ES2627082T3

ES2627082T3 - Procedimiento de producción de una vacuna contra la gripe

Info

Publication number: ES2627082T3
Application number: ES10768502.6T
Authority: ES
Inventors: Erik Jozef D' Hondt; Hans Bernd Engelmann
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: CA2777670A1; US10398771B2; CN102781469B; GB0918830D0; WO2011051235A1; EP2493501B1; JP6185548B2; CA2777670C; EP2493501A1; US9636394B2; US20120219587A1; JP2013508437A; JP2016106093A; CN102781469A; US20170196968A1

Abstract

Un procedimiento de producción de una masa de virus fragmentados, inactivados, purificados, que comprende las etapas de: (i) propagación de un germen de trabajo en huevos de gallina fecundados, recogida y agrupación de los fluidos alantoideos infectados para obtener una masa de virus enteros crudos, (ii) purificación de la cepa viral que conduce a una masa de virus enteros purificados, (iii) fragmentación de la masa de virus enteros monovalentes purificados con desoxicolato sódico, dando como resultado una masa de virus fragmentados purificados, e (iv) inactivación de la masa de virus monovalentes fragmentados purificados en dos etapas mediante incubación con desoxicolato sódico y con formaldehído, seguida por ultrafiltración y filtración estéril con el fin de obtener la masa de virus fragmentados inactivados purificados. caracterizado porque la masa de virus fragmentados purificados se filtra gradualmente en una membrana de filtro de 0,45 μm o superior, seguido por una segunda etapa de filtración en membrana con un tamaño de poro de 0,45 μm o inferior, y en el que se añade t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100tm) para alcanzar una concentración final del 0,25 % en el filtrado.

Description

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aceite en agua.

El adyuvante puede ser una emulsión, en particular, una emulsión de aceite en agua, y puede comprender opcionalmente otros inmunoestimulantes.

El adyuvante puede ser una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite no tóxico metabolizable, tal como escualano o escualeno, opcionalmente un tocol tal como tocoferol en particular alfa tocoferol (y opcionalmente tanto escualeno como alfa tocoferol) y un emulsionante (o tensioactivo) tal como el tensioactivo no iónico monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™). Mezclas de tensioactivos, pueden usarse mezclas de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™)/tioleato de sorbitán (SPAN 85™), o mezclas de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™)/t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™).

También se usan tocoles (por ejemplo vitamina E) en adyuvantes de emulsiones de aceite (documentos EP0382271B1; US5667784; WO95/17210). Los tocoles usados en emulsiones de aceite (opcionalmente emulsiones de aceite en agua) pueden formularse tal como se describe en los documentos US5650155A; US5667784A; EP0382271B1, ya que los tocoles pueden ser dispersiones de gotitas de tocol, que opcionalmente comprenden un emulsionante, de opcionalmente menos de 1 micrómetro de diámetro. Como alternativa, los tocoles pueden usarse en combinación con otro aceite, para formar la fase oleosa de una emulsión de aceite. En el presente documento se describen ejemplos de emulsiones en aceite que pueden usarse en combinación con el tocol, tales como los aceites metabolizables descritos anteriormente.

En una emulsión de aceite en agua, el aceite y el emulsionante deben estar en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato o un tampón citrato.

En un aspecto, la emulsión de aceite en agua tiene una de las siguientes composiciones:

-de 0,5 a 11 mg de escualeno, del 0,05 al 5 % de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) y opcionalmente, del 2 al 12 % alfa-tocoferol; o

-aproximadamente el 5 % de escualeno, aproximadamente el 0,5 % de monooleato de polioxietileno sorbitán

(TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) y aproximadamente el 0,5 % de trioleato de sorbitán (SPAN 85™). Este

adyuvante se denomina MF59.

Composiciones farmacéuticas y/o inmunogénicas

En el presente documento se desvelan, además, composiciones farmacéuticas y/o inmunogénicas preparadas usando el proceso de la invención que comprenden hemaglutinina de una o más cepas a una cantidad de aproximadamente 15 g/cepa, aproximadamente 7,5 g/cepa, aproximadamente 3,8 g/cepa, aproximadamente 1,9 g/cepa o 5 g/cepa.

Algunas vacunas existentes actualmente tienen detergente residual presente como resultado del uso de ese detergente en el proceso de fragmentación. En otros casos puede haber adición del detergente al antígeno de vacuna. En la presente invención, el uso de un detergente, tal como un tensioactivo no iónico, tal como toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™), añadido después de la fragmentación del virus (y adecuadamente antes de la filtración y adecuadamente antes de la inactivación), proporciona una relación de entre 1,5 y 15 de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™):HA en la masa monovalente final producida después del proceso de fabricación, valorada mediante las relaciones de peso/volumen del t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) y HA, adecuadamente entre 2,5 y 15, adecuadamente entre 3 y 15, adecuadamente entre 3,3 y 15, o una relación mayor.

También se describen composiciones farmacéuticas o inmunogénicas que comprenden una hemaglutinina de virus de la gripe (HA) y un tensioactivo no iónico en las que la relación de peso/volumen de tensioactivo no iónico respecto a hemaglutinina está entre 1 y 15. El tensioactivo puede ser t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™). La concentración de HA puede estar entre 2 y 200 g por cepa por ml. la concentración de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) puede estar entre 10 y 500 g/ml.

En un aspecto, la invención puede usarse para fabricar una vacuna fabricada a partir de múltiples cepas de gripe, en la que al menos un componente se fabrica de acuerdo con el proceso de la invención. Adecuadamente, una vacuna que comprende 2 o 3 cepas se fabrica usando un proceso de la invención.

Composiciones farmacéuticas o inmunogénicas preparadas usando procesos de la invención que comprenden cepas multivalentes, tienen una relación de entre 1 y 15 de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™):HA en la vacuna final, valorada mediante las relaciones de peso/volumen de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) y HA, adecuadamente, tal como entre 1,5 y 15, tal como entre 2 y 15, tal como entre 2,5 y 15, adecuadamente entre 3 y 15, adecuadamente entre 3,3 y 15, o una relación mayor.

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Preparación de gripe fragmentada

El proceso de preparación para una preparación de virus de la gripe fragmentado para su uso en composiciones farmacéuticas o inmunogénicas puede incluir una serie de diferentes etapas de filtración y/u otra separación tales como etapas de ultracentrifugado, ultrafiltración, centrifugado zonal y cromatografía (por ejemplo de intercambio iónico) en diversas combinaciones que pueden llevarse a cabo antes o después de la fragmentación. El proceso de fragmentación puede llevarse a cabo como un proceso discontinuo, continuo o semicontinuo. Un proceso de fragmentación y purificación preferido para una composición inmunogénica fragmentada se describe en el documento WO 02/097072 (US7316813B2).

Dicho proceso comprende adecuadamente las etapas de:

Filtración inicial, fragmentación del virus, filtración, inactivación, filtración; en la que la filtración puede ser una etapa de ultrafiltración.

La preparación de virus de la gripe fragmentado puede filtrarse usando una serie de filtros de diferente tamaño, por ejemplo filtros de 0,5 m, 0,45 m y/o 0,2/0,22 m. En una realización particular, la etapa de filtración (etapa iv) se lleva a cabo usando una o más membranas de filtro, en las que al menos una membrana de filtro es de calidad estéril (por ejemplo 0,2 m o 0,22 m).

La ultrafiltración puede realizarse usando una membrana de acetato de celulosa con un límite de peso molecular de aproximadamente 20 kDa.

En una realización adicional, se proporcionan procesos de la invención que comprenden además la etapa de clarificar toda la preparación de virus.

En una realización adicional, se proporcionan procesos de la invención que comprenden la etapa de ultracentrifugar toda la preparación de virus.

Preparaciones de virus de la gripe fragmentado de acuerdo con la invención preferidas comprenden una cantidad residual de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) y/o toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) que queda del proceso de producción, aunque estos pueden añadirse o sus concentraciones ajustarse después de la preparación del antígeno fragmentado. En una realización, tanto monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) como t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) están presentes. Los intervalos preferidos para las concentraciones finales de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) en la dosis de vacuna, que resulta de la preparación antigénica, son:

monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™): del 0,01 al 1 %, o aproximadamente el 0,1 % (v/v)

En una realización específica, la concentración final para monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) que resulta de la preparación de virus de la gripe fragmentado, varía entre el 0,025 %-0,09 % p/v. En otra realización específica, la preparación de virus de la gripe fragmentado se proporciona como una mezcla concentrada 2 veces, que tiene una concentración de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) que varía entre el 0,025 %-0,2 % (p/v) y tiene que ser diluida dos veces en el momento de la formulación final con el adyuvante (o el tampón en la formulación de control).

Pueden prepararse preparaciones de virus de la gripe fragmentado en presencia de un nivel bajo de tiomersal, o en ausencia de tiomersal dichas preparaciones de virus de la gripe fragmentado pueden ser estables en ausencia de conservantes organomercuriales, en particular la preparación no contiene tiomersal residual. En particular la preparación de virus de la gripe fragmentado comprende un antígeno de hemaglutinina estabilizado en ausencia de tiomersal, o a niveles bajos de tiomersal (generalmente 5 g/ml o menos). Específicamente, la estabilización de la cepa de la gripe B se es realizada por un derivado de alfa tocoferol, tal como succinato de alfa tocoferol (también conocido como succinato de vitamina E, es decir VES). Dichas preparaciones y procedimientos para prepararlas se desvelan en el documento WO 02/097072 (US7316813B2).

Composiciones particulares descritas en el presente documento contienen tres preparaciones de virus de la gripe fragmentado inactivado, preparadas a partir de las cepas recomendadas por la OMS de la temporada de gripe apropiada.

La preparación de virus de la gripe fragmentado o preparación de gripe de subunidad y el adyuvante preparado de acuerdo con el proceso de la invención pueden estar contenidos en el mismo recipiente. A esto se le denomina el “enfoque de un vial”. El vial puede ser una jeringa precargada. La preparación de virus de la gripe fragmentado o la preparación de gripe de subunidad y adyuvante descritas en el presente documento pueden estar contenidas en recipientes o viales independientes y mezclarse poco antes o en el momento de la administración al sujeto. A esto se le denomina el “enfoque de dos viales”. Adecuadamente, el enfoque de dos viales consiste en 0,5 ml de preparación de virus de la gripe fragmentado o preparaciones de gripe de subunidad concentradas, tal como se

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(al menos) capaz de desencadenar respuestas inmunológicas suficientes para cumplir adecuadamente los tres estándares actuales establecidos para vacunas existentes en sujetos adultos o ancianos no sensibilizados, después de dos dosis de vacuna. La Directriz de la EMEA describe la situación de que en caso de una pandemia, la población será inmunilógicamente virgen y, por lo tanto, se supone que los tres criterios del CHMP para vacunas estacionales serán cumplidos por vacunas candidatas pandémicas. No se requiere ningún requisito explícito para probarlas en sujetos seronegativos pre-vacunación.

Las composiciones producidas usando el proceso de la presente invención cumplen adecuadamente al menos uno de dichos criterios para la cepa incluida en la composición (un criterio es suficiente para obtener aprobación), adecuadamente al menos dos, o normalmente al menos los tres criterios para protección, tal como se muestra en la tabla 3.

Tabla 3 (criterios de la CHMP)

18 -60 años: > 60 años

Tasa de seroconversión*: >40 % >30 %

Factor de conversión**: >2,5 >2,0

Tasa de protección***: >70 % >60 %

* La tasa de seroconversión se define como la proporción de sujetos en cada grupo que tienen un valor cuantitativo protector post-vacunación ≥ 1:40. La tasa de seroconversión simplificada es el % de sujetos que tienen un valor cuantitativo de HI antes de la vacunación de <1:10 y ≥1:40 después de la vacunación. Sin embargo, si el valor cuantitativo inicial es ≥1:10 entonces es necesario que haya un aumento de al menos cuatro veces en la cantidad de anticuerpo después de la vacunación. ** El factor de conversión se define como el aumento en veces de los valores cuantitativos medios geométricos (GMT) de HI sérica después de la vacunación, para cada cepa de vacuna. *** La tasa de protección se define como la proporción de sujetos que fueron seronegativos antes de la vacunación y tienen un valor cuantitativo de HI (protector) post-vacunación de ≥ 1:40 o que fueron seropositivos antes de la vacunación y tienen un incremento significativo de 4 veces del valor cuantitativo post-vacunación; normalmente se acepta que indica protección.

La FDA usa puntos de corte de edad ligeramente diferentes, pero sus criterios se basan en los criterios del CHMP. Los criterios de valoración apropiados incluyen, de forma similar: 1) el porcentaje de sujetos que alcanzan un valor cuantitativo de anticuerpos para HI ≥ 1:40, y 2) tasas de seroconversión, definidas como un aumento de cuatro veces el valor cuantitativo de anticuerpos para HI post-vacunación. El valor cuantitativo medio geométrico (GMT) debe estar incluido en los resultados, pero los datos deben incluir no solamente la estimación puntual, sino también el límite inferior del intervalo de confianza al 95 % de la tasa de incidencia de seroconversión, y la tasa de incidencia del día 42 de valores cuantitativos de HI ≥ 1:40 debe superar el valor diana. Por lo tanto, deben proporcionarse estos datos y los intervalos de confianza al 95 % (IC) de las estimaciones puntuales de estas evaluaciones. El borrador de la guía de la FDA requiere que ambas dianas se cumplan. Esto puede resumirse en la tabla 4.

Tabla 4

18 -64 años: > 64 años

Tasa de seroconversión*: >40 % >30 %

Tasa de valores cuantitativos de HI ≥ 1:40: >70 % >60 %

*La tasa de seroconversión se define como: a) para sujetos con un valor cuantitativo inicial 1:10, un aumento de 4 veces o mayor; o b) para sujetos con un valor cuantitativo inicial < 1:10, un aumento hasta ≥ 1:40. Estos criterios deben cumplirse en el límite inferior del IC del 95 % para el valor auténtico.

Las composiciones cumplen adecuadamente al menos un de dichos criterios para la cepa incluida en la composición, adecuadamente ambos criterios para protección, tal como se muestra en la tabla 4.

Adecuadamente, este efecto se consigue con una dosis baja de antígeno, tal como con 7,5 g de HA o incluso una dosis de antígeno más baja tal como 3,8 g o 1,9 g de HA.

Adecuadamente, cualquiera o todos de dichos criterios también se cumplen para otras poblaciones, tales como en niños y en cualquier población inmunocomprometida.

Dosis humanas de una composición farmacéutica o inmunogénica puede contener una hemaglutinina (HA) a partir de una única cepa de la gripe, y se denomina una composición de gripe “monovalente”. Una dosis humana de una composición farmacéutica o inmunogénica puede comprender hemaglutinina (HA) de más de una cepa de la gripe, y se denomina una composición de gripe “multivalente”. Una composición multivalente adecuada es una composición bivalente (que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas de virus de la gripe tales como, pero no exclusivamente, dos cepas asociadas a una pandemia o susceptibles de estar asociadas con una pandemia, por ejemplo H5=H2),

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una composición trivalente (que comprende hemaglutinina (HA) de tres cepas de virus de la gripe, opcionalmente de dos cepas de A, y una cepa de B tal como aunque sin limitarse a B/yamagata o B/Victoria), una composición tetravalente (que comprende hemaglutinina (HA) de cuatro cepas de virus de la gripe) o una composición pentavalente (que comprende hemaglutinina (HA) de cinco cepas de virus de la gripe). Una composición tetravalente adecuada puede comprender hemaglutinina de dos cepas de A y dos cepas de B de diferente linaje (tales como B/yamagata o B/Victoria). Dicha composición que comprende una segunda cepa de B es particularmente adecuada para niños muy jóvenes especialmente donde la exposición o cebado anterior es importante. Como alternativa, una composición tetravalente comprende hemaglutinina de tres cepas de A (opcionalmente H1N1, H3N2, y una cepa de A asociada a un pandemia o susceptible de asociarse a una pandemia) y una cepa de B (tal como B/yamagata o B/Victoria). Otra composición tetravalente alternativa comprende hemaglutinina de cuatro cepas de A de una cepa asociada a una pandemia o susceptibles de asociarse a una pandemia, tales como cepas aviares, tales como H5 + H2 + H7 + H9. Específicamente, una composición pandémica potenciada multivalente tal como una bivalente pandémica (por ejemplo H5+H2) o trivalente o tetravalente (por ejemplo H5 + H2 + H7 + H9) ofrece la ventaja de una inmunización preventiva contra subtipos de amenazas de gripe A pandémicas y sensibilización duradera contra subtipos de amenaza. Normalmente se administran dos dosis a partir de 6 semanas de edad usando un programa conveniente (por ejemplo, separadas por 6-12 meses), y opcionalmente está previsto un refuerzo periódico (por ejemplo, 10 años). Opcionalmente, dicha vacuna pandémica puede combinarse con una vacuna estacional.

Una composición multivalente también puede comprender más de 5 cepas de la gripe, tal como 6, 7, 8, 9 o 10 cepas de la gripe.

Cuando se usan dos cepas de B en una composición estacional multivalente, éstas pueden proceder de dos linajes diferentes (opcionalmente de B/Victoria y B/Yamagata). Al menos una de dichas cepas de B, adecuadamente ambas cepas de B, procederá de un linaje circulante. Dicha composición es particularmente adecuada para niños. Adecuadamente, cuando la composición multivalente para su uso en niños incluye dos cepas de B, la cantidad de antígeno asignada normalmente a la cepa de B se divide entre las dos cepas de B. Específicamente, la vacuna contra la gripe tetravalente (H1 + H3 + ambos linajes B) potenciada ofrece la ventaja de profilaxis mejorada para niños sin exposición previa, debido a su superior eficacia en comparación con vacunas no potenciadas (sin adyuvantes) (en términos de protección tanto homóloga y de deriva, y su eficacia contra dos linajes de B circulantes) y de posible inmunización durante todo el año basándose en la edad. Adecuadamente, se administra una dosis o dos dosis ya a partir de la edad de 6 semanas, o entre 6 y 35 meses.

La dosis humana de la composición farmacéutica o inmunogénica puede ser una composición inmunogénica o de vacuna trivalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas de A (opcionalmente H1N1, H3N2) y una cepa de B. Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente 10 g de HA por cepa o menos) y es tal como se ha definido anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa está a aproximadamente 5 g o menos, a aproximadamente 2,5 g o menos. Un adyuvante, tal como se define en el presente documento, puede estar incluido y, en particular, tal como se define en la tabla 1. Adecuadamente, la composición adyuvante es una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) a una cantidad de entre 5-6 mg, entre 5-6 mg y entre 2-3 mg por dosis, respectivamente. Como alternativa, la composición adyuvante es una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) a una cantidad de entre 2,5-3,5 mg, entre 2-3 mg y entre 1-2 mg por dosis, respectivamente. Estas composiciones inmunogénicas, o vacunas potenciadas, son particularmente adecuadas para la población adulta (18-60 años) o de niños mayores (de 3 a 17 años), y puede proporcionar protección cruzada contra variantes de deriva de H3N2 y contra una cepa de B de un linaje diferente.

La dosis humana de la composición inmunogénica puede ser una composición inmunogénica o de vacuna tetravalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas de A (opcionalmente H1N1, H3N2) y dos cepas de B (opcionalmente de un linaje diferente, tal como de B/Victoria y B/Yamagata). La dosis humana de la composición inmunogénica puede ser una composición inmunogénica o de vacuna tetravalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas de A interpandémicas (opcionalmente H1N1, H3N2), una cepa de B y una cepa de A asociada a una pandemia o susceptible de asociarse con una pandemia (opcionalmente H5N1, H9N2, H7N7, H5N8, H5N9, H7N4, H7N3, H2N2, H10N7, H5N2, H7N2 y H7N1). La dosis humana de la composición inmunogénica puede ser una composición inmunogénica o de vacuna tetravalente que comprende hemaglutinina (HA) de tres cepas de A interpandémicas (opcionalmente H1N1, y dos cepas H3N2) y una cepa de B. Adecuadamente, la HA por cepa por dosis está a aproximadamente 15 g. Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente a aproximadamente 10 g de HA por cepa por dosis o menos, para alcanzar un máximo de 40-45 g de HA por dosis de composición tetravalente) y es tal como se ha definido anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa está a aproximadamente 5 g o menos, a aproximadamente 2,5 g o menos. Un adyuvante, cuando está presente, puede ser cualquier adyuvante, tal como se describe en el presente documento.

La dosis humana de la composición farmacéutica o inmunogénica puede ser una composición inmunogénica o de vacuna pentavalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas de A interpandémicas (opcionalmente H1N1, H3N2), dos cepas de B (opcionalmente de un linaje diferente, tal como de B/Victoria y B/Yamagata) y una cepa de A asociada a una pandemia o susceptible de asociarse con una pandemia (opcionalmente H5N1, H9N2, H5N8, H5N9,

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H7N4, H7N7, H7N3, H2N2, H10N7, H5N2 y H7N1). La dosis humana de la composición farmacéutica o inmunogénica puede ser una composición inmunogénica o de vacuna pentavalente que comprende hemaglutinina (HA) de tres cepas de A interpandémicas (opcionalmente H1N1, y dos cepas H3N2) y dos cepas de B (opcionalmente de un linaje diferente, tal como de B/Victoria y B/Yamagata). Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente 10 g de HA por cepa o menos) y es tal como se ha definido anteriormente.

Las composiciones multivalentes pueden tener un adyuvante, adecuadamente un adyuvante de emulsión de aceite en agua a base de escualeno. Una composición inmunogénica contra la gripe puede comprender escualeno y HA en la que la relación en peso de escualeno:cantidad total de HA (todas las cepas de gripe incluidas) está en el intervalo de entre aproximadamente 50-150 o aproximadamente 150-400 (por ejemplo aproximadamente 200-300). Dichas composiciones son adecuada pero no exclusivamente para su uso en la población anciana y equilibran de la mejor manera reactogenicidad e inmunogenicidad. Las composiciones inmunogénicas contra la gripe pueden comprender escualeno y HA, en las que la relación en peso de escualeno:cantidad total de HA (todas las cepas de gripe incluidas) está entre aproximadamente 50-400, por ejemplo aproximadamente 50-100, 75-150, 75-200, 75-400, 100200, 100-250 o 200-400. La relación será, adecuadamente, tal que al menos dos, adecuadamente los tres criterios (tabla C o D) para protección se cumplirán para una población específica. Adecuadamente, la HA es de al menos tres, al menos cuatro cepas de gripe. Adecuadamente, tres cepas estacionales (por ejemplo H1N1, H3N2, B) están presentes. Adecuadamente, cuando cuatro cepas están presentes, éstas son del grupo de: cuatro cepas estacionales (por ejemplo H1N1, H3N2, dos cepas de B; o H1N1, B, dos cepas H3N2) o el grupo de una cepa pandémica (por ejemplo aviar) más tres cepas estacionales (por ejemplo H1N1, H3N2, B).

Lenguaje general

La enseñanza de todas las referencias en la presente solicitud, incluyendo las solicitudes de patente y patentes concedidas, se incorporan completamente en el presente documento como referencia. Cualquier solicitud de patente a la cual esta solicitud reivindica prioridad se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad de la manera descrita en el presente documento para publicaciones y referencias.

Para evitar dudas, las expresiones “que comprende”, “comprenden” y “comprende” en el presente documento, están concebidas por los inventores para ser opcionalmente sustituibles con las expresiones “que consiste en”, “consisten en” y “consiste en”, respectivamente, en todos los casos. Las realizaciones en el presente documento relativas a las “composiciones de vacuna” de la invención son también aplicables a realizaciones relacionadas con “composiciones inmunogénicas” de la invención, y viceversa. El término “aproximadamente” (o “alrededor de”) en todos los valores numéricos permite una variación del 5 %, es decir, un valor de aproximadamente el 1,25 % significaría de entre el 1,19 % -1,31 %.

El uso de la palabra “un” o “una”, cuando se usa junto con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno”, pero también es coherente con el significado de “uno o más”, “al menos uno” y “uno o más de uno”. El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solamente o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere solo a alternativas y “y/o”. En toda esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error de la medición, empleándose el procedimiento para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras “que comprende” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “que contiene” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusiva o abiertas y no excluyen elementos, o etapas del procedimiento adicionales no citadas.

La invención se describirá adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos:

Ejemplos

Ejemplo 1:

Un proceso de producción ejemplar para las cepas del virus de la gripe basado en el proceso descrito en el documento WO02/097072 (US7316813B2) y las etapas resumidas en la figura 1 se comparó con otros dos procesos tal como se perfila en la figura 1.

La cepa H1N1v pandémica (A/California/7/2009 X-179A) se produjo de acuerdo con el proceso A realizado en presencia o ausencia de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) (figura 1). Cuando se aplica el proceso de fabricación A se observó que aproximadamente el 50 % de hemaglutinina (HA), según lo medido por HPLC, se perdió en las dos etapas de filtración de 0,2 m (figura 2).

Tres lotes de ensayo de masas monovalentes contra A/California/7/2009 X-179A H1N1v se produjeron usando el proceso de fabricación A modificado mediante la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en el

tampón de dilución añadido después del gradiente de fragmentación, justo antes de la inactivación con formaldehído (descrita en el presente documento como “proceso A + t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™)”).

Las etapas del proceso aguas arriba de la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) permanecieron sin cambios.

5 Tal como se muestra en la tabla 5, la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) después de la fragmentación y antes de la filtración produjo un rendimiento mejorado de HA en comparación con el proceso sin toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en esta fase.

Se descubrió que los tamaños de partícula antes de la filtración eran reducidos en comparación con los observados con el proceso A que no comprende la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™).

10 El rendimiento de HA en la etapa de masa monovalente es de 39 g/huevo en comparación con 15 g/huevo en el proceso A + t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™), que corresponda a un incremento de 2,6 veces.

La relación de contenido de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™)/contenido de HA en la masa final de HIN1v es mayor cuando se usa el proceso A + t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™), en comparación con el proceso A en solitario sin t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™).

15 El proceso de purificación modificado (proceso A + t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™)) también se llevó a cabo en una cepa H3N2 con la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en el mismo punto en el proceso que el usado para la cepa H1N1v. La adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en un tampón de dilución después del gradiente de fragmentación, justo antes de la inactivación con formaldehído, dio como resultado un incremento de 2-3 veces en la cepa de A/H2N2/Nanchang/933/95 RESVIR-9.

20 Tabla 5

Cepa A/H1N1v: Cepa H3N2

Proceso A: Proceso A con tampón toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) Proceso Fluarix con toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™)

Rendimiento de HA por huevo: 63 g/huevo

Contenido de HA en masas monovalentes: 20 -50 g/ml 140 -190 g/ml 80 -280 g/ml

Contenido de HA en masas finales: 15 g/ml 15 g/ml 90 g/ml

Contenido de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en masas monovalentes: 0 g/ml 470 -600 g/ml 190 -440 g/ml

Contenido de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en masas finales: 13 -17 g/ml 60 -103 g/ml 80 -105 g/ml

Especificación de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en masa final: 11 -20 g/ml 50 -170 g/ml 50 -170 g/ml

Relación de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™)/HA: 0,7 -1,3 3,3 -11,3 0,6 -1,9

Ejemplo 2: Impacto sobre la calidad del antígeno

El impacto potencial de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) sobre la calidad del producto se evaluó mediante mediciones del tamaño de partícula, así como pureza y análisis del patrón de proteínas mediante SDS-PAGE.

25 Análisis del perfil mediante Gel y transferencia de Western.

Se ha mostrado que la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en el proceso mejora la pureza, dado que se muestra que la relación de contenido de proteína total/HA se reduce de 2,5 a 1,7.

Tal como se ve en la figura 3, el patrón de bandas de péptidos en geles de SDS-PAGE permanece sin cambios ya se usara t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) o no en el proceso de fabricación. Una porción incrementada

5 de HA (aproximadamente 3 veces observada por densitometría) se observa en lotes producidos con toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™). Este descubrimiento es coherente con la relación de proteína/HA mejorada.

Ejemplo 3: Datos de calidad preliminares sobre los 1º lotes de masa monovalente pandémica fabricados con t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™)

10 Los datos de calidad preliminares obtenidos en tres masas monovalentes producidas usando el proceso con toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) se presentan en la tabla 6.

Los datos obtenidos están en línea con lo que se observó en lotes de ensayo producidos para las 1ª evaluaciones del proceso: mayores rendimientos de HA y mayor perfil de pureza.

Análisis de datos por lotes en masas monovalentes para H1N1v fabricadas con el proceso con t15 octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X -100™)

A/California/7/2009 NYMC X-179A N.º de lote

Parámetro: DFLSIDA03 0 (AFLSFDA1 07) DFLSIDA031 (EFLSDFA10 9) DFLSIDA032 (EFLSDFA11 1)

Contenido de HA por SRD (g/ml): ~180 >=200 >=200

Proteína (g/ml): 259 297 325

Tween (g/ml): 503 ND ND

t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) (g/ml): 509 447 579

Relación de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™):HA: ~ 2,83 ~ 2,24 ~ 2,88

Como comparación, datos obtenidos en masas monovalentes contra H3N2 fabricadas para una vacuna Fluarix contra H3N2 fabricada usando t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™), tal como se ha desvelado anteriormente se presentan en la tabla 7.

Tabla 7 datos de análisis por lotes obtenidos en masas monovalentes contra H3N2

A/Uruguay/7/2009 NYMC X-179A N.º de lote

Parámetro: AFLUFDAO 70 AFLUFDAO 71 AFLUFDAO 72

Contenido de HA por SRD Int (µg/ml): 69 82 90

Concentración de sacarosa (µg/ml): 80 89 88

Proteína (µg/ml): 172 232 198

Ovoalbúmina (ng/ml): 9 12 19

Desoxicolato sódico (µg/ml): 95 105 125

Endotoxina (EU/ml): < 0,5 < 0,5 < 0,5

Formaldehído (µg/ml): 0,9 0,9 0,4

Tween (µg/ml): 391 438 407

t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) (µg/ml): 374 431 474

Inactivación viral: Demostrada Demostrada Demostrada

Esterilidad (de acuerdo con la Ph.Eur.): Estéril Estéril Estéril

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inyectan en el plazo de la hora después del final de su preparación.

Otra parte de la formulación de dosis completa se incuba 30 días a 30 °C y se diluye extemporáneamente y se inyecta.

Lecturas

La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió 14 días después de la segunda inmunización (día 28), en 10 ratones/grupo. Se ensayaron muestras de suero mediante el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI).

Resultados

Respuestas inmunitarias humorales

Los resultados se muestran en las figuras 4 y 5.

Se requieren dos inmunizaciones en ratones inmunizados con la vacuna sin adyuvante con el fin de inducir valores cuantitativos de HI > 40.

Con el proceso sin adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) (figura 4), solamente los ratones inmunizados con la dosis humana completa (15 g HA) de la vacuna sin adyuvante almacenada 30 días a 30 °C mostraron una respuesta inmunitaria similar en comparación con los ratones inmunizados con la vacuna sin adyuvante preparada de forma extemporánea.

Con la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en el proceso (figura 5), se observaron respuestas inmunitarias similares entre ratones inmunizados con la dosis humana completa (15 g de HA) y 1⁄4 de dosis humana de la vacuna sin adyuvante almacenada 30 días a 30 °C y ratones inmunizados con la vacuna sin adyuvante preparada extemporáneamente.

Conclusión

En comparación con la respuesta inmunitaria inducida en ratones inmunizados con la vacuna sin adyuvante preparada extemporáneamente, la vacuna sin adyuvante almacenada 30 días a 30 °C mostraba mayor estabilidad con la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en comparación con la vacuna sin adyuvante formulada sin adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™).

Ensayo de potencia in vivo en ratones inmunizados con vacuna fragmentada contra A/California/7/2009-X179A potenciada con AS03A

Diseño experimental y objetivo

Tratamiento/grupo (tabla 12)

Grupos de 10 ratones BALB/c hembra adultos se inmunizaron por vía intraperitoneal con dos dosis de vacuna fragmentada contra A/California/7/2009-NYMC X-179A potenciada con AS03A en un volumen total de 1 ml. Una dosis humana (HD) se consideró a 15 g HA y que contenía 11,8 de mg alfa-tocoferol (Vitamina E).

Los ratones se inmunizaron con media dosis humana de vacuna potenciada y dilución por etapas de 2 veces o 4 veces de la vacuna (7,5, 3,75, 1,9, 0,46 y 0,115 g de HA) sin la adición de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X100™) en la masa (relación de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™)/HA de 1) o con la adición de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) en la masa (relación de t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X100™)/HA 2,83).

Los ratones se inmunizaron con formulaciones preparadas extemporáneamente (TO) o con formulaciones similares almacenadas 30 días a 30 °C.

Antígeno del virus A/California fragmentado sin octoxinol adicional: Lote AFLSFDA048 -53 gHA/ml

Antígeno del virus A/California fragmentado que contiene octoxinol adicional 10: Lote AFLSFDA 107 -180 gHA/ml

Tabla 12

Gr: Antígeno/formulación A/California/7/2009 (conc. de HA/dosis) Etapa de dilución Otro tratamiento

A/California sin t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X100™) -AS03A (Lote AFLSFDA048): 15 g HD completa

1: 7,5 g 1/2 Días 0 y 14

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(continuación)

2: 3,75 g 1/4 Días 0 y 14

3: 1,9 g 1/8 Días 0 y 14

4: 0,46 g 1/32 Días 0 y 14

5: 0,115 g 1/128 Días 0 y 14

A/California con octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X100™)-AS03A (Lote AFLSFDA107): 15 g HD completa

6: 7,5 g 1/2 Días 0 y 14

7: 3,75 g 1/4 Días 0 y 14

8: 1,9 g 1/8 Días 0 y 14

9: 0,46 g 1/32 Días 0 y 14

10: 0,115 g 1/128

11: Tampón de dilución A

Los datos obtenidos con dosis humana completa y ½ dosis humana de vacuna contra A/California/7/09 potenciada con AS03A no se incluyeron debido a un alto nivel de mortalidad (> 50 %) en ratones inmunizados por vía intraperitoneal.

Preparación de las formulaciones de vacuna.

Se añaden monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™), t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) y Tiomersal a tampón A (NaCl 130 mM, KCl 2,68 mM, MgC12 0,49 mM 6H2O, Na2HPO4 7,26 mM 12 H2O, KH2PO4 2,74 mM) con el fin de alcanzar una concentración final en la vacuna de 115,4 g/ml de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™), 15 g/ml de toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) y de 10 g/ml de Tiomersal. Las cantidades usadas se calculan para tener en cuenta las cantidades ya presentes en las cepas. La premezcla se mezcla durante de 15 a 45 minutos sobre una mesa de agitación orbital a temperatura ambiente antes de la adición de 15 g de vacunas fragmentadas contra A/California. Después de la adición de las vacunas fragmentadas, las formulaciones se mezclan durante de 15 a 45 min sobre una mesa de agitación orbital a temperatura ambiente. La emulsión de aceite en agua se añade a continuación con el fin de alcanzar una concentración final de 10,69 mg de escualeno, 11,86 mg de alfa-tocoferol y 4,86 mg de monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN-80™ o POLYSORBATE 80™) por ml. La vacuna se mezcla durante de 15 a 45 min sobre una mesa de agitación orbital a temperatura ambiente.

Parte de las formulaciones de dosis completa se diluyen extemporáneamente 1/2, 1/4, 1/8, 1/32 y 1/128 veces en tampón A mediante diluciones sucesivas. La dosis completa y las diluciones se inyectan en el plazo de la hora después del final de su preparación.

Otra parte de las formulaciones de dosis completa se incuba 30 días a 30 °C y se diluye e inyecta extemporáneamente.

Lecturas

La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió 14 días después de la primera (día 14) y la segunda inmunización (día 28) sobre 10 ratones/grupo. Se ensayaron muestras de suero mediante el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI).

Resultados

Respuestas inmunitarias humorales

Los resultados se muestran en las figuras 6 y 7, 14 días después de la primera dosis, y en las figuras 8 y 9, 14 días después de la segunda dosis.

Se observaron valores cuantitativos de HI por encima de 40 después de una dosis de vacuna potenciada con AS03A preparada extemporáneamente. Después de una dosis de vacuna potenciada con AS03A, y estuviera presente toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100™) (figura 7) o no (figuras 6), se observaron valores cuantitativos de HI significativamente más bajos después de almacenamiento 30 días a 30 °C en comparación con la respuesta

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Claims

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