PL178578B1 - Zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A i sposób jej wytwarzania oraz kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A i sposób jej wytwarzania - Google Patents

Abstract

1. Zawiesina czastek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL), znamienna tym, ze jest wizual- nie przejrzysta i sterylizowalna przez slepa filtracje na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 µ m, korzystnie czastki zawiesiny maja rozmiar mniejszy niz 120 nm. 2. Sposób wytwarzania zawiesiny czastek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A, znamienny tym, ze sklada sie z zawieszania 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A w wodzie i poddawania otrzymanej za- wiesiny dzialaniu ultradzwieków do wytworzenia zawiesiny czastek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez slepa filtracje na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 µ m, korzystnie o rozmiarze czastek zawiesiny generalnie mniejszym niz 120 nm. 3. Kompozycja szczepionki zawierajacej antygen w polaczeniu z zawiesina 3-0-deacylowanego mono- fosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nosnikiem, znamienna tym, ze zawiera MPL w postaci zawiesiny czastek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez slepa filtracje na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 µ m, korzystnie o rozmiarze czastek zawiesiny generalnie mniejszym niz 120 nm, w ilosci 10-100 µ g na dawke i antygen. 25. Sposób wytwarzania kompozycji szczepionki zawierajacej antygen w polaczeniu z zawiesina 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nosnikiem, znam ienny tym, ze polega na mieszaniu zawiesiny czastek MPL wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez slepa filtracje na hydrofilo- wej membranie PVDF 0,22 µ m, korzystnie o rozmiarze czastek zawiesiny generalnie mniejszym niz 120 nm, z nosnikiem i antygenem w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest nowa zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A i sposóbjej wytwarzania oraz kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A i sposób jej wytwarzania.

3-0-deacylowany monofosforylolipid A (lub 3-de-0-acylowany monofosforylolipid A) był poprzednio nazywany 3D-MPL lub d3-MPL w celu wskazania że pozycja 3 redukującego końca glukozaminy jest de-O-acylowana. Preparatykę podaje brytyjski opis patentowy nr 2220211A. Chemicznie jest to mieszanina 3-deacylowanego monofosforylolipidu A z 4,5 lub 6 acylowanymi łańcuchami. W opisie termin 3D-MPL (lub d3-MPL) skracany jest do MPL, ponieważ „MPL” jest zastrzeżoną nazwą Ribi Immunochem,. Montana, stosowanym przez Ribi w celu jednoznacznego nazwania swojego 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A.

Brytyjski opis patentowy nr 2220211A wspomina, że endotoksyczność wcześniej stosowanych enterobakteryj nych lipopolisacharydów (LPS) zmniejsza się przy zachowaniu immunogennych właściwości. Jednak opis podaje te informacje po prostu w związku z układami bakteryjnymi (Gram-ujemnymi). Nie wspomniano o rozmiarach cząstek MPL. W istocie rozmiary cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A przekraczają 500 nm.

Publikacja WO/92/16231 opisuje szczepionkę zawierającą glikoproteinę gD wirusa opryszczki lub jej immunologiczne fragmenty w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A. Tu także nie wspomniano o rozmiarach cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A.

Publikacja WO/92/06113 opisuje szczepionkę zawierającą glikoproteinę 160 wirusa HIV lub jej immunologiczne fragmenty w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A. Nie wspomniano o rozmiarach cząstek MPL.

Przedmiotem wynalazkujest zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu

A (MPL), charakteryzująca się tym, że jest wizualnie przejrzysta i sterylizowalna przez ślepą filtrację nahydrofilowej membranie PVDF 0,22 pm, korzystnie cząstki zawiesiny mająrozmiar generalnie mniejszy niż 120 nm.

178 578

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania zawiesiny cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A, charakteryzujący się tym, że składa się z zawieszania 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A w wodzie i poddawania otrzymanej zawiesiny działaniu ultra-dźwięków do wytworzenia zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepąfiltrację nahydrofilowej membranie PVDF 0,22 pm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm.

Przedmiotem wynalazkujest też kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nośnikiem, charakteryzująca się tym, że zawiera MPL w postaci zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 pm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, w ilości 10-W0 pg na dawkę i antygen.

Korzystnie kompozycja zawiera MPL o rozmiarach cząstek 60-120 nm, a szczególnie korzystnie o rozmiarach cząstek mniejszych niż 100 nm.

W innym korzystnym wykonaniu kompozycja szczepionki zawiera jako nośnik wodorotlenek glinu.

Innym korzystnym nośnikiem jest emulsja typu olej w wodzie lub inny ciekły nośnik lipidowy.

Korzystnie szczepionka według wynalazku antygen zawiera antygen wirusowy. Szczególnie korzystnymi antygenami są: antygen Hepatitis A, a zwłaszcza zdezaktywowana kompozycja pełnych komórek szczepu HM-175; antygen Hepatitis B, a zwłaszcza antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) lubjego wariant, antygen HBsAg będący antygenem S HBsAg (226 aminokwasów), antygen HBsAg zawierający dodatkowo sekwencję pre-S, antygen HBsAg zawierający złożoną cząstkę o wzorze (L*, S), przy czym L* oznacza zmodyfikowane białko L wirusa Hepatitis B mające sekwencję aminokwasową złożoną z reszt 12-52, następnie 133-145 i 175-400 białka L, a S oznacza białko S HBsAg; antygen Hepatitis A; jeden lub wiele antygenów Hepatitis i co najmniej jeden składnik wybrany spośród związków' różnych od antygenu Hepatitis, który chroni przed jedną lub wieloma chorobami wybranymi spośród dyfterytu, tężca, kokluszu, Haemofilis influenzae b (Hib) oraz polio.

Szczególnie korzystne są kompozycje zawierające kombinację DTP (dyfteryt-tężec-koklusz)-HBsAg, kombinację Hib-HBsAg, kombinację DTP-Hib-HBsAg oraz kombinację IPV (nieaktywna szczepionka polio)-DTP-Hib-HBsAg, i ewentualnie dodatkowo antygen Hepatitis A.

W innym wykonaniu kompozycja szczepionki zawiera glikoproteinę D HSV lub jej immunologiczny fragment, a zwłaszcza glikoproteinę D o uciętej sekwencji, korzystnie HSVgD₂ pozbawione kotwiczącego końca C.

Kompozycja szczepionki korzystnie zawiera HIV gp 160 lub jego immunologiczny fragment, a zwłaszcza jako pochodną gp 160 zawiera pochodną gp 120.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania kompozycji szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesinąMPL polegający na mieszaniu zawiesiny MPL z nośnikiem i antygenem w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce.

Korzystnym przedmiotem wynalazkujest kompozycja szczepionki zawierająca antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A (skracanym do nazwy MPL) i odpowiedni nośnik, w której rozmiar cząstek MPL jest „niewielki”, nie przekracza 120 nm.

Takie preparaty nadają się do wielu jedno- lub wielow-artościowych szczepionek.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że kompozycje szczepionek według wynalazku mają szczególnie korzystne właściwości opisane poniżej. W szczególności takie kompozycje są wysoce immunogenne. Ponadto można zapewnić sterylność kompozycji z adiuwantem, ponieważ produkt nadaje się do sterylizującej filtracji. Kolejna korzyść z „małych” cząstek MPL pojawia się w przypadku kompozycji z wodorotlenkiem glinu, ponieważ MPL oddziaływuje z wodorotlenkiem glinu i antygenem tworząc wyodrębnionąjednostkę.

W kompozycjach według wynalazku antygen jest antygenem wirusowym, np. antygenem wobec infekcji żółtaczkowej (Hepatitis A, B, C, D lub E) lub opryszczki (HSV-1 lub HSV-2)

178 578 zgodnie z poniższym opisem. Opis współczesnych szczepionek przeciwżółtaczkowych wraz z pewną liczbą odnośników^- można znaleźć w Lancet z 12 maja 1990 na stronie 1142 ff (prof.

A.L.W.F. Eddleston). Patrz także „Viral Hepatitis and Liver Disease” (wyd. Vyas, B.N., Dienstag, J.L. iHoofnagle, J.H., Grune and Stratton, Inc. (1984)) oraz „Viral Hepatitis and Liver Disease” (Proceedings of the 1990 International Symposium, wyd. F.B. Hollinger, S.M. Lemon i H. Margolis, publ. Williams i Wilkins). Odnośniki dla HSV-1 i HSV-2 można znaleźć w publikacji WO92/16321.

Infekcja wirusem hepatitis A (HAV) jest szeroko występującym problemem, ale dostępne są szczepionki nadające się do masowych szczepień, np. Havrix (SmithKline Beecham Biologicals) będący martwąatenuowanąszczepionkąze szczepu HM-175 HAV [patrz „Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A”, F.E. Andre, A. Hepburn i E.D'Hondt, Prog Med. Virol., tom 37, str. 72-75 (1990) i monografia produktu „Havrix” opublikowana przez SmithKline Beecham Biologicals (1991)].

Flehming i in. (loc. cit., str. 56-71) przejrzał kliniczne aspekty, wirologię, immunologię i epidemiologię Hepatitis A i przedyskutował podejście do opracowywania szczepionek wobec tej pospolitej infekcji wirusowej.

W niniejszym opisie wyrażenie „antygen HAV” odnosi się do antygenu zdolnego do neutralizacji przeciwciała HAV u ludzi. Antygen HAV może zawierać żywe atenuowane cząstki wirusa lub zdezaktywowane atenuowane cząstki wirusa, albo też może być kapsyd lub białko wirusowe HAV, dogodne do wytworzenia metodami inżynierii genetycznej.

Infekcja wirusem hepatitis B (HBV) jest szeroko występującym problemem, ale dostępne są szczepionki nadające się do masowych szczepień, np. Engerix-B (SmithKline Beecham plc) otrzymywany metodami inżynierii genetycznej.

Wytwarzanie powierzchniowego antygenu Hepatitis B (HBsAg) jest dobrze udokumentowane. Patrz np. Hartford i in., Develop. Biol. Standard 54, str. 125 (1983), Gregg i in., Biotechnology, 5, str. 479 (1987), europejskie opisy patentowe EP-A-0226846, EP-A-0299108 i odnośniki tam zawarte.

W niniejszym opisie termin „antygen powierzchniowy Hepatitis B” lub „HBsAg” obejmuje każdy antygen HBsAg lub jego fragment wykazujący antygeniczoność antygenu powierzchniowego hBv. Należy rozumieć, że poza 226 aminokwasami sekwencji antygenu HBsAg S (patrz Tiollais i in., Nature, 317,489 (1985) i odnośniki tam zawarte) HBsAg opisany tutaj może w razie potrzeby zawierać całość lub część sekwencji pre-S opisanej w powyższych odnośnikach i w europejskim opisie patentowym EP-A-0278940. W szczególności HBsAg może stanowić polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów zawieraj ącąreszty 12-52, a następnie 133-145 i 175-400 białka L HBsAg względem otwartej ramki odczytu wirusa B Hepatitis serotypu ad (polipeptyd ten określa się jako L*, patrz europejski opis patentowy EP 0414374). HBsAg z zakresu wynalazku może także zawierać polipeptyd preS1-preS2-s opisany w europejskim opisie patentowym EP 0198474 (Endotronics) lub jego analogi takie, jak opisano w europejskim opisie patentowym EP 0304578 (McCormick i Jones). Opisany tutaj HBsAg może się też odnosić do mutantów, np. „mutanta ucieczkowego” opisanego w publikacji WO 91/14703 lub europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0511855A1, a szczególnie do HBsAg, w którym na pozycji 145 glicynę podstawiono argininą.

Zwykle HBsAg występuje w postaci cząstek. Cząstki mogą zawierać np. białko S samo lub w postaci złożonych cząstek, np. (L*, S), gdzie L* jest takie, jak zdefiniowano powyżej, a S oznacza białko S HBsAg. Wymieniona cząstka ma korzystnie postać, w której jest produktem ekspresji w drożdżach.

Glikoproteina D wirusa Herpex Simplex mieści się w osłonie wirusa, a także możnają znaleźć w cytoplazmie zarażonych komórek (Eisenberg R.J. i in., J. of Virol. 1980, 35, 428-435). Składa się z 393 aminokwasów, w tym peptydu sygnałowego, i ma masę cząsteczkową około 60 kD. Ze wszystkich glikoprotein osłony tajest chyba najlepiej zbadana (Cohen i in. Virology 60,157-166). Wiadomo, że in vivo gra główną rolę w łączeniu się wirusa z błoną komórkową. Ponadto glikoproteina D wydziela neutralizujące przeciwciała in vivo (Eing i in. J. Med. Virology 127, 59-65).

178 578

Jednak latentny wirus HSV2 może wciąż ożyć i indukować nawrót choroby pomimo wysokiego poziomu neutralizujących przeciwciał w osoczu pacjenta. Jest więc oczywiste, że zdolność do indukowania tylko neutralizujących przeciwciał nie wystarcza do właściwego zwalczenia choroby.

W kompozycjach szczepionek według wynalazku korzystnie stosuje się dojrzałą rekombinacyjną uciętą glikoproteinę D (rgD2t) lub równoważne białka. Równoważne białka obejmują glikoproteinę gD z HSV-1.

W korzystnym aspekcie rgD₂tjest glikoproteinąD o 308 aminokwasach, zawierająca aminokwasy od 1do 306 z naturalnej glikoproteiny z dodatkiem asparaginy lub glutaminy na końcu C uciętego białka. Ta postać białka obejmuje peptyd sygnałowy, który jest ucinany dając dojrzałe białko z 238 aminokwasami. Wytarzanie takiego białka w komórkach jajnika chomików chińskich opisuje europejski opis patentowy Genetech EP-B-139417 i Science 222, str. 524, a także Biotechnology, czerwiec 1984, str. 527. Taka szczepionka, skomponowana z małym MPL według wynalazku ma znacznie większy potencjał terapeutyczny niż znane kompozycj e rgD₂tChociaż pewne doświadczalne i dostępne w handlu szczepionki dają doskonałe wyniki, wiadomo dobrze, że optymalna szczepionka musi stymulować nie tylko neutralizujące przeciwciało, ale także powinna stymulować tak skutecznie, jak to możliwe, odporność komórkową mediowaną komórkami T.

Szczególnie korzystne jest, że kompozycje szczepionek według wynalazku skutecznie indukują zabezpieczającą odporność, nawet przy badzo niewielkich dawkach antygenu.

Stanowią one doskonałą ochronę przeciwko pierwotnej i nawrotowej infekcji, a także korzystnie stymulują zarówno specyficznąpozakomórkową (neutralizującąprzeciwciała), a także mediowaną komórkami efektorowymi (DTH) odpowiedź immunologiczną.

W celu wytworzenia 3-deacylowanego monofosforylolipidu A z małymi rozmiarami cząstek, zwykle nie przekraczającymi 120 nm, można stosować procedurę opisanąw brytyj skim opisie patentowym GB 2200211 uzyskuj ąc znane 3D-MPL (lub handlowe MPL o większych rozmiarach cząstek można zakupić w Ribi Immunochem) i a następnie produkt można poddać działaniu ultradźwięków aż do otrzymania przejrzystego roztworu. Rozmiary cząstek można oszacować stosując dynamiczne rozpraszanie światła opisane poniżej. W celu utrzymania rozmiarów MPL w zakresie 100 nm po połączeniu z wodorotlenkiem glinu, antygenem i buforem, można dodać Tween 80 lub sorbitol. W tych warunkach ustalono, że MPL nie ulega agregacji w obecności bufora fosforanowego, jak to jest możliwe wjego nieobecności. Postępując w ten sposób określa się dokładniej końcową kompozycję. MPL wciąż oddziaływuje z wodorotlenkiem glinu i antygenem tworząc wyodrębnionąjednostkę. Przejrzysty zawiesina MPL również stanowi aspekt wynalazku. Zawiesinę można sterylizować przepuszczając ją przez filtr.

Korzystnie rozmiary cząstek w zawiesinie wynoszą 60-120 nm.

Najkorzystniej rozmiary cząstek w zawiesinie wynoszą poniżej 100 nm.

mPl zdefiniowany powyżej występuje w ilości 10-200 pg, korzystnie 25-50 pg na dawkę, w której antygen występuje w ilości 2-50 pg lub więcej. Kompozycja szczepionki według wynalazku może zawierać ponadto immunostymulatory, a w korzystnej odmianie QS21 (nazywane niekiedy QA21). Jest to frakcja HPLC ekstraktu saponiny pochodzącego z kory drzewa Quillaja Saponaria Molina, a sposób jej wytwarzania podaje opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5057540.

Nośnik może być ewentualnie emulsjątypu olej w wodzie, nośnikiem lipidów lub wodorotlenkiem glinu (solą wodorotlenku glinu).

Nietoksyczne emulsje typu olej w wodzie korzystnie zawierają nietoksyczny olej, np. skwalen, oraz emulgator taki jak Tween 80, w wodnym nośniku. Wodny nośnik może być np. solanką buforowaną fosforanem.

Korzystnie kompozycje szczepionki będą zawierały antygen lub kompozycję antygenową mogącą wywoływać odpowiedź immunologiczną wobec ludzkich lub zwierzęcych patogenów, przy czym antygen lub antygenowa kompozycja pochodzi w HIV-1 (taki jak gp120 lub gp160, patrz publikacja WO 92/06113 i odnośniki tam umieszczone), wirusa opryszczki, takijak gD lub

178 578 jego pochodne, lub białko Immediate Early takiejak ICP27 z HSV-1 lub HSV-2, gB (lubjego pochodne) z ludzkiego cytomegalowirusa, lub gpl, II lub III z wirusa Varicella Zoster, lub z wirusa żółtaczki, takiego jak wirus hepatitis B albo wobec innych wirusowych patogenów, takich jak Respiratory Syncytial Virus, wirus ludzkiego brodawczaka lub grypy, albo też patogenów bakteryjnych, takich jak Salmonella, Neisseria, Borr^lia (np. OspA lub OspB lub jego pochodne), lub Chlamydia, lub Bordetella, np. P.69, PT lub FHA, i pasożytów takichjak plazmodium lub Toxoplasma. Kompozycje szczepionki według wynalazku mogązawierać antygen nowotworowy, i nadawać się na szczepionkę przeciwrakową.

Jednąz odmian wynalazku jest kompozycja zawierająca antygen HAV (np. jak w Havrix) w mieszaninie z MPL i wodorotlenkiem glinu zgodnie z poniższym opisem.

Kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja zawierająca antygen powierzchniowy wirusa HB (HBsAg) (np. jak w Engerix) w mieszaninie z MPL i wodorotlenkiem glinu zgodnie z poniższym opisem.

Kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja zawierająca antygen HBsAg jako cząstki (L8, S) w mieszaninie z MPL i wodorotlenkiem glinu.

Kombinowane szczepionki Hepatitis A z Hepatitis B można wytwarzać zgodnie ze sposobem według wynalazku.

Kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja szczepionki zawierająca dojrzałą uciętą glikoproteinę D(rgD2)) lub równoważne białka opisane powyżej. Tak więc kolejną. odmianą wynalazku jest kompozycja według wynalazku zawierająca antygen OspA lub jego pochodną z Borelia btagdorferi. Można na przykład stosować antygeny, szczególnie antygeny OsaA ze szczepów ZS7' lub B31. Tak więc kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja szczepionki zawierająca antygen grypy. Dzięki temu otrzymuje się z ulepszoną szczepionkę przeciw grypie, szczególnie przy zastosowaniu wirusa rozszczepionego.

Kompozycję można stosować także z lekkimi cząstkami opryszczkowymi, takimi jak opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/GB92/00824 i międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/GB/00179.

Korzystnie kompozycje szczepionki według wynalazku zawierają inne antygeny do skutecznego leczenia lub profilaktyki jednej lub wielu infekcji bakteryjnych, wirusowych lub grzybiczych.

Np. kompozycje szczepionki na żółtaczkę według wynalazku korzystnie zawierająco najmniej jeden składnik taki jak antygen nieżółtaczkowy, znany z tego, że nadaje odporność na jedną lub kilka z powyższych infekcji: defteryt, tężec, koklusz, Haemofilis influenzae b (Hib) oraz polio.

Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera HBsAg jak zdefiniowano powyżej. Szczególna kombinacja szczepionki według wynalazku obejmuje kombinację szczepionek DTP (dyfteryt-tężec-koklusz^hepatitis B, kombinację szczepionek Hib-hepatitis B, kombinację szczepionek DTP-Hib-hepatitis B i kombinację szczepionek IPV (nieaktywna szczepionka aoli)-DTP-Hib-hepatitis B.

Powyższe kombinacje mogą korzystnie zawiera składnik zabezpieczający przed Hepatitis A, szczególnie martwy osłabiony szczep pochodzący ze szczepu HM-175 obecny w Havrix.

Odpowiednie składniki takich szczepionek są dostępne w handlu, a szczegóły można otrzymać ze Światowej Organizacji Zdrowia. Na przykład składnik IPV może być zdeaktywowaną szczepionką przeciw polio Salka. Szczepiona przeciwko krztuścowi może zawierać całe komórki lub produkty komórkowe.

Korzystnie szczepionka przeciw hepatitis lub kombinowana jest szczepionką pediatryczną.

Kompozycje szczepionek według wynalazku mają zastosowanie w terapii medycznej, szczególnie do leczenia lub profilaktyki infekcji, w tym wirusowych i bakteryjnych, lub do immunoterapeutycznego leczenia nowotworów. W korzystnym aspekcie szczepionka według wynalazku stanowi szczepionkę terapeutyczną do leczenia istniejących infekcji, np. żółtaczki B lub opryszczki u ludzi.

178 578

Preparaty szczepionkowe są opisane ogólnie w New Trends and Developments in Vaccines, wyd. Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Kapsułkowanie liposomami opisuje np. Fullerton, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4372945 i Armor i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4474757.

Ilość antygenu w każdej dawce szczepionki dobiera się tak, indukowała immunozabezpieczającą odpowiedź bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych typowych szczepionek. Ilość ta będzie zmieniała się w zależności od rodzaju wykorzystanych immunogenów. Zwykle można się spodziewać, że każda będzie zawierać 1-1000 pg pełnego immunogenu, korzystnie 2-100 pg, najkorzystniej 4-40 pg. Optymalną ilość dla konkretnej szczepionki można ustalić w standardowy sposób, w tym obserwując miano przeciwciał lub inne odpowiedzi u badanych. Po wstępnym szczepieniu pacjenci mogąotrzymać wtórnąszczepionkę po około 4 tygodniach.

W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki skutecznej w zapobieganiu lub leczeniu infekcji, który to sposób polega na mieszaniu antygenu z nośnikiem i zawiesinąMPL, przy czym rozmiary cząstek MPL korzystnie nie przekraczają 120 nm, zwykle 60-120 nm, bardziej korzystnie około 100 nm lub mniej.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek i pokazują płynące z niego korzyści.

Przykład 1: Wytwarzanie MPL o rozmiarach cząstek 60-120 nm.

Wodę do zastrzyków wprowadza się do fiolek zawierających 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (MPL) z Ribi Immunochem, Montana, przy pomocy strzykawki do stężenia 1 do 2 mg/ml. Zawiesinę początkowąuzyskano stosując mieszanie wirowe. Zawartość fiolek przeniesiono do 25 ml okrągłodennych probówek Corex (10 ml zawiesiny na probówkę) i zawiesinę poddano działaniu ultradźwięków w łaźni ultradźwiękowej. Gdy zawiesina stała się przejrzysta, rozmiary cząstek oceniono metodą dynamicznego rozpraszania światła (Malvern Zetasizer 3). Obróbkę kontynuowano do osiągnięcia przez cząstki MPL rozmiarów 60-120 nm.

Zawiesiny można w pewnych przypadkach przechowywać w temperaturze 4°C bez znaczącej agregacji do 5 miesięcy. Izotoniczny NaCl (0,15 M) lub izotoniczny NaCl z 40 mM fosforanu indukuje gwałtowną agregację (rozmiar >3-5 pm).

Przykład 2: Wytwarzanie wielkoskalowe sterylnego rozpuszczalnego MPL o rozmiarach cząstek poniżej 100 nm.

Liofilizowany 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (MPL) z Ribi Immunochem umieszczono w zawiesinie w wodzie do zastrzyków (WFI). Zawiesinę przepompowywano w sposób ciągły przez ultradźwiękową komorę przepływową. Komora taka jest sporządzana ze szkła lub stali nierdzewnej z uszczelnieniem z PTFE, aby spełniać wymagania praktyki ogólnolekarskiej. Ultradźwięki generuje się odpowiednim generatorem i sonotrodą z Undatim Ultrasonics (Louvain-La-Neuve, Belgia). Wymiennik ciepła dołącza się do pętli w celu uniknięcia degradacji cieplnej produktu. Temperatura MPL między wlotem a wylotem komory wynosi od +4°C do 30°C, a różnica tych temperatur nie przekracza 20°C. Należy rozumieć, że ciepło jest usuwane w miarę przechodzenia materiału przez aparat.

Aparat ten pokazano schematycznie na fig. 1.

2.1. Ultradźwięki

Proszek MPL(5 Odo 500 mg) umieszcza się w zawiesinie w WFI w stężeniu od 1do2 mg/ml.

Zawiesinę MPL (w warunkach mieszania) przepompowuje się w sposób ciągły przez pętlę ultrr^cU^^^wicęktową (fig. 1) z natężeniem od 50 do 100 ml na minutę w celu uzyskania temperatury równowagi układu wynoszącej od +4 do +15°C.

Widmo własnej częstotliwości sonotrody w układzie (moc, komora przepływowa, natężenie przepływu cieczy, temperatura) ustawia się zgodnie z instrukcją producenta. Wstępnie ustalone granice mieszczą się od 19000 do 21000 Hz dla przetwornika 20000 Hz.

Generator pozwala kontrolować optymalną wydajność obróbki ultradźwiękowej (więcej energii i mniej ciepła) w danym czasie.

Temperatura w czasie procesu wynosi poniżej 30°C, aby uniknąć degradacji MPL.

Proces jest zakończony, gdy cząstki mająrozmiary poniżej 100 nm, a roztwórjest widocznie przejrzysty. W czasie działania ultradźwiękami pobiera się próbki, aby ustalić .rozmiary cząstek

178 578 metodąfotokorekcyjnej spektroskopii (dynamiczne rozpraszanie światła) stosując Malvern Zetasizer 3 w taki sposób, jak w przykładzie 1. Całkowity czas przebywania cieczy w komorze oblicza się na od 2,5 do 3,5 minuty (patrz tabela 1) przy komorze o pojemności 20 ml i natężeniu recyrkulacji 50 ml na minutę. Daje to średni czas przebywania 25 s na cykl, a zwykle potrzeba mniej niż 10 cykli dla uzyskania pożądanego efektu - małych cząstek MPL.

2.2. Proces sterylizacji

Powstały „rozpuszczony” MPL sterylizuje się przez ślepą filtrację na hydrofitowej membranie PVDF 0,22 pm. Obserwowane ciśnienie wynosi poniżej 1 bar. Co najmniej 25 mg „rozpuszczonego” MPL z łatwością przetwarza się na 1 cm² z odzyskiem ponad 85%.

2.3. Przechowywanie/Trwałość

Sterylny „rozpuszczony” MPL przechowuje się w temperaturze +2 do 8°C. Dane o trwałości (Malvern) nie wykazują znacznych różnic rozmiarów cząstek po 6 miesiącach przechowywani (patrz tabela 2).

Przykład 3: Kompozycja szczepionki przeciwkoHepatitis B.

MPL o rozmiarach cząstek poniżej 100 nm otrzymano jak w przykładzie 1. Wodorotlenek glinu otrzymano z Superfos (Alhydrogel).

MPL umieszczono w zawiesinie w wodzie do zastrzyków w stężeniach od 0,2 do 1 mg.ml metodą działania ultradźwiękami w łaźni wodnej, aż do osiągnięcia rozmiarów cząstek od 80 do 500 nm, według pomiaru fotokorekcyjnego rozpraszania światła.

Od 1 do 20 pg HBsAg (S-antygen, jak w Engerix B) w roztworze bufora fosforanowego (1 mg/ml)zaadsorbowanona30do 100 pg wodorotlenku glinu (roztwór 10,3 8 mg/ml Al³⁺) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Do roztworu dodano następnie 30 do 50 pg MPL (roztwór 1 mg/ml). Objętość i osmotyczność ustawiono na 600 pl wodą do zastrzyków i stężonym 5-krotnie buforem fosforanowym. Roztwór inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i trzymano w temperaturze 4°C do użycia. Dojrzewanie kompozycji zachodzi w czasie przechowywania. Całość stanowi 10 dawek wstrzykiwanych przy testach na myszach.

Przykład 4: kompozycja szczepionki przeciwko Hepatitis A.

MPL o rozmiarach cząstek poniżej 100 nm otrzymano jak w przykładzie 1. Wodorotlenek glinu otrzymano z Superfos (Alhydrogel).

HAV (360 do 22 EU (jednostki ELISA) na dawkę) poddano wstępnej adsorpcji na 10% końcowego stężenia wodorotlenku glinu (0,5 mg/ml). Do roztworu dodano MPL (12,5 do 100 pg na dawkę).

Pozostały wodorotlenek glinu dodano do roztworu i pozostawiono na godzinę w temperaturze pokojowej. Objętości uzupełniono buforem fosforanowym i końcowąkompozycję trzymano w temperaturze 4°C do użycia.

Przykład 5: Porównanie skuteczności adiuwantów w szczepionce rekombinacyjnej podjednostki glikoproteiny D Herpes Simplex.

5.1. W studium tym określono zdolność kompozycji Al(OH)₃ z MPL do polepszania odporności ochronnej obciętej glikoproteiny D wirusa Herpes Simplex typu 2. Stadia immunogeniczne przeprowadzono na naczelnych. Celem eksperymentów było zbadanie wpływu rozmiarów cząstek 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (MPL) na immunogenność i skuteczność kompozycji rgD2t, Al(OH)₃ i MPL u gryzoni i naczelnych. Zbadano trzy różne kompozycje Al(OH)₃ z MPL o małych rozmiarach cząstek:

Al(OH)3 z MPL 100 nm (jak opisano poprzednio)

Al(OH)3 z MPL i sorbitolem

Al(OH)3 z MPL i Tween

5.2. Kompozycje antygenowe

Wodorotlenek glinu (Al(OH)3) otrzymano z Superfos (Alhydrogel Superfod, Dania). MPL otrzymano z Ribi Immunochem Research Inc.

178 578

5.2.1.1. rgD₂t z Al(OH)₃/MPL i TEA (trójetyloglin)

MPL umieszczono metodą działania ultradźwiękami w łaźni wodnej otrzymując rozmiary cząstek od 200 do 600 nm. Preparaty otrzymano zgodnie ze zgłoszeniem patentowym nr WO 92/16231 i przechowywano w temperaturze 4°C przed użyciem.

Dawka zawierała 5 pg fgD₂t, 0,5 mg Al(OH)₃ i 50 pg MPL.

5.2.1.2. rgD2t z Al(OH)₃/MPL 100 nm

MPL (rozmiary cząstek poniżej 100 nm) otrzymano jak w przykładzie 1. rgD2t adsorbowano na wodorotlenku glinu i inkubowano jeszcze przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Preparat skompletowano dodając bufor PBS z końcowym stężeniem 10 nM PO₄ i 150 mM NaCl. Końcową kompozycję inkubowano dalej przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przechowywano w temperaturze 4°C przed użyciem.

Dawka zawierała 5 pg fgD2t, 0,5 mg Al(OH)3 i 50 pg MPL.

5.2.1.3. rgD₂t z Al(OH)3/MPL 100 nm i sorbitol

MPL otrzymano jak w przykładzie 1. rgD2t adsorbowano na wodorotlenku glinu i inkubowano jeszcze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Dodano następnie 50% roztwór sorbitolu do końcowego stężenia 5%. Dodano następnie roztwór Tris 10 mM do końcowej objętości i ihkubowano jeszcze przez godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

Kompozycję przechowywano w temperaturze 4°C przed użyciem.

Dawka zawierała 5 pg fgD2t, 0,5 mg Al(OH)3 i 50 pg MPL.

5.2.1.4. rgD₂t z Al(OH)3/MPL 100 nm i Tween

MPL otrzymano jak w przykładzie 1. W celu utrzymania rozmiarów cząstek MPL 100 nm dodano do roztworu Tween 80 w stężeniu takim, że daje stężenie 0,01 %w końcowej kompozycji. Dalej przygotowano kompozycję jak powyżej w 5.2.1.3.

Dawka zawierała 5 pg fgD2t, 0,5 mg Al (OH)3 i 50 pg MPL.

5.3. Eksperyment profilaktyczny na świnkach morskich

W eksperymentach zaszczepiono grupę świnek morskich w dniu 0 i 28 5 pg rgD₂t w dwu różnych kompozycjach MPL z wodorotlenkiem glinu. Szczepiono podskórnie dawką 0,5 ml. W miesiąc po pierwszym szczepieniu prowadzono świnkom dopochwowo 10⁵ jednostek HSV2 szczep MS. Obserwowano je codziennie szukając pierwotnej i nawrotnej choroby HSV2 (dni 4 do 39 po zarażeniu).

5.3.1. Eksperymenty terapeutyczne na świnkach morskich

W eksperymentach zarażono grupę świnek morskich 10⁵jednostkami HSV2 szczep MS. Po wyzdrowieniu z pierwotnej infekcji obserwowano je codziennie szukając nawrotu choroby opryszczkowej (dni 13 do 21). Świnki zaszczepiono w -dniu 21 i 42 szczepionką rgDfoA/OH/./MPL. Szczepionki podawano podskórnie w dawce 0,5 ml. Zwierzęta obserwowano codziennie na obecność opryszczkowych uszkodzeń aż około do dnia 60 do 84.

5.3.2. Studia immunogenności u naczelnych

Immunogenność rgD₂t/Al(OH)3/MPL w kombinacji z MPL w sorbitolu przeprowadzono na afrykańskich zielonych małpach. Grupy małp zaszczepiono w dniu 0 i 28 20 pg rgD2t i 0,5 mg Al(OH)3 z 50,20 lub 5 pg MPL w sorbitolu. Badano specyficzne pozakomórkowe (miano ELISA i zobojętniające) oraz komórek efektorowych (reakcja nadwrażliwa typu opóźnionego DTH) odpowiedzi immunologiczne. Kompozycje podawano domięśniowo w dawce 1 ml. Preparaty kompozycji przygotowywano tak, jak opisano powyżej. Badano krew zwierząt co około dwa tygodnie w celu stwierdzenia obecności przeciwciał.

Odpowiedź DTH badano w 14 dni po drugim szczepieniu. Opis testu skórnego podano poniżej.

5.4. Odczyty informacji

Przeprowadzono testy w celu określenia specyficznej odpowiedzi na przeciwciała indukowanej przez kompozycje rgD₂t/Al(OH).3/MPL (określenie miana ELISA anty-rgD2t i miana zobojętniającego anty-HSV2). Skuteczność ochronną, kompozycji gD2 oceniano na modelach profilaktycznych i terapeutycznych na świnkach morskich. Przeprowadzono także na małpach studia immunogenności. Określono odpowiedzi specyficzne pozakomórkowe i DTH.

178 578

5.4.1. Miana ELISA i zobojętniające

Określono miana anty-przeciwciało rgD₂t i aktywność neutralizującą anty-HSV2 zgodnie ze sposobami podanymi w zgłoszeniu patentowym WO 92/16231.

5.4.2. Nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH)

Kompozycje rgD2t przetestowano na zdolność indukowania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla komórek T mierzonej przez indukcję odpowiedzi nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH).

Afrykańskie zielone małpy zaszczepiono w dniu 0 i 28 20 pg kompozycji szczepionki gD2 podawanej domięśniowo. Wykonano na nich testy skórne w 14 dni po drugim szczepieniu metodą śródskómej iniekcji na brzuchu 15 lub 5 pg rgD₂t w solance. Wykonano na nich testy skórne z solankąjako płynem kontrolnym. Miejsce iniekcji zbadano w 24 i 48 godzin później w poszukiwaniu rumienia i stwardnienia. Zmierzono rozmiary lokalnych reakcji.

5.4.3. Model dopochwowy zarażenia na śwince morskiej

Model ze świnką morską infekcji genitalnej HSV opisał L. Stanberry i in. (J. of Infectious Diseases 1982, 146:397-403); Intervirology 1985, 24: 226-231). Krótko, w eksperymentach profilaktycznych świnki morskie zarażono dopochwowo 10⁵jednostek HSV2 szczep MS w miesiąc po ostatnim szczepieniu. Obserwowano codziennie kliniczny przebieg pierwotnej choroby i ostrość uszkodzeń skóry genitalnej w 4-12 dni po zarażeniu. Badano codziennie zwierzęta na obecność powrotnych uszkodzeń optyszczkowych w dniach od 13 do 39. W eksperymentach terapeutycznych świnki morskie zarażono w dniu 0 10⁵jednostkami HSV2 szczep MS. Po wyzdrowieniu z pierwotnej infekcji badano je codziennie pod kątem nawrotu opryszczki (dni 13 do 21), po czym podzielono na grupy przypadkowo zgodnie z skutkami choroby pierwotnej i wtórnej (równoważny rozkład zwierząt z łagodną i ostrą infekcją w każdej grupie) w celu wykonania szczepienia lub niewykonania szczepienia. Szczepionkę podawano w dniu 20 i 41 po zarażeniu. Rozkład obecności nawrotu choroby obserwowano zwykłe w około 70 dni po zarażeniu.

Uszkodzenia opiyszczkowe oceniono ilościowo stosując skalę od 0 do 32.

Skala ocen

Typ uszkodzenia	Ocena
Brak	0
Uszkodzenia pochwowe
- krwawienie	0,5
- zaczerwienienie przez 1 do 2 dni bez krwawienia	0,5
- zaczerwienienie i krwawienie przez dzień	1
- zaczerwienienie bez krwawienia przez co najmniej 3 dni	1
Zewnętrzne pęcherzyki opryszczkowe
- <4 małe pęcherzyki	2
- > 4 małe pęcherzyki lub 1 duży	4
- > 4 duże uszkodzenia	8
- zlewające się duże uszkodzenia	16
- zlewające się duże uszkodzenia na całych zewnętrzu genitaliów	32

Odczyty kliniczne

Infekcja pierwotna

- Ostrość urzkodzzkia - en arna duiennyeh odczytów yróez prz z dn do 12 po infekcji.

Ostrość uszkodzenia wyraża się jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe, a także medianę (lepsze dla testu bezparametrowego)

178 578

- Wystąpienia pierwotnej infekcji = % zwierząt mających maksymalne oceny 0,0,:5,12,4, lub 16 (rzadziej 32).

Indeks pierwotnej infekcji=Ą (maks. ocena i) x (% wystąpień) z i = 0,0,5,2,4,8 lub 16.

Nawrót choroby

- Liczba dni nawrotu = liczba dni z nawrotem dla dni od 13 do 39 po infekcji. Jeden nawrót musi być poprzedzany i musi po nim następować jeden dzień bez uszkodzeń, a w jego okresie muszą być dwa dni z rumieniem lub jeden z pęcherzykami. Liczba dni nawrotu jest wyrażana średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe i medianami.

- Ostrość nawrotu=suma dziennych ocen dla dni od 13 do 39 po infekcji. Wyniki sąpodane jako średnie arytmetyczne ± odchylenia standardowe i mediany.

5.5. Wyniki

Skuteczność ochronna różnych kompozycji rgD₂t/Al(OH)₃/MPL porównano w eksperymentach profilaktycznych na świnkach morskich. Przeprowadzono także na naczelnych studia immunogenności. Celem tych eksperymentów było porównanie immunogenności i skuteczności ochronnej ^^D₂t^zAl(OH)₃ w połączeniu z MPL o różnych rozmiarach cząstek.

5.5.1. Eksperymenty profilaktyczne

Przeprowadzono dwa eksperymenty w celu określenia potencjału różnych szczepionek rgD2t/Al(OH)₃/MPL w chronieniu przed pierwotną i powrotną chorobą HSV2 przy podawaniu świnkom morskim przed zarażeniem dopochwowym.

Eksperyment 1: Porównanie MPL 100 nm z sorbitolem z MPL z TEA

Grupę samic świnek morskich Hartleya (200-250 g) zaszczepiono w dniu 0 i 28 5 pg rgD2t/Al(OH)₃ w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek (100 nm, MPL w sorbitolu) lub większych (MPL w TEA). Kontrolne zwierzęta zaszczepiono zgodnie z tym samym protokołem adiuwantem lub nie szczepiono wcale. Krew pobierano w dniu 14 i 28 po drugim szczepieniu w celu określenia przeciwciał w teście ELISA lub teście zobojętniania. Zwierzęta zarażono 29 dni po drugim szczepieniu 10⁵jednostkami HSV2 szczep MS dopochwowo. Po zarażeniu obserwowano je codziennie szukając śladów ostrej infekcji (dni 4 do 12 po zarażeniu) i dowodów nawrotnej choroby opryszczkowej (dni 13 do 39 po zarażeniu).

a) indukcja odporności pozakomórkowej

Jak pokazano w tabeli 3, wyższe miana ELISA i zobojętniające uzyskano w przypadku stosowania MPL o małych rozmiarach cząstek w kompozycji ng.D₂t/Al(OH)₃.

b) Wpływ szczepienia na pierwotną infekcję HSV2 (tabela 3)

W porównaniu z grupą kontrolną zarażoną i przechodzącą ostrą pierwotną infekcję, obie szczepione grupy wykazały znacznie niższy poziom uszkodzeń (p <0,00005). Rzadsze występowanie uszkodzeń skóry zaobserwowano w przypadku grupy szczepionej rgD₂t/Al(OH)3/MPL 100 nm (p<0.06).

c) Wpływ szczepienia na nawrotnąinfekcję HSV2

Wyniki podaje tabela 4. W porównaniu z kontrolną grupą obie szczepionki były w stanie wstrzymać rozwój nawrotu choroby opryszczkowej, na co wskazywała mniej sza liczba przypadków nawrotu (p <0,02 dla rgD₂t/Al(OH)₃MPL 100 nm).

d) Wnioski

Obie kompozycje sąw stanie zapewnić znai^^^ochronę przed pierwotnąinfekcją i zmniejszyć zakres nawrotu choroby. Wyniki pokazują, że kompozycja rgD2t/Al(OH)3/MPL z cząstkami MPL o małych rozmiarach ma bardzo dużą skuteczność profilaktyczną.

Eksperyment 2: Skuteczność Al(OH)3/MPL 100 nm

Grupę świnek morskich Hartleya (200-250 g) zaszczepiono w dniu 0 i 28 5 pg gD2 w Al(OH)3 z MPL 100 nm. Szczepienie wykonano podskórnie w dawce 0,5 ml. Kontrolne zwierzęta zaszczepiono zgodnie z tym samym protokołem adiuwantem lub nie szczepiono wcale. Krew pobierano w dniu 14 i 28 po drugim szczepieniu w celu określenia przeciwciał w teście ELISA lub teście zobojętniania. Zwierzęta zarażono 29 dni po drugim szczepieniu 10⁵ jednostkami HSV2 szczep MS dopochwowo.

a) indukcja odporności pozakomórkowej

178 578

Jak pokazano w tabeli 3, grupa szczepiona wykazała dobre miana ELISA i zobojętniające. Grupa kontrolna nie wykazała wykrywalnej odpowiedzi pczeciwciałowej.

b) Wpływ szczepienia na pierwotną infekcję HSV2 (tabela 3)

W porównaniu z grupąkontrolnązarażoną i przechodzącą ostrąpierwotną infekcję, szczepiona grupa wykazała znacznie niższy poziom uszkodzeń (p < 0,00005) i występowania (p < 0,002). Nie zaobserwowano zewnętrznych uszkodzeń skóry u szczepionych świnek morskich.

c) Wpływ szczepienia na nawrotną infekcję HSV2 (tabela 4)

W porównaniu z kontrolną grupą szczepionka rg'D₂t^/Al(OH)₃/MPL była w stanie zmienić rozwój nawrotu choroby opryszczkowej, na co wskazywała znaczna redukcja ostrości przypadków nawrotu (p < 0,00005) i częstości nawrotów (p < 0,01)

d) Wnioski

Kompozycja rgD₂t/Al(OH)₃ z cząstkami MPL o małych rozmiarach ma bardzo dużąskuteczność w zapewnianiu ochrony przed pierwotną i wtórną infekcją HSV2 u świnek morskich.

Z eksperymentów opisanych powyżej można wyciągnąć wniosek, że kompozycje Al(OH)₃ z MPL o małych rozmiarach otrzymane na dwa różne sposoby indukująco najmniej tak silną odpowiedź profilaktyczną, jak kompozycje Al(OH)3 z MPL o dużych rozmiarach. Ponadto MPL o małych rozmiarach korzystnie ulega łatwej sterylizacji przed użyciem.

5.5.2. Eksperymenty terapeutyczne

Celem tych eksperymentów jest porównanie potencjału terapeutycznego różnych kompozycji rgD2t/Al(OH)₃/MPL w czasie nawrotu opryszczki u świnek morskich z ustaloną infekcjąHSV2.

Świnki morskie szczepiono dopochwowo w dniu 0 10⁵jednostkami HSV2 szczep MS. Obserwowano je codziennie szukając pierwotnej infekcji (dni 4 do 12), atakże nawrotu infekcji opryszczkowej (dni 13 do 20). Zwierzęta podzielono na grupy przypadkowo zgodnie z skutkami choroby pierwotnej i wtórnej (równoważny rozkład zwierząt z łagodną i ostrą infekcją w każdej grupie). Świnki morskie bez śladów klinicznych infekcji nie wprowadzono do protokołu. Szczepionkę podawano podskórnie w dniu 21 i 42 po zarażeniu.

Terapeutycznąinfekcję rgD₂t/Al(OH)₃/MPL oceniono w trzech różnych eksperymentach.

Eksperyment 1: Porównanie rgD₂t/Al(OH)3 z MPL o dużych rozmiarach cząstek (MPL w TEA)

Świnki morskie z nawrotem choroby podzielono na grupy, podając im albo 20 pg rgD2t/Al(OH)3 z MPL o dużych rozmiarach cząstek (MPL w TEA), lub sam adiuwant. Szczepionki podawano podskórnie w dniu 21 i 42 po zarażeniu. Rozkład nawrotów choroby obserwowano do dnia 84.

Jak pokazuje tabela 3, kompozycja rgD2t/Al(OH)3/MPL z TEA nie była skuteczna w osłabianiu trwaaącego nawrotu infekcji;

Eksperyment 2: Skuteczność rgD2t/Al(OH)3 z MPL 100 nm

Dwie grupy świnek morskich zaszczepiono 20 pg rgD2t/Al(OH)3 z MPL o małych rozmiarach cząstek (MPL 100 nm), lub zaniechano szczepienia.

Szczepionki podawano w dniu 21 i 42 po zarażeniu.

Rozkład nawrotów choroby obserwowano do dnia 69.

Jak pokazuje tabela 5, w porównaniu z danymi z eksperymentu 1, gdzie użyto MPL o dużych rozmiarach cząstek, szczepienie rgD₂t/Al(OH)3/MPL 100 nm zmieniła częstość powstawania choroby HSV2 w porównaniu z grupąkontrolną, zmniejszając ostrość nawrotu (-39%, p <0,05) i liczbę dni z nawrotem (-28%, p <0,1).

Eksperyment 3: Porównanie skuteczności Al(OH)3 w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek

W eksperymencie zastosowano trzecią strategię otrzymywania MPL o małych rozmiarach cząstek: dodanie Tween, np. Tween 80.

Grupy eksperymentalne były następujące: Grupa 1 (n = 15): 20 pg rgD2t/Al(OH)₃ z MPL

100 nm z Tween

Grupa 2 (n = 15): 20 pg rgD2t/Al(OH)₃ z MPL 100 nm z sorbitolem

178 578

Grupa 3 (n = 16): kontrolna

Grup kontrolnych nie poddawano szczepieniu lub szczepiono tylko Al(OH)_:, z MPL. Szczepionki podawano w dniu 21 i 42 po zarażeniu. Rozkład nawrotów choroby obserwowano do dnia 60.

Wyniki pokazano w tabeli 5. Znaczne, wyraźne działanie terapeutyczne zaobserwowano u zwierząt szczepionych dwoma kompozycjami rgD2t/Al(OH)3 z MPL. Obie kompozycje znacznie zmniejszały ostrość nawrotów, liczbę dni ich trwania i liczbę nawrotów.

Wnioski

Zaobserwowano bardzo silne działanie terapeutyczne wobec ustalonego nawrotu genitalnej choroby HSV2 w przypadku dwu kompozycji rgD2t/Al(OH>3 z MPL o małych rozmiarach cząstek (około 100 nm). W przeciwieństwie do tego nie zaobserwowano działania terapeutycznego w przypadku MPL o dużych rozmiarach cząstek (MPL w TEA) dodawanego do szczepionki rgD₂t/Al(OH)3.

Wyniki otrzymane dla świnek morskich wyraźnie pokazują skuteczność profilaktyczną kompozycji rgD2t/Al(OH)3 z MPL o małych rozmiarach cząstek. Mają one wyższy potencjał terapeutyczny niż rgD2t/Al(OH)3 z MPL o dużych rozmiarach cząstek.

5.5.3. Studia immunogenności rgD₂t/Al(OH)3 w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek u naczelnych

Dawki 50,20 lub 5 pg MPL 100 nm połączono z 20 pg rgD2t i A/OH) (0,5 mg). Wykonano dwa szczepienia w dniu 0 i po miesiącu. Mierzono specyficzne pozakomórkowe (miano ELISA i zobojętniające) oraz komórek efektorowych (DTH) odpowiedzi immunologiczne.

a) procedura doświadczalna

Trzy grupy zielonych małp afrykańskich zaszczepiono w dniu 0 i 28 20 pg gD₂t z Al(OH)3 zawierającym 50,20 lub 5 pg MPL. Badano krew zwierząt co około dwa tygodnie w celu stwierdzenia obecności przeciwciał w testach ELISA (miana anty-gD2) i testach zobojętniających. Trzy kompozycje szczepionki porównano pod względem zdolności indukowania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla komórek T mierzonej przez indukcję odpowiedzi nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH). Na trzech małpach z każdej grupy wykonano na nich testy skórne w 14 dni po drugim szczepieniu metodą iniekcji na brzuchu 15 lub 5 pg gD2t w solance. Wykonano na nich także testy skórne z solankąjako płynem kontrolnym. Miej sce iniekcji zbadano w 24 i 48 godzin później w poszukiwaniu rumienia i stwardnienia.

b) Wyniki

Odpowiedzi serologiczne i DTH pokazuje tabela 6. Grupy małp szczepione kompozycją rgD₂t i Al(OH)3 zawierającą 50 lub 20 pg MPL wytwarzały znacznie więcej zobojętniających przeciwciał niż grupa otrzymująca dawkę 5 pg MPL (odpowiednio p <0,003 i p <0,008). Nie było wyraźnej różnicy w mianach ELISA i zobojętniającym mierzonych w grupach 50 lub 20 pg MPL. Zauważono korelację pomiędzy dawkąMPL a wpływem na odpowiedź immunologicznąkomórek efektorowych. Silnąodpowiedź DTH wykryto u większości małp (3/4) szczepionych kompozycjami z 50 lub 20 pg MPL. W przeciwieństwie do tego tylko jedna małpa z grupy 5 pg MPL wykazała odpowiedź w teście skórnym.

c) Wnioski

Dane podane powyżej pokazują, że działanie jako adiuwanta Al(OH)3 w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek jest skuteczne również u naczelnych, a nie tylko u małych gatunków zwierząt. U małp można zaobserwować korelację pomiędzy dawkąMPL i immunogenicznością kompozycji rgD2t/Al(OH)3/MPL , przy czym najlepszą odpowiedź serologiczną i DTH daje ilość 50 i 20 pg.

Przykład 6: BADANIA KLINICZNE szczepionek na Lyme i Hepatitis B oraz małych cząstek MPL

6.1. Szczepionka na chorobę Lyme zawierająca białko fuzyjne NS1(1-81)z wirusa grupy i

OspA z B. burgdorferi ZS7.

178 578

Wytwarzanie kompozycji

6.1.1. NS 1 -OspA/wodorotlenek glinu

NSl-OspA wytworzoną zgodnie z , procedurą ze zgłoszenia patentowego WO 93/04175 zaadsorbowano na wodorotlenku glinu i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę Końcową objętość osiągnięto dodając bufor fosforanowy (PO₄ 10 mM, NaCl 150 mM). Kompozycję przechowywano w temperaturze 4°C do wykorzystania.

Dawka zawiera 10 pg NS1-OspA/500 pg wodorotlenku glinu.

6.1.2. NS1-OspA/wOdorotlenek glinu/MPL

NS1-OspA zaadsorbowano na wodorotlenku glinu i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. MPL, wytworzony jak uprzednio opisano, dodano do kompozycji i ponownie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. -Końcową objętość osiągnięto dodając bufor fosforanowy (PO₄ 10mM,NaCl 150 mM). Kompozycję przechowywano w temperaturze 4°C do wykorzystania.

Dawka zawiera 10 pg NSl-OspA/500 pg wodorotlenku glinu/50 pg MPL.

6.1.3. Przebieg szczepień

Ochotnicy otrzymali trzykrotnie zastrzyki domięśniowe 1 ml danej kompozycji w dniach 0, 31 i 62. Osocza pobrano w 30 dnia po I, II i III szczepieniu. Poddano je analizie ELISA na łączną zawartość IgG anty-OspA i podobnądo LA-2 odpowiedź przeciwcialową w teście inhibicji (LA-2 wykazało jako przeciwciało działanie zabezpieczające przed infekcją u myszy).

6.2. Κοιτφί^ο^ε HHsAg/'MPL dla. luuzi

6.2.1. Wytwarzanie kompozycji

HBsAg 20 pg/wodorotlenek glinu 500 pg

HBsAg zaadsorbowano 'na końcowej ilości wodorotlenku glinu i końcową objętość osiągnięto dodając bufor fosforanowy z solanką (PO4 10 mM, NaCl 150 mM) dla dawki 1 ml. Kompozycję przechowywano w temperaturze 4°C do wykorzystania.

6.2.2. HBsAg 20 pg/wodorotlenek glinu 100 pg

HBsAg skomponowano jak powyżej adsorbując na 100 pg wodorotlenku glinu. Końcowa objętość wynosiła 1 ml na dawkę.

6.2.3. HBsAg 20 pg/wodorotlenek glinu 100 pg/MPL 50 pg

HBsAg zaadsorbowano na 100 pg wodorotlenku glinu. Dodano MPL we właściwym stężeniu i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Końcową objętość osiągnięto dodając odpowiedni bufor (jak powyżej) i przechowywano w temperaturze 4°C do wykorzystania.

6.2.4. Przebieg szczepień

Ochotnicy (20_;w grupie) otrzymali zastrzyki domięśniowe 1 mljednej z danych kompozycji. Osocza pobrano w miesiącu 0, 1, 3 i 6. Poddano je analizie na przeciwciała zabezpieczające handlowo dostępnym testem Abbota.

6.3. WWNIKJ

Tabela 8 pokazuje, że MPL , stosowany w połączeniu z wodorotlenkiem glinu i NS1 -OspA w postaci cząstek 100 nm skutecznie pozwala na powstanie wyższych mian przeciwciał o naturze inhibitującej, niż antygen na wodorotlenku glinu, a kinetyka serokonwersji jest szybsza.

Wynika stąd że dla rozpuszczalnego antygenu ,takiego jak NS 1 -OspA , u ludzi MPL skomponowany w postaci małych cząstek ma własności adiuwanta wykazywane już u zwierząt w dla innych rozpuszczalnych antygenów.

Tabela 7 pokazuje, że działanie wspomagające utracone w wyniku zmniejszenia ilości wodorotlenku glinu w kompozycjach dla Hepatitis B może być odzyskane po dodaniu MPL w postaci opisanej w niniejszym opisie. MPL polepsza także szybkość serokonwersji.

Przykład 7: Połączona kompozycja szczepionki - Hepatitis B + Hepatitis A

HBsAg adsorbuje się na 90% końcowej ilości wodorotlenku glinu (0,5 mg/ml) i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Odczyn pH ustawia się na 6,2 i preparat pozostawia na 14 dni w temperaturze pokojowej do dojrzenia.

antygen Hepatitis A w ilości 360 do 22 UE na dawkę, w postaci zdezaktywowanej pochodnej szczepu HM-175 (jak w Havrix) poddaje się wstępnej adsorpcji na wodorotlenku glinu

178 578 w 10% końcowego stężenia (0,5 mg/ml). Resztę wodorotlenku glinu dodaje się następnie do roztworu i pozostawia na godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

HAV zaadsorbowany na wodorotlenku glinu dodaj e się następnie do kompozycj i HBsAg.

Do roztworu HAV/HBsAg dodaje się MPL (cząstki mniejsze niż 100 nm) do końcowego stężenia 12,5 do 100 pg na 1 ml dawki, uzupełnia się do końcowej objętości i przechowuje kompozycję w temperaturze 4°C przed użyciem.

Przykład 8: Kombinowane szczepionki zawierające dodatkowe antygeny

Kombinowane szczepionki można wytwarzać dodając jeden lub kilka żądanych antygenów do kompozycji opisanych w przykładzie 2, 3 lub 4 powyżej.

Przykład 9: Wzrost odporności pozakomórkowej i indukcja odporności komórkowej metodą immunizacji myszy HBsAg skomponowanym z wodorotlenkiem glinu i MPL.

9.1. Wpływ Al(OH)₃ z MPL na indukcję przeciwciał anty-HBs

Myszy Balb/c immunizowano podskórnie lub przezskórnie rekomibnacyjnym HBsAg adsorbowanym na Al(OH)₃ z MPL jako adiuwantem. Myszy szczepiono dwukrotnie kompozycjami HBsAg(Al(MPL i mierzono odpowiedź przeciwciał po pierwszej i drugiej dawce. Łączną ilość Ig zmierzono testem ELISA lub AUSAB (Abbott Lab, 111.), zawierając szczególną uwagę na indukcję przeciwciał izotypu IgG2a, ponieważjest on indukowany głównie przez wydzielanie g-interferonu. Indukcja tego izotypu pośrednio odzwierciedla aktywację odporności komórkowej, konkretnie aktywację Th1.

Zbadano stosunek HBsAg/MPL i rozmiary cząstek MPL.

9.1.1. Eksperyment 1: Wpływ dawki MPL (> 500 nm) na immunogenność rec HBsAg adsorbowanego na Al(OH)₃

Grupę 10 samic myszy Balb/c immunizowano podskórnie 2,5 pg recHBsAg adsorbowanego na 50 pg Al^łt + (jako Al(OH>3 zawierającego rosnące ilości MPL (3,1 do 50 pg) o rozmiarach cząstek> 500 nm. Myszy szczepiono dwukrotnie 100 pl w odstępie dwutygodniowym. Pobrano próbki krwi po 2 tygodniach od pierwszego zastrzyku (częściowe) i po tygodniu od drugiego. Zmierzono łączne IgG anty-HBs i specyficzne IgG2a testem ELISA stosując recHBsAg jako antygen przechwytujący. Miana wyrażono jako odwrotności rozcieńczenia odpowiadającego 50% wartości maksymalnej (środkowe rozcieńczenie). Wyniki wskazująca wzrost ilości specyficznych IgG i IgG2a ze wzrostem dawek MPL, szczególnie przy dawce od 12,5 do 50 pg. Wpływjest widoczny dla pierwotnej i wtórnej odpowiedzi, i jest szczególnie wyraźny dla IgG2a (prawie 20-krotny wzrost), wskazując pośrednio na wydzielanie g-interferonu indukowane immunizacją MPL.

9.1.2. Eksperyment II - Porównanie klinicznych zestawów adsorbowanego recHBsAg zawierającego lub nie zawierającego MPL (> 500 nm)

Przygotowano 3 kliniczne zestawy recHBsAg adsorbowanego na A^OHty zestaw DSAH16 nie zawierał MPL i był zestawem kontrolnym. Zestawy DSAR501 i 502 przygotowano w podobny sposób (20 pg recHBsAg adsorbowano na 0,5 mg Al⁺⁺⁺ jako Al(OH^), ale zawierały 50 pg MPL (> 500 nm).

Trzy zestawy wstrzyknięto grupom po 10 myszy (200 pl zawiera 2,5 pg HBsAg, 100 pg Al⁺++ i 6,25 pg MPL), dwukrotnie w odstępie dwutygodniowym. Pobrano próbki krwi po 14 dniach od pierwszego zastrzyku i po tygodniu od drugiego. Zmierzono poziom przeciwciał anty-HBs zestawem AUSAB lub domowym ELISA dla IgG lub IgG2a. Wyniki podaje tabela 2. Wyniki wskazują, że dwa tygodnie po pierwszym zastrzyku oba zestawy zawierające MPL indukując bardzo wyraźną odpowiedź anty-HBs (12,4 i 41,9 mIU/ml), a zestaw bez MPl tylko odpowiedź minimalną (0,75 mIU/ml). Liczba odpowiedzi jest także wyższa w przypadku obecności MPL (9/10 i 9/10 wobec 1/10 bez MPL). Wpływ MPL podkreśla także stan po drugim zastrzyku, ponieważ uzyskane miana dla zestawów DSAR501 i DSAR502 są około 6-krotnie wyższe niż w nieobecności MPL.

Wskazuje to, że przynajmniej w przypadku myszy MPL (> 500 nm) może polepszyć zarówno kinetykę odpowiedzi anty-HBs, jak i poziom tej odpowiedzi.

178 578

Wyniki potwierdził poziom specyficznej IgG i IgG2a po immunizacji zestawem DSAH 16 (bez MPL) i DSAR502 (z MPL): miano anty-HBs IgG wynosi 5 (pierwotna odpowiedź) i 3 (wtórna odpowiedź) razy więcej w obecności MPL.

9.1.3. Eksperyment III: Wpływ dawki MPL (< 100 nm) na immunogenność rekombinacyjnego HBsAg adsorbowanego na Al(OH)₃

Grupę 10 myszy (Balb/c, samice, 7-tygodniowe) immunizowano podskórnie 1 pg rekombinacyjnego HBsAg adsorbowanego na 50 pg A+++ (jako Al(OH)₃) zawierającego rosnące ilości MPL (3,1 do 25 pg) o rozmiarach cząstek< 100 nm. Myszy szczepiono dwukrotnie 200 pl w odstępie dwutygodniowym. Pobrano próbki krwi po 2 tygodniach od pierwszego zastrzyku i po tygodniu od drugiego. Zmierzono testem ELISA odpowiedź anty-HBs (łączne Ig, IgG, IgG2a) na pobranym osoczu. Miana wyrażono jako środkowe rozcieńczenie (odwrotności rozcieńczenia odpowiadającego 50% wartości maksymalnej). Wyniki wskazują, że nawet mała dawka 3,1 pg MPL indukuje silny wzrost odpowiedzi antygenu, zarówno pierwotnej, jak i wtórnej. Odpowiedź jest maksymalna dla 6,25 pg i spada do wartości w nieobecności MPL przy dużych dawkach MPL; (25 pg). Wzór odpowiedzi jest podobny dla IgG, IgG2a i łącznej Ig. Wyniki są przeciwne do wyników dla MPL o dużych rozmiarach (> 500 nm) i wskazują, że cząstki MPL o małych rozmiarach (> 100 nm) są skuteczniejsze (co najmniej w przypadku odporności pozakomórkowej), ponieważ potrzeba mniej MPL dla uzyskania maksymalnego efektu. Wyższą aktywność MPL o małych rozmiarach cząstek potwierdziło kilka doświadczeń.

Jak widać dla MPL o dużych rozmiarach cząstek (> 500 nm), działanie wspomagające MPL jest wyższe dla IgG2a niż łącznej IgG lub Ig. Przy maksymalnym efekcie wtórnej odpowiedzi (6,25 pg MPL) występuje 25-krotny wzrost zawartości IgG2a, oraz odpowiednio 7,6 i

4,3 dla IgG i łącznej Ig.

9.2. Indukcja odporności komórkowej przez recHBsAg adsorbowany na Al(OH)₃ - wpływ

MPL

Jeśli odporność eozakomórkowa wystarcza do ochrony przed wirusem Hheαtjtjtd B, indukcja komórkowej odporności (CTH, Th1) powinna mieć duże znaczenie w leczeniu choroby.

Do leczniczych szczepionek konieczne są nowe kompozycje, ponieważ Al(OH)3 jest w stanie polepszyć odporność pozakomórkową, ale nie komórkową.

Zbadano wpływ MPL na indukcję komórek Th1 zdolnych do wydzielania IL-2 i g-(to jest gamma)- interferonu u myszy Balb/c immunizowanych recHBsAg adsorbowanym na Al(OHty

9.2.1. Eksperyment I - Wpływ MPL (> 500 nm) na indukcję komórek Th1eo immumzncjj myszy Balb/c HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3

Grupę 10 myszy Balb/c (samice, 5-tygodniowe) jmmunizowαnz zastrzykiem w poduszkę stóp 30 pl roztworu zawierającego 10 pg HBsAg 15 pg Al⁺⁺⁺ (jako Al(OHty) i 15 pg MPL. Kontrolnym myszom wstrzyknięto tę samą ilość recHBsAg zmieszanego z FCA (pozytywna kontrola) lub adsorbowanego na Al(OH)3 (negatywna kontrola).

Sześć dni po immunizacji myszy zabito i usunięto podkopowe węzły chłonne. Komórki węzłów (LNC 2,105/ml) hodowano przez różny okres (24 do 74 godzin) na pożywce RPMI uzupełnionej 1 % negatywnego osocza myszy i 5 pg/ml recHBsAg. Po zakończeniu hodowli zmierzono ilość IL-2, INF-g i IL-4 wydzielonego do pożywki. IL-2 oszacowano po zdolności do stymulacji proliferacji (miarą jej było przyłączanie 3H-tymidyny) zależnej od IL-2 linii CTL (komórki VDA2), a miano wyrażono jako wskaźnik stymulacji (SI = ilość 3H-tymidyny włączanej do stymulowanych komórełk/ilość 3H tymidyny do mestymulzwnnych komórek). Ilość IL-4 i INF-g mierzono przy pomocy handlowych zestawów ELISA (Holland Biotechnology dla IFN-g i Endogen dla IL-4). Miana wyrażono w pg IFN-g/ml.

Wyniki wskazują, LNC z myszy immunizowanych HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3 nie wydziela znaczniej szych ilości IL-2, IL-4 lub INF-g. W przeciwieństwie do tego duże ilości IL-2 (SI = 38 po 48 godzinach) i znaczne ilości INF-g wydzielają LNC z myszy immunizowanych HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3 z MPL. Wydzielanie to jest podobne (INF-g) lub wyższe (IL-2) w porównaniu z obserwowanym dla myszy immunizowanych HBsAg z FCA, a in vitro zachodzi wcześniej.

178 578

Nie wykryto IL-4 po immunizacj i HBsAg absorbowanym na Al(OH)3 nawet w obecności MPL.

Taki profil wydzielania wskazuje, że specyficzne komórki Th1 (IL-2, INF-g) uległy indukcji przez immunizację adsorbowanym HBsAg w obecności MPL, ale nie wjego nieobecności. Jednak nie wykryto Th2 (IL-4) w tych warunkach immunizacji.

9.2.2. Eksperyment I - Wpływ dawki MPL (<100 nm) na indukcję komórek Th1 po immunizacji myszy Balb/c HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3.

Grupę 5 myszy Balb/c immunizowano zastrzykiem w dwie poduszki stóp 30 pl roztworu zawierającego 10 pg HBsAg adsorbowanego na 15 pg A+++ (jako Al(OH^) ze wzrastającą ilością MPL (100 nm, 0 do 15 pg).

Sześć dni po zastrzyku myszy zabito i komórki węzłów podkolanowych (LNC, 2,106 komórek/ml)) hodowano na pożywce RPMI uzupełnionej 1%negatywnego osocza myszy przez różny okres (24 godziny do 96/25) w obecności 5 pg/ml rccHBsAg.

Wydzielanie IL-2 zmierzono stymulując proliferację komórek VDA2, a stężenie IL-2 wyrażono jako wskaźnik stymulacji (SI). Wydzielanie INF-g zmierzono przy pomocy handlowych zestawów⁷ i wyrażono w pg/ml.

Stwierdzono, że wydzielanie IL-2 wzrasta bardzo znacznie przy niskiej dawce MPL (7,5 pg), a maksymalny efekt powstaje przy 15 pg MPL.

Wydzielanie IL-2 jest znacznie istotniejsze po 24 godzinach niż po 48 lub 72 godzinach.

Wydzielanie INF-g nie następuje w przypadku HBsAg adsorbowanego na Al(OH)3 w nieobecności MPL. Mała dawka (7,5 pg) MPL indukuje wydzielanie INF-g, a ponownie maksymalny efekt powstaj e przy 15 pg MPL. W przeciwieństwie do IL-2 wydzielanie INF-gjest w hodowli opóźnione i wzrasta z czasem do 96 godzin.

Łącznie dane te wskazują, że MPL (poniżej 100 nm) jest silnym induktorem Th1 w połączeniu z HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3. Zbadano wpływ kompozycji zawierającej HBsAg adsorbowany na Al(OH)3 i MPL na indukcję pozakomórkowej i komórkowej odporności u myszy Balb/c. Wyniki wskazuj, że MPL wyraźnie polepsza kinetykę odpowiedzi anty-HBs, ponieważ znacznie więcej przeciwciał anty-HBs znaleziono po pierwotnym i powtórnym szczepieniu. Zmodyfikowanajest także jakość anty-HBs i obserwuje się preferowanąindukcję IgG2a, która wskazuje pośrednio na wydzielanie INF-g, a więc indukcję komórkowej odporności.

Bezpośrednie określenie indukcji komórek Th1 przez kompozycje zawierające HBsAg, Al(OH)3 i MPL wskazuje wyraźnie, że MPL bardzo silnie indukuje wydzielanie IL-2 i INF-g przez komórki Th1. Takie kompozycje stanowiąważny wkład w rozwój leczniczych szczepionek.

Najlepsze wyniki osiągnięto w przypadku MPL o rozmiarach cząstek mniejszych niż 100 nm.

Wyniki eksperymentów opisanych tutaj podają tabele 9-14.

13. Wnioski

Łączne dane sugerują, że MPL o małych rozmiarach cząstek jest ulepszonym immunostymulatorem u naczelnych, w tym i człowieka, w porównaniu z MPL o dużych rozmiarach cząstek. Cech ta połączona z możliwością wytwarzania na wielką skalę preparatów sterylizowanych powoduje, że ML o małych rozmiarach cząstekjest odpowiednim immunostymulatorem do wielu ludzkich i zwierzęcych szczepionek.

Tabela 1

Cząstki MPL i odzyskiwanie filtracyjne przy różnych parametrach działania ultradźwiękami

Próba nr	Stężenie mg/ml	Łączny czas przebywania w komorze (min.)	Rozmiar cząstek przed filtracją (nm)	Odzysk po filtracji (%)
16	1	2,5	92	104
17	1	3	79	78,5
18	1	3,5	95	86,4
19	2	2,8	77	Brak
20	1	2,8	98	Brak

178 578

Tabela 2

Stabilność rozmiarów cząstek sterylnego roztworu MPL określona metodą spektroskopii korelacji światła (Malvern), 1 mg/ml

Próba nr	Rozmiar cząstek po filtracji (nm)	Rozmiar cząstek po stabilizacji w temperaturze 4°C (nm)
		8 dni	1 miesiąc	3 miesiące	6 miesięcy
9	94	81	74	88	82

Tabela 3

Profilaktyczna skuteczność kompozycji rgD₂t/ A1(OH)3/MPL u świnek morskich Odpowiedź pozakomórkowa i wpływ szczepienia na pierwotną chorobę HSV2

Grupa	Kompozycja	Miana (GTM)	Pierwotna infekcja
		28 dni po III	Ostrość	Wystąpienia ocen uszkodzeń**%	in-
				uszkodzenia*								deks
													PI***
		ELISA	NEUTRA	Śr.arytm.	Mediana	0	0,5	1	2	4	8	16
				±SD
	Eksperyment 1
ln=12	rgD2t 5 pg Al(OH)3/MPL (sorbitol)	10439	673	2,2±311	0,5	50	17	0	33	0	0	0	75
2n=12	rgD2t 5 pg Al(OH)a/MPL TEA	5454	378	4,6±6,3	1,5	42	8	8	25	17	0	0	130
3n=11	kontrolna	<100	<50	55,3±51,8	55	18	0	0	0	27	0	55	988
	Eksperyment 2
1n=10	rgD2t Al(OH)3/MPL
	100 nm	21039	696	0,5±0,7	0	60	30	10	0	0	0	0	25
2n=10	kontrolna	<100	<50	28,5±29,1	31,5	30	0	0	0	10	40	20	680

* Suma ocen us zkzdoeń od dma 4 do 12 po io fekeji ** Oceny uszkodzeń: brak (0), pochwowe (0,5 lub 1), zewnętrzne pęcherzyki na skórze (2, 4, 8 lub 16 *** Indeks pierwotnej infekcji = Σί (maks. ocena i) x (% wystąpień); i = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 lub 16

Tabela 4

Profilaktyczna skuteczność kompozycji rgD₂t/Al(OH)3/MPL u świnek morskich Wpływ szczepienia na nawrót choroby HSV2

Grupa	Kompozycja	Nawroty choroby
Ostrość nawrotu*	Liczba dni nawrotów**	Liczba wystąpień nawrotów (%)
Śr.arytm. ±SD	Mediana	Śr.arytm. ±SD	Mediana	0	1	2	3	4	5
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Eksperyment 1
1n=12	rgD2t 5 pg	5,44±6,2	3,5	4±5	2,5	33	42	8	8	8	0
	Al(OH)3/MPL
	(sorbitol)
2n=12	rgD2t 5 pg	6,5±5,9	6,5	4,3±3,9	3	27	27	9	27	9	0
	Al(OH)j/MPL
	TEA
3n=11	kontrolna	8±5,4	9	5,1±3,1	6	18	0	18	64	0	0

178 578

Tabela 4 - ciąg dalszy

1	2	9	4	5	6	7	8	9	10	11	12
1n=10	Eksperyment 2 rgD2t	1,6±9,9	0	0,5±1,1	0	80	20	0	0	0	0
2n=10	Al(OH)3/MPL 100 nm kcnti-clna	6,1 ±6	6,75	4,9±4,9	4,5	40	0	20	20	0	20

* Suma occn uszkoddee od ddia 1 3dd3 9poinfekcji ** Liczba dni nawrotów dla dni cd 19 dc 99 pc infekcji.

Jeden nawrót jest ocorzedzany i następuje pc nim dzień bez uszOcdzeń, a cznacza cn cc najmniej dwa dni z rumieniem lub jeden dzień z pęcherzykami.

T abe1 a 5

Terapeutyczna skutecz^ć Ocmpczycji rgD2t/Al(OH)₃/MPL

Grupa	Kdmodzyzja	Działanie terapeutyczne
Ostrość*	Liczba dni nawrotu**	Liczba nawrctów***
Śr.arytm.±UD	Mediana (% kcnt.)	Śr.arytm.±UD	Mediana (% kcnt)	Śr.arytm±UD	Mediana (% kcnt.)
	Eksperyment 1
1n=18	rgD2t 20 pg Al(OH)9/MPL TEA	brak	brak	brak	11	brak	7
2n=18	kcnti-cina	brak	brak	brak		brak	5
	Eksperyment 2
1n=14	rgD2t Al(OH)9/MPL 1ϋ0 nm	11,1±8,7 (-99%) p<0,05	10,25 (-41%) P<0,1	8,4±(-28%) P<0,1	8,5 (-29%) P<0,31	β,2±2	4
2n=19	kdftrdlfa	18,9±10,9	17,5	11,7±6,8	11	4,4±2,1	4
	Eksperyment 9
1n=15	rgD2t Al(OH)9/MPL 100 nm, Tween	10,9±10,1	6 (-54%) p<0,07	6,9±5,8	4 (-49%) P<0,1	2,7±2 p<0,1	9 (-25%) p<0,1
2n=15	rgD2t Al(OH)9/MPL 100 nm, scrbitcl	8,9±6,7	6,5(-50%) p<0,09	5,4±4,4	4 (-49%) p<0,1	2,7±1,5	9 (-25%) P<0,1
9n=16	Odntrcina	12,5±8,1	19	8,5±4,5	7	9,6±1,6	4

* Suma ccen uszOcdzeń cd dnia 21 dc 60 pc infekcji ** Łączna liczba dni nawrctów u zwierząt dla dni cd 21 dc 60 pc infekcji * * * I^iizzn ρι^Γ^ΙΟ^ nnwrotów dladm od 2 2 do 66 pp> infenoii.Jenen nfwróttent i nfltępoSepo mm dzień bez uszOcdznń, a cznacza cn cc najmniej dwa dni z rumieniem (dzefa = 0,5) lub jeden dzień z pęcherzykami zewnętrznymi (ccena^ 2). Immundterapie: pdOskórne zastrzyki 21 i 42 dnia pc infekcji, analiza statystyczna: test WilccKcna z rangami względem kcntrclnych adiowantów (ninzfaczące dla p> 0,1).

178 578

Tabela 6

Immunogenność kompozycji gD2t, wodorotlenek glinu, MPL 100 nm u naczelnych Wyniki serologiczne i DTH

Szczepionka	Liczba małp	Odpowiedź przeciwciała*	Odpowiedź DTH (stwardnienie)*
Miano ELISA	Miano NEUTRA	PBS	GD2 5 Pg	gd2 15 pg
20 μ gD2t	KQ 101	5554	1600	-	-	-
wodorotlenek glinu	KQ 102	14870	800	-	++	+++
50 pgMPL	KQ 103	5846	1600	-	++	+++
	KQ 104 GTM	16270 10665	1600 1213	brak	brak	brak
	KQ 105	16170	800	-	+	++
20 pg gD2t	KQ 106	4389	800	-	-	-
wodorotlenek glinu	KQ 107	20440	1600	-	++	+++
20 pg MPL	KQ 108	5613	800	-	+	+
	KQ 109 GTM	6755 8876	1600 1056	brak	brak	brak
	KQ 110	2486	200	-	-	-
	KQ 111	9918	800	-	++	+++
20 pg gD2t	KQ 112	2526	400	-	-	-
wodorotlenek glinu	KQ 113	7137	400	-	-	-
5 pgMPL	KQ 114 GTM	8396 5181	400 400	brak	brak	brak

* mierzone w 6 cdii po IIIGTM = śrecdiie geemetryczne miano miano ELISA = miano punktu środkowego miano NEUTRA titer=odwrotność najwyższego rozcieńczenia dającego 100% ochrony przed cytopatogenią ** test na skórze 14 dnia po II stwardnienie - 24 godziny odczytu + = 1 mm ++ = 1-5 mm +++ = > 5 mm

Tabela 7

Czas	N	Serokonwersja	%	GMT	Min. miano	Maks. miano
wodorotlenek glinu (500 pg), HBsAg przed	20	0	0	0	0	0
PI (miesiąc 1)	20	10	50	6	1	58
PII (miesiąc 3)	20	19	95	80	7	565
wodorotlenek glinu (100 pg), HBsAg przed	20	0	0	0	0	0
PI (miesiąc 1)	18	7	36,8	4	1	56
PII (miesiąc 3)	19	18	94,7	24	2	320
wodorotlenek glinu (100
pg), HBsAg przed	20	0	0	0	0	0
PI (miesiąc 1)	20	12	60	10	1	66
PII (miesiąc 3)	20	20	100	73	6	605

178 578

Tabela 8

Immunogenność klinicznych szczepów OspA u ludzi Anty-OspA w teście inhibicji LA-2 (ng równoważniki LA-2/ml) (GTM)

Szczepionka	Przed dzień 0	Po I 30 dzień 28	Po II 30 dzień 56	Po III 30 dzień 84
NS1-OspA na wodorotlenku glinu	118	233	409	768
SC (%)	2,6	77,2	86,5	100
NS1-OspA+MPL na wodorotlenku glinu	134	269	865	2424
SC (%)	2,6	88,6	97,2	100

N = 80 pg/dawkę

Domięśniowo

Tabela 9

Wpływ zwiększającej się dawki MPL (> 500 nm) na immunogenność recHBsAg adsorbowanego na Al(OH)3

Ilość MPL (pg/dawka)	Odpowiedź anty-HBs
łączenie IgG	IgG2a
dzień 14	dzień 21	dzień 14	dzień 21
0*	69	743	3.2	11
3.13	122	541	3.8	20
6.25	296	882	6.4	24
12.5	371	1359	10	48
25	456	1493	18	138
50	403	1776	33	242

* HBsAg on Al.

Tabela 10

Porównanie 3 klinicznych zestawów z MPL i bez MPL. Odpowiedź AUSAB

Zestaw	Dawka HBsAg na Al(OH)3 (pg)	Dawka MPL (pg)	GMT anty-HBs (mlU/ml)
DSAH16	2,5	0	0,75	15,1
DSAR501	2,5	6,25	12,4	96,7
DSAR502	2,5	6,25	41,9	89,2

178 578

Tabela 11

Porównanie 2 klinicznych zestawów z MPL i bez MPL (> 500 nm). Odpowiedź anty-HBs IgG i IgG2a

Zestaw	Dawka HBsAg na Al(OH)3 (pg)	Dawka MPL (pg)	Odpowiedź anty-HBs
IgG	IgG2a
d15	d21	d15	d21
DSAH16	2,5	0	20	178	<5	5
DSAR502	2,5	6,25	113	641	<5	28

Tabela 12

Wpływ dawki MPL (< 100 nm) na immunogeniczność recHBsAg adsorbowanego na Al(OH)3

Dawka HBsAg adsorb, Al(OH)3 (pg)	Dawka MPL <100 nm (pg)	Odpowiedź anty-HBs
Łączne IG	IgG	IgG2a
d15	d21	d15	d21	d15	d21
1	0	30	637	67	516	15	99
1	3,12	312	2302	335	3532	167	1752
1	6,25	538	2719	856	3932	261	2521
1	12,5	396	2104	485	3625	125	139
1	25,0	38	446	141	638	28	233

Tabela 13

Wpływ MPL (> 500 nm) na indukcję komórek Th1 specyficzną dla HBsAg w myszach Balb/c

Dawka HBsAg (pg/mysz)	Kompozycja	Wydzielanie in vitro
IL-2 (SI)	INF-γ (pg/ml)	IL-4 (pg/ml)
24h	48h	72h	24h	48h	72h	24h	48h	72h
20	FCA	1,3	2,0	8,0	<125	<125	385	NT	NT	NT
-	FCA	0,7	1,8	0,7	<125	<125	<125	NT	NT	NT
20	AI(OH)3	1,0	1,4	1,2	<125	<125	<125	<40	<40	<40
20	Al(OH) + MPL (30 pg)	2	38	10	<125	280	280	<40	<40	<40

Po opisanej w tekście, komórki węzłów chłonnych hodowano z 5 monnych hodowano z 5 pg recHBsAg przez wskazany okres i mierzono wydzielanie IL-2, INF-γ i IL-4 stosując linię VDA2 komórek T i dwa handlowe zestawy ELISA

178 578

Tabela 14

Wpływ różnych dawek MPL (< 100 nm) na indukcję specyficznych dla HBsAg komórek Thi

Dawka HBsAg ( p/mysz)	Dawka MPL	Wydzielanie in vitro
IL-2 (SI)	INF-γ (pg/ml)
		24 h	48 h	72 h	24 h	48 h	72 h	96 h
20	0	2,6	28	21,8	<67	<67	<67	<67
20	7,5	207	173	58	< 67	207	522	698
20	15	270	71	36	275	878	1249	1582
20	30	41	59	36	<67	<67	<67	207

POMPA

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (25)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL), znamienna tym, że jest wizualnie przejrzysta i sterylizowalna przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 pm, korzystnie cząstki zawiesiny mają rozmiar mniejszy niż 120 nm.
2. 2. Sposób wytwarzania zawiesiny cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A, znamienny tym, że składa się z zawieszania 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A w wodzie i poddawania otrzymanej zawiesiny działaniu ultradźwięków do wytworzenia zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 pm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm.
3. 3. Kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nośnikiem, znamienna tym, że zawiera MPL w postaci zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepąfiltrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 pm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, w ilości 10-100 pg na dawkę i antygen.
4. 4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera MPL o rozmiarach cząstek 60-120 nm.
5. 5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że zawiera MPL o rozmiarach cząstek mniejszych niż 100 nm.
6. 6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako nośnik zawiera wodorotlenek glinu.
7. 7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako nośnik zawiera emulsję typu olej w wodzie lub inny ciekły nośnik lipidowy.
8. 8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen wirusowy.
9. 9. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen Hepatitis A.
10. 10. Kompozycja szczepionki według zastrz. 9, znamienna tym, że jako antygen Hepatitis A zawiera zdez.aktywowanąkompozycję pełnych komórek szczepu HM-175.
11. 11. Kompozycja szczepionki ' według zastrz. 3 albo 4, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen Hepatitis B.
12. 12. Kompozycja szczepionki według zastrz. 11, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) lub jego wariant.
13. 13. Kompozycja szczepionki według zastrz. 12, znamienna tym, że jako antygen zawiera HBsAg będący antygenem S HBsAg (226 aminokwasów).
14. 14. Kompozycja szczepionki według zastrz. 13, znamienna tym, że jako antygen zawiera HBsAg zawierający dodatkowo sekwencję pre-S.
15. 15. Kompozycja szczepionki według zastrz. 13, znamienna tym, że jako antygen HBsAg zawiera złożoną cząstkę o wzorze (L*, S), przy czym L* oznacza zmodyfikowane białko L wirusa Hepatitis B mające sekwencję aminokwasową złożoną z reszt 12-52, następnie 133-145 i 175-400 białka L, a S oznacza białko S HBsAg.
16. 16. Kompozycja szczepionki według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienna tym, że zawiera dodatkowo antygen Hepatitis A.
17. 17. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że zawierajeden lub wiele antygenów Hepatitis i co najmniej jeden składnik wybrany spośród związków różnych od anty178 578 genu Hepatitis, który chroni przez jedną lub wieloma chorobami wybranymi spośród dyfterytu, tężca, kokluszu, Haemofilis influenzae b (Hib) oraz polio.
18. 18. Kompozycja szczepionki według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera kombinację DTP (dyfteryt-tężec-koklusz)-HBsAg, kombinację Hib-HBsAg, kombinację DTP-Hib- HBsAg oraz kombinację IPV (nieaktywna szczepionka polio)-DTP-Hib- HBsAg.
19. 19. Kompozycja szczepionki według zastrz. 18, znamienna tym, że zawiera dodatkowo antygen Hepatitis A.
20. 20. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że zawiera glikoproteinę D HSV lub jej immunologiczny fragment.
21. 21. Kompozycja szczepionki według zastrz. 20, znamienna tym, że zawiera glikoproteinę D o uciętej sekwencji.
22. 22. Kompozycja szczepionki według zastrz. 21, znamienna tym, że jako białko o uciętej sekwencji zawiera HSVgD₂ pozbawione kotwiczącego końca C.
23. 23. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że zawiera HIV gp 160 lub jego immunologiczny fragment.
24. 24. Kompozycj a szczepionki według zastrz. 23, znamienna tym, że j ako pochodna gp 160 zawiera pochodną gp 120.
25. 25. Sposób wytwarzania kompozycji szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL). i odpowiednim nośnikiem, znamienny tym, że polega na mieszaniu zawiesiny cząstek MPL wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację nahydrofilowej membranie PVDF 0,22 pm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, z nośnikiem i antygenem w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce.