ES2621487T3 - Nueva composición de vacuna contra la gripe - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica sin conservante mercúrico para su uso en la profilaxis de una infección o enfermedad gripal en un niño de edad entre 6 y 36 meses, en la que dicha composición comprende una preparación acuosa de virus de la gripe inactivado que comprende hemaglutinina (HA) y succinato de α-tocoferol en una cantidad suficiente para establecer dicha HA, en la que la preparación es una preparación antigénica de virus fragmentado o subunitario y es una preparación trivalente de virus de la gripe que comprende la HA de 2 cepas A y de 1 cepa B o una preparación tetravalente de virus de la gripe que comprende la HA de 2 cepas A y de 2 cepas B y en la que la composición no comprende adyuvante.

Description

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DESCRIPCION
Nueva composicion de vacuna contra la gripe
La presente solicitud es una continuacion en parte de la solicitud de Estados Unidos relacionada N.° 11/874.647, presentada el 18 de octubre de 2007, que es una continuacion de la solicitud N.° 10/480.952, presentada el 22 de junio de 2004, ahora Patente de Estados Unidos 7.316.813 que es una 371 de la Solicitud Internacional N.° PCT/EP02/ 05833, presentada el 29 de mayo de 2002. Esta solicitud tambien reivindica beneficio de las fechas de presentacion anteriores de Solicitudes de Patente de Reino Unido N.° 0113083.0, presentada el 30 de mayo de 2001 y 0204116.8, presentada el 21 Febrero de 2002.
La invencion se refiere a nuevas preparaciones antigenicas de virus de la gripe, a procedimientos para su preparacion y a su uso en la profilaxis o terapia de sujetos humanos. En particular, la invencion se refiere a vacunas de la gripe inactivadas que estan alteradas en lugar de a vacunas de virus enteros y que son estables en ausencia de conservantes organomercuricos. Ademas, las vacunas contienen hemaglutinina que es estable de acuerdo con ensayos convencionales. La presente invencion tambien se refiere al uso de composiciones inmunogenicas gripales sin conservantes mercuricos en la inmunizacion de ninos. Una composicion inmunogenica gripal sin conservante mercurico suscita una respuesta inmunitaria mas elevada en la poblacion pediatrica en comparacion con una composicion que contiene conservantes organomercuricos. Las vacunas pueden administrarse mediante cualquier via adecuada para administrar dichas vacunas, tal como a traves de la via intramuscular, subcutanea, intradermica o mucosa, por ejemplo, intranasal.
El virus de la gripe es uno de los virus mas ubicuos presentes en el mundo, que afecta tanto a seres humanos como al ganado. El impacto economico de la gripe es significativo. Los virus de la gripe circulan la mayona de los inviernos en regiones templadas y durante todo el ano en regiones tropicales. La gripe A y B poseen las glicoprotemas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), que cada ano evolucionan en un proceso de mutaciones puntuales, conocido como deriva antigenica. Esta alteracion continua de los virus de la gripe los permite evadir el sistema inmunitario del hospedador y es la razon por la cual la vacunacion contra la gripe estacional debe repetirse cada ano.
El virus de la gripe es un virus de ARN con envoltura, con un tamano de partmula de aproximadamente 125 nm de diametro. Consta basicamente en una nucleocapside interna o nucleo de acido ribonucleico (ARN) asociado con nucleoprotema, rodeado por una envoltura vmca con una estructura de bicapa lipfdica y glicoprotemas externas. La capa interna de la envoltura vmca esta compuesta predominantemente de protemas de matriz y la capa externa esta principalmente compuesta por material lipfdico procedente del hospedador. Las glicoprotemas de superficie, neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) aparecen como espigas, de 10 a 12 nm de longitud, en la superficie de las partmulas. Estas protemas de superficie son, particularmente la hemaglutinina, las que determinan la especificidad antigenica de los subtipos de la gripe.
Actualmente las vacunas de la gripe disponibles son vacunas de la gripe atenuadas vivas o inactivadas. Las vacunas gripales inactivadas estan compuestas de tres formas posibles de preparacion antigenica: virus enteros inactivados, subviriones en los que las partmulas purificadas de virus se alteran con detergentes u otros reactivos para solubilizar la envoltura lipfdica (denominada vacuna "fraccionada") o HA o NA purificada (vacuna subunitaria). Esas vacunas inactivadas se suministran por via intramuscular (i.m.) o intranasal (i.n.). En el comercio no se dispone de ninguna vacuna atenuada viva.
Las vacunas de la gripe, de todos los tipos, son normalmente vacunas trivalentes. Generalmente contienen antfgenos procedentes de dos cepas del virus de la gripe A y de una cepa del virus de la gripe B. En la mayona de los casos, Una dosis inyectable convencional de 0,5 ml contiene 15 |jg de componente antigenico de hemaglutinina de cada cepa, medida por inmunodifusion radial simple (SRD, single radial immunodiffusion) (J.M.Wood y col.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood y col., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330).
Las cepas del virus de la gripe a incorporar cada estacion en la vacuna de la gripe las determina la Organizacion Mundial de la Salud en colaboracion con las autoridades sanitarias nacionales y los fabricantes de vacunas.
Las epidemias tfpicas de la gripe hacen que aumente la frecuencia de la neumoma y de las enfermedades de las vfas respiratorias inferiores, como se observa por el aumento de las tasas de hospitalizacion o mortalidad. Las personas mayores o aquellas que padecen enfermedades cronicas subyacentes son mas probablemente las que padecen dichas complicaciones, aunque los ninos pequenos tambien pueden padecen enfermedades graves. Cada vez hay mas pruebas de que la gripe tiene un impacto significativo en los ninos. Las tasas de ataque mas altas de la gripe se producen en ninos y las tasas de morbilidad relacionadas con la gripe son las mas altas en este grupo de edad. Se considera tambien que los ninos son los principales transmisores de la gripe, ya que padecen las tasas de ataque mas altas del virus, tienen los tttulos nasofarmgeos mas altos del virus y muestran una duracion mas prolongada de presencia vmca. Por lo tanto, la vacunacion de los ninos contra la gripe impedina la morbilidad
asociada a la enfermedad y tambien podna tener un impacto sobre el "efecto colectivo" y disminuina el impacto de la gripe sobre la comunidad. Aparte de los efectos directos de la vacunacion sobre la salud de los propios ninos, sus contactos familiares y la comunidad mas amplia, tambien interviene un importante factor economico. De hecho, la morbilidad asociada a la gripe es responsable de tasas significativas de absentismo y perdida de productividad. Por 5 lo tanto, es necesario proteger a estos grupos en particular.
Los esfuerzos actuales para controlar la morbilidad y mortalidad asociadas a epidemias anuales de la gripe se basan en el uso de vacunas gripales inactivadas administradas por via intramuscular. La eficacia de dichas vacunas en la prevencion de enfermedades respiratorias y complicaciones por gripe, vana de 75 % en adultos sanos a menos de 50 % en ancianos.
10 Para medir la eficacia de las vacunas gripales, se aplican internacionalmente normas. Los criterios oficiales de la Union Europea para una vacuna eficaz contra la gripe se exponen mas adelante en la tabla. Teoricamente, para cumplir con los requisitos de la Union Europea, una vacuna contra la gripe debe cumplir solo uno de los criterios de la tabla, para todas las cepas de la gripe incluidas en la vacuna. Sin embargo, en la practica, para todas las cepas sera necesario cumplir al menos dos o los tres criterios, particularmente para una nueva vacuna, tal como una nueva
15 vacuna para el suministro mediante una via diferente. En algunas circunstancias basta con cumplir dos criterios. Por ejemplo, puede ser aceptable que se cumplan dos de los tres criterios en todas las cepas mientras que el tercer criterio se cumpla en algunas cepas pero no en todas (p. ej., dos de tres cepas). Los requisitos son diferentes para las poblaciones adultas (18-60 anos) y para las poblaciones ancianas (>60 anos).
18-60 anos >60 anos
Tasa de seroconversion*
>40 % >30 %
Factor de conversion*
>2,5 >2,0
Tasa de proteccion***
>70 % >60 %
* La tasa de seroconversion se define como el porcentaje de vacunados que tiene al menos un aumento multiplicado por 4 en los tftulos de inhibicion de hemaglutinina (IH) en suero despues de la vacunacion, para cada cepa de
vacuna.
** El factor de conversion se define como el aumento en veces en la media geometrica de los tftulos (GTM, Geometric Mean Titres) de IH en suero despues de la vacunacion, para cada cepa de vacuna. *** La tasa de proteccion se define como el porcentaje de vacunados con un tftulo de IH en suero igual a o mayor que 1:40 despues de la vacunacion (para cada cepa de vacuna) y esta normalmente aceptada como indicadora de
proteccion.
20 La FDA utiliza puntos de corte de edad ligeramente diferentes, pero sus criterios se basan en los criterios del CHMP (Committee for Medicinal Products for Human Use). Los criterios de valoracion apropiados incluyen de manera similar: 1) el porcentaje de sujetos que consigue un tftulo de anticuerpo IH >1:40, y 2) tasas de seroconversion, definidas como un aumento cuatro veces mayor en el tftulo de anticuerpos IH despues de la vacunacion. La media geometrica del tftulo (GTM) debe incluirse en los resultados, aunque los datos deben incluir no solo el punto 25 estimado, sino tambien el ftmite inferior del intervalo de confianza del 95 % de la tasa de frecuencia de seroconversion y la tasa de frecuencia el dfa 42 de tftulos IH >1:40 debe superar el valor objetivo. Por lo tanto, estos datos y los intervalos de confianza (IC) del 95% del punto estimado de estas evaluaciones deben proporcionarse. La grna del proyecto de la FDA requiere que se cumplan los dos objetivos. Esto se resume en la Tabla 1B.
18 - 64 anos > 64 anos
Tasa de seroconversion *
>40 % >30 %
Tasa de tftulos IH > 1:40
>70 % >60 %
* La tasa de seroconversion se define como: a) para sujetos con el tftulo basal > 1:10, un aumento 4 veces mayor o mas; o b) para sujetos con el tftulo basal < 1:10, un aumento a > 1:40. Estos criterios deben cumplirse en el ftmite inferior del IC del 95 % para el valor verdadero.
30 Para que una nueva vacuna gripal sea util desde el punto de vista comercial, no solo debera cumplir estos estandares, sino que tambien, en la practica, debera ser al menos tan eficaz como lo son las vacunas inyectables de las que se dispone actualmente. Tambien sera necesario que sea viable desde el punto de vista comercial en cuanto a la cantidad de antfgeno y al numero de administraciones requeridas.
Las vacunas de la gripe que estan actualmente disponibles en el comercio, son vacunas inyectables fraccionadas o 35 subunitarias. Estas vacunas se preparan alterando la partfcula de virus, generalmente con un disolvente organico o un detergente, y separando o purificando las protemas vfticas a diversos grados. Las vacunas fraccionadas se preparan por fraccionamiento de virus enteros de la gripe, bien infecciosos o inactivados, con concentraciones solubilizantes de disolventes organicos o detergentes y posterior retirada del agente solubilizante y de algo o de la
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mayona del material lipfdico vmco. Las vacunas fraccionadas generalmente contienen protemas de matriz y nucleoprotemas contaminantes y algunas veces lfpidos, as^ como las protemas de envoltura de membrana. Las vacunas fraccionadas normalmente contendran la mayor parte o todas las protemas estructurales del virus aunque no necesariamente en las mismas proporciones, como ocurre en el virus entero. Son ejemplos de vacunas fraccionadas disponibles en el comercio, por ejemplo, FLUARIX™, FLUSHIELD™ o FLUZONE™.
Por otro lado las vacunas subunitarias constan esencialmente de protemas de superficie vmcas altamente purificadas, opcionalmente hemaglutinina con neuraminidasa, que son las protemas de superficie responsables de suscitar los anticuerpos neutralizantes de virus deseado, despues de la vacunacion. Las vacunas subunitarias pueden tener una ventaja adicional sobre las vacunas de viriones completos, ya que generalmente son menos reactogenicas, particularmente en vacunados jovenes. Las vacunas subunitarias pueden producirse bien de manera recombinante o purificarse de partroulas vmcas alteradas. Son ejemplos de vacunas subunitarias disponibles en el comercio, por ejemplo, AGRIPPAL™, o FLUVIRIN™. En una realizacion espedfica, se preparan vacunas subunitarias a partir de al menos un componente de envoltura principal tal como de hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) o M2, adecuadamente a partir de HA. Adecuadamente estas comprenden combinaciones de dos antfgenos o mas, tal como una combinacion de al menos dos de las protemas estructurales de la gripe HA, NA, Matriz 1 (M1) y M2, adecuadamente una combinacion tanto de HA como de NA, comprendiendo opcionalmente M1. Adecuadamente, los componentes de la gripe se producen por tecnologfa de ADN recombinante, es decir, resultan de, o se expresan de, un acido nucleico resultante de manipulaciones de ADN recombinante, incluyendo un vector recombinante vivo (vacuna) o una protema subunitaria recombinante (baculovirus/celulas de insecto, celulas de mairnfero, celulas de ave, levaduras, plantas o bacterias). Son celulas de insecto adecuadas las celulas de insecto de Spodoptera frugiperda (Sf9) o celulas de insecto High Five (Hi5) desarrolladas por Trichoplusia ni (Invitrogen) y son baculovirus adecuados el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) (Baculogold, Becton Dickinson, PharMingen) o el sistema denominado Bacmido.
En una realizacion, la preparacion del virus de la gripe esta en forma de un virosoma. Los virosomas son vesroulas esfericas, unilaminares que conservan las glicoprotemas HA y NA funcionales de la envoltura vmca en una conformacion autentica, intercaladas en la membrana de la bicapa fosfolipfdica de los virosomas. Son ejemplos de vacunas de virosomas disponibles en el comercio, por ejemplo, iNfLEXAL V™ o INVAVAC™.
En otra realizacion, los componentes gripales subunitarios se expresan en forma de partroulas similares a virus (VLP, virus-like-particles) o capsomeros, fabricandose adecuadamente las VLP en celulas de plantas o de insectos. Las VLP presentan los anrtgenos en su forma nativa. La tecnologfa subunitaria de VLP puede basarse por completo en protemas gripales, o puede basarse en otros virus, tales como el virus de la leucemia murina (MLV, murine leukaemia virus) y por tanto puede comprender un antfgeno no gripal, tal como la protema gag del MLV. Una VLP adecuada comprende al menos una, adecuadamente al menos dos, protemas gripales, opcionalmente con otras protemas gripales o no gripales, tales como M1 y HA, HA y NA, HA, NA y M1 o HA, NA y la protema gag del MLV. Pueden producirse bien en celulas de plantas o en celulas de insectos. Las VLP tambien pueden llevar antfgenos de mas de una cepa de la gripe, tales como las VLP fabricadas a partir de dos cepas estacionales (p. ej., H1N1 y H3N2) o, por ejemplo, de una cepa estacional y una pandemica (p. ej., H3N2 y H5N1).
Muchas vacunas disponibles en la actualidad, requieren un conservante para prevenir el deterioro. Un conservante frecuentemente utilizado es el timerosal que es un compuesto que contiene mercurio. Se han comentado algunos problemas de interes publico sobre los efectos de los compuestos que contienen mercurio. En la actualidad no hay ningun sistema de supervision para detectar los efectos de dosis bajas a moderadas de los compuestos organomercuricos en el desarrollo del sistema nervioso, y estudios especiales realizados en ninos que han recibido altas dosis de compuestos organomercuricos, tardaran varios anos en completarse. Algunos analistas han resaltado que no debe exagerarse sobre los posibles peligros de las vacunas que contienen timerosal (Offit; P.A. JAMA Vol.283; N.°:16). No obstante, sena una ventaja descubrir procedimientos alternativos para la preparacion de vacunas que reemplacen el uso de tiomerosal en los procesos de elaboracion. Por tanto hay una necesidad de desarrollar vacunas exentas de timerosal, en particular vacunas como las de la gripe, que se recomiendan anualmente al menos para determinados grupos de poblacion.
Hasta ahora, ha habido una practica convencional para emplear un conservante para las vacunas gripales inactivadas, comerciales, durante los procesos de produccion/purificacion y/o en la vacuna final. El conservante se requiere para impedir el crecimiento de microorganismos a traves de las diversas etapas de purificacion. Para las vacunas gripales procedentes de huevo, tfpicamente se anade tiomersal al lfquido alantoideo en bruto y tambien puede anadirse una segunda vez durante el procesamiento del virus. Por tanto, al final del proceso, estara presente tiomersal residual, y adicionalmente este puede ajustarse a una concentracion deseable de conservante en la vacuna final, por ejemplo, a una concentracion de aproximadamente de 100 pg/ml.
Un efecto secundario del uso de timerosal como un conservante en las vacunas gripales es un efecto de estabilizacion. El timerosal en las vacunas gripales comerciales actua estabilizando el componente HA de la vacuna, en particular, pero no exclusivamente, la HA de la cepa B de la gripe. Determinadas hemaglutininas de la cepa A, por ejemplo, H3 tambien pueden requerir estabilizacion. Por lo tanto, aunque puede ser deseable considerar la retirada de tiomersal de las vacunas de la gripe, o al menos reducir su concentracion en la vacuna final, hay un problema que resolver puesto que sin tiomersal la HA no sera suficientemente estable.
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Los documentos WO2006/100110 y WO2008/128939 desvelan estudios clmicos en poblaciones de personas adultas o ancianas, ensayando vacunas gripales adyuvadas sin conservante mercurico, que comprenden hemaglutinina A y succinato de a-tocoferol en una cantidad suficiente para estabilizar dicha HA.
En la presente invencion se ha descubierto que es posible estabilizar la HA en preparaciones gripales inactivadas usando reactivos alternativos que no contengan compuestos organomercuricos. La HA continua estabilizada de tal manera que es detectable a lo largo del tiempo mediante procedimientos convencionales cuantitativos, en particular SRD, a un mayor grado que en una preparacion antigenica no estabilizada producida por el mismo procedimiento pero sin excipiente estabilizante. El procedimiento SRD se realiza como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Cabe destacar, que la HA permanece estabilizada durante hasta 12 meses, que es el estandar requerido de una vacuna gripal final.
Sorprendentemente tambien se ha descubierto que una vacuna gripal sin conservante mercurico suscita respuestas inmunitarias significativamente mejoradas en ninos. En comparacion con una vacuna gripal que contiene tiomersal, la vacuna sin tiomersal indujo en ninos tttulos de anticuerpos mas elevados (GTM), en todas las cepas ensayadas, y en particular para la cepa de la gripe H1N1 en la que el efecto fue especialmente notable. Ademas, los tres criterios del CHMP para la evaluacion de la inmunogenicidad de las vacunas de la gripe en adultos, solo se cumplieron tanto en ninos de 6 a 35 meses como en los que teman de 36 meses a <6 anos en el grupo ST (sin tiomersal). En el grupo de control, solo se cumplieron los criterios SCR (tasa de seroconversion, seroconversion rate) y SCF (factor de seroconversion, seroconversion factor) en los dos grupos de edades.
En un primer aspecto, la presente invencion proporciona una composicion inmunogenica sin conservante mercurico para uso en la profilaxis de una infeccion o enfermedad gripal en un nino entre 6 meses y 36 meses de edad, comprendiendo dicha composicion una preparacion acuosa de virus de la gripe inactivado que comprende hemaglutinina (HA) y succinato de a-tocoferol en una cantidad suficiente para estabilizar dicha HA, en la que la preparacion es una preparacion antigenica de virus fraccionado o subunitario y es una preparacion de virus de gripe trivalente que comprende la HA de 2 cepas A y de 1 cepa B o una preparacion de virus de la gripe tetravalente que comprende la HA de 2 cepas A y de 2 cepas B y en la que la composicion no comprende un adyuvante.
Niveles bajos de tiomersal son aquellos niveles en los que se reduce la estabilidad de la HA procedente de la gripe B, de tal manera que para estabilizar la HA, se requiere un excipiente estabilizante que tenga niveles bajos de tiomersal, generalmente de 5 pg/ml o menores.
Generalmente, HA estabilizada se refiere a HA que es detectable a lo largo del tiempo mediante procedimientos estandar cuantitativos, en particular SRD, a un mayor grado que una preparacion antigenica no estabilizada producida por el mismo procedimiento, pero sin ningun excipiente estabilizante. La estabilizacion de la HA mantiene preferentemente la actividad de la HA sustancialmente constante durante un penodo de un ano. Preferentemente, la estabilizacion permite que la vacuna comprenda HA para proporcionar una proteccion aceptable despues de un penodo de conservacion de 6 meses, mas preferentemente un penodo de un ano.
Adecuadamente, la estabilizacion se realiza con un excipiente estabilizante, preferentemente un excipiente modificador de micela. Un excipiente modificador de micela es generalmente un excipiente que puede incorporarse en una micela formada por detergentes que se utilizan, o que son adecuados, para solubilizar la protema HA de la membrana, tales como los detergentes Tween 80, Triton X100 y desoxicolato, individualmente o en combinacion.
Sin desear limitarse a la teona, se piensa que los excipientes actuan estabilizando la HA por interaccion con los lfpidos, detergentes y/o protemas en la preparacion final. Pueden formarse micelas mixtas de excipientes con protemas y lfpidos, tales como micelas de Tween y desoxicolato con lfpidos residuales y/o Triton X-100. Se piensa que las protemas de superficie se mantienen solubilizadas por estas micelas complejas. Preferentemente, la agregacion de protemas esta limitada por la repulsion de carga de micelas que contienen excipientes adecuados, tales como micelas que contienen detergentes con carga negativa.
Como excipientes modificadores de micelas adecuados se incluyen: moleculas anfifflicas con carga positiva, negativa o zwitterionicas, tales como alquilsulfatos o alquilarilsulfatos; moleculas anfifflicas no ionicas tales como alquilpoliglicosidos o derivados de los mismos, tales como Plantacare® (disponible en Henkel KGaA) o polialquilen eteres de alcohol alqrnlico o derivados de los mismos, tales como Laureth-9.
Particularmente se prefiere succinato de a-tocoferol. El succinato de a-tocoferol esta presente en una cantidad suficiente para estabilizar la hemaglutinina.
Otros excipientes adecuados pueden identificarse por procedimientos convencionales en la tecnica, y pueden someterse a ensayo, por ejemplo, usando el procedimiento SRD para analisis de estabilidad como se describe en el presente documento.
De manera adecuada se utiliza una dosis de vacuna de 0,5 ml. Para la poblacion pediatrica, se utiliza una dosis de vacuna menor de 0,5 ml. Una dosis adecuada oscila entre 0,2 y 0,45 ml, o entre 0,2 y 0,3 ml, tfpicamente es de aproximadamente 0,25 ml. Dependiendo de la concentracion de HA en la muestra original sin procesar, podran hacerse de manera habitual ligeras adaptaciones del volumen de la dosis, o dependiendo de la via de administracion se daran dosis mas pequenas mediante la via intranasal o intradermica, o dependiendo de la poblacion en cuestion
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(p. ej., ninos entre 0 y 35 meses pueden recibir una dosis de vacuna de 0,25 ml, mientras que ninos de 3 anos pueden recibir una dosis de vacuna mas alta).
En otra realizacion, la poblacion objeto de vacunacion son ninos entre 6 y 36 meses, especialmente ninos de 6 y 23 meses que padecen una tasa de hospitalizacion relativamente alta relacionada con la gripe.
La vacuna puede administrate mediante cualquier via de administracion adecuada, tal como la via intradermica, mucosa, intranasal, oral, intramuscular o subcutanea. En la tecnica se conocen otras v^as de administracion.
Se prefiere la administracion intradermica. Puede usarse cualquier dispositivo adecuado para la administracion intradermica, por ejemplo, dispositivos de aguja corta, tales como los descritos en los documentos US 4.886.499, US 5.190.521, US 5.328.483, US 5.527.288, US 4.270.537, US 5.015.235, US 5.141.496 y US 5.417.662. Las vacunas intradermicas tambien pueden administrarse con dispositivos que limitan la longitud de la aguja para una penetracion eficaz en la piel, tales como los descritos en los documentos WO99/34850 y EP1092444, incorporados en el presente documento por referencia, y equivalentes funcionales de los mismos. Tambien son adecuados los dispositivos de inyeccion por chorro que suministran vacunas lfquidas a la dermis mediante un inyector de chorro lfquido o mediante una aguja que perfora el estrato corneo y produce un chorro que alcanza a la dermis. Se describen dispositivos de inyeccion por chorro, por ejemplo, en los documentos US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520.639, US 4.596.556 US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Tambien son adecuados los dispositivos de suministro balfsticos en polvo/partfcula que utilizan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a traves de las capas externas de la piel a la dermis. Adicionalmente, en el procedimiento de Mantoux clasico de administracion intradermica pueden usarse jeringas convencionales. Sin embargo, el uso de jeringas convencionales requiere personal muy cualificado y, por tanto, se prefieren dispositivos que puedan administrar de forma precisa sin necesidad de personal muy cualificado.
La divulgacion tambien proporciona un procedimiento para la profilaxis de infecciones o enfermedades causadas por gripe un sujeto cuyo procedimiento comprende administrar al sujeto, por via intradermica, una vacuna contra la gripe de acuerdo con la invencion.
La invencion tambien se amplfa a dispositivos intradermicos en combinacion con el uso de una vacuna de acuerdo con la presente invencion, en particular con dispositivos desvelados, por ejemplo, en los documentos WO99/ 34850 o EP1092444.
La invencion se aplica particularmente, pero no exclusivamente, a la estabilizacion de la hemaglutinina de la gripe de la cepa B.
Preferentemente la HA estabilizada de la presente invencion es estable durante 6 meses, mas preferentemente 12 durante meses.
Las concentraciones preferidas para el a-tocoferol o sus derivados, oscilan entre 1 pg/ml y 10 mg/ml, mas preferentemente entre 10 pg/ml y 500 pg/ml.
La vacuna de acuerdo con la invencion contiene generalmente antfgenos de virus tanto de la cepa A como de la cepa B, tfpicamente en una composicion trivalente de dos cepas A y de una cepa B. Las vacunas tetravalentes tambien se contemplan, en particular vacunas que comprenden: i) dos cepas A (p. ej., H3N2 y H1N1) y dos cepas B de diferente linaje (p. ej., B/Yamagata y B/Victoria), ii) tres cepas A (p. ej., H3N2, dos H1N1; o H3N2, H1N1, H5N1) y una cepa B.
El componente HA en la composicion inmunogenica puede seleccionarse del grupo que consiste en: H1, H2, H3, H5, H7 y H9.
En una realizacion, cada dosis pediatrica para la composicion inmunogenica contiene 15 pg de HA por cepa de virus de la gripe, medida por inmunodifusion radial simple (SRD) (JM Wood y col., J. Biol. Stand 5 (1977) 237- 247, JM Wood y col., J. Biol. Stand 9 (1981) 317-330). En otra realizacion, se utiliza una dosis baja de hemaglutinina (HA), definida como una cantidad menor de 15 pg de HA por dosis, adecuadamente menor de 10 pg. En una realizacion espedfica, la dosis pediatrica de la composicion inmunogenica comprende una dosis de hemaglutinina (HA) por cepa a un nivel de aproximadamente 10 pg, por ejemplo, entre 5 y 15 pg, adecuadamente entre 6 y 14 pg, por ejemplo, entre 7 y 13 pg o entre 8 y 12 pg o entre 9 y 11 pg, o 10 pg. En una realizacion adicional, la dosis humana de la composicion inmunogenica comprende una dosis de hemaglutinina (HA) por cepa a un nivel de aproximadamente 5 pg, por ejemplo, entre 1 y 9 pg, o entre 2 y 8 pg o adecuadamente entre 3 y 7 pg o 4 y 6 pg, o 5 pg. Las cantidades adecuadas son 1,9 pg, 2,5 pg, 3,8 pg, 5,0 pg, 7,5 pg o 10 pg de HA o cualquier cantidad adecuada de HA inferior a 15 pg que debe haberse determinado de tal manera que la composicion de la vacuna cumpla los criterios de eficacia definidos en el presente documento. Ventajosamente, puede utilizarse una dosis de HA de 1 pg o incluso menor, tal como de 0,5 pg de HA, que permita cumplir los criterios reguladores. Una cantidad adecuada de HA es, por ejemplo, cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, pg (p/v) por cepa de virus de la gripe por dosis humana de la composicion inmunogenica. Dicha cantidad baja de HA puede ser tan baja como
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sea factible siempre que permita formular una vacuna que cumpla las normas internacionales, por ejemplo, criterios de eficacia de la EU o la FDA.
La preparacion antigenica gripal no viva para su uso en la invencion, puede seleccionarse del grupo que consiste en preparaciones antigenicas de virus fraccionados y de antigenos subunitarios (expresados de manera recombinante o preparados a partir de virus enteros). La preparacion antigenica es una preparacion de virus fraccionado, o un antigeno subunitario preparado a partir de virus enteros, particularmente mediante un proceso de fraccionamiento seguido de purificacion del antigeno de superficie. Las preparaciones de virus fraccionados son las mas preferidas. Otras preparaciones preferidas son las preparaciones de virus subunitarios.
Preferentemente la concentracion del antigeno hemaglutinina para la cepa o para cada una de las cepas de la preparacion de virus de la gripe es de 1-1000 |jg por ml, mas preferentemente de 3-300 |jg por ml y lo mas preferentemente de aproximadamente 30 jg por ml, medida con un ensayo SRD.
Las vacunas de acuerdo con la invencion comprenden adicionalmente al menos un tensioactivo que puede ser en particular un tensioactivo no ionico. El tensioactivo no ionico adecuado se selecciona del grupo que consiste en octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (p. ej., las series Triton™ disponibles en el comercio), esteres de polioxietileno de sorbitan (series Tween™) y eteres o esteres de polioxietileno de formula general (I):
(I) HO(CH2CH2O)n-A-R
en la que n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C1-50 o alquil fenilo C1-50; y combinaciones de dos o mas de estos.
Los tensioactivos preferidos que se incluyen en la formula (I) son moleculas en las que n es 4-24, mas preferentemente 6-12, y lo mas preferentemente 9; el componente R es alquilo C1-50, preferentemente alquilo C4-C20 y lo mas preferentemente alquilo C12.
Los octilfenoxi polioxietanoles y los esteres de polioxietileno de sorbitan se describen en "Surfactant systems" Eds: Attwood and Florence (1983, Chapman and Hall). Los octilfenoxi polioxietanoles (los octoxinoles), incluyendo el t- octilfenoxi polietoxietanol (Triton X-100™) tambien se describen en Merck Index Entry 6858 (Pag. 1162, 12a Edicion, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3). Los esteres de polioxietileno de sorbitan, incluyendo el monooleato de polioxietileno de sorbitan (Tween 80™) se describen en Merck Index Entry 7742 (Pag. 1308, 12a Edicion, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3). Ambos pueden fabricarse usando procedimientos descritos en el presente documento, o pueden adquirirse en proveedores comerciales tales como Sigma Inc.
Los tensioactivos no ionicos particularmente preferidos incluyen Triton X-45, t-octilfenoxi polietoxietanol (Triton X- 100), Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N-57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, 9-lauril eter de polioxietileno (lauret 9) y 9-estearil eter de polioxietileno (estearet 9). Particularmente se prefiere Triton X-100 y lauret 9. Tambien se prefiere particularmente el ester de polioxietileno de sorbitan, el monooleato de polioxietileno de sorbitan (Tween 80TM.
Otros eteres de polioxietileno adecuados de formula general (I) se seleccionan del siguiente grupo: 8-estearil eter de polioxietileno, 4-lauril eter de polioxietileno, 35-lauril eter de polioxietileno y 23-lauril eter de polioxietileno.
En el registro CAS se desvelan terminos o nombre alternativos de los lauril eteres de polioxietileno. El numero de registro CAS del 9-lauril eter de polioxietileno es: 9002-92-0. Los eteres de polioxietileno, tales como lauril eter de polioxietileno, se describen en el mdice Merck (12a ed: entrada 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3). El Lauret 9 se forma haciendo reaccionar el oxido de etileno con alcohol dodedlico, y tiene un promedio de nueve unidades de oxido de etileno.
En la formulacion de la vacuna del presente documento puede haber dos o mas tensioactivos no ionicos de los diferentes grupos de tensioactivos descritos. En particular, se prefiere una combinacion de un ester de polioxietileno de sorbitan, tal como monooleato de polioxietileno sorbitan (Tween 80TM) y un octoxinol, tal como t-octil fenoxi polietoxietanol (Triton) X-100TM. Otra combinacion particularmente preferida de tensioactivos no ionicos comprende lauret 9 y un ester de polioxietileno de sorbitan o un octoxinol o ambos.
Los tensioactivos no ionicos, como los desvelados anteriormente, tienen las siguientes concentraciones preferidas en la composicion de la vacuna final: esteres de polioxietileno de sorbitan, tal como Tween 80TM: de 0,01 a 1 %, siendo lo mas preferido aproximadamente 0,1 % (p/v); octil o nonilfenoxi polioxietanoles, tales como Triton X-100TM u otros detergentes de la serie Triton: de 0,001 a 0,1 %, mas preferentemente de 0,005 a 0,02% (p/v); eteres de polioxietileno de formula general (I), tal como lauret 9: de 0,1 a 20%, preferentemente de 0,1 a 10% y lo mas preferentemente de 0,1 a 1 % o aproximadamente de 0,5 % (p/v).
Para determinadas formulaciones de vacuna, en la formulacion pueden incluirse otros componentes de vacuna Como tales, las formulaciones de la presente invencion tambien pueden comprender un acido biliar o un derivado del mismo, en particular en forma de una sal. Estos incluyen derivados de acido colico y sus sales, en particular
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sales de sodio de acido colico o derivados de acido colico. Como ejemplos de acidos biliares y derivados de los mismos se incluyen acido colico, acido desoxicolico, acido quenodesoxicolico, acido litocolico, acido ursodexocolico, acido hiodesoxicolico y derivados tales como derivados de glico-, tauro-, amidopropil-1-propanosulfonico-, amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfonico de los acidos biliares anteriormente mencionados, o N, N-bis (3Dgluconoamidopropil) desoxicolamina. Un ejemplo particularmente preferido es el desoxicolato de sodio (NaDOC) que puede estar presente en la dosis de la vacuna final.
La divulgacion tambien proporciona kits farmaceuticos que comprenden un dispositivo para la administracion de vacunas cargado con una vacuna para su uso de acuerdo con la invencion. Dichos dispositivos de administracion incluyen, pero sin limitacion, dispositivos de aguja, dispositivos de chorro lfquido, dispositivos para polvos, y dispositivos pulverizadores (para uso intranasal).
Las preparaciones antfgenas del virus de la gripe de acuerdo con la invencion pueden obtenerse con procedimiento convencional de cultivo en un huevo embrionado, o pueden obtenerse con cualquiera de los procedimientos de nueva generacion usando un cultivo tisular para cultivar el virus o expresar los antigenos de superficie del virus de la gripe recombinantes. Los sustratos celulares adecuados para el crecimiento del virus incluyen, por ejemplo, celulas de rinon de perro tales como MDCK o celulas de un clon de MDCK, celulas similares a MDCK, celulas de rinon de mono tales como celulas AGMK incluyendo celulas Vero, lmeas celulares porcinas adecuadas, o una celula de cualquier otro mairnfero, adecuada para la produccion de virus de la gripe con fines vacunales. Los sustratos celulares adecuados tambien incluyen celulas humanas, por ejemplo, celulas MRC-5 o la lmea celular Per.C6, y tambien se incluyen celulas y lmeas celulares de ave, tales como lmeas celulares de pollo y pato (p. ej., la lmea celular EBx® tal como EB14®, EB24® o EB66® procedente de celulas madre embrionarias de pollo o pato). Se prefiere particularmente la lmea celular EB66®. Otras celulas de insecto adecuadas son Sf9 o Hi5. Los sustratos celulares adecuados no se limitan a lmeas celulares; por ejemplo, tambien se incluyen celulas primarias, tales como fibroblastos de embrion de pollo.
La preparacion antigenica del virus de la gripe puede realizarse mediante cualquiera de los diversos procesos aplicables en el comercio, por ejemplo, el proceso de fraccionamiento del virus de la gripe descrito en las patentes n.° DD 300 833 y DD 211 444, incorporadas en el presente documento por referencia. Tradicionalmente, el fraccionamiento del virus de la gripe se produjo usando un tratamiento con disolvente/detergente, tal como tri-n-butil fosfato, o eter dietflico en combinacion con Tween™ (conocido como fraccionamiento con “Tween-eter”) y este proceso se usa aun en algunas instalaciones de produccion. Otros agentes de fraccionamiento empleados en la actualidad incluyen detergentes o enzimas proteolfticas o sales biliares, por ejemplo, desoxicolato de sodio, como se describe en la patente n.° DD 155 875, incorporada en el presente documento por referencia. Los detergentes que pueden usarse como agentes de fraccionamiento incluyen detergentes cationicos, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), otros detergentes ionicos, por ejemplo, laurilsulfato, taurodesoxicolato, o detergentes no ionicos, tales como los descritos anteriormente incluyendo Triton X-100 (p. ej., en el proceso descrito en Lina y col., 2000, Biologicals 28, 95-103) y Triton N-101, o combinaciones de cualquiera de dos o mas detergentes.
El proceso de preparacion de una vacuna fraccionada incluira diversas etapas de filtracion y/o separacion diferentes, tales como etapas de ultracentrifugacion, ultrafiltracion, centrifugacion zonal y cromatograffa (p. ej., de intercambio ionico) en una variedad de combinaciones, y opcionalmente, una etapa de inactivacion. p. ej, con calor, formaldetndo o p-propiolactona o U.V. que puede realizarse antes o despues del fraccionamiento. El proceso de fraccionamiento puede realizarse como un proceso discontinuo, continuo o semicontinuo.
Las preparaciones antigenicas de vacuna gripal fraccionada de acuerdo con la invencion, comprenden una cantidad residual de Tween 80 y/o de Triton X-100 que quedan de los procesos de produccion, aunque estas pueden anadirse o sus concentraciones pueden ajustarse despues de la preparacion del antfgeno fraccionado. Preferentemente tanto el Tween 80 como el Triton X-100 estan presentes. Los intervalos preferidos para las concentraciones finales de estos tensioactivos no ionicos en la dosis de vacuna son:
Tween 80: de 0,01 a 1 %, mas preferentemente de aproximadamente 0,1 % (v/v)
Triton X-100: de 0,001 a 0,1 % (p/v), mas preferentemente de 0,005 a 0,02 % (p/v).
Como alternativa las separaciones antigenicas del virus de la gripe de acuerdo con la invencion pueden proceder de una fuente que no sea el virus de la gripe vivo, por ejemplo, el antfgeno hemaglutinina puede producirse de manera recombinante.
A continuacion se describira la invencion en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparacion de una preparacion antigenica de virus de la gripe usando succinato de a-tocoferol como un estabilizador para una vacuna sin conservante (vacuna reducida en tiomersal)
De acuerdo con el siguiente procedimiento se preparo una vacuna fraccionada monovalente.
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Preparacion del inoculo del virus
El dfa de la inoculacion de huevos embrionados, se preparo un inoculo reciente mezclando el lote de semillas de trabajo con una solucion salina tamponada con fosfato que contema sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a 25 pg/ml (dependiente de cepa del virus). El inoculo del virus se mantuvo a 2-8 °C.
Inoculacion de huevos embrionados
Para la replicacion del virus se usaron huevos embrionados de nueve a once dfas de vida. Las cascaras se descontaminaron. Los huevos se inocularon con 0,2 ml de inoculo de virus. Los huevos inoculados se incubaron a la temperature apropiada (dependiente de la cepa del virus) durante 48 a 96 horas. Al final del penodo de incubacion, los embriones se destruyeron con enfriamiento y los huevos se mantuvieron durante 12-60 horas a una temperatura de 2-8 °C.
Recogida
El lfquido alantoideo de los huevos embrionados enfriados se recogio. Normalmente se recogieron de 8 a 10 ml de lfquido alantoideo crudo por huevo.
Concentracion y purificacion de virus entero del liquido alantoideo
1. Clarificacion
El lfquido alantoideo recogido se clarifico con centrifugacion a velocidad moderada (intervalo: 4.000-14.000 g).
2. Etapa de adsorcion
Para obtener un gel de CaHPO4 en el grupo de virus clarificado se anadieron soluciones de Na2HPO4 0,5 mol/l y CaCl2 0,5 mol/l para obtener una concentracion final de CaHPO4 de 1,5 g a 3,5 g de CaHPO4/litro dependiendo de la cepa del virus.
Despues de la sedimentacion durante al menos 8 horas, el sobrenadante se retiro y el sedimento que contema el virus de la gripe se resolubilizo por adicion de una solucion de EDTA-Na2 0,26 mol/l, dependiendo de la cantidad de CaHPO4 utilizada.
3. Filtracion
El sedimento resuspendido se filtro en una membrana de filtro de 6 pm.
4. Centrifugacion en gradiente de sacarosa
El virus de la gripe se concentro por centrifugacion isopfcnica en un gradiente de sacarosa lineal (0,55 % (p/v)) que contema tiomersal 100 pg/ml. El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final de la centrifugacion, el contenido del rotor se recupero mediante cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se midio en un refractometro):
- fraccion 1 sacarosa 55-52 %
- fraccion 2 sacarosa aproximadamente 52-38 %
- fraccion 3 sacarosa 38-20 *
- fraccion 4 sacarosa 20-0 %
* Dependiente de la cepa del virus: la fraccion 3 puede reducirse a sacarosa al 15 %.
Para la preparacion de la vacuna posterior, se usaron solo las fracciones 2 y 3.
La fraccion 3 se lavo mediante diafiltracion con tampon fosfato para reducir el contenido de sacarosa a aproximadamente por debajo del 6 %. El virus de la gripe presente en esta fraccion diluida se sedimento para retirar los contaminantes solubles.
El sedimento se resuspendio y se mezclo cuidadosamente para obtener una suspension homogenea. La fraccion 2 y el sedimento resuspendido de la fraccion 3 se agruparon y se anadio tampon fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros. Este producto es el concentrado de virus entero monovalente.
5. Centrifugacion en gradiente de sacarosa con desoxicolato de sodio
El concentrado de virus de la gripe completo monovalente se aplico a una ultracentnfuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente de sacarosa lineal (0,55 % (p/v)) en el que se superpuso adicionalmente un gradiente de desoxicolato de sodio. Durante el fraccionamiento el Tween 80 estaba presente hasta el 0,1 % (p/v) y para virus de la cepa B se anadio succinato de tocoferol hasta 0,5 mM. La concentracion maxima de desoxicolato de sodio es de
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30
0,7-1,5 % (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final de la centrifugacion, el contenido del rotor se recupero mediante tres fracciones diferentes (la sacarosa se midio en un refractometro). La fraccion 2 se uso para procesamiento posterior. El contenido de sacarosa para los lfmites de la fraccion (47-18 %) vana de acuerdo con las cepas y se fija despues de la evaluacion:
6. Filtracion esteril
La fraccion de virus fraccionado se filtro en membranas de filtro que acaban con una membrana de 0,2 pm. Para la dilucion se uso tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,5 mM (para virus de cepa B). El volumen final de la fraccion 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fraccion original.
7. Inactivacion
El material monovalente filtrado se incubo a 22 ± 2 °C durante a lo sumo 84 horas (dependiendo de las cepas del virus, esta incubacion puede acortarse). El tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) se anadio despues para reducir el contenido proteico total hasta un maximo de 250 pg/ml. Para los virus de cepa B, para la dilucion se aplico una solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,25 mM para reducir el contenido total de protema hasta 250 pg/ml. Se anadio formaldehndo a una concentracion final de 50 pg/ml y la inactivacion se produjo a 20 °C ± 2 °C durante al menos 72 horas.
8. Ultrafiltracion
El material de virus fraccionado inactivado se concentro al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltracion, equipada con membranas de acetato de celulosa con un MWCO (por las siglas Molecular Weigh Cut-Off, peso molecular nominal lfmite) de 20 kDa. Posteriormente el material se lavo con tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y despues con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween al 0,01 % (p/v). En virus de la cepa B, para el lavado, se uso una solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,01 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,1 mM.
9. Filtracion esteril final
Despues de la ultrafiltracion el material se filtro en membranas de filtro que acababan con una membrana de 0,2 pm. Las membranas de filtro se aclararon y el material se diluyo, si fuera necesario, de tal manera que la concentracion proteica no superase 500 pg/ml, con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,01 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,1 mM (para virus de la cepa B)
10. Conservacion
El volumen final monovalente se conservo a 2-8 °C durante un maximo de 18 meses.
Estabilidad
Tabla 1. Comparacion del contenido (pg/ml) de HA dependiente del tiempo medido por RSD en volumenes finales
monovalentes.
Cepa
Estabilizador Despues de la produccion 4 semanas a 30 °C 6 meses a 2-8 °C 12 meses a 2-8 °C
B/Yamanashi/166/98
Succinato de tocoferol (mercurio residual 3 pg/ml) 169 139 (82 %) 172 (> 100 %) ND
B/Yamanashi/166/98
Tiomersal (108 pg/ml) 192 160 (83 %) 186 (97 %) 178 (93 %)
B/Yamanashi/166/98
Ninguno (mercurio residual 3 pg/ml) 191 122 (60 %) 175 (92 %) 154 (81 %)
B/Johannesburgo/5/99
Succinato de tocoferol (mercurio residual 4 pg/ml) 166 183 (> 100 %) 158 (95 %) 179(> 100 %)
B/Johannesburgo/5/99
Succinato de tocoferol 167 179 158 178
(mercurio residual 4 pg/ml) (> 100 %) (95 %) (> 100 %)
B/Johannesburgo/5/99
Succinato de tocoferol (mercurio residual 3 pg/ml) 144 151 (> 100 %) 130 (90 %) 145(> 100 %)
(continuacion)
Cepa
Estabilizador Despues de la produccion 4 semanas a 30 °C 6 meses a 2-8 °C 12 meses a 2-8 °C
B/Johannesburgo/5/99*
Tiomersal 159 ND 172 (> 100 %) 154 (97 %)
B/Johannesburgo/5/99**
Ninguno 169 107 (63 %) 153 (90 %) EC
* producido de acuerdo con FLUARIX ™ autorizado**, producido de acuerdo con el ejemplo 1 sin succinato de tocoferol, EC: En curso, ND no determinado
Ejemplo 2 - Preparacion de la vacuna de la gripe usando succinato de a-tocoferol como un estabilizador para una vacuna reducida en tiomersal
5 Se produjeron volumenes finales monovalentes de tres cepas, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166/98 de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
Agrupamiento
Las cantidades apropiadas de volumenes finales monovalentes se agruparon a una concentracion final de HA de 30 10 |jg/ml para A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2)-17, respectivamente y de 39
|jg/ml para B/Yamanashi/166/98. Se ajustaron Tween 80 y Triton X-100 a 580 jg/ml y a 90 jg/ml respectivamente. El volumen final se ajusto a 31 con solucion salina tamponada con fosfato. El grupo trivalente se filtro finalizando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 jm para obtener el volumen final trivalente. El volumen final trivalente se cargo en jeringas, al menos 0,5 ml en cada una.
15 Tabla 2. Comparacion del contenido de HA dependiente del tiempo medido por SRD (inmunodifusion radial simple)
en volumenes finales trivalentes que se recupero de las jeringas.
Formulacion de la vacuna
Cepa 0 meses 2 meses 4 meses 6 meses
Vacuna de la gripe sin estabilizador
A/NCal/20/99 33 (32-34) 32 (31-33) 36 (34-38) 31 (30-32)
A/Pan/2007/99
29 (27-31) 31 (28-34) 34 (32-36) 32 (31-33)
B/Yam/166/98
36 (34-38) 33 (32-34) 32 (30-34) 31 (29-33)
Vacuna de la gripe que contiene succinato de alfa tocopherol
A/NCal/20/99 31 (30-32) 32 (31-33) 36 (34-38) 32 (31-33)
A/Pan/2007/99
33 (30-36) 33 (30-36) 36 (35-37) 33 (31-35)
B/Yam/166/98
37 (35-39) 36 (34-38) 38 (35-41) 36 (33-39)
Ejemplo 3 - Procedimiento SRD utilizado para medir el contenido de hemaglutinina
Se revistieron placas de vidrio (12,4-10,0 cm) con un gel de agarosa que contema una concentracion de suero anti- 20 HA de la gripe que esta recomendado por el NIBSC (The National Institute for Biological Standards and Control). Despues del asentamiento del gel, en la agarosa se perforaron 72 pocillos de muestra (3 mm 0). En los pocillos se cargaron 10 microlitros de diluciones apropiadas de la referencia y de la muestra. Las placas se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente (de 20 a 25 °C) en una camara con humedad. Despues de esto, las placas se impregnaron durante una noche con solucion de NaCl y se lavaron brevemente en agua destilada. Despues, el gel 25 se presiono y se seco. Cuando estuvieron completamente secas, las placas se tineron con una solucion de Azul Brillante de Coomassie durante 10 min y se destineron dos veces en una mezcla de metanol y acido acetico hasta que las zonas tenidas claramente definidas se hadan visibles. Despues de secar las placas, el diametro de las zonas tenidas que rodeaba los pocillos con antfgeno se midio en dos direcciones a angulos rectos. Como alternativa, para medir la superficie puede utilizarse un aparato.
30 Se construyeron curvas de respuesta a la dosis de las diluciones antigenicas frente al area de la superficie y los resultados se calcularon de acuerdo con procedimientos de ensayo convencionales de proporcion frente a pendiente (Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin,
Ejemplo 4 Ensayo clinico de la vacuna de la gripe estabilizada con a-tocoferol (reducida en tiomersal)
Para el ensayo clrnico se utilizaron lasjeringas obtenidas como se describe en el Ejemplo 2.
H3N2: A/Panama/2007/99 RESVIR-17 H1N1: A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 5 B: B/Yamanashi/166/98
Tabla 3
Adultos de 18 a 60 anos
reducida en tiomersal con tiomersal
H3N2 H1N1 B H3N2 H1N1 B
pre-
GMT 47 41 111 55 37 102
vacun.
Tftulo <10 [%] 10,3 % 13,8 % 1,7 % 5,3 % 12,3 % 8,8 %
Tftulo > 40, SPR [%] 60,3 % 55,2 % 75,9 % 70,2 % 52,6 % 75,4 %
pos-
Tasa de seroconversion [%] 10,3 % 13,8 % 1,7 % 5,3 % 12,3 % 8,8 %
vacun.
Aumento significativo en el Tftulo de anticuerpos [%] 58,6 % 74,1 % 58,6 % 63,2 % 73,7 % 52,6 %
H3N2 H1N1 B H3N2 H1N1 B
Seroconversiones [%] 58,6 % 74,1 % 58,6 % 63,2 % 73,7 % 52,6 %
GMT 328 525 766 324 359 588
Factor GMT 7,3 13,0 6,9 5,9 9,8 5,9
Tftulo >40, SPR [%] 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
n.d. = El I.C. para la proporcion p=n/N no esta definido porque p*(1-p)*N < 9 n/N = respondedores (n) como parte de numero de sujetos de la subpoblacion (N), es decir, seroconversiones o aumento significativo, vease tambien: CPMAP/BWP/214/96 12 de marzo de 1997, p.17ff GMT = media geometrica de los tftulos, redproco I.C. 95 % = intervalo de confianza de 95 % SPR = Tasa de seroproteccion: proporcion de sujetos con un tftulo protector pre- o posvacunacion >40 tftulo = tftulo de anticuerpo-HI Tasa de seroconversion = proporcion de sujetos con aumento de anticuerpo de <10 prevacunacion a >40 posvacunacion Factor GMT = aumento en veces de GMT Aumento significativo = proporcion de sujetos con un tftulo de anticuerpos >10 prevacunacion y aumento multiplicado por 4 de anticuerpos posvacunacion (dos etapas de tftulo) req. = requisito EU Seroconversiones = negativo a positivo o g.e. 4 veces (neg: tftulo<10, pos: tftulo>40) = proporcion de sujetos con seroconversion (<10 a >40) o aumento significativo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Los resultados muestran que la vacuna puede ofrecer una proteccion equivalente a la de las vacunas que contienen tiomersal como conservante.
Ejemplo 5a Preparacion de una preparacion antigenica de virus de la gripe utilizando succinato de a- tocoferol como un estabilizador para una vacuna sin tiomersal
De acuerdo con el siguiente procedimiento se preparo una vacuna fraccionada monovalente:
Preparacion del inoculo del virus
El dfa de la inoculacion de huevos embrionados se preparo un inoculo reciente mezclando el lote de semillas de trabajo con una solucion salina tamponada con fosfato que contema sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a 25 pg/ml (dependiente de la cepa del virus). El inoculo del virus se mantuvo a 2-8 °C.
Inoculacion de huevos embrionados
Para la replicacion del virus se utilizaron huevos embrionados de nueve a once dfas de vida. Las cascaras se descontaminaron. Los huevos se inocularon con 0,2 ml inoculo de virus. Sesenta mil (60.000) huevos inoculados se incubaron a la temperatura apropiada (dependiente de la cepa del virus) durante 48 a 96 horas. Al final del penodo de incubacion, los embriones se destruyeron por enfriamiento y los huevos se conservaron durante 12-60 horas a una temperatura de 2-8 °C.
Recogida
El lfquido alantoideo de los huevos embrionados enfriados se recogio. Normalmente se recogieron de 8 a 10 ml de lfquido alantoideo crudo por huevo.
Concentracion y purificacion de virus entero del liquido alantoideo
1. Clarificacion
El lfquido alantoideo recogido se clarifico con centrifugacion a velocidad moderada (intervalo: 4.000-14.000 g).
Etapa de precipitacion
Al conjunto de virus clarificado se anadio una solucion saturada de sulfato de amonio para alcanzar una concentracion final de sulfato de amonio de 0,5 mol/l. Despues de la sedimentacion durante al menos 1 hora, el precipitado se retiro por filtracion en filtros profundos (tfpicamente de 0,5 pm)
Filtracion
El volumen del virus entero crudo clarificado se filtro en membranas de filtro que terminaban con una membrana esteril homologada (tfpicamente de 0,2 pm).
Ultrafiltracion
El volumen del virus entero monovalente crudo filtrado esteril se concentro al menos 6 veces en un casete dotado de una membrana BIOMAX™ con un MWCO de 1.000 kDa. La fraccion retenida concentrada se lavo con solucion salina tamponada con fosfato al menos 1,8 veces.
Centrifugacion en gradiente de sacarosa
El virus de la gripe se concentro mediante centrifugacion isopfcnica en un gradiente de sacarosa lineal (0,55 % (p/v)). El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final de la centrifugacion, el contenido del rotor se recupero por cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se midio en un refractometro):
- fraccion 1 sacarosa 55-52 %
- fraccion 2 sacarosa aproximadamente 52-38 %
- fraccion 3 sacarosa 38-20 *
- fraccion 4 sacarosa 20-0 %
* Dependiente de la cepa del virus: la fraccion 3 puede reducirse a sacarosa al 15 %.
Para una preparacion de vacuna posterior, se utilizo solo la fraccion 2 o la fraccion 2 junto con una fraccion 3 purificada adicional.
La fraccion 3 se lavo por diafiltracion con tampon fosfato para reducir el contenido de sacarosa a aproximadamente por debajo del 6 %. Opcionalmente esta etapa puede omitirse. El virus de la gripe presente en esta fraccion diluida se sedimento para retirar los contaminantes solubles.
5
10
15
20
25
30
35
40
El sedimento se resuspendio y se mezclo cuidadosamente para obtener una suspension homogenea. La fraccion 2 y el sedimento resuspendido de la fraccion 3 se agruparon y se anadio tampon fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros. Este producto es el concentrado de virus entero monovalente.
Centrifugacion en gradiente de sacarosa con desoxicolato de sodio
El concentrado de virus de la gripe completo monovalente se aplico a una ultracentnfuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente de sacarosa lineal (0,55 % (p/v)) en el que se superpuso adicionalmente un gradiente de desoxicolato de sodio. Durante el fraccionamiento el Tween 80 estaba presente hasta el 0,1 % (p/v) y para virus de la cepa B se anadio succinato de tocoferol hasta 0,5 mM. La concentracion maxima de desoxicolato de sodio es de 0,7-1,5 % (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final de la centrifugacion, el contenido del rotor se recupero mediante tres fracciones diferentes (la sacarosa se midio en un refractometro). La fraccion 2 se uso para procesamiento posterior. El contenido de sacarosa para los lfmites de la fraccion (47-18 %) vana de acuerdo con las cepas y se fija despues de la evaluacion:
Filtracion esteril
La fraccion de virus fraccionado se filtro en membranas de filtro que acaban con una membrana de 0,2 pm. Para la dilucion se uso tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,5 mM (para virus de cepa B). El volumen final de la fraccion 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fraccion original.
Inactivacion
El material monovalente filtrado se incubo a 22 ± 2 °C durante a lo sumo 84 horas (dependiendo de las cepas de virus, esta incubacion puede acortarse). Despues se anadio tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) para reducir el contenido proteico total hasta un maximo de 450 pg/ml. Para las cepas B se aplico una solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,25 mM para dilucion para reducir el contenido proteico total a 450 pg/ml. Se anadio formaldehndo a una concentracion final de 100 pg/ml y la inactivacion se produjo a 20 °C ± 2 °C durante al menos 72 horas.
Ultrafiltracion
El material de virus fraccionado inactivado se concentro al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltracion, dotada de membranas de acetato de celulosa con un MWCO de 20 kDa. Posteriormente el material se lavo con tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y despues con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween al 0,01 % (p/v). Para los virus de la cepa B, se uso una solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,01 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,1 mM.
Filtracion esteril final
Despues de la ultrafiltracion el material se filtro en membranas de filtro que acababan con una membrana de 0,2 pm. Las membranas de filtro se aclararon y el material se diluyo, si fuera necesario, de tal manera que la concentracion de la protema no superase 500 pg/ml con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,01 % (p/v) y, espedfico para cepas B, succinato de tocoferol 0,1 mM.
Conservacion
El volumen final monovalente se conservo a 2-8 °C durante un maximo de 18 meses.
Estabilidad
Tabla 4. Comparacion del contenido de HA dependiente del tiempo (pg/ml) medido por SRD en volumenes finales
monovalentes.
Cepa
Estabilizador Despues de la produccion 4 semanas a 30°C 6 meses a 2-8°C
B/Johannesburgo/5/99
Succinato de tocoferol 214 196 (92 %) 206 (96 %)
B/Johannesburgo/5/99**
Ninguno 169 107 (63 %) 153 (90 %)
** producido de acuerdo con el ejemplo 1 sin succinato de tocoferol.
Ejemplo 5b - Preparacion de una preparacion antigenica de virus de la gripe usando succinato de a-tocoferol como un estabilizador para una vacuna sin tiomersal
Una variacion preferida del procedimiento descrito en el Ejemplo 5a es la siguiente:
A la recogida del virus entero le sigue una etapa de precipitacion (precipitacion con sulfato de amonio). A esto le sigue una etapa de clarificacion en la que el lfquido se clarifica con centrifugacion a velocidad moderada (intervalo de 4.000-14.000 g). Por tanto, el orden de las etapas de precipitacion y clarificacion se invirtieron en comparacion con el Ejemplo 5a.
5 Se sigue las etapas de filtracion esteril, ultrafiltracion y ultracentrifugacion (centrifugacion en gradiente de sacarosa) del ejemplo 5a. Sin embargo, no se requiere la etapa de reprocesado de las fracciones resultantes de la etapa de ultracentrifugacion.
Las etapas restantes del proceso son como se describe en el Ejemplo 5a.
Por tanto, el proceso resumido en este ejemplo es de la siguiente manera:
10 Recogida
Precipitacion (sulfato de amonio)
Clarificacion Filtracion esteril Ultrafiltracion
15 Ultracentrifugacion
Fraccionamiento (preferiblemente con desoxicolato de sodio)
Filtracion esteril
Inactivacion
Ultrafiltracion
20 Filtracion esteril final
Otra variacion preferida del Ejemplo 5a implica una etapa de prefiltracion antes de la filtracion esteril. Esta utiliza una membrana que no filtra de manera esteril pero que permite la retirada de contaminantes, por ejemplo, albumina, antes de la filtracion esteril. Esto puede dar como resultado un mejor rendimiento. Una membrana adecuada para la 25 prefiltracion es una de aproximadamente 0,8 pm a aproximadamente 1,8 pm, por ejemplo, de 1,2 pm. La etapa de prefiltracion puede usarse en el esquema del Ejemplo 5a o del Ejemplo 5b.
Ejemplo 6 - Preparacion de la vacuna de la gripe utilizando succinato de a-tocoferol como un estabilizador para una vacuna sin tiomersal
Se produjeron volumenes finales monovalentes de tres cepas A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, 30 A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166/98 de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo
5.
Agrupamiento
Las cantidades apropiadas de volumenes finales monovalentes se agruparon a una concentracion final de HA de 30 pg/ml para A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2)-17, respectivamente y de 36 35 pg/ml para B/Yamanashi/166/98. Se ajustaron Tween 80 y Triton X-100 a 580 pg/ml y a 90 pg/ml respectivamente. El volumen final se ajusto a 31 con solucion salina tamponada con fosfato. El grupo trivalente se filtro acabando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 pm para obtener el volumen final trivalente. El volumen final trivalente se cargo en jeringas, al menos 0,5 ml en cada una.
Tabla 5. Comparacion del contenido de HA dependiente del tiempo (pg/ml) medido por SRD en volumenes finales 40 trivalentes.
Formula de vacuna
Cepa 0 meses 4 meses a 30 °C 6 meses a 2-8 °C
Vacuna de la gripe sin estabilizador
A/NCal/20/99 31 32 30
A/Pan/2007/99
31 34 33
B/Joh/5/99*
35 25 31
Vacuna de la gripe que contiene succinato de alfa tocoferol
A/NCal/20/99 34 35 34
A/Pan/2007/99
33 33 34
B/Joh/5/99**
29 25 28
*La formulacion se baso en la concentracion diana de 39 pg/ml. **La formulacion se baso en la concentracion diana de 34 pg/ml.___________________________________________________________________________________
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 7 - Preparacion de una preparacion antigenica de virus de la gripe utilizando laurilsulfato de sodio como un estabilizador para una vacuna sin conservante (vacuna reducida en tiomersal)
El concentrado de virus entero monovalente de B/Johannesburgo/5/99 se obtuvo como se describe en el Ejemplo 1.
Centrifugacion en gradiente de sacarosa con desoxicolato de sodio
El concentrado de virus de la gripe completo monovalente se aplico a una ultracentnfuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente de sacarosa lineal (0,55 % (p/v)) en el que se superpuso adicionalmente un gradiente de desoxicolato de sodio. Durante el fraccionamiento el Tween 80 estaba presente hasta el 0,1 % (p/v). La concentracion maxima de desoxicolato de sodio es de 0,7-1,5 % (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final de la centrifugacion, el contenido del rotor se recupero mediante tres fracciones diferentes (la sacarosa se midio en un refractometro). La fraccion 2 se uso para procesamiento posterior. El contenido de sacarosa para los lfmites de la fraccion (47-18 %) vana de acuerdo con las cepas y se fija despues de la evaluacion:
Filtracion esteril
Se tomo una muestra de 10 ml de la fraccion 2 para procesamiento posterior. La fraccion de virus fraccionado se filtro en membranas de filtro que terminaban con una membrana de 0,2 pm. Para la dilucion se utilizo tampon fosfato que contema 0,025 % (p/v) de Tween 80 y laurilsulfato sodico 0,5 mM. El volumen final de la fraccion filtrada 2 es 5 veces el volumen de la fraccion original.
Inactivacion
El material monovalente filtrado se incubo a 22 ± 2 °C durante a lo sumo 84 horas (dependiendo de las cepas del virus, esta incubacion puede acortarse). Se anadio despues solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y laurilsulfato de sodio 0,5 mM para reducir el contenido de protema total hasta un maximo de 250 pg/ml. Se anadio formaldelmdo a una concentracion final de 50 pg/ml y la inactivacion se produjo a 20 °C ± 2 °C durante al menos 72 horas.
Ultrafiltracion
El material de virus fraccionado inactivado se concentro al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltracion, dotada con membranas de acetato de celulosa con un MWCO de 20 kDa. El material se lavo posteriormente con 4 volumenes de solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween al 0,01 % (p/v) laurilsulfato de sodio 0,5 mM.
Filtracion esteril final
El material despues de la ultrafiltracion se filtro en membranas de filtro que acababan con una membrana de 0,2 pm. Las membranas de filtro se aclararon y el material se diluyo si fuera necesario de tal manera que la concentracion de la protema no superase 500 pg/ml con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,01 % (p/v) y laurilsulfato de sodio 0,5 mM.
Conservacion
El volumen final monovalente se conservo a 2-8 °C.
Tabla 7. Comparacion del contenido de HA dependiente del tiempo medido por SRD en volumenes finales
monovalentes.
estabilizador Despues de la produccion 4 semanas a 30 °C
B/Johannesburgo/5/99
Ninguno* 182 139 (77 %)
B/Johannesburgo/5/99
Lauril sulfato de sodio 288 264 (92 %)
* producido de acuerdo con el Ejemplo 7 sin adicion de lauril sulfato de sodio
Ejemplo 8 - Preparacion de una preparacion antigenica de virus de la gripe utilizando Plantacare o Lauret-9 como un estabilizador para una vacuna sin conservante (vacuna reducida en tiomersal)
El concentrado de virus entero monovalente B/Yamanashi/166/98 se obtuvo como se describe en el Ejemplo 1.
Fragmentacion
El concentrado del virus de la gripe completo monovalente se diluyo a una concentracion de protema de 1.000 pg/ml con solucion salina tamponada con fosfato pH 7,4. Se anadio Plantacare® 2000 UP o Lauret-9 a una concentracion
5
10
15
20
25
30
35
40
final de 1 % (p/v). El material se mezclo ligeramente durante 30 minutos. Despues, el material se aplico sobre un amortiguador de sacarosa al 15 % (p/p) en una cubeta. La ultracentrifugacion se realizo en un rotor Beckman SW 28 oscilante durante 2 horas a 25.000 rpm y a una temperature de 20 °C.
Filtracion esteril
Se tomo un sobrenadante para procesamiento posterior. La fraccion de virus membrana que terminaban con una membrana de 0,2 pm.
Inactivacion
Se anadio solucion salina tamponada con fosfato si fuera necesario para reducir el un maximo de 500 pg/ml. Se anadio formaldehndo a una concentracion final de 100 a una temperatura de 20 °C ± 2 °C durante al menos 6 dfas.
Ultrafiltracion
El Tween 80 y el Triton X 100 se ajustaron en el material inactivado a 0,15 % y 0,02 % respectivamente. El material de virus fraccionado inactivado se concentro al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltracion, dotada de membranas de acetato de celulosa con un MWCO de 30 kDa. Posteriormente el material se lavo posteriormente con 4 volumenes de solucion salina tamponada con fosfato.
Filtracion esteril final
Despues de la ultrafiltracion el material se filtro en membranas de filtro que terminaban con una membrana de 0,2 pm. Las membranas de filtro se aclararon y el material se diluyo de tal manera que la concentracion proteica no superaba 500 pg/ml con solucion salina tamponada con fosfato.
Conservacion
El volumen final monovalente se conservo a 2-8 °C.
Tabla 8. Comparacion del contenido de HA dependiente del tiempo medido por SRD en volumenes finales
monovalentes.
Estabilizador Despues de la produccion 4 semanas a 30 °C
B/Yamanashi/166/98
Ninguno 143 98 (68 %)
B/Yamanashi/166/98
Plantacare® 2000 UP 476 477(100%)
B/Yamanashi/166/98
Lauret-9 468 494 (> 100 %)
fracciono se filtro en filtros de
contenido de proterna total hasta pg/ml y la inactivacion se produjo
Ejemplo 9 - Ensayo clinico de la vacuna de la gripe estabilizada con a-tocoferol (reducida en tiomersal) en ancianos por administracion ID e IM
A Preparacion de una preparacion antigenica de virus de la gripe
La vacuna fraccionada monovalente se preparo de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Preparacion del inoculo del virus
El dfa de la inoculacion de huevos embrionados se preparo un inoculo reciente mezclando el lote de semillas de trabajo con una solucion salina tamponada con fosfato que conterna sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a 25 pg/ml (dependiente de la cepa del virus). El inoculo del virus se mantuvo a 2-8 °C.
Inoculacion de huevos embrionados
Para la replicacion del virus se utilizaron huevos embrionados de nueve a once dfas de vida. Las cascaras se descontaminaron. Los huevos se inocularon con 0,2 ml inoculo de virus. Los huevos inoculados se incubaron a la temperatura apropiada (dependiente de la cepa del virus) durante 48 a 96 horas. Al final del penodo de incubacion, los embriones se destruyeron por enfriamiento y los huevos se conservaron durante 12-60 horas a una temperatura de 2-8 °C.
Recogida
El lfquido alantoideo de los huevos embrionados enfriados se recogio. Normalmente se recogieron de 8 a 10 ml de lfquido alantoideo crudo por huevo.
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Concentracion y purificacion del virus entero del liquido alantoideo
1. Clarificacion
El Kquido alantoideo recogido se clarifico con centrifugacion a velocidad moderada (intervalo: 4.000-14.000 g).
2. Etapa de adsorcion
Para obtener un gel de CaHPO4 en el grupo de virus clarificado se anadieron soluciones de Na2HPO4 0,5 mol/l y CaCl2 0,5 mol/l para obtener una concentracion final de CaHPO4 de 1,5 g a 3,5 g de CaHPO4/litro dependiendo de la cepa del virus.
Despues de la sedimentacion durante al menos 8 horas, el sobrenadante se retiro y el sedimento que contema el virus de la gripe se resolubilizo por adicion de una solucion de EDTA-Na2 0,26 mol/l, dependiendo de la cantidad de CaHPO4 utilizada.
3. Filtracion
El sedimento resuspendido se filtro en una membrana de filtro de 6 pm.
4. Centrifugacion en gradiente de sacarosa
El virus de la gripe se concentro por centrifugacion isopfcnica en un gradiente de sacarosa lineal (0,55 % (p/v)) que contema tiomersal 100 pg/ml. El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final de la centrifugacion, el contenido del rotor se recupero mediante cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se midio en un refractometro):
- fraccion 1 sacarosa 55-52 %
- fraccion 2 sacarosa aproximadamente 52-38 %
- fraccion 3 sacarosa 38-20 *
- fraccion 4_____sacarosa 20-0 %__________________________________________
* Dependiente de la cepa del virus: la fraccion 3 puede reducirse a sacarosa al 15 %.
Para la preparacion de la vacuna posterior, se usaron solo las fracciones 2 y 3.
La fraccion 3 se lavo mediante diafiltracion con tampon fosfato para reducir el contenido de sacarosa a aproximadamente por debajo del 6 %. El virus de la gripe presente en esta fraccion diluida se sedimento para retirar los contaminantes solubles.
El sedimento se resuspendio y se mezclo cuidadosamente para obtener una suspension homogenea. La fraccion 2 y el sedimento resuspendido de la fraccion 3 se agruparon y se anadio tampon fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros, un volumen apropiado para 120.000 huevos/lote. Este producto es el concentrado de virus entero monovalente.
5. Centrifugacion en gradiente de sacarosa con desoxicolato de sodio
El concentrado de virus de la gripe completo monovalente se aplico a una ultracentnfuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente de sacarosa lineal (0,55 % (p/v)) en el que se superpuso adicionalmente un gradiente de desoxicolato de sodio. Durante el fraccionamiento el Tween 80 estaba presente hasta el 0,1 % (p/v) y para virus de la cepa B se anadio succinato de tocoferol hasta 0,5 mM. La concentracion maxima de desoxicolato de sodio es de 0,7-1,5 % (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final de la centrifugacion, el contenido del rotor se recupero mediante tres fracciones diferentes (la sacarosa se midio en un refractometro). La fraccion 2 se uso para procesamiento posterior. El contenido de sacarosa para los lfmites de la fraccion (47-18 %) vana de acuerdo con las cepas y se fija despues de la evaluacion:
6. Filtracion esteril
La fraccion de virus fraccionado se filtro en membranas de filtro que acaban con una membrana de 0,2 pm. Para la dilucion se uso tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,5 mM (para virus de cepa B). El volumen final de la fraccion 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fraccion original.
7. Inactivacion
El material monovalente filtrado se incubo a 22 ± 2 °C durante a lo sumo 84 horas (dependiendo de las cepas del virus, esta incubacion puede acortarse). El tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) se anadio despues para reducir el contenido proteico total hasta un maximo de 250 pg/ml. Para los virus de cepa B, para la
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dilucion se aplico una solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,25 mM para reducir el contenido total de protema hasta 250 pg/ml. Se anadio formaldelmdo a una concentracion final de 50 pg/ml y la inactivacion se produjo a 20 °C ± 2 °C durante al menos 72 horas.
8. Ultrafiltracion
El material de virus fraccionado inactivado se concentro al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltracion, equipada con membranas de acetato de celulosa con un MWCO de 20 kDa. Posteriormente el material se lavo con tampon fosfato que contema Tween 80 al 0,025 % (p/v) y despues con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween al 0,01 % (p/v). En virus de la cepa B, para el lavado, se uso una solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,01 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,1 mM.
9. Filtracion esteril final
Despues de la ultrafiltracion, el material se filtro en membranas de filtro que acababan con una membrana de 0,2 pm. Las membranas de filtro se aclararon y el material se diluyo, si fuera necesario, de tal manera que la concentracion proteica no superase 1.000 pg/ml aunque la concentracion de hemaglutinina superaba 180 pg/ml con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 0,01 % (p/v) y succinato de tocoferol 0,1 mM (para virus de la cepa B).
10. Conservacion
El volumen final monovalente se conservo a 2-8 °C durante un maximo de 18 meses.
B Preparacion de la vacuna de la gripe
Se produjeron volumenes finales monovalentes de tres cepas, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/ 2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Johannesburgo/5/99 de acuerdo con el procedimiento descrito en la parte A anterior.
Agrupamiento
Las cantidades apropiadas de volumenes finales monovalentes se agruparon a una concentracion final de HA de 60 pg/ml para A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2)-17, respectivamente y de 68 pg/ml para B/Yamanashi/166/98. Se ajustaron Tween 80, Triton X-100 y succinato de tocoferol a 1.000 pg/ml, 110 pg/ml y 160 pg/ml, respectivamente. El volumen final se ajusto a 31 con solucion salina tamponada con fosfato. El grupo trivalente se filtro acabando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 pm para obtener el volumen final trivalente. El volumen final trivalente se cargo en jeringas, al menos 0,165 ml en cada una.
Administracion de la vacuna
La vacuna se suministro en jeringas precargadas y se administro por via intradermica en la region deltoidea. La aguja intradermica (ID) era como se describe en el documento EP1092444, que tema un limitador de penetracion cutanea para garantizar una inyeccion intradermica correcta. Dado que la formacion de una roncha (papula) en el lugar de la inyeccion demuestra la buena calidad de la administracion ID, el investigador midio el tamano exacto de la roncha en el sujeto 30 minutos despues de la vacunacion.
Una dosis (100 pl) contema los siguientes componentes:
HEMAGLUTININA DE TRES CEPAS DE LA GRIPE
A/NUEVA CALEDONIA/20/99 6,0 pg
A/PANAMA/2007/99 6,0 pg
B/JOHANNESBURGO 5/99 6,0 pg
CONSERVANTE TIOMERSAL
0,4 pg -0,8 pg
B La vacuna anterior se comparo con una vacuna de la gripe fragmentada trivalente convencional: Fluarix™. La vacuna Fluarix se suministro en jeringas precargadas y se administro por via intramuscular en el musculo deltoides. Se uso una aguja de al menos 2,5 cm/25,4 mm (1 pulgada) de longitud (calibre 23) para garantizar una inyeccion intramuscular correcta.
Una dosis (0,5 ml) contema los siguientes componentes:
HEMAGLUTININA DE TRES CEPAS DE LA GRIPE
A/NUEVA CALEDONIA/20/99 15,0 pg
A/PANAMA/2007/99 15,0 Mg
B/JOHANNESBURGO 5/99 15,0 Mg
CONSERVANTE TIOMERSAL
50,0 Mg
Resultados
La edad promedio de la cohorte total en el momento de administracion de la vacuna fue de 70,4 ± Desviacion tfpica (D.T.) de 6,2 anos, la proporcion de hombre/mujer fue de 1,7:1.
Resultados de inmunogenicidad: El analisis de las variables de inmunogenicidad derivadas fue el siguiente:
Variable
Flu-red ID (N=65) Fluarix™ IM (N=65)
GMT
GMT LI LS GMT LI LS
A/NUEVA CALEDONIA
PRE 99,5 76,9 128,7 90,0 70,1 115,7
POST 165,1 129,2 211,0 174,3 133,3 227,9
a/panamA
PRE 75,5 54,7 104,2 69,2 51,9 92,4
POST 128,6 99,1 166,8 164,3 126,0 214,1
B/JOHANNESBURGO
PRE 236,0 187,7 296,8 222,6 176,9 280,2
POST 341,2 276,0 421,7 402,4 312,1 518,9
Tasa de seroconversion
% LL UL % LL UL
A/NUEVA CALEDONIA
15,4 7,6 26,5 18,5 9,9 30,0
a/panamA
20,0 11,1 31,8 29,2 18,6 41,8
B/JOHANNESBURGO
9,2 3,5 19,0 16,9 8,8 28,3
Factor de conversion
GMR LL UL GMR LL UL
A/NUEVA CALEDONIA
1,7 1,4 2,0 1,9 1,6 2,3
a/panamA
1,7 1,4 2,1 2,4 1,9 3,0
B/JOHANNESBURGO
1,4 1,2 1,7 1,8 1,5 2,1
A/NUEVA CALEDONIA
PRE 87,7 77,2 94,5 90,8 81,0 96,5
POST 92,3 83,0 97,5 96,9 89,3 99,6
a/panamA
PRE 75,4 63,1 85,2 81,5 70,0 90,1
POST 90,8 81,0 96,5 93,8 85,0 98,3
B/JOHANNESBURGO
PRE 98,5 91,7 100,0 96,9 89,3 99,6
POST 100,0 94,5 100,0 98,5 91,7 100,0
N: numero de sujetos con resultados disponibles; %: Porcentaje de sujetos dentro del parametro determinado; LI/LS: lfmite inferior y superior del IC del 95 %; Pre: en el momento de la administracion de la vacuna; Pos: 21 dfas despues de la dosis de la vacuna.
El dolor en el lugar de la inyeccion, referido por las persona vacunadas 10/65 (15,4 %), fue el smtoma mas normal 5 despues de la administracion IM de Fluarix™. En el grupo de administracion ID, 3/65 (4,6 %) de las personas vacunadas refirieron dolor. Esta diferencia fue estadfsticamente significativa (p=0,038; ensayo exacto de Fisher). Por consiguiente, se prefiere el suministro por via ID de un producto reducido en tiomersal.
Conclusiones
Tanto la administracion ID como la IM de una vacuna gripal reducida en tiomersal en una poblacion anciana puede 10 proporcionar una seroproteccion del 100 %.
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Se encontro una respuesta comparable a la vacunacion en terminos de media geometrica de t^tulos, tasas de seroproteccion, tasas de seroconversion y factores de conversion, en individuos vacunados por v^a IM e ID, en la que el grupo vacunado por via ID recibio 2,5 veces menos antigeno.
En los dos grupos de tratamiento, no hubo ninguna diferencia perceptible en la incidencia global de los smtomas sistemicos esperados/inesperados relacionados con la vacuna.
Ejemplo 10 - Suministro intradermico de una vacuna gripal reducida en tiomersal
Se evaluo la inmunogenicidad de la vacuna gripal fragmentada reducida en tiomersal preparada como se describe en el Ejemplo 9 (salvo que el agrupamiento se realizo independientemente y que la vacuna no se cargo en jeringas) mediante suministro ID en cobayas usando una aguja convencional.
Grupos de 5 animales cada uno se sensibilizaron por via intranasal con el virus de la gripe trivalente completamente inactivado que contema 5/pg de cada HA en un volumen total de 200 pl. Veintiocho dfas despues de la sensibilizacion, los animales se vacunaron por via intradermica o intramuscular. Las dosis intradermicas, que
conteman 0,1, 0,3 o 1,0 pg de vacuna gripal fragmentada reducida en tiomersal trivalente en un volumen de 0,1 ml,
se administraron en el dorso de la cobaya usando una aguja convencional. En la pata trasera de la cobaya se administro una dosis intramuscular de 1,0 pg de vacuna gripal fragmentada reducida en tiomersal trivalente, en un volumen de 0,1 ml. Los grupos fueron los siguientes:
• Grupo 1 - 0,1 pg de vacuna gripal fragmentada reducida en tiomersal trivalente por via ID
• Grupo 2- 0,3 pg de vacuna gripal fragmentada reducida en tiomersal trivalente por via ID
• Grupo 3-1,0 pg de vacuna gripal fragmentada reducida en tiomersal trivalente por via IM
• Grupo 4-1,0 pg de vacuna gripal fragmentada reducida en tiomersal trivalente por via IM
Catorce dfas despues de la vacunacion se extrajo la sangre de los animales y usando un ensayo de inhibicion de hemaglutinina (IH) convencional se evaluaron los tftulos de los anticuerpos inducidos por la vacunacion. Los resultados se muestran en la Figura 1. La vacunacion indujo fuertes respuestas de IH fuertes en las tres cepas. No se observo ninguna respuesta clara a la dosis, lo que sugena que dosis muy bajas de antfgeno reducido en tiomersal pueden incluso inducir respuestas de anticuerpos IH muy fuertes cuando se administran por la via ID. No hubo diferencias significativas entre los tftulos IH inducidos por vacunacion ID o IM. Por tanto, los resultados obtenidos en cobayas confirmaron que los antfgenos gripales fragmentados trivalentes reducidos en timerosal indudan niveles similares de anticuerpos IH en animales cuando se suministraban por via ID en comparacion con la via IM.
Ejemplo 11 - Suministro intradermico de una vacuna de la gripe adyuvantada, reducida en tiomersal
Protocolo
Los cobayas se sensibilizaron el dfa 0 con 5 pg de virus de la gripe trivalente completamente inactivado en 200 pl, por via intranasal.
Vacunacion - Dfa 28 - La vacuna contema 0,1 pg de HA por cepa de virus de la gripe fragmentado trivalente como se describe en el Ejemplo 9 (excepto que la etapa de agrupamiento produjo una concentracion final para cada antfgeno de 1,0 pg/ml para dar una dosis de 0,1 pg en 100 pl en comparacion con los 60 pg/ml del Ejemplo 9). La formacion trivalente final se administro por via intradermica usando jeringas para tuberculina, adyuvantada o no adyuvantada, en 100 pl.
Extraccion de sangre - Dfa 42.
El efecto de la adyuvantacion se evaluo midiendo las respuestas de los anticuerpos mediante un ensayo de inhibicion de hemaglutinina, IH (dfas 0, 28, 42).
Todos los experimentos por via ID se realizaron usando una aguja convencional.
Resultados
G1-G5 se refieren a 5 grupos de cobayas, 5 por grupo.
G1 Reducido en tiomersal trivalente fragmentado 0,1 pg G2 Red. tio trivalente fragmentado 0,1 pg + 3D-MPL 50 pg G3 Red tio trivalente fragmentado 0,1 pg + 3D-MPL 10 pg
G4 Red tio trivalente fragmentado 0,1 |jg + 3D-MPLin 50 |jg + QS21 50 |jg
G5 Red tio trivalente fragmentado 0,1 jig + 3D-MPLin 10 jg + QS21 10 jig
Observese que 3D-MPLin + QS21 se refieren a una formulacion de adyuvante que comprende una vesfcula unilamelar que comprende colesterol, que tiene una bicapa lipfdica que comprende dioleoil fosfatidilcolina, en la que 5 el QS21 y el 3D-MPL se asocian con, o estan embebidos dentro de, la bicapa lipfdica. Dichas formulaciones de adyuvante se describen en el documento EP 0 822 831 B, cuya divulgacion se incorpora en el presente documento por referencia.
Tftulos IH anti-A-Nueva Caledonia/20/99
NC
Pre-inmun Pre-refuerzo Pos-refuerzo
G1
5 10 92
G2
5 10 70
G3
5 11 121
G4
7 9 368
G5
5 10 243
10 Tftulos IH anti-A/Panama/2007/99
P
Pre-inmun Pre-refuerzo Pos-refuerzo
G1
5 485 7760
G2
5 279 7760
G3
5 485 8914
G4
7 485 47051
G5
5 320 17829
Tftulos IH anti-B/Johannesburgo/5/99
J
Pre-inmun Pre-refuerzo Pos-refuerzo
G1
5 23 184
G2
5 11 121
G3
5 11 70
G4
6 15 557
G5
5 13 320
Por tanto, tanto adyuvantado como no adyuvantado el antigeno gripal fragmentado trivalente reducido en tiomersal es un fuerte inmunogeno y es capaz de inducir fuertes respuestas IH cuando se administra por via ID o IM. Estas 15 respuestas parecen ser al menos tan potentes como las respuestas inducidas por la preparacion Fluarix convencional.
Ejemplo 12 - Comparacion de vacunas con y sin tiomersal suministradas por via intradermica a cerdos.
Para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna gripal fragmentada (con y sin tiomersal) administrada por via ID, se utilizo el modelo de cerdo sensibilizado. Dado que la inmensa mayona de la poblacion habfa sufrido al menos una 20 infeccion con gripe, una vacuna contra la gripe debena ser capaz de reforzar una respuesta inmunitaria preexistente. Por lo tanto los animales se sensibilizaron con la intencion de simular mejor la situacion en seres humanos.
En este experimento se sensibilizaron cerdos de 4 semanas de vida por via intranasal. Seis grupos de cinco animales cada uno se sensibilizaron de la siguiente manera:
Grupo 1 - dos sensibilizaciones de virus inactivado completo trivalente (50 pg cada HA) el dfa 0 y 14; Grupo 2 - dos sensibilizaciones de virus inactivado completo trivalente (50 pg cada HA) el dfa 0 y 14; Grupo 3 - una sola sensibilizacion con virus inactivado completo trivalente (50 pg cada HA) el dfa 0; Grupo 4 - dos sensibilizaciones de virus inactivado entero trivalente (25 pg cada HA) el dfa 0 y 14; Grupo 5 - una sola sensibilizacion de virus 5 inactivado completo trivalente (25 pg cada HA) el dfa 0; Grupo 6 - dos sensibilizaciones de virus inactivado
completo trivalente (12,5 pg cada HA) el dfa 0 y 14.
El dfa 28 posterior a la sensibilizacion final, los animales se vacunaron con 3 pg de cada antigeno fragmentado trivalente Ha (cepas A/Nueva Caledonia H1N1, A/Panama H3N2 y B/Johannesburgo) en 100 pl por via ID. El Grupo 1 recibio Fluarix™ convencional que contema conservante tiomersal como antfgeno de vacuna. Los grupos restantes 10 recibieron el antfgeno sin conservante.
Los resultados del ensayo de inhibicion de hemaglutinina, IH, obtenidos en este experimento se muestran en la Figura 2 (Tftulos de inhibicion de hemaglutinacion anti-gripe inducidos en cerdos sensibilizados con diversas dosis de antfgeno y vacunados con 3 microgramos de antfgeno de la gripe trivalente con o sin tiomersal por via intradermica).
15 En este experimento se indujeron tftulos IH relativamente bajos contra la cepa B y el fondo contra la cepa A/ H3N2 es alto. Se observo un efecto beneficioso en cuanto a la respuesta a la vacunacion cuando se reducfa la dosis de sensibilizacion. En casi todos los casos, la reduccion en la concentracion de antfgeno o en el numero de dosis de sensibilizacion (a partir de las dos sensibilizaciones con 50 pg) produjo una respuesta intensificada a la vacunacion. Aunque la respuesta de los animales en los Grupos 1 y 2, que se sensibilizaron dos veces con 50 pg, a la 20 vacunacion no era tan evidente, parecfa que el antfgeno sin conservante (Grupo 2) funcionaba al menos tan bien como Fluarix™ (Grupo 1) en estas condiciones. Una respuesta fuerte a la vacunacion con el antfgeno de la gripe trivalente sin conservante administrado mediante la via iD en los animales alternativamente sensibilizados (Grupos 3-6) es clara y esta respuesta se observa incluso en la cepa B, aunque los tftulos IH permanecen bajos.
Ejemplo 13 - Estudio en fase III, comparativo, aleatorizado, con ocultacion doble, en ninos de 6 meses a <6 25 anos
13.1 Procedimientos
13.1.1 Diseno del estudio
En este estudio se incluyo a ninos con una edad comprendida entre 6 meses a menos de 6 anos, con o sin una enfermedad cronica subyacente, y que nunca habfan sido vacunados contra la gripe.
30 Se administraron dos dosis de la vacuna de estudio (vacuna de la gripe fragmentada sin tiomersal (ST) preparada de acuerdo con un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5) o de la vacuna control (Influsplit reducida en tiomersal SSW®/Fluarix™, que contiene <2,5 pg tiomersal por 0,5 ml de dosis) (0,25 ml para ninos de 6 a 35 meses y 0,5 ml para ninos de 36 meses a menos de 6 anos) el dfa 0 y el dfa 28 ± 2. Ambas vacunas conteman 15 pg de HA de cada cepa de virus A/Nueva Caledonia/20/99 (IVR-116) [H1N1], A/Panama/2007/99 (RESVIR-17) [H3N2] y 35 B/Shangdong / 7/97, es decir, las cepas recomendadas para el Hemisferio Norte durante la estacion de la gripe durante el 2003/2004.
13.1.2 Inmunogenicidad
Se recogieron muestras de suero antes de la inmunizacion (Dfa 0), 21 dfas despues de la segunda vacunacion (Dfa 49 ± 2), 3 meses despues de la segunda vacunacion (Dfa 118/Mes 4) y 6 meses despues de la segunda vacunacion 40 (Dfa 208/Mes 7). Los sueros se analizaron mediante ensayo de inhibicion de HA (IH), de acuerdo con procedimientos convencionales. Los antfgenos utilizados en el ensayo fueron los mismos que los incluidos en la formulacion de la vacuna (A/Nueva Caledonia/20/99 (IVR-116) [H1N1], A/Panama/2007/99 (RESVIR-17) [H3N2] y B/Shangdong/7/97). Cada suero se ensayo a una dilucion de partida de 1:10. Se calculo la media geometrica de los tftulos (GMT), la tasa de seroproteccion, SPR, (es decir el porcentaje de sujetos con un tftulo IH en suero > 1:40 45 despues de vacunacion), la tasa de seroconversion, SCR, (es decir el porcentaje de sujetos con un tftulo IH prevacunacion <1:10 y un Tftulo posvacunacion > 1:40 o un tftulo de prevacunacion > 1:10 y al menos un aumento de cuatro veces en el tftulo posvacunacion), y los factores de seroconversion, SCF, (es decir el aumento en veces en las GMT IH posvacunacion en comparacion con el Dfa 0). Dado que aun no se habfan establecido las pautas para la evaluacion de la inmunogenicidad de las vacunas de la gripe en ninos, los resultados serologicos se 50 evaluaron de acuerdo con los criterios del CHMP para la evaluacion de las vacunas de la gripe en adultos de una edad comprendida entre los 18 y 60 anos: Los valores SPR>70 %, SCR> 40 % y SCF>2,5 se consideraron como niveles ftmite de inmunogenicidad de la vacuna. Ademas, se calculo el poder de la seroproteccion (SPP; es decir, la proporcion de sujetos no seroprotegidos antes de la vacunacion [tftulo <1:40 el dfa 1], que presentaban un tftulo seroprotector de >1:40 despues de la segunda vacunacion) como un parametro derivado adicional.
5
10
15
20
25
13.2 Resultados
13.2.1 Reactogenicidad y seguridad
Ambas vacunas presentaron un perfil de seguridad favorable.
13.2.2 Inmunogenicidad
En las Tablas 9 y 10 se resumen los resultados de inmunogenicidad para cada grupo de edad y vacuna. Las GMT de prevacunacion para las tres cepas de la vacuna estaban dentro del mismo intervalo en los dos grupos de vacuna. Veintiun dfas despues de la segunda vacunacion, en el grupo ST, las GMT variaron entre 71,3 y 283,0 para ninos de 6-35 meses y entre 180,3 y 712,7 para los que teman de 36 meses a <6 anos. En el grupo de control, las GMT variaron de 31,3 a 111,2 para ninos de 6-35 meses y de 165,1 a 529,8 para los de 36 meses a <6 anos. Despues de dos dosis, los criterios del CHMP para la evaluacion de la inmunogenicidad de las vacunas de la gripe en adultos se cumplieron tanto para los ninos de 6 a 35 meses como para los de 36 meses a <6 anos en el grupo ST (Tabla 9 y Tabla 10). En el grupo de control, solamente se cumplieron los criterios SCR y SCF en ambos grupos. La SPR fue mayor del 70 % en las tres cepas en ninos mas mayores (de 36 meses a <6 anos), pero no supero el 65,9 % en ninguna de las tres cepas en ninos mas pequenos (de 6 a 35 meses).
En el penodo de seguimiento mas largo (es decir al mes 4 y mes 7 posvacunacion), la respuesta inmunitaria persistio, aunque a un nivel mas bajo. La persistencia fue comparable en ambos grupos de vacuna y edad.
Tabla 9 - Resumen de resultados de inmunogenicidad prevacunacion y 21 dias despues de la segunda _______________vacunacion (Cohorte total de vacunados - Ninos de 6 a 35 meses)_______________
ST (n=42) Control (n=41)
D0 PII (D49) D0 PII (D49)
GMT (valor, IC 95 %) A/Nueva Caledonia
5,2 (4,8-5,5) 71,3 (49,1-103,5) 5,2 (4,8-5,5) 31,3 (21,0-46,8)
A/Panama B/Shangdong
25,2 (13,4-47,4) 5,8 (4,9-6,9) 283,0 (157,0-510,1) 113,2 (77,3-165,9) 17,5 (9,6-31,6) 5,7 (4,7-7,0) 111,2 (57,5-215,3) 45,8 (29,2-71,8)
SPR (%, IC 95 %) A/Nueva Caledonia
0,0 (0,0-8,4) 73,8 (58,0-86,1) 0,0 (0,0-8,6) 53,7 (37,4-69,3)
A/Panama B/Shangdong
40,5 (25,6-56,7) 2,4 (0,1-12,6) 97.6 (87,4-99,9) 85.7 (71,5-94,6) 31,7 (18,1-48,1) 4,9 (0,6-16,5) 65.9 (49,4-79,9) 65.9 (49,4-79,9)
SPP (%, IC 95 %) A/Nueva Caledonia
73,8 (58,0-86,1) 53,7 (37,4-69,3)
A/Panama
- 96,0 (79,6-99,9) - 50,0 (30,6-69,4)
B/Shangdong
- 85,4 (70,8-94,4) - 64,1 (47,2-78,8)
SCR (IC 95 %) A/Nueva Caledonia
73,8 (58,0-86,1) 51,2 (35,1-67,1)
A/Panama
- 95,2 (83,8-99,4) - 63,4 (46,9-77,9)
B/Shangdong
- 83,3 (68,6-93,0) - 65,9 (49,4-79,9)
SCF (valor, IC 95 %) A/Nueva Caledonia
13,8 (9,6-19,8) 6,1 (4,1-9,0)
A/Panama
- 11,2 (8,3-15,2) - 6,4 (4,5-9,0)
B/Shangdong
- 19,5 (13,5-28,2) - 8,0 (5,4-11,9)
La cohorte total de vacunados incluyo 157 ninos, pero como no se dispoma de resultados inmunologicos de 12 de ellos, el tamano real de esta cohorte para los analisis inmunologicos fue de 145.
ST = vacuna sin tiomersal (vacuna de estudio)
Control = Influsplit SSW®/Fluarix ™
D = dfa, PII = 2a posvacunacion, GMT = media geometrica de tftulo; IC= intervalo de confianza; SPR = tasa de seroproteccion, SPP = poder de seroproteccion, SCR = tasa de seroconversion, SCF = factor de seroconversion
5
10
15
Tabla 10 - Resultados de inmunogenicidad prevacunacion y 21 dias despues de la segunda vacunacion (cohorte total de vacunados - ninos de 36 meses a <6 anos)
ST (n=29) Control (n=33)
D0 PII (D49) D0 PII (D49)
GMT (valor, IC, 95%) A/Nueva Caledonia A/Panama B/Shangdong
25,4 (13,0-49,7) 78,1 (37,1-164,5) 6,0 (4,8-7,4) 561,0 (230,7-1363,7) 712,7 (432,4-1174,6) 180,3 (113,8-285,5) 10,0 (6,1-16,3) 56,0 (28,3-110,6) 7,8 (5,7-10,5) 191,3 (101,6-360,2) 529,8 (303,7-924,2) 165,1 (93,9-290,3)
SPR (%, IC 95 %) A/Nueva Caledonia A/Panama B/Shangdong
48,3 (29,5-67,5) 69,0 (49,2-84,7) 3,4 (0,1-17,8) 82,8 (64,2-94,2) 96,6 (82,2-99,9) 86,2 (68,3-96,1) 21,2 (9,0-38,9) 63,6 (45,1-79,6) 12,1 (3,4-28,2) 84.8 (68,1-94,9) 97,0 (84,2-99,9) 90.9 (75,7-98,1)
SPP (%, IC 95 %) A/Nueva Caledonia A/Panama B/Shangdong
- 66.7 (38,4-88,2) 88,9 (51,8-99,7) 85.7 (67,3-96,0) - 80,8 (60,6-93,4) 91.7 (61,5-99,8) 89.7 (72,6-97,8)
SCR (%,
IC 95 %)
La cohorte total de vacunados incluyo 157 ninos, pero como no se dispoma de resultados inmunologicos de 12 de ellos, el tamano real de esta cohorte para los analisis inmunologicos fue de 145
ST = vacuna sin tiomersal (vacuna de estudio)
Control = Influsplit SSW®/Fluarix ™
D = dfa, PII = 2a posvacunacion, GMT = media geometrica de tttulo; IC= intervalo de confianza; SPR = tasa de seroproteccion, SPP = poder de seroproteccion, SCR = tasa de seroconversion, SCF = factor de seroconversion
13.3 Conclusion
Tanto la nueva formulacion de Fluarix™, sin tiomersal, como la de Fluarix™ (control), reducida en tiomersal, fueron inmunogenicas y presentaron un buen perfil de seguridad.
Se demostro que la vacuna sin tiomersal, ST, cumplfa los tres criterios del CHMP definidos para adultos tanto en ninos de 6 a 35 meses como en ninos de 36 meses a <6 anos y para las tres cepas. Se demostro que la inmunogenicidad era mas alta en ninos menores de 3 anos que recibfan 2 dosis de la vacuna ST en comparacion con los que recibfan 2 dosis de la vacuna de control.

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso en la profilaxis de una infeccion o enfermedad gripal en un nino de edad entre 6 y 36 meses, en la que dicha composicion comprende una preparacion acuosa de virus de la gripe inactivado que comprende hemaglutinina (HA) y succinato de a-tocoferol en una cantidad suficiente para establecer dicha HA, en la que la preparacion es una preparacion antigenica de virus fragmentado o subunitario y es una preparacion trivalente de virus de la gripe que comprende la HA de 2 cepas A y de 1 cepa B o una preparacion tetravalente de virus de la gripe que comprende la HA de 2 cepas A y de 2 cepas B y en la que la composicion no comprende adyuvante.
  2. 2. La composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el succinato de a-tocoferol esta presente en una cantidad tal que la HA de dicha preparacion permanece estable durante al menos 6 meses despues de que se produzca dicha preparacion, tal como se determina por la presencia de una cantidad de HA detectable por ensayo SRD.
  3. 3. La composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la concentracion de antfgeno HA para cada cepa de virus de la gripe es de 1-100 |jg por ml, medida mediante un ensayo SRD.
  4. 4. La composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la concentracion de antfgeno HA para cada cepa de virus de la gripe es de aproximadamente 15 jg por ml, medida mediante un ensayo SRD.
  5. 5. La composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la concentracion de antfgeno HA para cada cepa de virus de la gripe es menor que 15 jg por ml, medida mediante un ensayo SRD.
  6. 6. La composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que la cantidad de antfgeno HA para cada cepa de virus de la gripe es entre 6-9 jg por dosis, medida mediante un ensayo SRD.
  7. 7. La composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion inmunogenica tiene un volumen de dosis de aproximadamente 0,5 ml o de aproximadamente 0,25 ml.
  8. 8. La composicion inmunogenica sin conservante mercurico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion inmunogenica tiene un volumen de dosis de entre 0,2 a 0,45 ml.
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