:2814-2822)。自1918年以来，已在水生禽类中找到所有HA和NA亚型的病毒，但只有3个HA亚型(H1、H2和H3)和2个NA亚型(N1和N2)在人群中建立了稳定的谱系。对于乙型流感病毒仅鉴定出一个HA亚型和一个NA亚型。
新的流感病毒以不可预测的时间间隔出现，具有与之前季节传播的毒株完全不同的亚型的血凝素抗原。此时，与先前在人类传播的毒株的相应蛋白质不同，所得抗原可变化20%到50%。称为“抗原性转变”的这种现象可导致病毒逃逸“群体免疫”并形成大流行。换句话说，当出现人群对之无免疫力的新的流感病毒时，便发生流感大流行。
大流行期间，抗病毒药可能不充足或有效地满足需要，有流感风险的个体数将多于大流行间(interpandemic)时期的个体数，因此具有大量生产潜力及具有有效分配和给药潜力的合适疫苗的开发是非常重要的。使用于季节性(大流行间)流感疫苗的抗原生产最大化的改进方法也同样重要，因为人群总在老化，对流感疫苗的需要增加。
本发明解决这种需求。
发明概述
第一个方面，本发明提供用于产生裂解流感病毒(split influenza virus)制备物或亚单位流感制备物(subunit influenza preparation)的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物；(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将裂解病毒制备物过滤。
本发明还涉及通过或可通过所述方法获得的裂解流感病毒制备物和/或亚单位流感病毒制备物。
本发明还涉及用于制备药物组合物或免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供通过按本文所述的本发明方法产生的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物，(ii)将所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物与药学上可接受的载体混合，以制备药物组合物或免疫原性组合物。
本发明还涉及通过或可通过本发明的方法获得的药物组合物或免疫原性组合物。
本发明还涉及在人受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者本文所述的药物组合物或免疫原性组合物。
本发明还涉及用于治疗或预防流感疾病或感染的本文所述药物组合物和/或免疫原性组合物。
本发明还涉及包含流感病毒血凝素(HA)和去污剂的抗原制备物，其中去污剂(µg/ml)与血凝素(µg/ml)的重量比介于1.5和15之间。
本发明还涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全流感病毒制备物，(ii)在以适于防止病毒颗粒一旦裂解便聚集的量加入的去污剂存在下，裂解全病毒制备物。
本发明还涉及包含一种或多种按照本文所述任何方法制备的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的疫苗。
附图简述
图1公开了各种流感疫苗生产方法。
图2公开了在不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的情况下在若干生产步骤后HA的丧失，8/1：纯化的单价裂解病毒原液(split virus bulk)；8/2和8/3：逐级过滤；8/4：灭活。
图3公开了在加入或不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的情况下所产生的H1N1v单价原液的SDS-PAGE。
图4公开了在用不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的情况下制备的未加佐剂甲型/加利福尼亚/7/2009裂解疫苗免疫的BALB/c小鼠中II次免疫后第14天的HI效价(GMT +/- CI95)。
图5公开了在用加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的情况下制备的未加佐剂甲型/加利福尼亚/7/2009裂解疫苗免疫的BALB/c小鼠中II次免疫后第14天的HI效价(GMT +/- CI95)。
图6公开了在不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)-14PI的情况下在用于AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的BALB/c小鼠中的HI效价(GMT +/- CI95)。
图7公开了在加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)-14PI的情况下，BALB/c小鼠中AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的血凝效价(GMT +/- CI95)抑制。
图8公开了在不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)-14PII的情况下，BALB/c小鼠中AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的血凝效价(GMT +/- CI95)抑制。
图9公开了在加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)-14PII的情况下，BALB/c小鼠中AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的血凝效价(GMT +/- CI95)抑制。
详述
本发明人证实叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)与裂解病毒制备物联合使用增加病毒制备物的抗原组分的产量。该方法增加来自大流行毒株和季节性(大流行间)毒株的抗原的产量。高产是需要的，因为例如当这类疫苗剂量当下不足时，其允许生产更大量的疫苗剂量。
叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)与裂解病毒制备物或亚单位制备物联合使用还提高流感抗原(例如HA或NA)的纯度。
虽然不希望受理论束缚，但叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)与裂解流感病毒制备物联合使用有助于防止裂解病毒颗粒的聚集，并允许流感疫苗更易过滤，这就在整体上或部分地解释了当使用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)时所观察到的产量增加。
本发明总的来说涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物，(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将裂解病毒制备物过滤。
另一方面，本发明提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物；(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，和(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将裂解病毒制备物过滤，其中将第二去污剂以至少0.1% (v/v)的浓度用于步骤(iii)中。
所述方法适宜在步骤(iii)后还可包括将所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物灭活的步骤。
因此在第三个方面，本发明提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物，(ii)在去污剂存在下裂解全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中；(iv)将所述裂解病毒制备物灭活；和(v)将裂解病毒制备物过滤。
去污剂
以前使用溶剂/去污剂处理来生产裂解流感病毒制备物，例如磷酸三正丁酯或与聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)组合的二乙醚(称为“吐温-乙醚”裂解法)，该方法仍用于一些生产设备中。现在使用的其它裂解剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆汁盐，例如在专利号DD 155 875或WO 02/097072 (US7316813B2)中描述的脱氧胆酸钠，其通过引用结合到本文中。可用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂(例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB))、其它离子去污剂(例如硫酸月桂酯、牛磺脱氧胆酸盐)或非离子去污剂，例如上述去污剂，包括叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (例如Lina等，2000，Biologicals 28，95-103中描述的方法)和Triton N-101或者任两种或更多种去污剂的组合。
在一方面，第一去污剂选自：离子去污剂(例如阴离子或阳离子去污剂)、非离子去污剂、两性去污剂或其组合。合适去污剂的实例是脱氧胆酸钠、CTAB和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。
第一去污剂还可用于与其它去污剂(例如上文列举的去污剂)组合，并且可以是非离子去污剂的组合，例如脱氧胆酸钠和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)的组合或脱氧胆酸钠和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的组合。
在一方面，第一去污剂不是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。在一个具体的实施方案中，在最终的裂解流感抗原制备物或亚单位抗原制备物中存在残留量的第一去污剂和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。
在本发明的一个具体实施方案中，第一去污剂是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。
在本发明的一个备选实施方案中，第一去污剂是脱氧胆酸钠。
叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的同义词包括但不限于聚二乙醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚、辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯辛基苯基醚、4-辛基酚聚乙氧基化物、Mono 30、TX-100、辛苯昔醇-9、辛苯昔醇10、X-100和辛基酚环氧乙烷缩合物。
在一方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)与其它去污剂联合使用，例如上文列举的去污剂(例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)，例如离子去污剂(例如阴离子或阳离子去污剂)、非离子去污剂、两性去污剂或其组合。
可在裂解流感制备物过滤之前或期间加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以改进过滤。因此，在本发明的一个实施方案中，提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物；(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将裂解病毒制备物过滤，其中步骤(iii)和(iv)同时进行。
与在裂解后无去污剂处理的方法相比，加入裂解流感病毒制备物中的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)为适于提高HA产量的量。适宜与在裂解后无去污剂处理的所得结果相比较，以评价提高的HA，例如正如通过0.2μm滤膜过滤后对[HA]的SRD测定所测量的(J.M. Wood等：An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines (用于流感血凝素抗原测定的改进的径向免疫扩散技术：适于灭活全病毒疫苗和亚单位疫苗的功效测定). J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247；J. M. Wood等，International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus (用于测定流感病毒血凝素抗原的径向扩散和免疫电泳技术的国际合作研究). J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)。
因此，在一个实施方案中，提供本发明的方法，其中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以足以提高过滤的裂解病毒制备物中的HA产量的量存在。
在一个具体的实施方案中，提供本发明的方法，其中，与其中在过滤前未将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加入裂解病毒制备物中的方法的HA相比，经过滤的裂解流感病毒制备物或亚单位制备物中的HA浓度大超过50%、75%、100%、150%、200%或250%。
在一个具体的实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以大于0.025% (w/v)的量存在。在一个具体的实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以0.1-1.5%的量存在。在另外其它的实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以0.1-0.8%的量存在。在又一个实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以0.1-0.4% (例如0.25% (w/v))的量存在。
在一方面，本发明的方法包括在灭活步骤前、适宜地基本上恰在灭活之前的过滤步骤，且在过滤步骤之前或期间加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。
因此，在一方面，本发明涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物，(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中，(iv)将制备物过滤，和(v)将所述经过滤的裂解病毒制备物灭活。
在本发明的一个备选实施方案中，提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物，(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中，和(iv)将经灭活的裂解病毒制备物过滤，还包括在步骤(iii)之后和在步骤(iv)之前将裂解病毒制备物灭活的步骤。
适宜通过< 0.45 μm (例如0.2μm或0.22µm)的过滤器进行过滤。在一方面，过滤之前是预过滤步骤。在一方面，预过滤产物经超声处理以利于过滤步骤。
在一方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇存在于裂解过程期间，即除第一去污剂以外还存在叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。
在一方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇在裂解期间以足以防止病毒颗粒一旦裂解便聚集的量存在，适宜通过裂解病毒制备物的过滤功效确定，例如经过滤后的HA浓度确定。
本发明的一个备选方面包括用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物，(ii)在叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)存在下裂解全病毒制备物，其以适宜在过滤后防止HA产量损失的量加入，其中产量损失通过与没有这类去污剂存在的方法进行比较确定。
在这个方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)在裂解期间存在以提高HA的产量。裂解后可能不需要使用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)可有助于裂解过程，但这不是必需的。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)适宜能够有助于减少将制备物过滤时出现的HA的损失。
因此，在一个实施方案中，提供本发明的方法，其中步骤(ii)和(iii)同时进行。
流感毒株
本文所述全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物可来源于任何流感毒株。
在本发明的一个实施方案中，本文所述全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于甲型流感毒株或乙型流感毒株。在一方面，甲型流感病毒毒株具有H1、H3、H7、H9或H5血凝素亚型。在一方面，病毒是大流行毒株或潜在的大流行(例如H1N1v或H5N1)毒株或非大流行(大流行间) (例如H3N2)毒株。本文提供了数据，表明本发明对大流行毒株(H1N1v，例如甲型/加利福尼亚/7/2009 X-179A)和大流行间H3N2毒株两者具有优势。
本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于合适毒株，其包括但不限于：
H1N1毒株
甲型/新喀里多尼亚/20/99样毒株(like strain)、甲型/新喀里多尼亚/20/99 (IVR-116)、甲型/所罗门群岛/3/2006样病毒、甲型/所罗门群岛/3/2006 (IVR-145)、甲型/布里斯班/59/2007样病毒、甲型/布里斯班/59/2007 IVR-148、甲型/新加坡/6/86样、甲型/新加坡/6/86、甲型/德克萨斯/36/91、甲型/拜恩/7/95样、甲型/约翰内斯堡/82/96 (NIB-39)、甲型/北京/262/95样毒株、甲型/北京/262/95 (X-127)、甲型/新喀里多尼亚/20/99样毒株、甲型/新喀里多尼亚/20/99 (IVR-116)、甲型/所罗门群岛/3/2006样、甲型/所罗门群岛/3/2006 (IVR-145)、甲型/布里斯班/59/2007样病毒、甲型/布里斯班/59/2007 IVR-148
H3N2毒株
甲型/悉尼/5/97样毒株、甲型/悉尼/5/97(IVR-108)、甲型/莫斯科/10/99样毒株、甲型/巴拿马/2007/99 (RESVIR-17)、甲型/福建/411/2002样毒株、甲型/怀俄明/3/2003 (X-147)、甲型/惠灵顿/1/2004样毒株、甲型/惠灵顿/1/2004 (IVR-139)、甲型/加利福尼亚/7/2004样毒株、甲型/New York/55/200 (NYMC X-157)、甲型/威斯康星/67/2005样毒株毒株、甲型/威斯康星/67/2005 (NYMC X-161-B)、甲型/布里斯班/10/2007样病毒、甲型/布里斯班/10/2007 (IVR-147)、甲型/乌拉圭/716/2007 NYMC X-175C、甲型/北京/353/89样毒株、甲型/贵州/54/89、甲型/北京/353/89、甲型/北京/32/92、甲型/山东/9/93、甲型/约翰内斯堡/33/94、甲型/武汉/359/95样毒株、甲型/南昌/933/95 (RESVIR-9)、甲型/悉尼/5/97样毒株、甲型/悉尼/5/97 (IVR-108)、甲型/莫斯科/10/99样毒株、甲型/巴拿马/2007/99 (RESVIR-17)、甲型/福建/411/2002样毒株、甲型/怀俄明/3/2003 (X-147)、甲型/加利福尼亚/7/2004样毒株、甲型/纽约/55/2004 NYMC (X-157、甲型/威斯康星/67/2005 (NYMC X-161)、甲型/威斯康星/67/2005样毒株、甲型/威斯康星/67/2005 (NYMC X-161-B)、甲型/布里斯班/10/2007样病毒、甲型/乌拉圭/716/2007 NYMC X-175C
乙型毒株
乙型/北京/184/93样毒株、乙型/山梨/166/98、乙型/四川/379/99样毒株
乙型/约翰内斯堡/5/99、乙型/四川/379/99样毒株、乙型/约翰内斯堡/5/99
乙型/香港/330/2001样毒株、乙型/山东/7/97、乙型/香港/330/2001样毒株、乙型/布里斯班/32/2002、乙型/上海/361/2002样毒株、乙型/江苏/10/2003、乙型/马来西亚/2506/2004样毒株、乙型/马来西亚/2506/2004、乙型/弗罗里达/4/2006样病毒
乙型/布里斯班/3/2007、乙型/山形/16/88、乙型/巴拿马/45/90、乙型/哈尔滨/7/94、乙型/北京/184/93样毒株、乙型/北京/184/93样毒株、乙型/山梨/166/98、乙型/四川/379/99样毒株、乙型/约翰内斯堡/5/99、乙型/香港/330/2001样毒株、乙型/山东/7/97、乙型/上海/361/2002样毒株、乙型/江苏/10/2003、乙型/马来西亚/2506/2004样毒株、乙型/马来西亚/2506/2004、乙型/弗罗里达/4/2006样病毒、乙型/布里斯班/3/2007、乙型/布里斯班/60/2008样病毒、乙型/布里斯班/60/2008
全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于一种或多种流感病毒毒株，其适宜地为大流行间(季节性)毒株或与大流行暴发有关的或具有与大流行暴发有关的潜力的毒株。
大流行间毒株例如为在大流行间期间在全球传播的毒株，例如但不限于：H1N1、H1N2、H3N2或乙型毒株。市售可得的流感疫苗是三价组合，包括1种乙型流感毒株和2种甲型流感毒株(H1N1、H3N2)。
赋予其引发大流行或与大流行流感毒株有关的流感疾病暴发的潜力的流感病毒毒株的特征是：与目前传播的毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，因此几乎所有人都是无免疫的；它能够在人群中水平传播；并且对人类是致病性的。新的血凝素可以是在一段延长的时期(或许数十年)内在人群中不明显的血凝素，例如H2。或者它可以是之前未在人群中全球传播的血凝素，例如存在于禽类物种(鸟类)中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大多数或至少一大部分人口或甚至整个人口之前未遇到该抗原和/或对其无免疫。目前，经WHO鉴定为可能引起人类大流行的甲型流感病毒是高致病性H5N1禽流感病毒。因此，本文公开的大流行疫苗适宜包含H5N1、H9N2或H7N1。
流感病毒毒株可以是大流行毒株。合适的大流行毒株为(但不限于)：H5N1、H5N8、H5N9、H7N4、H9N2、H7N7、H7N3、H2N2和H7N1。人的其它大流行毒株：H7N3、H10N7、H5N2和H7N2。是大流行毒株或易与大流行有关的毒株的流感毒株在本文中可简称为“大流行毒株”。
本文所述全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物可以是鸡卵来源的或细胞培养物来源的。例如，可通过使流感病毒在鸡卵中生长，并从收获的尿囊液中纯化，从而从常规含胚卵方法得到本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物。可在短期内收集大量鸡卵。或者，可采用细胞或细胞培养物使病毒生长或表达重组流感病毒表面抗原的任何新的生产方法得到。用于病毒生长的合适的细胞基底(cell substrate)包括例如狗肾细胞(例如MDCK或来自MDCK、MDCK样细胞克隆的细胞)、猴肾细胞(例如AGMK细胞包括Vero细胞)、合适的猪细胞系或适于生产用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基底还包括人细胞，例如MRC-5细胞或Per.C6细胞系。
在一个具体的实施方案中，本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物得自原代细胞(例如鸡胚成纤维细胞)，还包括禽细胞系，例如鸡或鸭细胞系(例如EBx细胞系，例如公开于WO03/076601 (US2004058441A1)和WO08/129058 (US2010062489A1)的来源于鸡的EB14或来源于鸭胚干细胞的EB24或EB66)。合适的昆虫细胞为Sf9或Hi5。在一个具体的实施方案中，本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于EB66细胞。
在一方面，本发明涉及本发明方法获得的或可获得的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物。
在一方面，本发明涉及用于制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)通过本文公开的任何方法提供裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物，和(ii)将所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物与药学上可接受的载体混合以制备疫苗。
在一方面，本发明涉及通过本发明的任何方法获得的或可获得的药物组合物和/或免疫原性组合物。
含有裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的本发明的药物组合物在本文可称为免疫原性组合物或疫苗。
医学治疗
在一方面，本发明涉及诱导人受试者的免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者本文所述的本发明的药物组合物和/或免疫原性组合物或疫苗。
在本发明的又一个实施方案中，提供用于药物的本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗。
在本发明的又一个实施方案中，提供本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗和/或预防受试者中由流感病毒引起的疾病。
在本发明的又一个实施方案中，提供本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗和/或预防受试者中由流感病毒引起的疾病的药物中的用途。
在本发明的一个具体实施方案中，给予本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗的受试者为无免疫应答的。在一个具体的实施方案中，受试者超过60岁，特别是超过65岁或更大岁数。在又一个实施方案中，受试者是婴儿/儿童，特别是年龄在6个月以上、甚至更特别是介于6个月和23个月之间。
佐剂
在一方面，本发明的药物组合物或免疫原性组合物不被佐剂化。另一方面，本发明的药物组合物或免疫原性组合物包含佐剂，例如水包油乳液。
在一方面，本发明的佐剂是乳液，特别是水包油乳液，并可任选包含其它免疫刺激剂。
在一个具体的实施方案中，水包油乳液包含可代谢的无毒油，例如角鲨烷或角鲨烯，任选母育酚(例如生育酚，特别是α生育酚(和任选角鲨烯和α生育酚两者))和乳化剂(或表面活性剂)，例如非离子表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)。可使用的表面活性剂的混合物为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)/脱水山梨醇三油酸酯(SPAN 85™)混合物或聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)/叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)混合物。
母育酚(例如维生素E)也可用于油乳液佐剂(EP0382271B1、US5667784、WO95/17210)。可按照US5650155A、US5667784A、EP0382271B1所述配制用于油乳液(任选水包油乳液)的母育酚，其中母育酚可以是母育酚液滴的分散体，任选包含任选直径小于1微米的乳化剂。或者，母育酚可与另一种油联用以形成油乳液的油相。本文描述了可与母育酚联用的油乳液的实例，例如上述可代谢油。
在水包油乳液中，油和乳化剂应在含水载体中。含水载体可以是例如磷酸缓冲盐水或柠檬酸缓冲液。
在一个方面，水包油乳液具有下列组成之一：
-0.5-11 mg角鲨烯、0.05-5%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)和任选2-12% α-生育酚；或
-约5%角鲨烯、约0.5%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)和约0.5%脱水山梨醇三油酸酯(SPAN 85™)。该佐剂称为MF59。
药物组合物和 / 或免疫原性组合物
在一个实施方案中，本发明的药物组合物和/或免疫原性组合物包含一种或多种毒株的血凝素，量为约15µg/毒株、约7.5µg/毒株、约3.8µg/毒株、约1.9µg/毒株或5µg/毒株。
一些现存疫苗由于在裂解过程中使用去污剂而存在残留的去污剂。在其它情况下，可将去污剂加入疫苗抗原中。在本发明中，去污剂的使用，例如在病毒裂解后(适宜在过滤前并适宜在灭活前)加入的非离子表面活性剂，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)，在制备方法后产生的最终单价原液中，提供叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™):HA之比介于1.5和15之间、适宜介于2.5和15之间、适宜介于3和15之间、适宜介于3.3和15之间或更高比率，这通过叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)和HA的重量/体积比来评价。
在一方面，本发明涉及包含流感病毒血凝素(HA)和非离子表面活性剂的药物组合物或免疫原性组合物，其中非离子表面活性剂与血凝素的重量/体积比介于1和15之间。表面活性剂可以是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。HA浓度可介于2和200 μg/毒株/ml之间。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)浓度可介于10和500 μg/ml之间。
在一方面，本发明涉及由多种流感毒株制备的疫苗，其中至少一种组分按照本发明的方法制备。适宜采用本发明的方法制备包含2种或3种毒株的疫苗。
在一方面，在最终的疫苗中，包含多价毒株的本发明的药物组合物或免疫原性组合物的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™):HA比率介于1和15之间，适宜例如介于1.5和15之间，例如介于2和15之间、例如介于2.5和15之间、适宜介于3和15之间、适宜介于3.3和15之间或更高比率，这通过叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)和HA的重量/体积比来评价。
裂解流感制备物
用于药物组合物或免疫原性组合物的裂解流感病毒制备物的制备方法可包括多个不同的过滤和/或其它分离步骤，例如以多个不同组合的超速离心、超滤、区带离心和色谱法(例如离子交换)步骤，以及任选例如可在裂解之前或之后进行的用热、甲醛或β-丙内酯或紫外线的灭活步骤。裂解方法可按分批方法、连续方法或半连续方法进行。WO 02/097072 (US7316813B2)中描述了用于裂解免疫原性组合物的优选的裂解和纯化方法，其通过引用以其整体结合到本文中。
这类方法适宜包括以下步骤：
初步过滤、病毒裂解、过滤、灭活、过滤；其中过滤可以是超滤步骤。
因此，在一个实施方案中，提供本发明的方法，其还包括将裂解流感病毒制备物灭活的步骤。灭活可通过本领域技术人员已知的任何方法进行，包括但不限于使用甲醛。可在该方法的步骤(ii)之后的任何阶段进行灭活。在本发明的具体实施方案中，在步骤(iii)之后进行灭活。
本发明的方法包括至少一个过滤步骤(步骤iv)，但除步骤(iv)以外，还可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个过滤步骤。例如，裂解流感病毒制备物可使用一系列不同尺寸的过滤器(例如0.5µm、0.45µm和/或0.2/0.22µm过滤器)过滤。在具体的实施方案中，使用一种或多种滤膜进行过滤步骤(步骤iv)，其中至少一种滤膜是无菌级的(例如0.2µm或0.22µm)。在又一个实施方案中，提供本发明方法，其除步骤(iv)的过滤步骤以外还包括过滤裂解流感病毒制备物的步骤。在具体的实施方案中，步骤iv)以外的过滤步骤使用无菌级过滤器(例如0.2µm或0.22µm过滤器)进行。
在又一个实施方案中，提供本发明方法，其还包括超速离心裂解流感病毒制备物的步骤。适宜超滤使用截止(cut-off)约20 kDa MW的醋酸纤维素膜进行。
在又一个实施方案中，提供本发明方法，其还包括使全病毒制备物澄清的步骤。
在又一个实施方案中，提供本发明方法，其包括超速离心全病毒制备物的步骤。
本发明的优选裂解流感病毒制备物包含从生产过程中留下的残留量的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)和/或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)，但可在制备裂解抗原后将其加入或调节其浓度。在一个实施方案中，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)两者均存在。疫苗剂量中产生自抗原制备物的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)的终浓度的优选范围为：
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)：0.01-1%或约0.1% (v/v)。
在具体的实施方案中，产生自裂解流感病毒制备物的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)的终浓度的范围为0.025%-0.09% w/v。在另一具体的实施方案中，提供裂解流感病毒制备物为2倍浓缩的混合物，其具有浓度范围为0.025%-0.2% (w/v)的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)，并且在佐剂化(或对照制剂中的缓冲液)的最终制剂中必须稀释2倍。
在一个实施方案中，在存在低水平的硫柳汞或不存在硫柳汞时制备裂解流感病毒制备物。在另一实施方案中，所得裂解流感病毒制备物在不存在有机汞防腐剂时是稳定的，具体地讲，制备物不含残余硫柳汞。具体地讲，裂解流感病毒制备物包含在不存在硫柳汞或在低水平的硫柳汞下(一般为5 μg/ml或以下)稳定化的血凝素抗原。具体地讲，通过α生育酚的衍生物，例如琥珀酸α生育酚(亦称琥珀酸维生素E，即VES)进行乙型流感毒株的稳定化。这类制备物及其制备方法公开于WO 02/097072 (US7316813B2)，其通过引用以其整体结合到本文中。
优选的组合物含有由WHO推荐的合适的流感季节毒株制备的3种灭活裂解流感病毒制备物。
在一个实施方案中，本发明的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物和佐剂装在同一容器中。它亦称‘一小瓶法’。在另一个实施方案中，小瓶是预灌装注射器。在一个备选实施方案中，本发明的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物和佐剂被装入不同的容器或小瓶，在给予受试者前不久或给予时混合。它亦称‘两小瓶法’。两小瓶法适宜由0.5ml浓缩的本文所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物(以I型玻璃小瓶(抗原容器)提供)和装有0.5ml佐剂的预灌装I型玻璃注射器(佐剂容器)组成。或者两小瓶法以2个小瓶(一个用于抗原，一个用于佐剂，各为10剂)提供，在给予第一患者之前在24小时内在室温下混合，随后在4℃下保存一段短的时间(例如至多一周)用于随后的给药。在注射时，将多剂量小瓶或装有佐剂的注射器的内容物注入装有浓缩裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的小瓶中。混合后，将内容物抽到注射器中，将针更换为肌内针。一剂佐剂化的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物(药物组合物或免疫原性组合物)相当于0.5ml。
在一个实施方案中，通过SRID测定的每人剂量的药物组合物或免疫原性组合物含有15µg HA/流感毒株/剂。这特别用于年长人群。
本发明的一个重要方面是流感抗原可以低于之前认为有用的量使用的事实，适宜每人剂量的免疫原性组合物的水平低于15µg HA/病毒毒株，例如介于1和10µg HA/毒株。
因此，在一个实施方案中，每人剂量的药物组合物或免疫原性组合物含有低剂量的血凝素(HA)，限定为低于15µg HA/剂的量，适宜低于10µg，这通过径向免疫扩散(SRD)测量(J.M. Wood等. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247；J. M. Wood等，J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)。在一个具体的实施方案中，人用剂量的免疫原性组合物包含每毒株的血凝素(HA)剂量水平为约10µg、例如介于5至15µg之间、适宜介于6至14µg之间、例如介于7至13µg之间或介于8至12µg之间或介于9至11µg之间或者为10µg。在又一个实施方案中，人用剂量的免疫原性组合物包含每毒株的血凝素(HA)剂量水平为约5µg，例如介于1至9µg之间或介于2至8µg之间或适宜介于3至7µg或4至6µg之间或者为5µg。可以测定的合适量为1.9μg、2.5 μg、3.8 μg、5.0 μg、7.5 μg或10μg HA或者低于15μg HA的任何合适的量，使得疫苗组合物符合本文确定的功效标准。有利的是，可使用可允许符合表C或/和表D确定的调节标准的1µg HA或甚至更低的HA剂量(例如0.5µg HA)。HA的合适量为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14µg (w/v)/流感毒株/人用剂量的免疫原性组合物中的任一个。所述低量的HA可以低至实际上是可行的，条件其允许配制符合下述国际(例如EU或FDA)功效标准的疫苗(参见表3和表4及给出的具体参数)。
适宜使用0.5ml的药物组合物或免疫原性组合物剂量。1ml (0.5ml佐剂加0.5ml抗原制备物)的药物组合物或免疫原性组合物剂量也是适宜的。有利的是，可以比常规注射的裂解流感疫苗(一般为约0.5、0.7或1ml/剂)少的体积，提供本发明的药物组合物或免疫原性组合物剂量，特别是低HA量的疫苗。本发明的小体积剂量适宜每剂低于500 μl、通常低于300 μl、适宜不超过约200 μl或更低。按常规，可根据原始原液样品中的HA浓度，或根据具有通过鼻内或皮内途径给予的较小剂量的递送途径，或根据目标人群(例如婴儿可接受成人剂量的一半)，对剂量体积略作改动。
本发明的流感药物组合物或免疫原性组合物适宜符合疫苗的某些国际标准。标准在国际上适于测量流感疫苗的功效。按照欧洲药品评价局(European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)人用标准评价血清学变量(CHMP/BWP/214/96，专利药品委员会(Committee for Proprietary Medicinal Products，CPMP)。用于临床试验的Note for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997。CHMP/BWP/214/96通知N°96-0666:1-22涉及流感疫苗的年度许可程序(表3或表4)。对成年人口(18-60岁)和老年人口(>60岁)的要求不同(表C)。对于大流行间流感疫苗，至少一种评价(血清转化因子、血清转化率、血清保护率)应符合对疫苗中所包括的全部流感毒株的欧洲要求。等于或大于1:40的效价比例被视为最相关，因为预期这些效价对保护有最佳相关性[Beyer W等，1998. Clin Drug Invest.;15:1-12]。
正如在“Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorisation application (有关大流行流感疫苗销售批准申请的档案结构与内容的准则) (CHMP/VEG/4717/03，2004年4月5日，或2007年1月24日更近期的EMEA/CHMP/VWP/263499/2006，标题为‘Guidelines on flu vaccines prepared from viruses with a potential to cause a pandemic (由具有引发大流行潜力的病毒制备流感疫苗的准则)’，可获自www.emea.eu.int)中规定的一样，在有关来自非传播毒株的流感疫苗的具体标准不存在的情况下，预期大流行候选疫苗应(至少)能够在未接触抗原的(unprimed)成人或年长受试者中，在2剂疫苗后引发足够的免疫应答以适宜地符合为现有疫苗设定的所有3个现行标准。EMEA准则描述了以下情况：在大流行的情况下人口将是无免疫的，并因此假定可通过大流行候选疫苗满足用于季节性疫苗的所有3个CHMP标准。未明确要求需要在接种前血清阴性受试者中证实该情况。
本发明的组合物对于组合物中所包括毒株适宜符合至少一个所述标准(一个标准足以获得批准)，适宜至少两个，或通常表3给出的用于保护的至少所有3个标准。
表3 (CHMP标准)
18-60岁 > 60岁
血清转化率* >40% >30%
转化因子** >2.5 >2.0
保护率*** >70% >60%
* 血清转化率定义为保护性接种后效价(protective post-vaccination titre) ≥ 1:40的每组中受试者的比例。简单来说，血清转化率是HI效价在接种前<1:10，接种后≥1:40的受试者的百分比。然而，如果起始效价≥1:10，则接种后抗体的量需要至少4倍的增加。
** 转化因子定义为接种后每种疫苗毒株的血清HI几何平均效价(GMT)的增加倍数。
*** 保护率定义为接种前血清阴性且(保护性)接种后HI效价≥ 1:40的受试者比例或接种前血清阳性且接种后效价具有4倍显著增加的受试者比例；它通常被公认为指示性保护(indicating protection)。
FDA采用稍有不同的年龄截止点，但是他们的标准以CHMP标准为基础。合适的终点类似地包括：1)达到HI抗体效价≥ 1:40的受试者的百分比，和2)血清转化率，定义为接种后HI抗体效价的4倍增加。几何平均效价(GMT)应包括在该结果中，但是数据不应只包括点估计值，而且还包括血清转化发生率95%置信区间的下限，且第42天HI效价≥ 1:40的发生率必须超过目标值。因此应提供这些数据和这些评价的点估计值的95%置信区间(CI)。FDA草案指引要求符合两个目标。这被概括于表4中。
表4
18-64岁 > 64岁
血清转化率* >40% >30%
HI效价率≥ 1:40 >70% >60%
* 血清转化率定义为：a)基线效价≥ 1:10、4倍或更多倍增加的受试者；或b)基线效价< 1:10，增加至≥ 1:40的受试者。这些标准必须符合真实值95% CI的下限。
在一个备选实施方案中，本发明的组合物对于组合物中所包括的毒株适宜符合至少一个这类标准，对于保护，适宜符合两个标准，如表4所示。
适宜用低剂量的抗原，例如用7.5µg HA或甚至更低的抗原剂量，例如3.8µg或1.9µg HA，来达到这个效果。
对于其它人群，例如在儿童中和在任何无免疫应答的人群中，适宜符合任何或全部的这类标准。
在本发明的一个方面，人用剂量的药物组合物或免疫原性组合物含有来自单一流感毒株的血凝素(HA)，称为“单价”流感组合物。在本发明的另一个方面，人用剂量的药物组合物或免疫原性组合物包含来自不止一种流感毒株的血凝素(HA)，称为“多价”流感组合物。合适的本发明的多价组合物为二价组合物(包含来自2种流感病毒毒株例如但并非唯一地指与大流行有关或易与大流行有关的两种毒株的血凝素(HA)，例如H5=H2)、三价组合物(包含来自3种流感病毒毒株，任选来自2种甲型毒株和1种乙型毒株(例如但不限于乙型/山形或乙型/维多利亚)的血凝素(HA) )、四价组合物(包含来自4种流感病毒毒株的血凝素(HA))或五价组合物(包含来自5种流感病毒毒株的血凝素(HA))。合适的四价组合物包含来自两种甲型毒株和来自不同谱系的两种乙型毒株(例如乙型/山形或乙型/维多利亚)的血凝素。包含第二乙型毒株的这类组合物特别适于非常年幼的儿童，尤其在既往暴露或初免(priming)是重要的情况下。或者，四价组合物包含来自3种甲型毒株(任选H1N1、H3N2和与大流行有关或易与大流行有关的1种甲型毒株)和1种乙型毒株(例如乙型/山形或乙型/维多利亚)的血凝素。另一种备选的四价组合物包含来自4种甲型毒株的血凝素，所述甲型毒株来自与大流行有关或易与大流行有关的毒株，例如禽毒株，例如H5 + H2 + H7 + H9。具体地讲，多价佐剂化的大流行组合物例如大流行二价(例如H5+H2)或三价或四价(例如H5 + H2 + H7 + H9)提供针对大流行甲型流感威胁亚型的先占免疫和针对威胁亚型的持久初免的优势。通常采用合宜的方案(例如相隔6-12个月)和任选预见的周期性加强免疫(booster) (例如10年)，从6周龄起给予2剂。任选这类大流行疫苗可与季节性疫苗组合。
多价组合物还可包含超过5种流感毒株，例如6、7、8、9或10种流感毒株。
当两种乙型毒株用于多价季节性组合物时，它们可来自两个不同的谱系(任选来自乙型/维多利亚和乙型/山形)。所述乙型毒株的至少一种，适宜两种乙型毒株，可来自传播谱系。这类组合物特别适于儿童。适宜当用于儿童的多价组合物包括两种乙型毒株时，正常分配给乙型毒株的抗原量在两种乙型毒株之间分配。具体地讲，佐剂化的四价(H1+H3+两个乙型谱系)流感疫苗因与未佐剂化的疫苗相比有优良的功效(就同源性保护和漂移保护(homologous and drift protection)两者及其针对两个传播乙型谱系的功效而言)而为未免疫儿童提供增强的预防的优势以及基于年龄的可能的整年免疫的优势。适宜早在6周龄或介于6-35个月之间的年龄给予一剂或两剂。
在一个具体的实施方案中，人用剂量的药物组合物或免疫原性组合物为三价免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含来自两种甲型毒株(任选H1N1、H3N2)和一种乙型毒株的血凝素(HA)。HA/毒株适宜为低量的HA (任选10µg HA/毒株或更低)，且如上定义。HA/毒株适宜为约5µg或5µg以下，约2.5µg或以下。本文限定的佐剂可包括在内，具体如表1中的规定。佐剂组合物适宜为水包油乳液，其包含量分别介于5-6 mg/剂之间、介于5-6 mg/剂之间和介于2-3 mg/剂之间的角鲨烯、α-生育酚和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)。或者，佐剂组合物是水包油乳液，其包含量分别介于2.5-3.5 mg/剂之间、介于2-3 mg/剂之间和介于1-2 mg/剂之间的角鲨烯、α-生育酚和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)。这些佐剂化的免疫原性组合物或疫苗特别适于成人(18-60岁)或年龄较大(3-17岁)的儿童人群，并且可提供针对H3N2漂移变体和针对来自不同谱系的乙型毒株的交叉保护。
在另一个具体的实施方案中，人用剂量的免疫原性组合物是四价免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含来自两种甲型毒株(任选H1N1、H3N2)和两种乙型毒株(任选来自不同谱系，例如来自乙型/维多利亚和乙型/山形)的血凝素(HA)。在另一个具体的实施方案中，人用剂量的免疫原性组合物为四价免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含来自两种大流行间甲型毒株(任选H1N1、H3N2)、一种乙型毒株和与大流行有关或易与大流行有关的一种甲型毒株(任选H5N1、H9N2、H7N7、H5N8、H5N9、H7N4、H7N3、H2N2、H10N7、H5N2、H7N2和H7N1)的血凝素(HA)。在另一个具体的实施方案中，人用剂量的免疫原性组合物为四价免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含来自3种大流行间甲型毒株(任选H1N1和两种H3N2毒株)和一种乙型毒株的血凝素(HA)。适宜HA/毒株/剂约为15µg。适宜HA/毒株为低量的HA (任选约为10µg HA/毒株/剂或更低，从而达到最大40-45µg HA/剂的四价组合物)，并如上限定。适宜HA/毒株为约5µg或5µg以下，为约2.5µg或以下。佐剂如存在，则可以是本文所述的任何佐剂。
在另一个具体的实施方案中，人用剂量的药物组合物或免疫原性组合物为五价免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含来自两种大流行间甲型毒株(任选H1N1、H3N2)、两种乙型毒株(任选来自不同谱系，例如来自乙型/维多利亚和乙型/山形)和与大流行有关或易与大流行有关的一种甲型毒株(任选H5N1、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、H5N2和H7N1)的血凝素(HA)。在另一个具体的实施方案中，人用剂量的药物组合物或免疫原性组合物为五价免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含来自3种大流行间甲型毒株(任选H1N1和两种H3N2毒株)和两种乙型毒株(任选来自不同谱系，例如来自乙型/维多利亚和乙型/山形)的血凝素(HA)。HA/毒株适宜为低量的HA (任选10µg HA/毒株或以下)，并如上限定。
在一个实施方案中，多价组合物是佐剂化的，适宜地为用基于角鲨烯的水包油乳液佐剂佐剂化的。因此，在具体实施方案中，本发明提供包含角鲨烯和HA的流感免疫原性组合物，其中角鲨烯:HA总量(包括所有流感毒株)的重量比的范围介于约50-150之间或约150-400之间(例如约200-300)。这类组合物适宜但并非唯一用于年长人群，并且使反应原性(reactogenicity)和免疫原性达最佳平衡。在另一个实施方案中，本发明提供包含角鲨烯和HA的流感免疫原性组合物，其中角鲨烯:HA总量(包括所有流感毒株)的重量比介于约50-400之间，例如约50-100、75-150、75-200、75-400、100-200、100-250或200-400。该比率可适宜如此，使得对于特定人群可符合保护的至少两个、适宜所有3个标准(表C或表D)。HA适宜来自至少3个、至少4个流感毒株。适宜存在3个季节性(例如H1N1、H3N2、乙型)毒株。当存在4种毒株时，适宜来自以下组：4种季节性毒株(例如H1N1、H3N2、两种乙型毒株；或H1N1、乙型、两种H3N2毒株)或一种大流行(例如禽)毒株加3种季节性毒株(例如H1N1、H3N2、乙型)的组。
通用术语
本申请中所有参考文献的教导，包括专利申请和授权专利，均通过引用全部结合到本文中。本申请对之要求优选权的任何专利申请以本文所述的针对出版物和参考文献的方式通过引用以其整体结合到本文中。
为避免疑义，在各种情况下，本发明人欲将本文的术语‘含有’、‘包括’、‘包含’任选用术语‘由…组成’替换。涉及本发明的“疫苗组合物”的本文的实施方案还适用于涉及本发明“免疫原性组合物”的实施方案，反之亦然。在所有数值中的术语“约” (或“大约”)允许5%变化，即约1.25%的值可意指介于1.19%-1.31%之间。
当与权利要求书和/或说明书中的术语“含有”联用时，使用单词“一(a或an)”可意指“一个”，但它也与“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或不止一个”的含义一致。权利要求书中使用的术语“或”用来意指“和/或”，除非明确说明仅是指备选或备选是相互排斥的，但本公开内容支持仅是指备选和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用来表明包括测量误差的固有变化的数值、用于确定该值的方法或研究主题中存在的变化。
用于说明书和申请书的词语“含有” (和含有的任何形式，例如“包括”和“包含”)、“具有” (和具有的任何形式，例如“有”和“带有”)、“包括” (和包括的任何形式，例如“包含”和“含有”)或“含有” (和含有的任何形式，例如“包含”和“含”)是包括性的或开放式的，并且不排除其它未说明的要素或方法步骤。
将通过参照下面的非限制性实施例，对本发明作进一步地阐述：
实施例。
实施例 1 ：
如图1所示，根据WO02/097072 (US7316813B2)中所述方法和图1概述的步骤，将流感病毒毒株的示例性生产方法与其它两种方法进行比较。
大流行H1N1v毒株(甲型/加利福尼亚/7/2009 X-179A)按照在叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)存在或不存在时实施的方法A来产生(图1)。当实施制备方法A时，观察到通过HPLC测量的大约50%血凝素(HA)在两个0.2µm过滤步骤中损失(图2)。
采用通过在裂解梯度后、刚好在用甲醛灭活前加入的稀释缓冲液中的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的加入而修改的制备方法A，产生3个试验批次的甲型/加利福尼亚/7/2009 X-179A H1N1v单价原液(本文称为“方法A+叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)”)。
加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的上游的方法步骤不改变。
如表5所示，在裂解后且在过滤前加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)与在该阶段不含叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的方法相比，得到改进的HA产量。
发现与不包括加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的方法A中所观察到的相比，过滤前的颗粒尺寸减小。
与方法A+叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)中的15µg/卵相比，单价原液步骤中的HA产量为39µg/卵，这相当于2.6倍的增加。
与仅方法A而无叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)相比，当采用方法A+叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)时，在H1N1v最终原液中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)含量/HA含量的比率较高。
在与H1N1v毒株所采用方法的相同点上加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)，也对H3N2毒株实施改进的纯化方法(方法A+叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™))。在裂解梯度之后、恰好在用甲醛灭活之前在稀释缓冲液中加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)，导致甲型/H2N2/南昌/933/95 RESVIR-9毒株中2-3倍的增加
表 5
。
实施例 2 ： 对抗原质量的影响
通过颗粒尺寸测量以及通过SDS-PAGE的纯度和蛋白质模式分析，评价叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)对产品质量的潜在影响。
通过凝胶和蛋白质印迹的概况分析(Profile analysis)。
在该方法中加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)显示提高纯度，因为总蛋白质/HA含量比率显示由2.5降低至1.7。
如图3所示，无论在制备方法中使用或不使用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)，SDS-PAGE凝胶中肽条带模式均不改变。在用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)产生的批次中观察到HA的部分增加(通过光密度测定法观察到大约3倍)。这个结果与改进的蛋白质/HA比率一致。
实施例 3 ： 用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 (TRITON X-100 ™ ) 制备的第一大流行单价原液批次的初步质量数据
表6显示采用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)方法产生的3个单价原液中获得的初步质量数据。
所得数据与用于该方法第一次评价而产生的试验批次中所观察到的一致：较高的HA产量和较高的纯度概况
有关用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 (TRITON X-100 ™ ) 方法制备的 H1N1v 单原液的分批分析数据
。
作为比较，表7中提供上述公开的用于H3N2 Fluarix疫苗制备的H3N2单价原液中获得的数据，所述H3N2 Fluarix疫苗采用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)制备
表 7 　 H3N2 单价原液中得到的分批分析数据
。
表9和表10提供在采用含有叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的改进的季节性Fluarix方法制备的代表性H3N2单价原液中得到的稳定性数据。在2-8℃下最多12个月后，有关批次的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)/HA含量的比率均接近3 (参见表8)，HA含量显示随时间变化是稳定的，所产生的每个时间点和所测试的各个批次的值相当。
如有需要，可通过分光光度测量来测量叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)-硫氰酸钴铵复合物浓度，以百万分率的范围检测叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)，有关叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)产品信息参见Sigma和Crabb, N.T.和Persinger, H.E., J. Amer. Oil Chem. Soc., 41, 752-755 (1964)以及Greff, R.A.等, J. Amer. Oil Chem. Soc., 42, 180-185 (1965)
表 8. 甲型 / 乌拉圭 /716/2007 NYMC X-175C (H3N2) 的单价原液批次中的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 (TRITON X-100 ™ )/HA 含量比率
表 9 采用 NIBSC 标准通过 SRD 测定 HA 含量 (µg/ml)
批号 0天 2个月 4个月 6个月 9个月 12个月
AFLUFDA035 122 134 128 134 128 126
AFLUFDA036 139 156 135 147 142 153
AFLUFDA037 131 138 125 136 135 144
表 10 采用 CBER 标准通过 SRD 测定 HA 含量 (µg/ml)
批号 0天 2个月 4个月 6个月 9个月 12个月
AFLUIDA041 152 145 163 166 153 162
AFLUIDA042 162 164 170 170 163 161
AFLUIDA043 157 166 144 176 168 167
实施例 4 ： 小鼠中的临床前研究
小鼠体内效价方法
血凝试验的抑制。
采用血凝抑制试验(HI)测定甲型/加利福尼亚/7/2009-X179A流感病毒毒株的抗血凝素抗体效价。HI试验的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血凝素(HA)抑制鸡红血细胞(RBC)血凝的能力。热灭活血清先用高岭土和鸡RBC处理以除去非特异性抑制物。在预处理后，将血清的2倍稀释液与4个血凝单位的各流感毒株一起孵育。然后加入鸡红血细胞，对凝集的抑制进行评分。效价表示为完全抑制血凝的血清最大稀释度的倒数。因为血清的第一稀释度为1:20，将未检出水平评分为等于10的效价。
用未加佐剂甲型 / 加利福尼亚 /7/2009-X179A 裂解疫苗免疫的小鼠中的体内效价试验
实验设计和目的
治疗 / 组 ( 表 11)
用总体积为1ml的2剂甲型/加利福尼亚/7/2009-NYMC X-179A裂解疫苗给各组10只成年雌性BALB/c小鼠进行腹膜内接种。用含有完全人用剂量(15µg HA)或人用剂量部分(3.75、1.9、0.46和0.115µg HA)的甲型/加利福尼亚/7/2009裂解疫苗而未加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (在原液中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)/HA比率为1)或加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (在原液中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)/HA比率为2.83)的制剂免疫小鼠。
小鼠用临用前(extemporaneously)制备的制剂(T0)或用在30℃下保存30天(假定加速的稳定性模拟在4℃下的长期稳定性)的同一制剂免疫。
未加入辛苯昔醇10的甲型/加利福尼亚/7/09裂解疫苗：批号AFLSFDA048，53µg HA/ml。
加入辛苯昔醇10的甲型/加利福尼亚/7/09裂解疫苗：批号AFLSFDA107，180µg HA/ml
表 11
。
疫苗制剂的制备
将聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)和硫柳汞加入缓冲液A (130mM NaCl，2.68mM KCl，0.49mM MgCl2。6H2O，7.26mM Na2HPO4.12 H2O，2.74mM KH2PO4)中以便在疫苗中的最终浓度达到115.4µg/ml聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)、15µg/ml叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)和10µg/ml硫柳汞。考虑已存在于毒株中的量，计算所使用的量。在室温下，将预混合物在定轨摇床上混合15-45分钟，然后加入15µg甲型/加利福尼亚裂解疫苗。在加入裂解疫苗后，在室温下，在定轨摇床中混合制剂15-45分钟。
将部分完全剂量制剂在同一缓冲液A (参见上文)中通过系列稀释，临用前稀释1/4、1/8、1/32和1/128倍。在其制备结束1小时内注射完全剂量和稀释液。
将另一部分的完全剂量制剂在30℃下孵育30天，临用前稀释，并注射。
读出
在第二次免疫后14天(第28天)，测定10只小鼠/组对接种的体液免疫应答。通过血凝抑制试验(HI)测定血清样品。
结果
体液免疫应答
结果见图4和图5。
用无佐剂疫苗免疫的小鼠需要2次免疫接种以诱导HI效价> 40。
对于未加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的方法(图4)，与用临用前制备的无佐剂疫苗免疫的小鼠相比，仅用在30℃下保存30天的完全人用剂量(15µg HA)的无佐剂疫苗免疫的小鼠显示类似的免疫应答。
至于在该方法加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (图5)，在用30℃下保存30天的完全人用剂量(15µg HA)和¼人用剂量的无佐剂疫苗免疫的小鼠与用临用前制备的无佐剂疫苗免疫的小鼠之间观察到类似的免疫应答。
结论
与在用临用前制备的无佐剂疫苗免疫的小鼠中诱导的免疫应答相比，在30℃下保存30天且加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的无佐剂疫苗比未加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)配制的无佐剂疫苗具有较高稳定性。
用 AS03A 佐剂化的甲型 / 加利福尼亚 /7/2009-X179A 裂解疫苗免疫的小鼠中的体内效价试验
实验设计和目的
治疗 / 组 ( 表 12)
各组10只成年雌性BALB/c小鼠用2剂AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009-NYMC X-179A裂解疫苗以1ml的总体积经腹膜内免疫。考虑人用剂量(HD)为15µg HA，并含有11.8 mg α-生育酚(维生素E)。
在原液中未加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)/HA比率为1)或在原液中加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)/HA比率为2.83)的情况下，用一半人用剂量的佐剂化疫苗和2倍或4倍梯度稀释的疫苗(7.5、3.75、1.9、0.46和0.115µg HA)免疫小鼠。
小鼠用临用前制备的制剂(T0)或在30℃下保存30天的相似制剂免疫。
无额外辛苯昔醇的裂解甲型/加利福尼亚病毒抗原：批号AFLSFDA048 -53µgHA/ml
含有额外的辛苯昔醇10的裂解甲型/加利福尼亚病毒抗原：批号AFLSFDA107 -180µgHA/ml
表 12
因通过腹膜内途径免疫的小鼠中的高水平死亡率(> 50%)所致，不包括用完全人用剂量和½人用剂量的AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/09疫苗得到的数据。
疫苗制剂的制备。
将聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)和硫柳汞加入缓冲液A (130mM NaCl，2.68mM KCl，0.49mM MgCl2，6H2O，7.26mM Na2HPO4.12 H2O，2.74mM KH2PO4)中以使疫苗中的终浓度达到115.4µg/ml聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)、15µg/ml叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)和10µg/ml硫柳汞的。考虑已存在于毒株中的量，计算所用量。在室温下，将预混合物在定轨摇床上混合15-45分钟，然后加入15µg甲型/加利福尼亚裂解疫苗。在加入裂解疫苗后，在室温下，将制剂在定轨摇床上混合15-45分钟。然后加入水包油乳液以达到每升10.69 mg角鲨烯、11.86mg α-生育酚和4.86mg聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)的终浓度。在室温下，将疫苗在定轨摇床上混合15-45分钟。
将部分完全剂量制剂在缓冲液A中通过系列稀释，临用前稀释1/2、1/4、1/8、1/32和1/128倍。完全剂量和稀释液在其制备结束后1小时内注射。
另一部分的完全剂量制剂在30℃下孵育30天，临用前稀释并注射。
读出
在第一次免疫(第14天)和第二次免疫后14天(第28天)测量10只小鼠/组对接种的体液免疫应答。通过抑制血凝试验(HI)测定血清样品。
结果
体液免疫应答
第一剂量后14天的结果见图6和图7，第二剂量后14天的结果见图8和图9。
在一剂临用前制备的AS03A佐剂化疫苗后，观察到HI效价高于40。在一剂AS03A佐剂化疫苗后，不论叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)存在(图7)或不存在(图6)，与在用临用前制备的AS03A佐剂化疫苗免疫的小鼠中诱导的免疫应答相比，在30℃下保存30天后观察到显著较低的HI效价。
与在用单剂量的AS03A佐剂化疫苗免疫的小鼠中诱导的免疫应答相比，在用2剂AS03A佐剂化疫苗免疫的小鼠中观察到较高的HI效价(图8和图9)。
在给予在无叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的情况下制备的2剂AS03A佐剂化疫苗后(图8)，与用临用前制备的疫苗免疫的小鼠相比，用30℃下保存30天的疫苗免疫的小鼠中观察到较低的HI效价。
在方法中加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (图9)的情况下，用30℃下保存30天的佐剂化疫苗与临用前制备的佐剂化疫苗免疫的小鼠中观察到类似的免疫应答。
结论
与在用临用前制备的佐剂化疫苗免疫的小鼠中诱导的免疫应答相比，在30℃下保存30天且加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的佐剂化疫苗比未加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)制备的佐剂化疫苗，显示较高的稳定性。
总体结论
与未加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)制备的疫苗相比，小鼠用含有较高浓度的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)的方法产生的未加佐剂或AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/09裂解疫苗接种导致较高的体液免疫应答(HI效价)。这些数据表明，当在该方法中加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)来制备该疫苗时，AS03A佐剂化或不加AS03A佐剂的裂解疫苗的稳定性得到改进。
实施例 5 ： 年龄介于 18 至 60 岁的成人中的 III 期双盲随机研究
引言和研究设计
在年龄介于18至60岁的成人中进行了III期双盲随机研究以评价AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样抗原的两种制备方法的免疫非劣效性。
约300名受试者、4个平行组(1:1:1:1)共接受下列疫苗IM：
− D-INI-1D组：75名受试者接受1剂最初方法制备的用AS03A佐剂化的流感D-PAN H1N1候选疫苗
− D-INI-2D组：75名受试者接受2剂最初方法制备的用AS03A佐剂化的流感D-PAN H1N1候选疫苗
− D-NEW-1D：75名受试者接受1剂新方法制备的用AS03A佐剂化的流感D-PAN H1N1候选疫苗
− D-NEW-2D：75名受试者接受2剂新方法制备的用AS03A佐剂化的流感D-PAN H1N1候选疫苗
方案：一次或两次肌内(IM)注射，两个组1中(第0天)仅一次，或两个组2中两次(第0天和第21天)，在接种后第0天、第21天、第42天、第182天和第364天收集血样。
研究目的
在年龄为18-60岁的健康受试者中第一次接种后21天，将新方法制备的用AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009(H1N1)v-样抗原(就疫苗-同源病毒H1N1 HI抗体GMT-血凝抑制(HI)抗体而言)与最初方法制备的用AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样抗原的免疫非劣效性进行比较。如果根据针对甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样的HI抗体效价，最初方法制备的疫苗和(相对于)新方法制备的疫苗之间GMT比率的双侧95% CI的上限小于或等于2，则视为达到非劣效性。还测量了在第一剂疫苗后的21天(第21天)和第二次接种后21天的HI抗体效价的几何平均效价(GMT)。下文还报道了其它参数例如血清转化率(SCR—定义为具有接种前效价< 1:10且接种后效价≥ 1:40或接种前效价≥ 1:10且接种后效价为至少4倍增加的疫苗的百分比)、血清转化因子(SCF—定义为与接种前相比接种后血清HI GMT的增加倍数)、血清保护率(SPR—定义为具有通常公认为标志性保护的血清HI效价≥ 1:40的疫苗的百分比)和中和抗体。
抗原制备
两种方法D-INI和D-NEW之间的唯一差别是在病毒裂解后立即加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)。这有助于防止在最终的无菌过滤步骤期间抗原聚集和抗原损失。图1表示制备D-INI (左栏)和D-NEW (中栏)的裂解灭活H1N1v原液制备物的方法概况。
基本上，原液的制备方法可分为4个主要部分，并且主要根据WO 02/097072 (US7316813B2)的实施例5a中描述的方法而省略琥珀酸α-生育酚稳定剂的加入：
1. 受精鸡蛋中工作种(working seed)的繁殖，受感染尿囊液的收获和合并，从而得到“粗制全病毒原液”(步骤1)。
2. 纯化各病毒毒株，得到“纯化的全病毒原液” (步骤2-6)。
3. 纯化的单价全病毒原液用脱氧胆酸钠裂解，得到“纯化的裂解病毒原液” (步骤7-8/1)。
4. 在两步骤中通过与脱氧胆酸钠和与甲醛孵育，接着超滤和无菌过滤，将纯化的单价裂解病毒原液灭活，得到“纯化的灭活裂解病毒原液”，或“原液” (步骤8/2-9)。
然后对D-NEW方法的纯化的裂解病毒原液(图1中的部分7/2)进行下列处理。过滤前，加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™) (使得在滤液中达到0.25%终浓度)。使流分7/2逐步过滤至0.45µm或更高滤膜，接着用孔径为0.45µm或更小的第二滤膜过滤步骤，其目的是除去生物负荷(bioburden)。然后对滤液进行短暂超声处理，并经孔径0.45µm或以下的膜过滤。在过滤结束时，过滤器用含有0.025%吐温-80的磷酸缓冲液冲洗。由于过滤和冲洗，滤液的最终体积是原始流分7/2体积的5倍。
将硫柳汞加入制剂中(在两种方法中)，呈10剂包装规格，浓度为5µg/剂。
疫苗组合物
疫苗的HA含量/剂固定在3.75µg/0.5ml剂量，疫苗在重配后含有一些赋形剂，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)分别至≥ 28.75µg/0.5ml剂量和22.5µg/0.5ml剂量的量。AS03A佐剂是每0.5ml疫苗剂量含有11.86 mg生育酚、10.69 mg角鲨烯和4.86 mg聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80™或POLYSORBATE 80™)的水包油乳液佐剂系统(WO2006/100109)。通过将佐剂O/W乳液与抗原悬液混合制备重配疫苗。重配疫苗组合物亦含有5µg硫柳汞/0.5ml剂量。
用于研究的抗原批号为：
● H1N1 (新方法D-NEW)的批号n° = DFLSA014A；佐剂AA03A209C的批号n°；叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)含量为22.5µg/0.25mL抗原悬液
● H1N1 (最初方法D-INI)的批号n° = DFLSA013A；佐剂AA03A209C的批号n°；叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)含量为3.75µg/0.25mL (与HA含量的比率为1:1)抗原悬液
对于两种抗原悬液，用于H1N1抗原悬液的吐温-80含量为>= 28.75µg/0.25mL抗原悬液(115µg/ml的目标制剂)，但不超过55µg/0.25mL (220µg/mL)。抗原悬液的组成见表13
表 13 灭活裂解病毒粒子 H1N1 抗原组分的组成
。
免疫原性结果–体液免疫应答
与最初方法制备的用 AS03A 佐剂化的甲型 / 加利福尼亚 /7/2009 (H1N1)v- 样抗原疫苗 (GMT) 相比，新方法制备的用 AS03A 佐剂化的甲型 / 加利福尼亚 /7/2009 (H1N1)v- 样抗原疫苗的非劣效性。
就第21天的GMT比率(表14)而言以及就第21天的血清转化率差异(表15)而言两者，新方法制备的用AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样抗原疫苗相对于最初方法制备的用AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样抗原疫苗具有非劣效性
表 14 对于第 21 天的 HI 抗体在 D-INI 和 D-NEW 之间的经调整的 GMT 比率 ( 免疫原性的 ATP 队列 (cohort))
1. D-NEW = 接受新方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
2. D-INI = 接受最初方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
3. 经调整的GMT = 针对基线效价调整的几何平均抗体效价
4. N = 接种前和接种后可获取结果的受试者的数目
5. 95% CI = 经调整的GMT比率的95%置信区间(Ancova模型：基线效价的调整-合并方差)；LL = 下限，UL = 上限。
表 15 　第 21 天 D-INI 和 D-NEW 血清转化率之间的差异 ( 免疫原性的 ATP 队列 )
1. D-NEW = 接受新方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
2. D-INI = 接受最初方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
3. N = 接种前和接种后可得到结果的受试者数
4. n/% = 具有疫苗应答的受试者的数目/百分比
5. 95% CI = 标准渐近95%置信区间；LL = 下限，UL = 上限
HI 几何平均效价 (GMT)
具有95% CI的HI抗体的GMT见表16。在第0天，血清阳性率为43.2%-47.2%。接种前，GMT值低，范围介于9.6至10.2之间。在第21天，血清阳性率在两个组(D-INI和D-NEW)均增至100%。观察到的HI应答的幅度在两个组中相似(D-NEW组的GMT为388.8相对于D-INI组的441.8)。
表 16 　在第 0 天和第 21 天 HI 抗体的血清阳性率和 GMT ( 免疫原性的 ATP 队列 )
1. D-NEW =接受新方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
2. D-INI = 接受最初方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
3. GMT = 对所有受试者计算的几何平均抗体效价
4. N = 可获得结果的受试者的数目
5. n/% = 具有规定范围内的效价的受试者的数目/百分比
6. 95% CI = 95%置信区间；LL = 下限，UL = 上限
7. MIN/MAX = 最小/最大
8. PRE= 随访1，第0天
9. PI(D21)= 随访2，第21天。
抗 HI Ab 效价的血清保护率、血清转化率和血清转化因子
表17中提供血清保护率(SPR)的结果，表18提供血清转化率(SCR)的结果，表19提供血清转化因子(SCF)的结果。
在两个组中，SPR显示在相同范围内，并且符合CHMP (平均值> 70)。通过新方法制备的流感D-PAN H1N1疫苗和最初方法制备的流感D-PAN H1N1疫苗诱导的SCR在相同范围内，并且均符合CHMP标准(平均值> 40)。对于两个组，SCF在相同范围内，并且超过CHMP标准(>2.5)。
表 17 　在第 0 天和第 21 天的 HI 抗体的血清保护率 (SPR) ( 免疫原性的 ATP 队列 )
1. D-NEW = 接受新方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
2. D-INI = 接受最初方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
3. N = 可获得结果的受试者的数目
4. n/% = 血清保护的受试者的数目/百分比(HI效价 >= 40 1/DIL)
5. 95% CI = 95%置信区间，LL = 下限，UL = 上限
6. PRE= 随访1，第0天
7. PI(D21)= 随访2，第21天
表 18 　在第 21 天 HI 抗体的血清转化率 (SCR) ( 免疫原性的 ATP 队列 )
1. D-NEW = 接受新方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
2. D-INI = 接受最初方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
3. N = 接种前和接种后可获得结果的受试者的数目
4. n/% = 血清保护的受试者的数目/百分比
5. 95% CI = 95%置信区间，LL = 下限，UL = 上限
6. PI(D21)= 随访2，第21天
表 19 　在第 21 天 HI 抗体效价的血清转化因子 (SCF) ( 免疫原性的 ATP 队列 )
1. D-NEW = 接受新方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
2. D-INI = 接受最初方法制备的具有佐剂的流感D-PAN H1N1疫苗的受试者
3. N = 接种前和接种后可获得结果的受试者的数目
4. SCF = 血清转化因子或几何平均比率(平均值[log10(POST/PRE)])
5. 95% CI = 95%置信区间，LL = 下限，UL = 上限
6. PI(D21)= 随访2，第21天。
按年龄层的免疫应答
表20中提供总体和按年龄层(18-40岁和41-60岁)的血清阳性、GMT、血清保护率、血清转化率和血清转化因子的结果。
按照年龄层的整体，在第21天，D-INI和D-NEW两组受试者的免疫应答均超过成人流感疫苗的全部CHMP监管验收标准。所有测试参数可视为在两组间相似。
表 20 　按年龄层和总体的抗甲型 / 加利福尼亚 /7/2009 (H1N1)v- 样毒株的 H1N1 HI 抗体
GMT = 几何平均效价；SPR = 血清保护率：抗体效价≥ 1:40的受试者的百分比；SCR = 血清转化率：对于起始血清阴性受试者接种后抗体效价≥ 40 1/DIL的受试者百分比，或对于起始血清阳性受试者为接种前抗体效价≥4倍的受试者百分比；SCF = 血清转化因子：与接种前相比，接种后GMT增加的倍数；PRE = 接种前；PI(D21) =在接种I后第21天；LL = 下限；UL = 上限；N = 具有可获得结果的受试者的数目。
反应原性结果
在D-NEW和D-INI组中以类似频率报告了诱发的(solicited)局部症状。注射部位疼痛是最常报告的症状，同时在两个组中均观察到较低频率的肿胀和发红。在两个组中，3级诱发的局部症状很少并相似。
与D-NEW (18.8%)组相比，除了在D-INI (27.5%)中报告了较高频率的战栗以外，在两个组中报告了相同频率的诱发的全身症状。在两个组中，3级相关诱发的普通症状很少并且相似(介于0%和2.0%之间)。
结论
免疫原性结论
与最初方法制备的用AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样抗原相比，新方法制备的用AS03A佐剂化的甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样抗原的免疫非劣效性目标(就GMT和SCR而言)，在年龄为18-60岁的健康受试者中第一次接种后21天皆能达到。
在接受1剂最初方法或新方法制备的疫苗的所有年龄层及在两个组中，就SCR、SPR和SCF而言，在第一次以3.75µg HA抗原给予流感大流行疫苗后21天观察到的HI体液免疫应答符合并超过所有EMEA/CHMP监管验收标准。
此外，就SCR、SPR和SCF而言，在第二次接种两种疫苗后21天，也符合并超过EMEA/CHMP验收标准。
安全性结论
在两个组中，反应原性概况相当。最常见的诱发的AE是注射部位疼痛、疲倦、肌肉痛和头痛。对于D-New和D-Ini疫苗，所有反应原性参数的各个值都相似。
总体结论
用新方法制备并用AS03A佐剂化的H1N1候选疫苗在成人中诱导针对甲型/加利福尼亚/7/2009 (H1N1)v-样毒株的免疫应答，其相对于按照最初方法方法制备的疫苗抗原诱导的免疫应答具有非劣效性。两种疫苗表明可接受的反应原性概况，未引起安全性问题。

Claims (23)

1.用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供全病毒制备物；(ii)在脱氧胆酸钠存在下裂解所述全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将所述裂解病毒制备物过滤。
2.权利要求1的方法，其中所述过滤步骤采用一种或多种滤膜进行，其中至少一种滤膜为无菌级。
3.权利要求1或2的方法，其中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以足以提高经过滤的裂解病毒制备物中的HA产量的量存在。
4.权利要求3的方法，其中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以大于0.025%w/v的量存在。
5.权利要求4的方法，其中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100™)以0.1-1.5% w/v的量存在。
6.权利要求1或2的方法，其还包括将所述裂解流感病毒制备物灭活的步骤。
7.权利要求6的方法，其中所述灭活步骤在步骤(iii)之后且在步骤(iv)之前进行。
8.权利要求6的方法，其中所述灭活步骤在步骤(iii)之后和在步骤(iv)之后进行。
9.权利要求1或2的方法，除步骤(iv)的过滤步骤以外，其还包括任选使用无菌级过滤器过滤所述裂解流感病毒制备物的步骤。
10.前述权利要求1或2的方法，其中步骤(ii)和(iii)同时进行。
11.裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物，其通过任何前述权利要求中的方法获得。
12.用于制备药物组合物和/或免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)通过权利要求1-10中任一项的方法提供裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物，(ii)将所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物与药学上可接受的载体混合以制备所述药物组合物和/或免疫原性组合物。
13.药物组合物和/或免疫原性组合物，其通过权利要求12的方法获得。
14.药物组合物和/或免疫原性组合物，其通过权利要求12的方法获得，其还包含佐剂。
15.权利要求13或14的药物组合物和/或免疫原性组合物，其中所述佐剂是水包油乳液。
16.权利要求15的药物组合物和/或免疫原性组合物，其中所述水包油乳液包含角鲨烯、以及聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯TWEEN 80™或POLYSORBATE 80™。
17.权利要求16的药物组合物和/或免疫原性组合物，其中所述水包油乳液还包含母育酚。
18.权利要求17的药物组合物和/或免疫原性组合物，其中所述母育酚是α-生育酚。
19.权利要求13-18中任一项的药物组合物和/或免疫原性组合物在制备用于诱导人受试者的免疫应答的药物中的用途。
20.用于药物的权利要求13-18中任一项的药物组合物和/或免疫原性组合物。
21.权利要求13-18中任一项的药物组合物和/或免疫原性组合物，其用于预防由流感引起的疾病。
22.权利要求13-18中任一项的药物组合物和/或免疫原性组合物在制备用于预防由流感引起的疾病的药物中的用途。
23.疫苗，其包含按照权利要求1-10中任一项的方法制备的一种或多种裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物。
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