KR100603884B1 - 모노포스포릴 지질 ａ의 수성 면역적 아쥬반트 조성물 - Google Patents
모노포스포릴 지질 ａ의 수성 면역적 아쥬반트 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
약독화된 지질 A 유도체와 계면활성제 또는 계면활성제들은 포함하는 수성 아쥬반트 조성물은 온혈 동물 내에서 단백질 항원에 대한 면역반응을 향상시킨다. 본 발명에 따른 유용한 약독화된 지질 A 유도체는 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A 또는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A를 포함한다. 계면활성제 또는 계면활성제 혼합물은 용매 내에 용해된다. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)은 바람직한 용매이다. 상기 용해된 계면활성제가 혼합물을 수득하기 위하여 약독화된 지질 A에 첨가하였다. 혼합물내 약독화된 지질 A 대 계면활성제의 몰비는 약 4:1이다. 상기 용매는 증발되고 그 결과로 수득되는 필름에 물이 첨가된다. 상기 현탁액은 60℃ 물중탕에서 맑아질 때까지 초음파처리된다. 아쥬반트 제형이 투여된 동물은 증가된 림프구 증식 및 세포독소 T-림프구 반응을 나타냄과 동시에 주어진 항원에 대한 증가된 항체 반응을 나타낸다. 상기 수성 아쥬반트 및 항원의 비강내 투여는 혈청 및 점막 분비 IgA의 생산을 촉진한다.
MLA, 3D-MLA, AF, OVA, LPS
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 1997년 4월 1일에 출원되어 계류중인 출원 제 08/831,073호의 일부-계속 출원이다
화합물 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A 및 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A(3D-MLA)는 박테리아 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide ; LPS)의 지질 A 성분의 약독화된 유도체이다. LPS 및 지질 A는 그러한 화합물이 투여된 환자에 있어서 체액 항체 반응 및 세포-매개 면역 반응을 유도하는 강력한 면역촉진제(immunostimulants)이다. 그러나 지질 A 및 LPS는 또한 발열 및 국부적 슈바르쯔만(Schwarzman) 반응과 같은 독성 부작용을 나타낸다. MLA 및 3D-MLA는 LPS의 독성을 약화시키기 위하여 변형된 지질 A-유사 분자이다.
지질 A와 같이, 상기 MLA 및 3D-MLA 분자는 그 위에 긴 사슬 지방산이 부착 되어 있는 위에 당 골격(sugar backbone)을 갖는다. 상기 골격은 글리코사이드(glycosidic) 결합되어 있는 두 개의 6 탄소 당 고리를 포함하고 있다. MLA 및 3D-MLA는 4 위치에서 포스포릴화(phosphorylated) 된다. 5 내지 8개의 긴 사슬 지방산(12-14 탄소)이 당 골격에 부착되어 MLA 및 3D-MLA를 물에 쉽게 용해되지 않는 매우 소수성인 분자로 만든다.
약독화된 지질 A의 유도체(ALDs)인 MLA 및 3D-MLA는 전염병에 대한 예방 백신 및 암 종양과 만성 감염증의 치료를 위한 치료 백신내 면역 아쥬반트로 이용된다. 대부분의 백신에 포함되는 항원 조제는 수용성 단백질들의 복잡한 혼합물이기 때문에 물을 기초로 하는 백신 내에 물에 용해되지 않는 아쥬반트제를 제형화하는 것을 어렵게 만든다. 그러므로, MLA 및 3D-MLA는 항원 조제에 첨가되기 전에 먼저 용매와 혼합되어야 한다. 그러나, 용매의 존재는 상기 백신의 제형화를 더욱 복잡하게 하고, 몇몇의 경우에는 그 성분들의 효과를 감소시킬 수 있다. 더욱이, 용매는 점막의 표면을 자극하거나 주사 부위에 있어서 염증을 일으킬 수 있다. 해가 되는 공통 용매를 포함하지 않는 MLA 또는 3D-MLA의 단순 제형은 백신 조성물에 있어서 아쥬반트제 및 항원 양자로부터 최대의 이득을 도출한다. 본 발명은 이 필요성을 만족시킨다.
[발명의 요약]
본 발명은 약독화된 지질 A 유도체와 계면활성제의 수성 제형(aqueous formulation) 및 그의 제조방법을 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 약독화된 지질 A 유도체는 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A(MLA) 및 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A(3D-MLA)를 포함한다. MLA(MLA/AF) 또는 3D-MLA(3D-MLA/AF)의 수성 제형은 백신 조제에 대한 바람직하지 않은 용매 또는 공통-용매 시스템의 필요성을 없앤다. 본 발명은 항원과 함께 쥐에게 투여되었을 때, 그 항원에 대한 동물의 세포 및 체액 면역 반응을 강화시키는 ALD와 계면활성제의 안정한 수성 조성물을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명의 수성 제형은 비강 내로 투여될 때 동물 내에서 고농도의 혈청 및 점막 분비 IgA를 유도한다. 청구된 수성 조성물의 일 실시예는 약 4:1의 몰비로 MLA 또는 3D-MLA와 계면활성제를 포함하고 약 50∼70nm의 입자 크기를 갖는다. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ; DPPC)은 바람직한 계면활성제이다.
본원에는 수성 조성물을 제조하는 방법도 개시된다. 일 실시예에 있어서, 상기 ALD 및 계면활성제는 에탄올 내에서 용해되고 균일하게 혼합된다. 상기 에탄올은 이후에 필름을 남기고 증발된다. 물이 상기 필름에 첨가된다. 상기 ALD 및 계면활성제는 초음파처리에 의해서 물 내에 현탁된다. 상기 현탁액은 맑아질 때까지 초음파처리된다. 항원과 함께 특허 청구된 조성물이 투여된 동물은 상기 항원에 대하여 강화된 체액 및 세포 면역 반응을 보인다. 이 반응을 강화시키기 위하여 상기 조성물을 이용하는 방법 또한 개시되고 특허 청구된다.
도 1a∼d는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A-수성 제형(3D-MLA/AF) 내 파상풍 톡소이드(TT) 항원★ 또는 염수 내 파상풍 톡소이드 항원◇이 투여된 쥐의 항체 역가(titers)를 보인다. 도 1a는 파상풍 톡소이드 항원이 투여된 쥐의 총 IgG 항체 역가를 보인다. 도 1b는 파상풍 톡소이드 항원이 투여된 쥐의 IgG2a 항체 역가를 보인다. 도 1c는 파상풍 톡소이드 항원이 투여된 쥐의 IgG2b 항체 역가를 보이고 도 1d는 동물들에 대한 IgG1 항체 역가를 보인다.
도 2는 정제된 단백질 유도체에 의해 면역성이 부여된 쥐 내의 T-세포 증식 반응을 보인다. 3D-MLA/AF내 파상풍 톡소이드★ 및 정상 대조군◇에 투여된 쥐 에서의 증식 반응은 1차 예방접종 후 14일에 보여진다.
본 발명은 약독화된 지질 A 유도체(ALD)의 수성 아쥬반트 제형을 포함한다. 상기 ALD 및 계면활성제는 약 4:1의 몰비로 물에 현탁되고 초음파처리되어 약 50∼70nm의 입자 크기를 갖는 현탁액을 제공한다.
본 발명에 따르면, 약독화된 지질 A 유도체는 강력한 아쥬반트제를 제공하기 위하여 수성 조성물로 제형화될 수 있다. 약독화된 지질 A 유도체는 바람직한 면역촉진 특성을 시현하면서도 지질 A 이 화합물의 해로운 부작용은 적게 나타내는 지질 A-유사 화합물이다. 예를 들면, 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A(MLA) 및 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A(3D-MLA)는 강력한 면역촉진제이면서 지질 A 보다 놀라울 정도로 독성이 적은 ALDs이다. MLA 및 3D-MLA는 모두 본 발명의 조성물에 이용될 수 있고 잘 알려져 있으므로 본원에서 상세히 설명하지 않는다. 예를 들어 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A 및 그의 제조법이 개시된, 리비 이뮤노켐 리서치(Ribi ImmunoChem Research)에 양도되고, 1984년 3월 13일 등록된 미국 특허 제 4,436,727호를 참조하라. 미국 특허 제 4,912,094호 및 역시 리비 이뮤노켐 리서치(Ribi ImmunoChem Research)에 양도된, 마이어(Myers,et al)의 재심사 인증 제 B1 4.912,094호에는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A 및 그의 제조 방법이 예시된다. MLA 및 3D-MLA에 관한 이들 특허 각각의 공개내용은 본원에 참조문헌으로 첨부된다.
참조 특허로 첨부된 선행기술에 상세히 들어가지 않아도, 본원에 사용된 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A(MLA)은 강력하지만 독성이 강한 면역 시스템 조정자인 장내세균 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide ; LPS)의 구성성분인 지질 A로부터 유도된다. 에드가 리비(Edgar Ribi)와 그의 동료들은 초기에 무독성 내독소로 인식된 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A(MLA)를 제조했었다. MLA는 약 30분동안 중간정도의 강도(예를 들면 0.1 N HCl)의 광물산 용액 내의 그램 음성의 박테리아의 7탄당이 없는 돌연변이체로부터 수득된 내독소 추출물(LPS 또는 지질 A)을 환류함에 의해 생산되었다. 이 처리에 의해 환원 말단 글루코스아민(glucosamine)의 위치 1에 있는 인산염 부분이 손실되었다.
한편, 중심 탄수화물(carbohydrate)는 이 처리를 하는 동안 비환원 글루코스아민(glucosamine)의 위치 6으로부터 제거되었다. 상기 결과물(MLA)는 발열, 국부적 슈바르쯔만(Schwarzman) 반응, 및 병아리 태아 50% 치사 도스 분석(chick embryo 50% lethal dose essay ; CELD50)으로 평가되는 독성과 같은 일반적으로 내독소 출발물질에서 발견되는 상당히 약화된 수준의 내독소 활성을 시현하였다. 그러나, 이것은 의외로 면역조정자로서의 지질 A 및 LPS의 작용을 그대로 보유한다.
본 발명의 실행에 있어서 유용한 또다른 약독화된 지질 A 유도체는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A(3D-MLA)로 불리운다. 3D-MLA는 미국 특허 제 4,912,094호를 시작으로, 재심사 등록 제 B1 4,912,094(상기 제 4,912,094호 특허)에 공지되어있고, 다른 그룹에 역효과를 미치지 않는 조건하에 위치 3에서 환원 말단 글루코스아민(glucosamine)에 에스테르 연결된 β-히드록시미리스틱 알킬(β-hydroxymyristic acyl) 잔기가 MLA 분자로부터 선택적으로 제거되었다는 점에서 MLA와 다르다. 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A는 몬타나(Montana) 59840, 헤밀톤(Hamilton)에 위치한 리비 이뮤노켐 리서치 인코퍼레이티드(Ribi ImmunoChem Research, Inc.)로부터 입수할 수 있다.
상기 MLA 및 3D-MLA 분자는 예를 들면 헵타아실(heptaacyl), 헥사아실(hexaacyl), 펜타아실(pentaacyl) 등과 같은 많은 지방산 치환 형태의 복 합체 또는 혼합물이다. 그러므로, 이들 다양한 형태의 MLA 및 3D-MLA는 본 발명에 의해 포함된다. 더욱이, 합성 또는 반합성 수단에 의해 생산된 각각의 화합물은 물론 여러 가지 형태의 화합물들의 혼합물도 본 발명에 포함된다. 제 4,912,094호 특허에 설명된 지질 A 골격은 에스. 미테소타 알 595(S. minesota R 595)로부터 헵타아실 지질 A의 3-디아실레이션(3-deacylation)에 의해 수득된 생성물에 해당한다. 다른 지방산 치환 형태들은 발명에 포함된다; 주요 특성은 상기 물질이 3-O-디아실화된다는(3-O-deacylated) 것이다.
본 발명에서 이용된 변형된 3D-MLA는 지질 A 골격의 위치 3으로부터 하나의 지방산만을 손실시키는 조건 하에서 MLA를 알카리 가수분해(alkaline hydrolysis)시킴으로써 제조된다. 위치 3의 β-히드록시미리스틱(β-hydroxymyristic) 지방산은 알카라인 매질 내에서 특이하게 불안정하다. 따라서 매우 약한 알칼리만 처리하여도 완전히 3-D-디아실화된 지질 A를 수득할 수 있다. 지질 A 내 다른 에스테르 연결은 나머지 분자에 별다른 영향을 주지 않고 위치 3에서 선택적으로 이들 물질을 디아실화하는 것을 가능하게 하기 위하여 가수분해가 일어나기 전에 다소 강한 조건들을 요한다. 위치 3에 있는 에스테르 연결된 β-히드록시미리스틱(β-hydroxymyristic) 지방산이 알카리성 매질에 대해 특히 민감한 이유는 오늘날까지 알려지지 않고 있다.
알카리 가수분해 방법은 공지되어 있지만, 위치 3의 β-히드록시미리스틱(β-hydroxymyristic)의 에스테르 결합 이외의 그룹들을 추가로 가수분해시키지 않도록 조건을 선택하는 것은 중요하다. 일반적으로 상기 가 수분해는 수성 또는 유기 매질 내에서 수행될 수 있다. 후자의 경우에, 용매는 메탄올(알콜), 디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide ; DMSO), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide ; DMF), 클로로포름, 디클로로메탄등 및 이들의 혼합물을 포함한다. 물과 상기 유기 용매중 하나 이상의 조합 또한 사용될 수 있다.
상기 알카리 염기(base)는 다양한 수산화물(hydroxides), 탄산염(carbonates), 인산염(phosphates), 및 아민 중에서 선택될 수 있다. 예시적인 염기는 수산화나트륨(sodium hydroxide), 수산화칼륨(potassium hydroxide), 탄산나트륨(sodium carbonate), 탄산칼륨(potassium carbonate), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 중탄산칼륨(potassium bicarbonate)등과 같은 무기 염기, 및 디에틸아민, 트리에틸아민, 등을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 알킬 아민과 같은 유기 염기를 포함한다.
수성 매질에 있어서 pH는 일반적으로 약 10에서 14 사이이고 바람직하게는 약 12 내지 약 13.5의 범위를 갖는다. 가수분해 반응은 일반적으로 약 10내지 30 분 동안 약 20℃에서 80℃까지의 온도, 바람직하게는 약 50℃에서 60℃까지의 온도에서 수행된다. 예를 들면, 상기 가수분해는 48 시간동안 상온(22℃∼25℃)의 3% 트리에틸아민 수용액 내에서 행해질 수 있다. 가수분해의 온도 및 시간 선택에 요구되는 것은 오직 디아실레이션이 위치 3의 β-히드록시미리스틱(β-hydroxymyristic)만을 제거하도록 해야 한다는 것이다.
실제로 특히 바람직한 가수분해 방법은 클로로포름:메탄올비가 2:1(v/v)인 용액에 지질 A 또는 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A를 용해하는 단계, 이 용 액을 pH 10.5인 0.5 M Na2CO3로 구성된 수성 버퍼로 포화시키는 단계, 및 상기 용매를 진공 또는 흡인기(약 100mmHg) 하에 45℃∼50℃에서 플래시(flash) 증발시키는 단계를 포함하는 것이 발견되었다. 상기 결과물은 선택적으로 위치 3에서 디아실화되었다. 이 과정은 또한 상술한 무기 염기를 가지고 수행될 수 있다. 수성 버퍼에 의한 포화 단계 전에, 유기 용액에 테트라 부틸 암모늄 브로마이드와 같은, 상 전이 촉매(phase transfer catalyst)를 첨가하는 것은 몇몇의 경우에 있어서 바람직하다.
본 발명의 조성물을 제조함에 있어서, 일반적으로, 약독화된 지질 A 유도체(ALD)와 계면활성제는 각각 용매에 용해된 상태로 혼합된다. 용매를 증발시키면 필름이 남는다. 상기 필름에 물을 첨가하는 상기 결과의 산물인 현탁액을 맑아질 때까지 가열하면서 초음파처리한다. 최종 현탁액은 약 40∼150nm, 바람직하게는 약 50내지 70nm의 입자 크기를 갖는다.
상기 ALD 및 계면활성제는 약 1부부터 약 5부까지의 계면활성제에 대해 약 10부의 ALD의 몰비로 조합된다. 바람직하게는, 성분들은 약 4부의 ALD에 약 1부의 계면활성제의 몰비로 조합된다. 본 발명에 이용된 계면활성제는 담즙 염, 자연산 인지질(phospholipids) 및 스핀고리피드(sphingolipids)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 글리코디옥시콜레이트(glycodeoxycholate) 및 디옥시콜레이트(deoxycholate)와 같은 담즙 염이 특허청구된 조성물에 있어서 계면활성제로 유용하다. 다른 적합한 계면활성제는 스핀고미엘린(sphingomyeline) 및 스핀고신(sphingosine)과 같은 스핀고리피드(sphingolipids) 및 계란 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), L-α-포스파티딜에탄올아민(L-α-Phosphatidylethanolamine), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 그 혼합물과 같은 인지질을 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 인지질 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ; DPPC)가 계면활성제이다. DPPC는 인체 내에서 이용 가능하고 특히 제형이 비강 내로 투여될 때 효과적이다.
상기 ALD 및 계면활성제는 용해되고 용매 내에 완전히 혼합된다. 본 발명에 따라 이용되는 수성 또는 유기 용매는 메탄올(알콜), 디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide ; DMSO), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide ; DMF), 등 및 이들의 혼합물을 포함한다.
ALD 및 계면활성제의 혼합물로부터 용매를 증발시키면 필름이 남는다. 상기 필름에 물을 첨가하고 그 결과로 수득된 현탁액을 맑아질 때까지 가열한다. 상기 현탁액은 물중탕(water bath) 초음파처리기 내에서 초음파처리되는 것이 바람직하다. 상기 물중탕(water bath) 온도는 40℃에서 80℃까지, 바람직하게는 약 60℃정도가 가능하다. 상기 현탁액은 맑아질 때까지 5분에서 약 1시간동안 초음파처리한다. 초음파처리의 기간은 현탁액의 부피 및 농도에 따라 다를 것이나 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 최종 현탁액은 약 40∼150nm, 바람직하게는 약 50 내지 70nm의 입자 크기를 갖는다.
본 발명의 조성물의 효과적인 양이 동물의 항원에 대한 면역 반응을 강화하기 위한 항원과 함께 온혈동물에게 투여된다. 본 발명의 조성물은 세포 면역 반응과 마찬가지로 동물의 항원에 대한 체액 면역 반응을 강화한다. 바람직한 반응을 이끌어내기 위하여 투여되는 항원의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 투여될 항원의 유형, 투여의 경로, 및 면역화 일정에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 21일 간격으로 2회 면역화된 쥐에 피하로 본 발명의 조성물과 함께 투여된 0.1㎍의 파상풍 톡소이드는 그 항원에 대하여 체액 면역 반응을 유도한다. 비강 내에 투여되어, 본 발명의 조성물 및 항원은 세포파괴 티-림프구(T-lymphocytes)의 생산을 촉진한다. 첫날과 21일째 본 발명의 조성물과 같이 비강 내에 투여된 B형 간염(hepatitis) 항원(2.5㎍)은 면역화된 동물 내에서 세포파괴 티-림프구(T-lymphocytes)의 생산을 촉진한다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 비강 내에 투여되었을 때 면역된 동물 내에서 IgA 반응을 이끌어내는 데에 특히 효과적이다. 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A의 수성 제형(3D-MLA/AF) 내에 포함된 0.5∼12.5㎍의 파상풍 톡소이드를 투여한 쥐는 상기 항원에 대하여 증가된 IgA 역가를 보인다. 본 발명의 조성물의 효과적인 양은 상기 면역 반응을 촉진하거나 강화하는 양이다. 예를 들면, 특허청구된 조성물의 효과적인 양은 일반적인 70kg의 성인 환자에게 투여하는 것을 기준으로 하면 1에서 약 250㎍, 바람직하게는 약 25에서 약 50㎍의 약독화된 지질 A 유도체를 포함할 수 있다.
후술하는 실시예들은 더욱 상세한 설명을 제공하나 본 발명의 조성물 및 방 법을 제한하지는 않는다. 본원에 나타난 쥐의 모델은 온혈동물을 대표하며, 인간을 포함하는 다른 온혈 동물의 경우에도 이상적으로 관련되어 있음이 이해되어야 한다. 모든 퍼센트는 중량 퍼센트이고 용매 혼합 비율은 특별한 언급이 없으면 부피비이다.
실시예 1-약독화된 지질 A 유도체의 수성 제형의 제조.
주사액 내에 3D-MLA(몬타나(Montana) 59840, 헤밀톤(Hamilton)에 위치한 리비 이뮤노켐 리서치 인코퍼레이티드(Ribi ImmunoChem Research, Inc.)) 1000㎍/ml, 살모넬라 미테소타 알 595(Salmonella minesota R 595)로 부터의 지질 A의 약독화된 형태 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ; DPPC) 118㎍/ml를 포함하는 본 발명에 따른 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A의 수성 조제(3D-MLA/AF)는 후술하는 바와 같이 제조되었다:
DPPC의 용액을 에탄올 내에서 4mg/ml의 농도로 제조하였고 맑아질 때까지 교반하였다. DPPC 용액의 2.7 ml 분취량(aliquot)을 동결건조된 3D-MLA 100mg를 포함하는 바이알에 첨가하고 상기 3D-MLA를 적시기 위하여 부드럽게 휘저었다. 상기 바이알 내에 여과된 질소 기류를 살살 불어넣어 에탄올을 제거하였다. 주사액(97.1ml)을 상기 바이알에 첨가하여 마개를 덮은 후 밀봉하여 래블린(Labline) 9303 물중탕 초음파처리기 내에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 맑 아질 때까지 60℃에서 10분동안 초음파처리하였다. 상기 수성 제형 결과물은 말번 인스트루먼트(Malvern Instruments)의 제품인 피에스시100 스펙트로메터(PSC100 Spectrometer)로 측정되는 70nm의 입자를 포함하였고 이를 0.2㎛의 필터로 여과·살균하였다.
실시예 2-항체 반응의 촉진.
본 발명의 수성 제형내의 파상풍 톡소이드(TT)에 의해 면역화된 쥐는 파상풍 톡소이드 특이적 항체를 생성하였다. 상기 TT-특이적 총 IgG 역가 및 IgG 아이소타이프(isotype)(2a, 2b, 1) 역가를 면역화 이후에 쥐의 혈청 내에서 효소-연결 면역흡착 분석(ELISA)로 측정하였다.
암컷 ICR 쥐들을 염수 내에 0.1㎍의 파상풍 톡소이드(TT) + 50 ㎍ 3D-MLA/AF 또는 0.1㎍의 TT를 포함하는 한 번의 백신 면역화하였다. 3D-MLA/AF는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 상기 백신들을 첫날과 21일 째에 피하 주사에 의해 투여하였다. 혈청을 2차 면역화 이후 14일째에 채취하였고 총 IgG와 마찬가지로 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b 아이소타이프의 파상풍 톡소이드 특이적 항체의 상대적인 양을 기록하기위해 표준 ELISA 기술에 의해 분석하였다.
도 1은 3D-MLA/AF에 의해 생성된 파상풍 톡소이드 특이적 항체 역가를 보인다. 3D-MLA/AF는 파상풍 톡소이드 항원과 함께 투여되었을 때 면역화된 동물내에서 IgG 항체의 생성, 특히 IgG2b 생성을 촉진한다.
실시예 3-세포 증식의 촉진
쥐들은 본 발명의 아쥬반트 조성물로 면역화하는 것에 의해 준비되었고 비장 세포가 상기 항원에 의해 처리되었을 때 정제된 단백질 유도체(PPD)(투베르쿨린)는 생체 내에서 증식 반응을 나타냈다.
암컷 BALB/c 쥐를 PPD 50㎍ + 3D-MLA/AF 50 ㎍를 포함하는 한 번의 백신 피하주사로 면역화하였다. 3D-MLA/AF는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 비장 세포를 면역화 후 14일 째에 회수했고 증식 분석에 있어서 림프구의 소스로 이용했다. 상기 비장 세포를 96시간동안 PPD를 0.1, 1, 또는 10㎍/ml 포함하는 매개물 내에 106cells/ml의 농도를 갖는 마이크로타이터 웰(microtiter wells) 내에서 배양했다. 트리티에이트된 티미딘(Tritiated thymidine)을 인큐베이션의 마지막 24 시간 동안 상기 배양체에 첨가했다. 상기 세포들을 유리 섬유 필터 상에 회수했고 트리튬 결합을 측정하였다. 촉진 지수는 PPD로 촉진된 세포의 분당 계수(CPM ; counts per minute)를 단지 매개물 내에서만 배양된 세포들의 CPM으로 나누는 것에 의해 결정하였다. 상기 결과 자료는 도 2에 보인다.
실시예 4-세포독성 T-림프구 반응의 촉진
본 발명의 수성 아쥬반트 조성물 및 단백질 항원의 투여 후에 세포독소 T-림프구 반응의 유도를 세포파괴 분석에 의해 감지하였다. C57/BL/6 쥐들의 그룹은 3D-MLA/AF 내에서 제형된 오브알부민(OVA) 25㎍이 든 피하주사로(서혜 부분) 1차 면역화 과정을 받았다. 3D-MLA/AF는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 상기 주사된 부피는 200㎕였다. 21일 후에 실험 그룹당 3마리의 쥐가 사망했고 비장을 적출하여 단일 세포 현탁액으로 풀링한(pooled) 후 계수하였다.
상기 실험 그룹들로부터의 비장 세포들(매개물 3∼4 ㎖ 내 75×106 세포)은 25㎠ T-플라스크에 놓았다. 이후에, 1.0㎖의 X선 처리된(20,000 rads) E.G7(OVA) 세포를 5×106/㎖로 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 배양물은 상기 T-플라스크를 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에 4일간 세워 놓음으로써 유지하였다. 4일째 살아남은 세포를 상기 플라스크로부터 회수하였고, 1X로 세정하였으며, 5.0ml내에 재현탁하였고, 계수하였다.
회수된 이펙터 세포를 5×106 생존세포/ml로 조정하였고 100㎕의 부피를 희석액으로 100㎕/well의 배지를 이용하여 96 웰 원형-바닥 플레이트(코닝 25850)의 웰 내에서 순차적으로 3회 희석하였다. 이후에, 100㎕ 부피의 51Cr-표지된(이하 참조) 표적세포[E.G7(OVA)-오브알부민 유전자 감염된 EL-4 세포 라인]들을 1×105 cells/ml로 상기 웰에 첨가하였다. 자발적인 방출(SR ; spontaneous release) 웰은 100㎕의 표적세포와 100㎕의 배지를 포함하였다. 최상 방출(MR) 웰은 100㎕의 표적세포와 100㎕의 세정제(트윈 20(Tween 20) 2%)를 포함하였다. 이펙터/표적세포(E/T)의 비는 50:1, 25:1, 12.5:1, 6.25:1이었다. 상기 플레이트를 400Xg로 원 심분리되었고 37℃, 5% CO2에서 4시간동안 인큐베이트하였다. 인큐베이션 후에 상기 웰 상청액을 스케트론 상청액 회수 시스템(Sketron Supernatant Collection System)에 의해 회수하였다.
(MR - SR)
표적 세포들, E.G7(OVA)을 51Cr(나트륨 크롬산염)로 후술하는 바와 같이 표지하였다. 5×106 개의 표적 세포 및 250μCi의 51Cr을 15ml의 원뿔형 관에서 섞어 총 부피 1.0ml로 만들었다. 상기 세포 현탁액을 15분마다 부드럽게 혼합하면서 37℃ 물중탕 내에서 90분동안 인큐베이트하였다. 인큐베이션 후에 표지된 세포를 3X 원심분리로 세정하였고 배지 중 15ml를 따라내었다. 3번째 원심분리 이후에 상기 세포들을 10ml의 새로운 배지 내에서 재현탁하였고 30분동안 상온에서 방치한 후 원심분리하였다. 상기 세포를 최종적으로 매개물 내에 1×105cells/m로 재현탁하였다. 세포파괴 분석의 결과는 표 1에 나타나있다.
| 세포파괴 % ( 51 Cr-방출) | ||||
| 이펙터:표적세포 비 | ||||
| 물질 | 50:1 | 25:1 | 12.5:1 | 6.25:1 |
| PBS* | 13 | 10 | 7 | 2 |
| 3D-MLA/AF | 61 | 60 | 59 | 45 |
| 면역화되지 않은 비장 세포 | 8 | 4 | 2 | 2 |
*인산염 버퍼된 염수(phosphate buffered saline)
실시예 5-수성 ALD 제형의 비강내 투여에 의한 항체 반응의 촉진.
비강내로 3D-MLA/AF와 함께 파상풍 톡소이드가 투여된 쥐들은 혈청 및 변 추출물 모두에서 검출가능한 정도의 IgA 역가를 생산하였다. 더욱이, 본 발명의 수성 제형화 및 TT의 비강내 투여는 아이소타이프 IgG2a 및 IgG2b에 있어서 높은 IgG의 역가를 생산하였다.
ICR 쥐들의 그룹에게는 비강내로, 인산염 버퍼된 염수(PBS)내 0.5, 2.5, 10 또는 12.5 ㎍의 파상풍 톡소이드를 주거나 3D-MLA/AF와 혼합된 파상풍 톡소이드를 주었다. 3D-MLA/AF는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 첫날에 쥐들을 준비하였고, 10일째 채혈하였으며(d10P1°), 14일째 부스트하였고(boosted), 24일째 채혈하였으며(d10P2°), 28일째 부스트하였고, 38일째 채혈하였다(d10P3°). IgG- 및 IgA 특이적 항-파상풍 톡소이드 항체에 대한 ELISA는 각각의 혈액으로부터 풀링된 혈청 상에 행하였다. 22일째 변 추출물을 검사하였다(d7P2°). 면역화된 쥐들의 혈청 및 변 추출물의 IgG 및 IgA 역가는 표2∼5에서 보인다.
| 혈청 항-파상풍 톡소이드 역가 -1 | |||||||
| IgG-특이성 | IgA-특이성 | ||||||
| 백신* | 경로 | d10P1° | d10P2° | d10P3° | d10P1° | d10P2° | d10P3° |
| 0.5㎍TT+PBS | 비강내 | 200 | 400 | 25,600 | <200 | <200 | <200 |
| 2.5㎍TT+PBS | 비강내 | 400 | 51,200 | 25,600 | <200 | <200 | <200 |
| 12.5㎍TT+PBS | 비강내 | 3,200 | 51,200 | 102,400 | <200 | 200 | 400 |
| 0.5㎍TT+3D-MLA/AF | 비강내 | 12,800 | >409,600 | >409,600 | <200 | 800 | 6,400 |
| 2.5㎍TT+3D-MLA/AF | 비강내 | 51,200 | >409,600 | >409,600 | <200 | 12,800 | 25,600 |
| 12.5㎍TT+3D-MLA/AF | 비강내 | 102,400 | >409,600 | >409,600 | <200 | 25,600 | 102,400 |
| 0.5㎍TT+PBS | 피하 | 800 | 204,800 | 409,600 | <200 | <200 | <200 |
*n=4
| 표 2에 있어서 d10P3°채혈물로부터의 혈청 IgG 아이소타이프 분석 | ||||
| 항-파상풍 톡소이드 역가 -1 | ||||
| 백신 | 경로 | IgG 1 | IgG 2a | IgG 2b |
| 0.5㎍TT+PBS | 비강내 | 25,600 | 6,400 | 25,600 |
| 2.5㎍TT+PBS | 비강내 | 51,200 | 3,200 | 25,600 |
| 12.5㎍TT+PBS | 비강내 | 204,800 | 12,800 | 51,200 |
| 0.5㎍TT+3D-MLA/AF | 비강내 | 819,200 | 409,600 | 819,200 |
| 2.5㎍TT+3D-MLA/AF | 비강내 | >819,200 | >819,200 | >819,200 |
| 12.5㎍TT+3D-MLA/AF | 비강내 | >819,200 | >819,200 | >819,200 |
| 0.5㎍TT+PBS | 피하 | 819,200 | 6,400 | 25,600 |
| 정상적인 쥐의 혈청 | --- | <400 | <400 | <400 |
| 혈청 항-파상풍 톡소이드 역가 -1 | |||||||
| IgG-특이성 | IgA-특이성 | 변 추출물 d7P2° | |||||
| 백신 | 경로 | d10P2° | d10P3° | d10P2° | d10P3° | IgG | IgA |
| TT*+3D-MLA/AF/PBS | 비강내 | >102,400 | >>102,400 | 6,400 | 25,600 | <50 | 1,600 |
| TT+DPPC/PBS | 비강내 | 6,400 | 6,400 | 100 | 200 | <50 | <50 |
| TT+3D-MLA/AF/PBS | 피하 | >102,400 | >102,400 | 100 | 100 | <50 | <50 |
| 정상적인 쥐의 혈청 | --- | 50 | 50 | 100 | 100 | <50 | <50 |
*10㎍의 파상풍 톡소이드가 투여되었다
| 표 4에 있어서 d10P3°채혈물로부터의 혈청 IgG 아이소타이프 분석 | ||||
| 항-파상풍 톡소이드 역가 -1 | ||||
| 백신 | 경로 | IgG a | IgG 2a | IgG 2b |
| TT+3D-MLA/AF/PBS | 비강내 | >819,200 | 102,400 | 409,600 |
| TT+DPPC/PBS | 비강내 | 25,600 | 1,600 | 3,200 |
| TT+3D-MLA/AF/PBS | 피하 | >819,200 | 51,200 | 102,400 |
| 정상적인 쥐의 혈청 | --- | <400 | <400 | <400 |
실시예 6-수성 ALD 제형의 비강내 투여에 의한 B형 간염 항원에 대한 면역 반응의 촉진.
비강내로 본 발명의 조성물 내에 B형 간염 항원(HBSAG)이 투여된 쥐들은 상기 항원에 대한 혈청 IgG 및 IgA 역가를 생산하였다. 분리 IgA는 질 세척물에서검출하였고 세포독소 T-림프구 반응의 유도는 세포파괴 분석에 의해 감지하였다.
Balb/C 쥐들의 그룹을 20㎕의 부피의 HBsAg 2.5㎍+ 3D-MLA/AF 10㎍를 투여하여 비강내로 1차 면역화하였다. 3D-MLA/AF는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 21일 후에 후자의 쥐들은 2차 면역화(2°)이 20㎕의 부피로 HBsAg 7.5㎍+ 3D- MLA/AF 10㎍와 함께 비강내로 시행하였다. 3차 면역화(3°)은 2차 면역화의 조성물과 동일하게 2차 면역화 시행 후 28일째 투여하였다. 2차 면역화 이후 16일째(d16,post2°) 및 3차 면역화 이후 8일째(d8,post3°)에 세포독소 T-림프구 활성을 감지하기 위하여 분석이 수행하였다. 혈청 및 점막 추출물 역가가 2차 면역화 이후 22일째(d22,post2°) 및 3차 면역화 이후 21일째(d21,post3°)평가하였다. 모든 분석은 당업계에서 표준적인 방법으로 행해졌고 상기 실시예 2 및 4에 기술하였다. 실험의 결과는 표 6∼8에 보인다.
| % 세포파괴( 51 Cr-방출) | |||||
| 이펙터:표적세포 비 | |||||
| 물질 | 일 | 50:1 | 25:1 | 12.5:1 | 6.25:1 |
| 3D-MLA/AF | d16,post2° | 38 | 22 | 15 | 9 |
| 부형제 | 3 | 2 | 0 | 0 | |
| 면역화되지않은 비장 세포 | 3 | 3 | 0 | 0 | |
| 3D-MLA/AF | d8,post3° | 82 | 65 | 49 | 36 |
| 부형제 | 5 | 2 | 1 | 1 | |
| 면역화되지않은 비장 세포 | 7 | 5 | 3 | 3 | |
| 항 HBsAg 역가 -1 | ||||
| 물질 | 일 | IgG 1 | IgG 2a | IgA |
| 3D-MLA/AF | d22,post2° | 256,000 | 64,000 | 1,600 |
| 부형제 | <2000 | <2000 | <200 | |
| 3D-MLA/AF | d21,post3° | 1,000,000 | 1,000,000 | 25,600 |
| 부형제 | <2000 | <2000 | <200 | |
Balb/C 쥐들의 그룹을 HBsAg 2.5㎍+ 3D-MLA/AF 10㎍에 의해 비강내로 면역화 하고, 21일 후 비강내로 HBsAg 7.5㎍+ 3D-MLA/AF 10㎍와 함께 부스트하였다. 질 표본은 상기 부스터 면역 이후 10일째 회수하였다.
| 질 세척물 | ||
| 항-HBSAG 역가 -1 | ||
| 물질 | IgG | IgA |
| 3D-MLA/AF | 100 | 6400 |
| 부형제 | <50 | <50 |
본 발명의 조성물에 있어서 HBsAg의 비강내 투여는 상기 항원에 대한 체액 및 세포 면역 반응을 모두 촉진하였다. 3D-MLA/AF내에 제형된 항원의 비강내 투여는 T-림프구 반응 및 항원 특이적 체액과 점막 면역 반응을 유도하였다.
실시예 7-수성 ALD 제형의 비강내 투여에 의한 인플루엔자에 대한 보호 면역 반응의 생성.
본 발명의 조성물 내에 제형화된 응집 항원을 포함하는 FLUSHIELD 인플루엔자 백신으로 비강내 면역화된 쥐들은 질 세척물 내에서 복원된 IgG 및 IgA를 모두 생산하였다. 면역화된 쥐들은 또한 그 후의 인플루엔자 공격으로부터 100% 보호하였다.
ICR 쥐들은 21일 간격을 두고 세 번 응집 항원(HA) 0.3㎍+ 3D-MLA/AF 10㎍을 포함하는 FLUSHIELD 인플루엔자 백신(와이스-레더릴(Wyeth-Lederle))으로 비강내 면역화하였다. 3D-MLA/AF는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 질 세척물을 최 종 면역화 이후 14일째 회수하였다. 쥐들은 최종 면역화 후 35일째 감염성 인플루엔자 A/HK/68의 10 LD50(치사 약 50)로 공격하고 치사율을 모니터하였다.
| IgA | IgG | ||
| 그룹 | 질 세척물 | 질 세척물 | 보호 % |
| 비면역화 | <20 | <20 | 0 |
| 부형제 | 160 | 80 | 60 |
| 3D-MLA/AF | 2560 | 1280 | 100 |
실시예 8-모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A의 조성물
모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A(MLA)을 본 발명의 수성 조성물로 제형할 수 있고 실시예 1∼7에서와 같은 용량 및 양으로 투여되어 유사한 결과를 생산할 수 있다.
앞서의 실시예들은 단지 본 발명의 설명을 위한 것임이 이해되어야 한다. 상기에 사용된 조성물 및/또는 방법의 몇몇 변형이 만들어 질 수 있고 본 발명의 목적으로 이룰수도 있을 것이다. 이러한 변형은 청구된 발명의 범위 내에 포함된다.
Claims (36)
- 계면활성제를 추가로 포함하는 물 내에 아쥬반트를 포함하는 아쥬반트 조성물에 있어서, 상기 아쥬반트가 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A(MLA) 또는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A(3D-MLA)로부터 선택되는 약독화된 지질 A 유도체를 포함하며, 상기 물이 공통 용매를 포함하지 않고, MLA 또는 3D-MLA 대 계면활성제의 몰비가 10:1 내지 2:1인 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,상기 약독화된 지질 A 유도체는 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A인 아쥬반트 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 약독화된 지질 A 유도체는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A인 아쥬반트 조성물.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 계면활성제는 글리코디옥시콜레이트(glycodeoxycholate), 디옥시콜레이트(deoxycholate), 스핀고미엘린(sphingomyeline), 스핀고신(sphingosine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), L-α-포스파티딜에탄올아민(L-α-Phosphatidylethanolamine), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 그 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아쥬반트 조성물.
- 제 5 항에 있어서,상기 계면활성제는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)인 아쥬반트 조성물.
- 삭제
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,약독화된 지질 A 유도체 대 계면활성제의 몰비가 4:1인 아쥬반트 조성물.
- a) 하나 이상의 계면활성제를 용매에 용해시키는 단계;b) 용해된 계면활성제를 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A(MLA) 또는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A(3D-MLA)로부터 선택된 약독화된 지질 A 유도체(ALD)에 혼합하는 단계;c) 혼합물로부터 용매를 증발시키는 단계;d) 증발시킨 혼합물에 물을 혼합하여 (ALD:계면활성제) 몰비가 10:1 내지 2:1인 물 내의 ALD의 현탁액을 수득하는 단계; 및e) 상기 현탁액이 맑아질 때까지 가열 및 초음파 처리하는 단계를 포함하는 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 삭제
- 제 9 항에 있어서,상기 약독화된 지질 A 유도체는 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A인 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 9 항에 있어서,상기 약독화된 지질 A 유도체는 3-O-디아실화 모노포스포릴(3-O-deacylated monophosphoryl) 지질 A인 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 9 항에 있어서,상기 계면활성제는 글리코디옥시콜레이트(glycodeoxycholate), 디옥시콜레이트(deoxycholate), 스핀고미엘린(sphingomyeline), 스핀고신(sphingosine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), L-α-포스파티딜에탄올아민(L-α-Phosphatidylethanolamine), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 그 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 9 항, 제 11 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,약독화된 지질 A 유도체 대 계면활성제의 몰비가 4:1인 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 9 항, 제 11 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 용매는 클로로포름, 알콜, 디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide), 및 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 또는 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 17 항에 있어서,상기 용매는 에탄올인 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 9 항, 제 11항, 제 12항 및 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,상기 현탁액은 60℃ 내지 80℃로 가열되는 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 19 항에 있어서,상기 현탁액은 60℃로 가열되는 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 9 항, 제 11 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 현탁액은 5분 내지 60분 동안 초음파처리되는 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 21 항에 있어서,상기 현탁액은 10분 동안 초음파처리되는 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 조성물이 MLA 또는 3D-MLA 및 계면활성제의 투명한 수성 현탁액인 아쥬반트 조성물.
- 제 29 항에 있어서,상기 현탁액이 50nm 내지 70nm 크기의 입자들을 구비하는 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 조성물이 MLA 또는 3D-MLA, 계면활성제 및 물로 구성되는 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이:상기 MLA 또는 3D-MLA와 계면활성제를 용매에 용해시키고 완전하게 혼합하여 상기 MLA 또는 3D-MLA와 계면활성제를 결합시키고;용매를 증발시키며;물을 혼합하여 상기 MLA 또는 3D-MLA와 계면활성제를 재현탁시키고;현탁액을 맑아질 때까지 가열하는 동안 초음파 처리함으로써 수득 가능한 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
- 용매 내에 아쥬반트를 포함하는 백신으로서, 상기 백신이 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 의한 조성물을 포함하고, 상기 아쥬반트가 MLA 또는 3D-MLA로 이루어지며 상기 용매가 공통 용매를 포함하지 않는 물인 백신.
- 제 33 항에 있어서,상기 백신이 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물 및 항원으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 9 항, 제 11 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,최종 산물이 MLA 또는 3D-MLA 및 계면활성제의 맑은 수성 현탁액인 수성 아쥬반트 조성물의 제조 방법.
- 제 9 항의 방법에 의해 제조된 수성 아쥬반트 조성물을 포함하는 백신.
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