CN113573730A - 乙型肝炎免疫方案和组合物 - Google Patents
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Abstract
提供了一种治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,其包括以下步骤:a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸(HBV ASO)的长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸(ASO)的组合物;b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;c)向所述人类施用包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及d)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
Description
发明领域
本发明涉及特别地适用于治疗慢性乙型肝炎的免疫方案、用于治疗慢性乙型肝炎的方法以及用于此类方案和方法的组合物。所述方案和方法涉及施用包含反义寡核苷酸的组合物、包含递送乙型肝炎抗原的载体的组合物和包含重组乙型肝炎抗原蛋白的组合物。
背景技术
乙型肝炎病毒是一种具有部分双链环状DNA基因组的DNA病毒,其全长链长3020-3320个核苷酸,较短链长1700-2800个核苷酸。在细胞感染后不久,就可在细胞核中发现病毒DNA。感染后,细胞DNA聚合酶使病毒基因组完全双链并连接末端。病毒核心(C)、表面(S)和X基因分别与基因组中的病毒聚合酶(P)基因重叠。乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、前核心抗原和HBeAg通过来自具有两个独立起始密码子的一个基因的不同处理来产生。类似地,表面基因具有三个起始密码子且产生三个具有不同长度的蛋白:大(pre-S1+pre-S2+S)、中(pre-S2+S)和小(S)表面抗原。乙型肝炎病毒(HBV)感染是主要的公共卫生问题。全球近似2.57亿人被HBV感染[WHO,2017]。HBV感染的临床过程和结果在很大程度上取决于感染时的年龄以及病毒和宿主免疫应答之间复杂的相互作用[Ott,2012;Maini,2016]。因此,暴露于HBV可能导致急性肝炎,其自行解决或可能进展为各种形式的慢性感染,包括非活动性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者状态、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)[Liaw,2009]。成年群体中HBsAg的流行率>2%,其中东南亚和中国的比率为5-8%,且非洲地区的比率为>8%。15-40%的具有慢性乙型肝炎感染的人(定义为检测到超过6个月的血清HBsAg)将发展肝脏后遗症,其中肝硬化(LC)、肝代偿不全和HCC是主要并发症。
尽管在婴儿中实施普遍的预防性乙型肝炎免疫已经高度有效地降低许多流行国家中的乙型肝炎的发病率和流行率,但其尚未导致青少年和成人中的慢性乙型肝炎感染(CHB)的流行率的强烈降低,并且不预期其影响HBV相关的死亡,直到引入后数十年。在2015年,乙型肝炎导致887,000例死亡,主要死于肝硬化和肝癌[WHO,2017]。
慢性乙型肝炎的临床管理旨在通过预防疾病进展并因此预防HCC发展来改善生存率和生活质量[Liaw,2013]。当前的治疗策略主要基于长期抑制HBV DNA复制,以实现HBV诱导的肝病的稳定并预防进展。血清HBV DNA水平是所有当前治疗方式的基石终点。实现(可检测的)乙型肝炎e-抗原(HBeAg)的丧失是另一种有价值的生物标志物,然而无论是否存在抗HBs血清转化,HBsAg丧失通常被认为是代表“功能性治愈”的最佳终点,因为它表明HBV复制和病毒蛋白表达的深刻抑制[Block,2017;Cornberg,2017]。目前,对于CHB患者存在两种主要的治疗选项:通过聚乙二醇化干扰素α(PegIFNα)或通过核苷(核苷酸)类似物(NA)[EASL,2017]。目的在于用有限持续时间治疗诱导长期免疫控制的PegIFNα可以实现持续的治疗外控制(off-treatment control),但持久的病毒学应答和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)丢失限于小部分的患者。此外,由于其耐受性差和长期安全性担忧,显著量的患者不适合进行这种类型的治疗。
NA通过经由抑制HBV聚合酶逆转录酶活性来抑制DNA复制而起作用。在欧洲获准用于HBV治疗的NAs包括恩替卡韦(ETV)、富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)和替诺福韦艾拉酚胺(TAF)(其与针对HBV抗性的高屏障相关),以及拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(adefovirdipivoxil)(ADV)和替比夫定(TBV)(其与针对HBV抗性的低屏障相关)。用具有对抗性的高屏障的有效NA进行治疗的主要优势是其可预测的长期高抗病毒效力(导致绝大多数顺应性患者中的HBV DNA抑制)以及其有利安全性概况。NA治疗的缺点是其长期治疗方案,因为NA通常没有实现HBV根除,并且NA停用可以导致HBV复发[Kranidioti,2015]。代表功能性治愈的HBsAg丢失现在是CHB中的金标准治疗终点[Block,2017;Cornberg,2017],然而,其很少用NA治疗实现[Zoutendijk,2011]。
由于HBsAg血清清除率低[Zoutendijk,2011]和NA外病毒复发的风险高[Kranidioti,2015],大多数患者被维持在长期或甚至无限NA疗法下,这可能与患者对疗法的顺从性降低、财务成本的增加以及长期暴露后药物毒性和耐药性突变的风险增加相关[Terrault,2015]。因此,新的策略对于补充NA疗法以实现用有限方案的“功能性治愈”是必要的。
反义疗法不同于核苷疗法,因为其可直接靶向抗原的RNA转录物并且从而降低血清HBeAg和HBsAg水平。除了反义疗法和新型抗病毒药物以外,目前正在探索的新的治疗策略包括新的抗病毒策略以及加强HBV-特异性适应性免疫应答或活化先天性肝内免疫力的新型免疫治疗策略[Durantel,2016]。迄今为止,这些实验治疗无一显示有效。在所评估的接种疫苗策略中,无一能够诱导对HBV核心抗原(HBcAg)的稳健的多功能CD8+T-细胞应答,这对于恢复对该病毒的免疫控制是至关重要的[Lau,2002;Li,2011;Liang,2011;Bertoletti,2012;Boni,2012]。关于基于HBV表面和/或PreS抗原的重组疫苗的早期努力初步诱导抗体应答,但没有HBV特异性CD8+T-细胞应答,其中没有临床或病毒学益处[Jung,2002;Vandepapelière,2007]。表达HBV包膜的DNA疫苗无法恢复对HBsAg和HBcAg特异性的T细胞应答,因此并不降低NA停用后患者中复发的风险[Fontaine,2015]。用新的递送系统,编码S、preS1/S2的DNA疫苗(引发疫苗)和MVA病毒载体疫苗(加强疫苗)没有显示T细胞诱导或病毒血症的降低,表明单独的HBV PreS和表面抗原不足以治愈患者[Cavenaugh,2011]。更近来,已经研究了靶向多种HBV抗原的疫苗策略和新的递送系统。重组HBsAg/HBcAg疫苗导致仅一半患者中的病毒载量降低到非常低的水平(即~50IU/ml)[Al-Mahtab,2013]。编码5、preS1/S2、核心、聚合酶和X蛋白的DNA疫苗与遗传佐剂化的IL-12连同拉米夫定一起在一半患者中诱导多特异性T细胞应答以及病毒载量的>2 log10降低。然而,在任何患者中均未观察到HBsAg的定量检测的变化,HBsAg的丧失或HBsAg血清转化[Yang,2012]。GS-4774疫苗,一种基于酵母的表达HBV的大S、核心和X蛋白的T细胞疫苗,在病毒抑制的CHB患者中没有提供HBsAg的显著降低[Lok,2016]。
仍然存在对可以清除HBsAg以允许患者安全地中止NA治疗而没有病毒学或临床复发的治疗的未满足需求。
丁型肝炎病毒(HDV)(也称为δ型肝炎病毒)是一种需要乙型肝炎病毒才能复制的病毒。HDV感染与HBV同时发生或作为双重感染发生。HDV通过接触感染者的血液或其他体液传播。母婴垂直传播很少见。至少有5%的慢性HBV感染者同时感染了HDV,但这可能被低估了,因为很多国家没有报告HDV的流行情况。丁型肝炎感染可以通过乙型肝炎疫苗接种来预防,自1980年代成功开展国家HBV预防性疫苗接种运动以来,HDV感染的数量也有所减少。认为HBV-HDV合并感染是最严重的慢性病毒性肝炎形式,因为其更迅速地进展为肝脏相关死亡和肝细胞癌。治疗是通过施用聚乙二醇话干扰素,但持续病毒应答的速率较低[WHO2018]。目前,治疗速率也较低。对于可以阻止HDV引起的慢性肝炎的进展或逆转,和/或可以清除慢性HDV感染(慢性丁型肝炎-CHD)或HBV/HDV合并感染(CHB/CHD)的治疗仍然存在未满足的需求。
发明内容
在一个方面中,提供了一种治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)向所述人类施用包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及
d)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,依次进行所述方法的步骤b)、c)和d),其中步骤b)在步骤c)之前和步骤c)在步骤d)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤d)。在另一个实施方式中,步骤d)与步骤b)和/或与步骤c)同时进行。
在一个特定实施方式中,重复步骤a)并且然后停止,其后依次进行步骤b)、步骤c)和步骤d)。任选地,可以重复步骤d)。在另一个实施方式中,重复步骤a)并且随后在任何后续步骤之前停止,并且步骤d)与步骤b)和/或与步骤c)同时进行。在这些实施方式中,步骤a)的ASO在其他组合物之前施用。
因此,在另一个方面中,提供了一种治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)向所述人类施用i)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及,同时施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物;和
c)向所述人类施用i)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,以及,同时施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前且步骤b)在步骤c)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤c)。
在一个特定实施方式中,重复步骤a)并且随后停止,其后依次进行步骤b)和步骤c)。任选地,可以重复步骤c)。在这些实施方式中,步骤a)的ASO在其他组合物之前施用。
在另一个方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法中的免疫原性组合,其包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物,
其中所述方法包括向所述人类顺序或同时施用所述组合物。
在另一个方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO),和复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸、编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸以及编码融合至所述HBc的所述人类不变链(invariant chain)(hIi)的核酸,其中所述方法包括以初免-强化方案(prime-boost regimen)施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。在某些实施方式中,用于治疗慢性CHB和/或CHD方法中的免疫原性组合物进一步包含一种或多种重组HBV蛋白抗原。
在一个进一步的方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的免疫原性组合,所述免疫原性组合物包含含有靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的(HBV ASO)的组合物和经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体,其包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,其中所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。在某些实施方式中,用于治疗慢性CHB和/或CHD方法中的免疫原性组合物进一步包含一种或多种重组HBV蛋白抗原。
在一个进一步的方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的免疫原性组合,所述免疫原性组合物包含含有靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的(HBV ASO)的组合物、重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)以及含有MPL(3-D单磷酰基脂质A)和QS-21(从皂树(Quillaja saponaria)树皮中纯化的三萜糖苷)的佐剂,其中所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。在某些实施方式中,用于治疗慢性CHB和/或CHD方法中的免疫原性组合物进一步包含一种或多种编码一种或多种HBV抗原的载体。
在一个进一步的方面中,提供了一种免疫原性组合物,其包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的组合物(HBVASO);
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
免疫原性组合可用于治疗慢性乙型肝炎的方法中,所述方法通过在初免-强化方案中施用所述组合物。
免疫原性组合可用于治疗人类CHB和/或CHD的方法中,所述方法通过顺序或同时施用所述组合物。
在另一个方面中,提供了一种治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
c)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,且步骤b)在步骤c)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤c)。在另一个实施方式中,步骤c)与步骤b)同时进行。
在一个特定实施方式中,重复步骤a)并且随后停止,其后依次进行步骤b)和步骤c)。任选地,可以重复步骤c)。在另一个实施方式中,步骤c)与步骤b)同时进行。在这些实施方式中,步骤a)的ASO在其他组合物之前施用。
因此,在另一个方面中,提供了一种治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的组合物(HBV ASO);和
b)向所述人类施用i)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸and编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,以及同时施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤b)。
在另一个方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法中的免疫原性组合,所述免疫原性组合包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的组合物(HBVASO);
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
c)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎核心抗原(HBc)和佐剂的组合物,
其中所述方法包括向所述人类顺序或同时施用所述组合物。
在一个进一步的方面中,提供了一种免疫原性组合,其包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的组合物(HBVASO);
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
c)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBC)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
免疫原性组合可以用于治疗慢性乙型肝炎(CBH)和/或CHD的方法中,所述方法通过初免-强化方案施用所述组合物。
免疫原性组合可以用于治疗人类CHB和/或CHD的方法中,所述方法顺序或同时施用所述组合物。
在一个实施方式中,靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC。在一个此类实施方式中,靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC,其由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
附图说明
图1-在第二剂和第四剂NaCl后7天时的HBc-(A)和HBs(B)特异性CD8+T细胞应答,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白(具有中值的个体动物)
图2-在第二剂和第四剂NaCl后7天时的HBc-(A)和HBs(B)特异性CD4+T细胞应答,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白(具有中值的个体动物)
图3-在第四剂NaCl后7天时在肝脏浸润淋巴细胞中的HBc-和HBs特异性CD4+(A)和CD8+(B)T细胞,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白(具有中值的3只或4只动物的混合物)
图4-初免强化疫苗方案后的HBc-特异性(A)和HBs-特异性(B)抗体应答(呈现具有几何平均值的个体动物)
图5-在第二剂NaCl后7天和在第四基NaCl后7天时的HBc-特异性脾脏(A)或肝脏(B)CD8+T细胞,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白(具有中值的个体动物)
图6-在第二剂NaCl后7天和在第四基NaCl后7天时的HBc-特异性脾脏(A)或肝脏(B)CD4+T细胞,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白(具有中值的个体动物)
图7-在第二剂NaCl后7天和在第四基NaCl后7天时的HBs-特异性脾脏(A)或肝脏(B)CD8+T细胞,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白(具有中值的个体动物)
图8-在第二剂NaCl后7天和在第四基NaCl后7天时的HBs-特异性脾脏(A)或肝脏(B)CD4+T细胞,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白(具有中值的个体动物)
图9-在第23天、第65天和第93天时的抗HBs(A)和抗HBc(B)结合抗体应答(NaCl给药前、第二剂后7天和第四剂后7天,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白)
图10-在第23天、第65天和第93天时(NaCl第一剂、第二剂和第四剂后7天,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白,第1、2、3组)或在第93天时(第4组),在小鼠血清中(第1、2、3和4组)测量的AST(A)和ALT(B)水平
图11-NaCl给药前、第二剂后7天和第四剂后7天,在AAV2/8-HBV注射小鼠血清中的HBs抗原水平,异源载体初免-强化与随后重组蛋白或异源载体初免-强化与伴随使用重组蛋白
图12-HBc-2A-HBs构建体的结构
图13-hIi-HBc-2A-HBs构建体的结构
序列表
SEQ ID NO:1:HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:2:HBc截短物的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:引入口蹄疫病毒的2A切割区域的间隔序列的氨基酸序列
SEQ ID NO:4:编码引入口蹄疫病毒的2A切割区域的间隔序列的核苷酸序列
SEQ ID NO:5:HBc-2A-HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:6:编码HBc-2A-HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:7:hIi的氨基酸序列
SEQ ID NO:8:编码hIi的核苷酸序列
SEQ ID NO:9:hIi-HBc-2A-HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:10:编码hIi-HBc-2A-HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:11:HBc的氨基酸序列
SEQ ID NO:12:hIi替代变体的氨基酸序列
SEQ ID NO:13:编码hI替代变体的核苷酸序列
SEQ ID NO:14:hIi-HBc-2A-HBs的替代核酸序列
SEQ ID NO:15:hIi-HBc-2A-HBs的替代氨基酸序列
SEQ ID NO:16:乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列(GENBANK登录号U95551.1)
具体实施方式
定义
除非另有定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同含义。例如,本文所使用的某些术语是如“A multilingualglossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Klbl,H.编辑(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland)中所述进行定义。
在本说明书和随后的权利要求书全文中,除非上下文另有要求,否则词语“包含(comprise)”和变型诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所述的整数或步骤或者整数或步骤组,但不排除任何其他的整数或步骤或者整数或步骤组。
在本说明书的文本全文中引用了几篇文献。本文所引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等),无论在上文或下文,都由此通过引用以其整体并入。本文没有任何内容被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于此类公开内容。在本发明的一个方面的上下文中提供的所有定义也适用于本发明的其他方面。
“2’-O-甲氧基乙基“(也称为2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)指在呋喃糖环2’位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是经修饰的糖。
“2’-MOE核苷”(也称为2’-O-甲氧基乙基核苷)指包含2’-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2’-取代的核苷”指在除H或OH以外的呋喃糖基环的2’-位置处包含取代的核苷。在某些实施方式中,2’取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。
“5-甲基胞嘧啶”指经附接至5位的甲基基团修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”指值的±7%内。例如,如果表述“这些化合物对HBV的抑制作用约为70%”,则暗示HBV水平被抑制在63%至77%的范围内。
“活性药剂”是指药物组合物中的一种或多种物质,当施用于个体时提供治疗获益。例如,在某些实施方式中,靶向HBV的反义寡核苷酸是活性药剂。
“急性乙型肝炎感染”是指暴露于乙型肝炎病毒的人开始出现病毒性肝炎的体征和症状。从暴露到出现感染体征和症状之间的时间段称为潜伏期,平均为90天,但可能短至45天或长达6个月。对于大多数人来说,这种感染会引起轻度到中度的不适,但由于身体的免疫反应成功地对抗病毒,这种感染会自行消失。然而,一些人,特别是那些免疫系统受损的人,如患有AIDS、接受化疗、服用免疫抑制药物或服用类固醇的人,由于急性HBV感染而出现非常严重的问题,并继续发展为更严重的情况,如爆发性肝功能衰竭。
“慢性乙型肝炎感染”发生在一个人最初患有急性感染但随后无法抵抗感染时。约90%的婴儿在出生时的感染将进展为慢性疾病。然而,随着年龄的增长,慢性感染的风险会降低,因此20%-50%的儿童感染者和不到10%的大龄儿童或成人感染者将从急性感染发展为慢性感染。慢性HBV感染是本发明实施方式的主要治疗目标,尽管本发明的组合物也能够治疗HBV相关的病况,如炎症、纤维化、肝硬化、肝癌、血清肝炎等。
“肽”是指通过酰胺键(也称为肽键)连接至少两个氨基酸形成的分子。术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用,并且是指任何肽连接的氨基酸链,而无论长度、共翻译或翻译后修饰。“融合蛋白”(或“嵌合蛋白”)是包含两个或更多个肽连接蛋白的重组蛋白。通过连接最初编码分离蛋白的两个或更多个基因来产生融合蛋白。该融合基因的翻译产生单一融合蛋白。关于蛋白或多肽,重组意味着蛋白是从重组多核苷酸表达的。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用,并且是指由核苷酸单体制成的聚合物大分子。合适地,本发明的多核苷酸是重组的。重组意味着,所述多核苷酸是克隆、限制或连接步骤或其他程序中的至少一个的产物,所述其他程序产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的多核苷酸。
异源核酸序列是指并非分离自、源自或基于宿主生物体中发现的天然存在的核酸序列的任何核酸序列。“天然存在的”意指在自然界中发现的且不是合成地制备或修饰的序列。当一个序列分离自一个来源、但是经过合适地修饰(例如,通过缺失、取代(突变)、插入或其他修饰)从而不破坏来源基因的正常功能时,所述序列“源自”所述来源。
合适地,本发明中使用的多核苷酸是分离的。“分离的”多核苷酸是从它的原始环境取出的多核苷酸。例如,如果它与天然系统中的一些或全部共存物质分离,则天然存在的多核苷酸是分离的。例如,如果将它克隆进不是它的天然环境的部分的载体中或如果将它包含在cDNA内,则认为多核苷酸是分离的。
“治疗”是指施用组合物以影响疾病或病况的改变或改善。如本文所用,与慢性乙型肝炎感染相关的术语“治疗”是指施用合适的组合物,其目的在于降低CHB的症状,防止CHB的进展或降低CHB的一种或多种可检测标志物的水平。术语“治疗”应相应地解释。例如,预防CHB的进展可以包括预防肝脏疾病的发作或稳定先前存在的肝脏疾病,如ALT(丙氨酸转氨酶)水平、肝纤维化或其他合适的可检测标志物所指示。CHB的其他标志物包括血清HBVDNA水平(其为病毒复制的指标)和血清HBs抗原水平(其为病毒载量的指标),因此治疗CHB可以包括将血清HBsAg(例如,如通过定量免疫测定法所确定)或HBV DNA(例如,如通过HBV测定法(Roche)或等效法所确定)的水平降低至不可检测的水平(“清除”HBsAg或HBV DNA)。如本文所用的与慢性丁型肝炎感染(CHD)相关的术语“治疗”应相应地解释。
“施用”是指向个体提供药剂,包括但不限于由医疗专业人员施用和自我施用。
“同时施用”指以任何方式共同施用两种药剂,其中两种药物的药理作用同时在患者中表现出来。同时施用不需要两种药剂以单一药物组合物、相同剂型或通过相同施用途径施用。如本文所用的与疫苗方案的组分相关的“同时”施用是指在相同的持续免疫应答期间施用并且“同时”应相应地解释。优选地,同时施用两种组分(诸如同时施用包含载体的组合物和包含蛋白的组合物),然而,可以在另一组分的几分钟内(例如,在同一次医学预约或医生就诊)或几小时内施用一种组分。这种施用也被称为共同施用。分开组分的同时施用可以经由相同的施用途径(例如,肌肉内注射)进行。或者,分开组分的同时施用可以经由不同的施用途径(例如,肌肉内注射和皮内注射,肌肉内和鼻内施用,吸入和皮下施用等)进行。在一些实施方式中,同时施用可以是指腺病毒载体和蛋白组分的施用。在其他实施方式中,共同施用是指一种腺病毒载体和另一种病毒载体(例如痘病毒诸如MVA)的施用。在其他实施方式中,共同施用是指腺病毒载体和蛋白组分(其中蛋白组分佐剂化)的施用。
“顺序”施用是指施用第一组合物,随后在大量时间后施用第二组合物。两次顺序施用之间的时间段为1周和12个月之间,例如2周和12周之间,例如1周、2周、4周、6周、8周或12周,6个月或12个月。更具体地,其在4周和8周之间,例如顺序施用之间的时间段可以是4周。因此,顺序施用涵盖在初免-强化设置中的第一次和随后的施用,即当在第一次施用引起的正在进行的免疫应答期间不实施第二组合物的施用时。
如本文所用,“免疫原性组合”是指在单一免疫方案(例如,初免-强化方案)中顺序和/或同时施用的多种分开配制的免疫原性组合物,每种分开配制的免疫原性组合物都是免疫原性组合的组分。
“反义化合物”是指能够通过氢键与靶核酸杂交的寡聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物,如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、snoRNA、miRNA和卫星重复序列。
“反义抑制”是指与靶核酸互补的反义化合物存在时靶核酸水平与不存在反义化合物时靶核酸水平相比降低。
“反义寡核苷酸”是指具有允许与靶核酸的相应区域或区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“互补性”是指第一种核酸和第二种核酸的核碱基之间的配对能力。
“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核碱基与靶核酸中的相应核碱基进行精确碱基配对(即,杂交)的能力,并且由相应核碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢结合介导。
“杂交”指互补核酸分子的退火。在某些实施方式中,互补核酸分子包括但不限于反义化合物和核酸靶点。在某些实施方式中,互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸和核酸靶点。
“完全互补”或“100%互补”是指第一核酸的每个核碱基在第二核酸中具有互补核碱基。在某些实施方式中,第一核酸是反义化合物,以及靶核酸是第二核酸。
“连续核碱基”是指彼此紧邻的核碱基。
“脱氧核糖核苷酸”是指在核苷酸的糖部分的2’位置具有氢的核苷酸。脱氧核糖核苷酸可以用多种取代基中的任何一种进行修饰。
“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上必需或所需的组分。例如,在注射的药物中,稀释剂可以是液体,例如,生理盐水。
“剂量单位”是指提供药剂的形式,例如,丸剂、片剂或本领域已知的其他剂量单位。
“剂量”是指在单次施用中或在指定时间段内提供的指定量的药剂。在某些实施方式中,剂量可以以两个或多个大丸剂、片剂或注射剂的形式给药。例如,在某些实施方式中,在需要皮下施用的情况下,所需剂量需要通过单次注射不易于容纳的体积。在此类实施方式中,可以使用两次或更多次注射以达到所需剂量。在某些实施方式中,可以以两次或更多次注射施用剂量以使得在个体中的注射部位反应最小化。在其他实施方式中,药剂通过长时间输注或连续输注施用。剂量可以表示为每小时、每天、每周或每月的药剂量。
“给药方案”是设计用于实现一种或多种所需效果的剂量组合。
“HBV”是指哺乳动物乙型肝炎病毒,包括人乙型肝炎病毒。该术语包括乙型肝炎病毒的地理基因型,特别是人乙型肝炎病毒,以及乙型肝炎病毒地理基因型的变异株。
“HBV抗原”指任何乙型肝炎病毒抗原或蛋白,包括核心蛋白,如“乙型肝炎核心抗原”或“HBcAg”和“乙型肝炎E抗原”,或者“HBeAG”和包膜蛋白,如“HBV表面抗原”或“HBsAg”。
“乙型肝炎E抗原”或“HBeAg”是分泌型、非颗粒形式的HBV核心蛋白。HBV抗原HBeAg和HBcAg共享一级氨基酸序列,因此在T细胞水平上显示交叉反应性。HBeAg不是病毒组装或复制所必需的,尽管研究表明其可能是建立慢性感染所必需的。
“HBV表面抗原”或“HBsAg”或“HBsAG”是感染性HBV病毒颗粒的包膜蛋白,但也以非感染性颗粒(Dane颗粒)的形式分泌,其血清水平比HBV病毒颗粒高1000倍。感染者或动物的血清HBsAg水平可高达1000μg/mL(Kann和Gehrlich(1998)Topley&Wilson’s Microbiologyand Microbial Infections,第9版,745)。
“乙型肝炎相关病况”或“HBV相关病况”是指因乙型肝炎感染、暴露或疾病而加剧、引起、相关、关联或可追溯的任何疾病、生物学状况、医疗状况或事件。术语乙型肝炎相关病况包括慢性HBV感染、炎症、纤维化、肝硬化、肝癌、血清肝炎、黄疸、肝癌、肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝脏衰竭、弥漫性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征、血清肝炎、HBV病毒血症、移植相关肝病以及具有可以包括以下中的任何或全部症状的病况:与乙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒抗原的阳性检测或乙型肝炎病毒抗原特异性抗体的阳性检测相结合时,流感样疾病、虚弱、疼痛、头痛、发烧、食欲不振、腹泻、恶心和呕吐、身体肝脏区域疼痛、粘土或灰色粪便、全身瘙痒和深色尿液。
“抑制表达或活性”是指表达或活性的减少、阻断,并不一定表示表达或活性的完全消除。
“核苷间键”是指核苷之间的化学键。
“连接的核苷”是指通过核苷间键连接在一起的相邻核苷。
“修饰的核苷间连接”是指天然存在的核苷间连接(即,磷酸二酯核苷间连接)的取代或任何变化。
“硫代磷酸酯连接”是指核苷之间的连接,其中磷酸二酯键通过用硫原子替换非桥连氧原子之一而被修饰。硫代磷酸酯连接是修饰的核苷间连接。
“修饰的核碱基”指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的任何核碱基。“未经修饰的核碱基”指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”是指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间连接或修饰的核碱基的核苷酸。
“修饰的寡核苷酸”是指包含至少一个修饰的核苷间连接、修饰的糖和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”指天然糖部分的取代和/或任何改变。
“化学上不同的区域”是指反义化合物的区域在某些方面与相同反义化合物的另一个区域在化学上不同。例如,具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域与不具有2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域是化学上不同的。
“基序”指在反应化合物中未经修饰和经修饰的核苷的模式。
“间隔体”是指嵌合反义化合物,其中具有支持RNase H切割的多个核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间,其中包含内部区域的核苷与包含外部区域的一个或多个核苷是化学上不同的。可以将内部区域称为“间隔”,以及可以将外部区域称为“翼”。
“翼区段”指修饰以赋予寡核苷酸性质(如增强的抑制活性、对靶核酸增加的结合亲和性或对通过体内核酸酶降解的抗性)的多个核苷。
“天然糖部分”指在DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中存在的糖部分。
“未经修饰的”核碱基指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“未经修饰的核苷酸”是指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间连接组成的核苷酸。在某些实施方式中,未经修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即,β-D-核糖核苷)或DNA核苷(即,β-D-脱氧核糖核苷)。
“核酸”指由单体核苷酸构成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微RNA(miRNA)。
“核碱基”指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基互补性”指能够与另一个核碱基碱基配对的核碱基。例如,在DNA中,腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)是互补的。例如,在RNA中,腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)是互补的。在某些实施方式中,互补核碱基是指能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的反义化合物的核碱基。例如,如果反义化合物某一位置的核碱基能够与靶核酸某一位置的核碱基形成氢键,则寡核苷酸和靶核酸之间的氢键位置被认为在该核碱基对处是互补的。
“核碱基序列”是指独立于任何糖、连接和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“核苷”指连接指糖的核碱基。
“核苷酸”指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。
“寡核苷酸”指连接的核苷的聚合物,每个核苷可以被修饰或未修饰,彼此独立。
“胃肠外施用”是指通过注射(例如,推注)或输注施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、腹腔内施用或颅内施用,例如,鞘内施用或脑室内施用。
“药物组合物”指适于向受试者施用的物质的混合物。例如,适于通过注射施用的药物组合物可以包含反义寡核苷酸和/或疫苗组分和无菌水溶液。
“受试者”指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
关于百分比同源性,查看两个序列的成对比对,可以观察到两个序列之间的比对的相同残基(″同一性″)。可以通过将(a)同一性数目和参考序列的全长之间的商乘以100来计算同一性(或同源性)的百分比(即百分比同一性=(同一性数目x100)/参考序列的长度。
方案
本公开内容涵盖以下方案,所述方案提供了反义寡核苷酸(ASO)治疗的计划表,随后是异源初免-强化疫苗计划表,所述计划表涉及编码乙型肝炎核心(HBc)和乙型肝炎表面(HBs)抗原的至少一个病毒载体,以诱导强CD8+T细胞应答,以及顺序或同时施用佐剂化的重组HBc和HBs蛋白,以诱导强抗原特异性CD4+T细胞和抗体应答。所公开的ASO治疗成功抑制体内和体外肝细胞中的靶HBV DNA和RNA。在再现人慢性HBV感染的病毒学和免疫学特征的小鼠模型中,所公开的疫苗方案成功地恢复了HBs和HBc特异性抗体和CD8+T细胞应答以及HBs特异性CD4+T细胞应答,而无肝脏改变副作用的相关体征。总之,组合的ASO和疫苗方案将提供病毒和临床应答,包括HBsAg和/或HBsAg血清转化的丧失,以及诱导对HBV核心抗原(HBcAg)的强大的多功能性CD8+T细胞应答。
更具体地,提供了一种治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBVASO)的组合物;
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)向所述人类施用包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBC)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,步骤b)在步骤c)之前和步骤c)在步骤d)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤c)。在某些实施方式中,所述方法的步骤之间的时间段是2至12周,例如,2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一个实施方式中,所述方法的步骤之间的时间段是4至8周。在一个实施方式中,根据所述方法顺序施用组合物之间的时间段是4周。在一个实施方式中,步骤a)以每周间隔或每两周间隔或每3周或每4周进行2至12次,例如2至10次、2至8次、2至7次、2至6次、2至5次,例如4次、3次或2次。在一个特定的实施方式中,步骤a)以每周间隔2至10次、以每周间隔2至8次、以每周间隔2至7次、以每周间隔2至6次、以每周间隔2至5次,例如以每周间隔4次、以每周间隔3次或以每周间隔2次进行。在另一个实施方式中,每天重复步骤a),然后每周重复一次。例如,步骤a)可以每天进行2至4次,然后以每周间隔进行2至8次。在另一个实施方式中,步骤a)在方案的第1天、第3天和第5天重复三次,然后以在方案的第12天开始的每周间隔进行2至8次、2至6次、2至4次,例如4次、3次或2次。在一个进一步的实施方式中,步骤a)在20-36天的时间段内,例如在方案的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天、第22天、第26天和第30天,或在所述方案的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第22天,或在所述方案的第1天、第6天、第11天、第16天、第21天、第26天、第31天和第36天进行4至8次。在一个实施方式中,步骤a)在步骤b)之前每天、隔天和/或以每周间隔进行,步骤b)在步骤c)之前进行且步骤c在步骤d)之前进行。在另一个实施方式中,步骤a)在步骤b)之前每天、隔天和/或以每周间隔进行,且在进行步骤b)、步骤c)和/或步骤d)的时间段期间以每周间隔重复。在另一个实施方式中,步骤d)与步骤a)和/或与步骤b)和/或与步骤c)同时进行。在某些实施方式中,可以同时重复步骤b)和c)。在某些实施方式中,可以同时重复步骤c)和d)。在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)任选地在步骤c)之前、步骤c)在步骤b)之前和步骤d)在步骤b)之后重复,或者与步骤b)和/或与步骤c)同时进行。在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)任选地在步骤d)之前、步骤d)在步骤b)之前和步骤b)在步骤c)之前重复。在另一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)任选第在步骤d)之前、步骤d)在步骤b)之前和步骤b)在步骤c)之前重复。在一个进一步的实施方式中,重复步骤d并按照以下顺序进行所述方法的步骤:步骤a)(任选地重复)、步骤b)、步骤c)、步骤d)、步骤d)。在某些实施方式中,所述方法的步骤b)、c)和d)之间的时间段是2至12周,例如2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一个实施方式中,所述方法的步骤b)、c)和d)之间的时间段是4至8周。在一个实施方式中,根据所述方法的步骤b)、c)和d)顺序施用组合物之间的时间段是4周。在某些实施方式中,所述方法在一年的时间段进行。在某些实施方式中,所述方法在8至50周,例如8至40周、8至30周、8至20周、8至16周的时间段内进行,例如所述方法可经8周、9周、10周、12周、14周、16周,经10至16周、12至16周、16至20周、20至40周或30至50周的时间段进行。
在另一个方面中,提供了一种治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
c)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,且步骤b)在步骤c)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤c)。在另一个实施方式中,步骤c)与步骤b)同时进行。在某些实施方式中,所述方法的步骤b)和c)之间的时间段是2至12周,例如2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一个实施方式中,所述方法的步骤b)和c)之间的时间段是4至8周。在一个实施方式中,步骤a)以每周间隔或每两周间隔或每3周或每4周进行2至12次,例如2至10次、2至8次、2至7次、2至6次、2至5次,例如4次、3次或2次。在一个特定的实施方式中,步骤a)以每周间隔2至10次、以每周间隔2至8次、以每周间隔2至7次、以每周间隔2至6次、以每周间隔2至5次,例如以每周间隔4次、以每周间隔3次或以每周间隔2次进行。在另一个实施方式中,每天重复步骤a),然后每周重复一次。例如,步骤a)可以每天进行2至4次,然后以每周间隔进行2至8次。在另一个实施方式中,步骤a)在方案的第1天、第3天和第5天重复三次,然后以在方案的第12天开始的每周间隔进行2至8次、2至6次、2至4次,例如4次、3次或2次。在一个进一步的实施方式中,步骤a)在20-36天的时间段内,例如在方案的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天、第22天、第26天和第30天,或在所述方案的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第22天,或在所述方案的第1天、第6天、第11天、第16天、第21天、第26天、第31天和第36天进行4至8次。在一个实施方式中,步骤a)在步骤b)之前每天、隔天和/或以每周间隔进行,步骤b)在步骤c)之前进行。在另一个实施方式中,步骤a)在步骤b)之前每天、隔天和/或以每周间隔进行,且在进行步骤b)和步骤c)的时间段期间以每周间隔重复。在另一个实施方式中,步骤c)与步骤a)和/或与步骤b)同时进行。在某些实施方式中,可以同时重复步骤b)和c)。在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)任选地在步骤c)之前,且步骤c)在步骤b)之前重复。在某些实施方式中,所述方法在一年时间段进行。在某些实施方式中,所述方法在8至50周,例如8至40周、8至30周、8至20周、8至16周的时间段内进行,例如所述方法可经8周、9周、10周、12周、14周、16周,经10至16周、12至16周、16至20周、20至40周或30至50周的时间段进行。
在某些实施方式中,在所述方法的步骤a)施用的组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个连接的核苷的寡核苷酸(HBV ASO)。HBV靶点具有包含在SEQ ID NO:16的序列内的序列。因此,在某些实施方式中,HBV ASO靶向HBV核酸的区域。在某些实施方式中,在步骤a)中施用的组合物包含具有与SEQ ID NO:16的HBV核酸的靶向区域的相同长度核碱基部分互补的连续核碱基部分的HBV ASO。例如,所述HBV ASO的连续核碱基部分可以是与区域SEQID NO:16的相同长度部分互补的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基。在某些实施方式中,在步骤a)中施用的组合物包含靶向HBV核酸的反义寡核苷酸,其在SEQ ID NO:16的以下核苷酸区域中的一者内互补:58-73、58-74、58-77、59-74、59-75、60-75、60-76、61-76、61-77、62-77、253-272、253-269、254-270、255-271、256-272、411-437、411-426、411-427、411-430、412-427、412-428、412-431、413-428、413-429、413-432、414-429、414-430、414-433、415-430、415-431、415-434、416-431、416-432、416-435、417-432、417-433、417-436、418-433、418-434、418-437、457-472、457-473、458-473、670-706、670-685、670-686、671-686、671-687、672-687、672-688、673-688、687-702、687-703、687-706、688-703、688-704、689-704、689-705、690-705、690-706、691-706、1261-1285、1261-1276、1261-1277、1261-1280、1262-1277、1262-1278、1262-1281、1263-1278、1263-1279、1263-1282、1264-1279、1264-1280、1264-1283、1265-1280、1265-1281、1265-1284、1266-1281、1266-1282、1266-1285、1267-1282、1267-1283、1268-1283、1268-1284、1269-1284、1269-1285、1270-1285、1577-1606、1577-1592、1577-1593、1577-1596、1578-1593、1578-1594、1578-1597、1579-1594、1579-1594、1579-1598、1580-1595、1580-1596、1580-1599、1581-1596、1581-1597、1581-1600、1582-1597、1582-1598、1582-1601、1583-1598、1583-1599、1583-1602、1584-1599、1584-1600、1584-1603、1585-1600、1585-1601、1585-1604、1586-1601、1586-1602、1586-1605、1587-1602、1587-1603、1587-1606、1588-1603、1588-1604、1589-1604、1589-1605、1590-1605、1590-1606、1591-1606、1778-1800、1778-1793、1778-1794、1778-1797、1779-1794、1779-1795、1779-1798、1780-1795、1780-1796、1780-1799、1781-1796、1781-1797、1781-1800、1782-1797、1782-1798、1783-1798、1783-1799、1784-1799和1784-1800。
在某些实施方式中,在步骤a)中施用的组合物包含HBV ASO,其中连续核碱基部分是与SEQ ID NO:16的HBV核酸的区域的相同长度部分互补的16、17、18、19或20个连续核碱基。在一个特定实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸具有与SEQ ID NO:16的以下核苷酸区域中的一者互补的16-20个互补连续核碱基:58-77、253-272、411-430、412-431、413-432、414-433、415-434、416-435、417-436、418-437、687-706、1261-1280、1262-1281、1263-1282、1264-1283、1265-1284、1266-1285、1577-1596、1578-1597、1579-1598、1580-1599、1581-1600、1582-1601、1583-1602、1584-1603、1585-1604、1586-1605、1587-1606、1778-1797、1779-1798、1780-1799和1781-1800或其部分。在一个特定实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸具有与SEQ ID NO:16的以下核苷酸区域中的一者互补的20个互补连续核碱基:58-77、253-272、411-430、412-431、413-432、414-433、415-434、416-435、417-436、418-437、687-706、1261-1280、1262-1281、1263-1282、1264-1283、1265-1284、1266-1285、1577-1596、1578-1597、1579-1598、1580-1599、1581-1600、1582-1601、1583-1602、1584-1603、1585-1604、1586-1605、1587-1606、1778-1797、1779-1798、1780-1799和1781-1800。
在某些实施方式中,在步骤a)中施用的组合物包含靶向HBV核酸的反义寡核苷酸,其在SEQ ID NO:16的以下核苷酸区域内互补:1583-1602。在一个特定的实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸具有与SEQ ID NO:16的以下核苷酸区域内互补的16-20个互补连续核碱基:1583-1602。在一个特定的实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸具有与SEQID NO:16的以下核苷酸区域互补的20个互补连续核碱基:1583-1602。
在某些实施方式中,在步骤a)中施用的组合物包含具有选自WO2012/145697(PCT/US2012/034550,于2012年04月20日提交)的SEQ ID NO:83-310的核苷酸序列的反义寡核苷酸。在特定实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸(HBV ASO)具有选自WO2012/145697的SEQ ID NO:224-227的核苷酸序列,或者与选自WO2012/145697的SEQ ID NO:224-227的序列具有85-95%同一性的序列。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
在某些实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd载体,其选自以下ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9,特别是ChAd63或ChAd155。在某些实施方式中,ChAd载体包括编码HBc和HBs的载体插入物,其通过编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔。在某些实施方式中,载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在某些实施方式中,HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)融合至hIi(例如,SEQID NO:7或与其至少98%同源的氨基酸序列,或者SEQ ID NO:12或与其至少98%同源的氨基酸序列)。例如,HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:7),或者HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:12)。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd155载体,其包含编码hIi、HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图13中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd载体,其包含编码SEQ ID_NO:9的氨基酸序列或SEQID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在某些实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd载体,其包含具有在SEQ ID NO:10给出的核苷酸序列或在SEQ IDNO:14给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个特定实施方式中,载体是ChAd155载体。因此,在某些实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在其他实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd155载体,其包含具有在SEQ ID NO:10中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在其他实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物包含ChAd155载体,其包含具有在SEQ ID NO:14中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物包含MVA载体,其包含编码由编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物。在某些实施方式中,所述载体编码HBc和HBs,其由编码引入口蹄疫病毒的2A切割区域的间隔序列的序列所分隔。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示的结构的构建体的插入物。在某些实施方式中,载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在一个实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物包含MVA载体,其包含具有在SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物包含以1∶1比率的重组HBc和重组HBs。在另一个实施方式中,在组合物中HBc与HBs的比率大于1,例如,HBc与HBs的比率可以是1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1或更高,特别是3∶1至5∶1,如3∶1、4∶1或5∶1,特别是4∶1的比率。在特定实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物包含比率为4∶1或更高的重组HBc和重组HBs。在某些实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物包含全长重组乙型肝炎表面抗原(HBs)(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列)、在C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。在某些实施方式中,截短的重组HBc包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149(例如,SEQID NO:2或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在一个实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物包含全长重组HBs、HBc的氨基酸1-149以及包含MPL和QS-21的佐剂。例如,在所述方法的步骤d)中施用的组合物包含全长重组HBs(SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和Hbc抗原是病毒样颗粒形式。
在一个进一步的实施方式中,提供了一种治疗人类CHB和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)向所述人类施用包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
d)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物;和
e)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
在本发明的另一个方面中,提供了一种治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,其包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用i)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及同时施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物;和
c)向所述人类施用i)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,以及同时施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
在本发明这一方面的一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,且步骤b)在步骤c)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤b)。任选地,可以重复步骤c)。在一个实施方式中,按照以下顺序进行方法步骤:步骤a),随后是步骤a),随后是步骤b),随后是步骤c)。在一个替代实施方式中,按照以下顺序进行方法步骤:步骤a)随后是步骤b),随后是步骤c),随后是步骤c)。在一个实施方式中,按照以下顺序进行方法步骤:步骤a)随后是步骤b),随后是步骤b),随后是步骤c)。任选地,步骤a)可以重复一次以上。任选地,可以重复步骤a)和步骤c)两者。在本发明这一方面的一个实施方式中,按照以下顺序进行方法步骤:步骤a)随后是步骤a),随后是步骤b),随后是步骤c),随后是步骤c)。在一个替代实施方式中,按照以下顺序进行方法步骤:步骤b)随后是步骤a),随后是步骤b),随后是步骤b)。在一个进一步的实施方式中,按照以下顺序进行方法步骤:步骤a)重复2至8次,随后是步骤b),随后是步骤c),随后是步骤c),任选地,随后是步骤c)。在某些实施方式中,所述方法的步骤之间的时间段是2至12周,例如,2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一个实施方式中,所述方法的步骤之间的时间段是4至8周。在一个实施方式中,根据所述方法顺序施用组合物之间的时间段是4周。
因此,在本发明这一方面的另一个实施方式中,提供了一种治疗人类CHB和/或CHD的方法,其包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用i)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及同时,施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物的组合物;
c)向所述人类施用i)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码HBs抗原的多核苷酸和编码HBc抗原的核酸,以及同时,施用ii)包含重组HBs蛋白抗原、重组HBc蛋白抗原和佐剂的组合物;
d)向所述人类施用i)包含MVA载体的组合物,所述载体包含编码HBs抗原的多核苷酸和编码HBc抗原的核酸,以及同时,施用ii)包含重组HBs蛋白抗原、重组HBc蛋白抗原和佐剂的组合物;和
e)向所述人类施用i)包含MVA载体的组合物,所述载体包含编码HBs抗原的多核苷酸和编码HBc抗原的核酸,以及同时,施用ii)包含重组HBs蛋白抗原、重组HBc蛋白抗原和佐剂的组合物。
在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补,
在某些实施方式中,可以重复步骤a)。在特定实施方式中,步骤a)以每天或每周间隔重复2至12次。在某些实施方式中,所述方法的步骤b)、c)、d)和e)之间的时间段是2至12周,例如2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一个实施方式中,所述方法的步骤b)、c)、d)和e)之间的时间段是4至8周。在一个实施方式中,根据所述方法顺序施用组合物之间的时间段是4周。在一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物i)包含ChAd载体,所述载体选自以下:ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9,特别是ChAd63或ChAd155。在某些实施方式中,所述ChAd载体包含编码由编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc和HBs,所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域。在某些实施方式中,HBc融合至hIi。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物i)包含ChAd155载体,其包含编码hIi、HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图13中所示的结构的构建体的插入物。在某些实施方式中,载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在某些实施方式中,HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:7或与其至少98%同源的氨基酸序列,或者SEQ IDNO:12或与其至少98%同源的氨基酸序列)。例如,HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:7),或者HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:12)。在一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物i〕包含ChAd155载体,其包含编码SEQ IDNO:9的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在另一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物i)包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物i)包含ChAd155载体,其包含具有在SEQ ID NO:10中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在另一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物i)包含ChAd155载体,其包含具有在SEQ ID NO:14中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在某些实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物ii)包含全长重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。在某些实施方式中,截短的重组HBc包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149。在一个实施方式中,在所述方法的步骤b)中施用的组合物ii)包含全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。
在一个实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码由编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含具有在SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在某些实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物ii)包含全长重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。在某些实施方式中,截短的重组HBc包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149。在一个实施方式中,在所述方法的步骤c)中施用的组合物ii)包含全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。
在一个实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码由编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔的HBc和HBS的载体插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含具有SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在某些实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物ii)包含全长重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。在某些实施方式中,截短的重组HBc包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。在一个实施方式中,在所述方法的步骤d)中施用的组合物ii)包含全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂。
在一个实施方式中,在所述方法的步骤e)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码由编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤e)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤e)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在所述方法的步骤e)中施用的组合物i)包含MVA载体,其包含具有在SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在某些实施方式中,在所述方法的步骤e)中施用的组合物ii)包含全长重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。在某些实施方式中,截短的重组HBc包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149。在一个实施方式中,在所述方法的步骤e)中施用的组合物ii)包含全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。
本发明还提供了一种在患有CHB和/或CHD的人中诱导细胞免疫应答和体液免疫应答的方法,特别是CD4+应答和CD8+应答和抗体应答,所述方法包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)向所述人类施用包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,步骤b)在步骤c)之前且步骤c)在步骤d)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤d)。在另一个实施方式中,步骤d)与步骤b)和/或与步骤c)同时进行。在一个进一步的实施方式中,在患有CHB和/或CHD的人中诱导细胞免疫应答和体液免疫应答(特别是CD4+应答和CD8+应答和抗体应答)的方法包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用i)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及同时施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物;和
c)向所述人类施用i)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,以及同时施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,且步骤b)在步骤c)之前。任选地,可以重复步骤c)。
本发明还提供了一种在患有CHB和/或CHD的人中降低血清HBsAg水平和/或血清HBV DNA水平的方法,所述方法包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)向所述人类施用包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,步骤b)在步骤c)之前且步骤c)在步骤d)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤d)。在另一个实施方式中,步骤d)与步骤b)和/或与步骤c)同时进行。
在一个进一步的实施方式中,在患有CHB和/或CHD的人中降低血清HBsAg水平和/或血清HBV DNA水平的方法包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸的组合物(HBV ASO);
b)向所述人类施用i)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及同时,施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物;和
c)向所述人类施用i)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,以及同时施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个实施方式中,所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,且步骤b)在步骤c)之前。任选地,可以重复步骤a)。任选地,可以重复步骤c)。在一个进一步的实施方式中,如通过定量免疫测定所确定的,血清HBsAg的水平降至不可检测的水平。在另一个实施方式中,如通过HBV测定或等效物所确定的,血清HBV DNA的水平降低至不可检测的水平。在另一个实施方式中,血清HBsAg的水平和/或血清HBV DNA的水平降低至不可检测的水平并保持至少6个月。在另一个实施方式中,血清HBsAg的水平和/或血清HBV DNA的水平降低至不可检测的水平并且ALT水平保持在正常范围内持续至少6个月。
抗原
已经鉴定了至少九种HBV的基因型(A至I),其基因组差异超过8%。在给定HBV基因型内,已经鉴定了多种基因亚型,其差异为4-8%。合适地选择用于所公开的方法中的抗原以提供跨多种、优选所有HBV基因型的免疫学覆盖范围。乙型肝炎核心蛋白抗原(HBc)跨基因型和基因亚型高度保守,并且合适地选择乙型肝炎表面蛋白抗原(HBs)序列以包括关键的跨基因型保留的B-细胞表位,其允许诱导广泛的中和应答。合适地,用于公开的方法和组合物中的HBc和HBs的序列基于来自基因型/亚型A2的那些。
合适地,用于公开的方法和组合物中的HBs抗原源自小、中或大表面抗原蛋白。具体而言,合适的HBs抗原包含HBV adw2毒株、基因型A的小(S)蛋白。例如,合适的HBs抗原具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的226个氨基酸。当用作重组蛋白时,HBs抗原优选组装成病毒样颗粒。该抗原包括在充分研究的市售乙型肝炎预防性疫苗(Engerix B、Fendrix、Twinrix和其他)中,并且已被证明针对跨基因型的乙型肝炎是保护性的。优选地,重组HBs蛋白抗原从酵母表达并纯化以用于本发明的疫苗组合物和方法中。用于表达和纯化的合适方法是已知的,例如从EP1307473B1已知。
乙型肝炎核心蛋白(HBc)是包装病毒基因组的核衣壳的主要组分。该蛋白(183-185aa长)在受感染细胞的细胞质中表达,并且保持未糖基化。HBc包含149个残基的组装结构域和在C末端的34-36个残基的RNA-结合结构域。用于公开的方法和组合物中的HBc抗原可以是全长的,或者可以包含C-末端截短的蛋白(缺乏RNA-结合C-末端),例如包括野生型核心抗原蛋白的组装结构域的145-149个氨基酸,例如野生型乙型肝炎核心抗原蛋白的氨基酸1-145、1-146、1-147、1-148或氨基酸1-149。截短的蛋白保留组装成核衣壳颗粒的能力。用于公开的方法和组合物中的合适的HBc抗原具有来自HBV adw2毒株、基因型A的氨基酸序列。当用作重组蛋白时,HBc抗原合适地在C-末端从野生型截短,具体而言,所述抗原可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。优选地,重组HBc蛋白抗原从大肠杆菌表达并纯化以用于本发明的疫苗组合物和方法中。用于在大肠杆菌中重组表达病毒蛋白的方法是本领域中众所周知的。
当用作重组蛋白时,HBc抗原优选组装成病毒样颗粒。当从病毒载体表达时,HBc抗原可以是全长或截短的,例如合适地是全长HBc抗原(例如SEQ ID NO:11)。用于本文公开的方法中的重组HBs蛋白抗原的合适剂量为每剂10ug至每剂100ug,诸如每剂10ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug。用于本文公开的方法中的重组HBc抗原蛋白的合适剂量为每剂10ug至每剂100ug,诸如每剂10ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug。
抗原是在体内诱导免疫应答、尤其是抗体的产生的物质。抗原可以是外来起源的,即病原体起源的,或来自生物体本身,后者被称为自身或自体抗原。抗原可以通过MHC分子呈递在抗原呈递细胞的表面上。存在两类MHC分子,MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)。MHC-II分子是膜结合的受体,其在内质网中合成并在MHCII类隔室中离开内质网。为了防止内源性肽(即自身抗原)结合MHC-II分子并呈递以生成免疫应答,新生的MHC-II分子与另一种蛋白(恒定链)(其阻断MHC-II分子的肽-结合裂缝)组合。人恒定链(hIi,当在质膜上表达时也称为CD74)是一种进化保守的II型膜蛋白,其在细胞内和整个免疫系统中具有几种作用[Borghese,2011]。当MHC II类隔室融合至含有吞噬和降解的外来蛋白的晚期内体时,恒定链被切割,仅留下与MHC-II分子结合的CLIP区域。在第二步中,通过HLA-DM分子除去CLIP,使MHC-II分子游离以结合外来蛋白的片段。一旦MHC II类隔室与质膜融合,所述片段就呈递在抗原呈递细胞的表面上,因此将外来抗原呈递给其他细胞,主要是T-辅助细胞。
已知当编码恒定链和所述抗原的融合体的腺病毒表达系统用于接种疫苗时,针对抗原的免疫应答增加(参见WO2007/062656,其也公开为US2011/0293704,并且出于公开恒定链序列的目的而通过引用并入),即恒定链增强抗原的免疫原性,且恒定链诸如hIi有时被称为识别该作用中的“遗传佐剂”。此外,已经证明所述腺病毒构建体可用于在引发-加强接种疫苗方案的背景下引发免疫应答(参见WO2014/141176,其也公开为US2016/0000904;和WO2010/057501,其也公开为US2010/0278904并且为了公开恒定链序列和编码恒定链序列的腺病毒载体的目的而通过引用并入)。具体而言,hIi序列和hIi具有增加CD8+T-细胞应答的潜能[Spencer,2014;Capone,2014]。在某些实施方式中,用于本文公开的方法、用途和组合物中使用的载体内包括的核苷酸序列可以包括编码hIi的核苷酸序列。如公开的腺病毒载体ChAd155-hIi-HBV中可以包括的hIi的氨基酸序列示于SEQ ID NO:7中,且替代序列示于SEQ ID NO:12中。编码这些氨基酸序列的核苷酸序列示于SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13中。合适地,将编码hIi的核苷酸序列融合至编码HBc抗原的核苷酸序列,以产生其中hIi多肽N-末端融合至HBc抗原的融合蛋白。
载体
除了编码抗原蛋白的多核苷酸(在本文中也称为“插入物”)以外,用于本文公开的方法和组合物中使用的载体还可以包括常规的控制元件,其以允许其在用载体转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与编码多核苷酸可操作连接。因此,将编码蛋白抗原的载体插入物多核苷酸并入具有合适控制元件的表达盒中。
表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的RNA加工信号诸如剪接和聚腺苷酸化(聚A)信号,包括兔β-珠蛋白聚A;稳定细胞质mRNA的序列;增强翻译效率的序列(例如,Kozak共有序列);增强蛋白稳定性的序列;和当期望时,增强编码的产物的分泌的序列。
启动子是允许RNA聚合酶的结合并指导基因的转录的核苷酸序列。通常,启动子位于靠近所述基因的转录起始位点的基因的5’非编码区域中。在转录的起始中发挥功能的启动子内的序列元件经常通过共有核苷酸序列表征。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括人)的启动子。大量表达控制序列(包括内部的、天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子)是本领域中已知的并且可以进行利用。
组成型启动子的实例包括TBG启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地与RSV增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子一起,参见,例如,Boshart等人,Cell,41:521-530(1985))、CASI启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子(Invitrogen)。合适地,所述启动子是CMV启动子或其变体,更合适地是人CMV(HCMV)启动子或其变体。
腺病毒载体
由于其在各种靶标组织中实现高度有效基因转移的能力以及其大转基因容量,腺病毒已被广泛用于基因转移应用。常规地,将腺病毒的E1基因缺失并用转基因盒替换,从而产生复制缺陷的重组病毒,所述转基因盒由选择的启动子、目标基因的cDNA序列和聚腺苷酸信号组成。在动物模型以及人中,已经显示人腺病毒载体是用于诱导对转基因的CD8+T-细胞应答的有效载体。腺病毒具有广泛的嗜性,并且具有感染复制和非复制细胞的能力。基于人腺病毒的载体的临床应用的主要限制是中和抗体在普通群体中的普遍流行。分离自替代物种的腺病毒已被认为是潜在的疫苗载体,以绕开人中预先存在的抗腺病毒免疫力的问题。它们中,源自黑猩猩、大猩猩或倭黑猩猩的猿猴腺病毒可适用于递送抗原和在人中引发针对那些抗原的靶向T细胞和/或体液应答。猿猴腺病毒,包括源自黑猩猩的那些,已在临床研究中进行测试。黑猩猩腺病毒载体在人群中具有低血清阳性率/没有血清阳性率,已知在人中不引起病理性疾病,并且一些ChAd载体可以在先前用于生产临床级材料的细胞系、诸如人胚肾细胞293(HEK 293)中生长至高滴度。
不能复制的或复制缺陷的腺病毒是不能复制的腺病毒,因为其已经被工程改造以至少包含功能缺失(或“功能丧失”突变),即在不将基因完全除去的情况下损害该基因的功能的缺失或突变,例如人工终止密码子的引入,活性位点或相互作用结构域的缺失或突变,基因的调节序列的突变或缺失等,或编码对于病毒复制必需的基因产物的基因的完全除去,诸如选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4(诸如E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1)的腺病毒基因中的一个或多个的完全除去。合适地,E1和E3基因被缺失。更合适地,E1、E3和E4基因被缺失。
用于本文公开的方法和组合物中的合适的载体是复制缺陷的黑猩猩腺病毒载体,例如ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan6、Pan 7(也称为C7)或Pan 9。此类毒株的实例描述于WO03/000283、WO2005/071093、WO2010/086189和WO2016/198621中。ChAd155载体(参见WO2016/198621,其出于公开ChAd155载体序列和方法的目的通过引用并入)属于与ChAd3载体(组C)相同的系统发生腺病毒组。在一个实施方式中,用于本文公开的方法和组合物中的载体是系统发生组C的ChAd载体,例如ChAd3或ChAd155。在一个具体实施方式中,本文公开的治疗慢性乙型肝炎的方法包括以下步骤:向人施用包含ChAd155载体的组合物,所述ChAd155载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸。用于本文公开的方法中的ChAd载体的合适剂量是每剂1x108-1x1011个病毒颗粒(vp),例如每剂约1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010或1x1011个病毒颗粒(vp)。
更具体地,在一个实施方式中,用于本文公开的方法和组合物中的载体是复制缺陷的黑猩猩腺病毒载体ChAd155,其编码源自以下两种HBV蛋白的序列的融合体:HBc(核心,核衣壳蛋白)和HBs(小表面抗原)。在某些特定实施方式中,所述载体是ChAd155,其编码HBc和HBs,其被SEQ ID NO:3(并入编码口蹄疫病毒(FMDV)的2A切割区域的序列[Donnelly等,2001]的间隔区)隔开(产生在上游蛋白的C-末端的23个氨基酸的尾部和在下游蛋白的N-末端的单个脯氨酸),用于将HBc和HBs加工成分开的蛋白。从表面抗原切割核心允许HBs的正确折叠,允许生成对表面抗原的抗体应答。或者,所述腺病毒载体可以是双重启动子(双顺反子)载体,以允许HBs和HBc抗原的独立表达。
在某些实施方式中,可以将编码HBc蛋白的基因的N-末端部分融合至编码人主要组织相容性复合体(MHC)II型相关的恒定链、p35同种型(即hIi或CD74)的基因。因此,用于本文公开的方法和组合物中的具体ChAd155载体包含编码具有图13中显示的结构的构建体的多核苷酸载体插入物,所述构建体包含hIi、HBc、2A和HBs。这种构建体的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中给出,且编码该构建体的氨基酸序列的核苷酸序列在SEQ ID NO:10中给出。这种替代构建体的氨基酸序列在SEQ ID NO:15中给出,且编码该构建体的氨基酸序列的核苷酸序列在SEQ ID NO:14中给出。
经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体
在人和其他哺乳动物中复制缺陷的修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)源自痘苗病毒。其属于痘病毒家族,并且最初被开发来通过将痘苗病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞中传代超过570次,导致多次缺失,此后该病毒在人和其他哺乳动物中高度减毒且复制缺陷,来提高天花接种疫苗的安全性。复制缺陷发生在病毒粒子组装的后期,使得病毒和重组基因表达不受损,使MVA成为不能引起哺乳动物中的感染的有效的单轮表达载体。MVA随后已被广泛用作病毒载体,以在动物模型和人两者中诱导针对转基因的抗原-特异性免疫力。MVA的描述可见于Mayr A等(1978)和Mayr,A.等(1975)中。
在一个实施方式中,MVA源自从痘苗病毒在CEF细胞上的第571次传代获得的病毒种子批次460MG。在另一个实施方式中,MVA源自病毒种子批次MVA 476 MG/14/78。在一个进一步实施方式中,MVA在1978年12月31日之前衍生或产生,并且没有病毒污染。用于本文公开的方法中的MVA载体的合适剂量是每剂1x106-1x109个噬斑形成单位(pfu),例如每剂约1x106、2x106、5x106、1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108或1x109pfu。
在一个特定实施方式中,本文公开的一种治疗慢性乙型肝炎的方法包括向人类施用包含MVA载体的组合物的步骤,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸。
更具体地,在一个实施方式中,用于本文公开的方法和组合物中的载体是MVA,其编码源自以下两种HBV蛋白的序列的融合体:HBc(核心核衣壳蛋白)和HBs(小表面抗原)。在某些实施方式中,用于本文公开的方法和组合物中的载体是MVA,其编码HBc和HBs,其被编码SEQ ID NO:3(并入编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列的间隔区)的核苷酸序列隔开(产生在上游蛋白的C-末端的23个氨基酸的尾部和在下游蛋白的N-末端的单个脯氨酸),用于将HBc和HBs加工成分开的蛋白。因此,用于本文公开的方法和组合物中的具体MVA载体包含编码具有图12中显示的结构的构建体的多核苷酸载体插入物,所述构建体包含HBc、2A和HBs。这种构建体的氨基酸序列在SEQ ID NO:5中给出,且编码氨基酸插入物构建体的核苷酸序列在SEQ ID NO:6中给出。
反义寡核苷酸(ASO)
对于表达由DNA编码的蛋白的细胞,DNA的一条链作为合成RNA互补链的模板。模板DNA链称为转录链,其序列与mRNA转录物反义或互补,mRNA转录物与原始双链DNA的有义序列具有相同的序列。由于DNA是双链的,与反义序列互补的链称为非转录链或有义链,并且与mRNA转录物具有相同的序列(除了DNA序列中的T核碱基被RNA序列中的U核碱基取代以外)。
与从DNA转录的RNA互补的核酸被称为“反义”寡核苷酸(ASO),因为其碱基序列与基因的信使RNA(mRNA)互补,即“有义”序列。因此,具有正义序列5’-AAGGTC-3’的编码DNA区域将经转录以产生具有5′-AAGGUC-3′的有义序列的mRNA,因此,如果该有义序列的反义寡聚体包含RNA核碱基,则其序列为3′-UUCCAG-5′,或者如果反义寡聚体包含DNA核碱基,则该序列为3′-TTCCAG-5′。
目前,反义疗法的主要焦点涉及使用寡聚体或寡核苷酸,长度约为20个核苷酸/核苷,合成为与负责靶蛋白表达或翻译的特定“有义”(5’到3’方向)DNA或mRNA序列互补。
一旦被引入细胞,反义寡核苷酸就会通过Watson-Crick结合与其相应的mRNA序列杂交,形成异双链体。一旦形成双链体,则抑制由结合mRNA的序列编码的蛋白的翻译。因此,反义疗法可直接靶向抗原的RNA转录物并且从而降低血清HBeAg和HBsAg的水平。由于在HBV感染时产生多个重叠的转录物,单个反义寡聚体也有机会使HBV DNA减少的数量超过一种HBV抗原。
提出了几种机制,寡核苷酸/mRNA双链体可能通过这些机制阻碍后续的翻译。最广泛接受的解释涉及通过泛素酶RNase H降解异双链体中的mRNA。RNase H被异双链体吸引并切割结合的mRNA,同时保持反义寡核苷酸(ASO)序列完整,允许ASO继续寻找并结合相应的mRNA序列。通过反义疗法抑制翻译的一些其他公认的解释可能单独发生或与RNase H活性结合发生,包括但不限于阻断适当的核糖体组装,使核糖体复合物的翻译能力失效,阻断RNA剪接,和/或阻碍mRNA的适当输出。
在反义疗法领域中,将化学修饰的核苷引入核酸分子,尤其是RNA,为克服外源RNA固有的体内稳定性和生物利用度的潜在限制提供了强大的工具。例如,使用化学修饰的核酸分子可以使特定核酸分子的剂量更低以达到给定的治疗效果,因为化学修饰的核酸分子在血清中往往具有更长的半衰期。此外,某些化学修饰可以通过靶向特定细胞或组织和/或提高核酸分子的细胞摄取来提高核酸分子的生物利用度。因此,即使化学修饰的核酸分子的活性与天然核酸分子相比降低,例如当与全RNA核酸分子相比时,由于改进的稳定性和/或分子的递送,修饰的核酸分子的总体活性可以大于天然分子。
一种有用的化学修饰,称为锁定核酸(LNA),引入2′O-4′C-亚烷基桥,其中亚烷基桥是C1-6亚烷基桥,更特别地,在一个或多个RNA或DNAR核苷部分处的2′O-4′C-亚甲基桥。当将LNA引入反义RNA或DNA寡聚物时,已证明其大大增加了反义RNA或DNA分子的稳定性,从而大大增加了反义RNA或DNA一旦被宿主细胞吸收后的生物利用度。可以引入反义RNA或DNA寡聚物以增加反义寡聚物的稳定性和生物利用度的其他有用的化学修饰包括硫代磷酸酯键或磷酸三酯键,使用其取代以代替个体RNA或DNA核苷酸之间天然存在的磷酸二酯键。
在某些实施方式中,在本发明的方法、方案和免疫学组合中使用的包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)的组合物包含是经修饰的反义寡核苷酸的HBV ASO。在一个特定的实施方式中,HBV ASO与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)具有85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸的至少一个核苷间连接是经修饰的核苷间连接。在某些实施方式中,至少一个经修饰的核苷间连接选自磷酸三酯核苷间连接和硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方式中,每个核苷间连接选自磷酸三酯核苷间连接和硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方式中,每个核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸的至少一个核苷包含经修饰的糖。在某些实施方式中,至少一个经修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基基团(2’-O(CH2)2-OCH3)。在某些实施方式中,经修饰的糖包含2’-O-CH3基团。
在某些实施方式中,至少一个经修饰的糖是双环糖。在某些实施方式中,至少一个经修饰的糖,双环糖包含4’-(CH2)n-O-2’桥,其中n是1或2。在某些实施方式中,双环糖包含4’-CH2-O-2’桥。在某些实施方式中,双环糖包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸的至少一个核苷包含经修饰的核碱基。在某些实施方式中,经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方式中,经修饰的寡核苷酸由单链修饰的寡核苷酸组成。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸包含:a)由连接的脱氧核苷组成的间隔区段;b)由连接的核苷组成的5’翼区段;和c)由连接的核苷组成的3’翼区段。间隔区段位于5’翼区段和3’翼区段之间,并且每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸由15-30个,例如15、16、17、20、25或30个连接的核苷组成,间隔区段由7-15个,例如7、8、9、10、12或15个连接的脱氧核苷组成,5’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,3’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖,至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯连接和至少一个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸由15-30个,例如15、16、17、20、25或30个连接的核苷组成,间隔区段由7-15个,例如7、8、9、10、12或15个连接的脱氧核苷组成,5’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,3’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,其中每个翼区段的至少一个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖,至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸由15-30个,例如15、16、17、20、25或30个连接的核苷组成,间隔区段由7-15个,例如7、8、9、10、12或15个连接的脱氧核苷组成,5’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,3’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,其中每个翼区段的至少一个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖,每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接和至少一个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸由15-30个,例如15、16、17、20、25或30个连接的核苷组成,间隔区段由7-15个,例如7、8、9、10、12或15个连接的脱氧核苷组成,5’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,3’翼区段由3-8个,例如3、5、7或8个连接的核苷组成,其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖,每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方式中,经修饰的反义寡核苷酸由20个连接的核苷组成,间隔区段由10个连接的脱氧核苷组成,5’翼区段由5个连接的核苷组成,3’翼区段由5个连接的核苷组成,每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖,每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个特定的实施方式中,靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),其由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
在某些实施方式中,反义化合物可以共价连接至增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物。典型缀合物基团包括胆固醇部分、脂质部分和碳水化合物。在某些实施方式中,缀合物基团是碳水化合物。在特定实施方式中,缀合物基团是糖。在特定实施方式中,缀合物基团是碳水化合物,其包含去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合部分,如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)糖。在某些实施方式中,缀合物基团碳水化合物是GalNAc糖,其包含:
在某些实施方式中,反义寡核苷酸包含缀合至具有以下结构的碳水化合物基团的经修饰的寡核苷酸,例如,如上文所述的WO2012/0145697的SEQ ID NO:226(GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC)的间隔体:
或其药学上可接受的盐(其中所述盐是H2SO4盐或HCl盐)。
在某些实施方式中,反义寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸,其由20个连接的核苷组成,所述核苷具有由WO2012/0145697的SEQ ID NO:226组成的核碱基序列,并且其中所述经修饰的寡核苷酸包含:
由十个连接的脱氧核苷组成的间隔区段;
由五个连接的核苷组成的5’翼区段;
由五个连接的核苷组成的3’翼区段;
其中间隔区段位于5’翼区段和3’翼区段之间,其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖,其中每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶,并且其中所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
在某个实施方式中,反义寡核苷酸具有以下结构:
或其药学上可接受的盐(其中所述盐是H2SO4盐或HCl盐)。
在某些实施方式中,反义寡核苷酸包含经修饰的反义寡核苷酸和缀合物基团,其中所述经修饰的反义寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成,并且包含核碱基序列,所述核碱基序列包含与SEQ ID NO:16(GENBANK登录号U95551.1)的相同长度部分互补的至少8个连续核碱基的一部分,其中所述经修饰的寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:16的12至30个核苷酸片段至少80%互补;并且其中所述缀合物基团包含:
在某些实施方式中,所述经修饰的反义寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖,其中所述经修饰的糖选自2’-O-甲氧基乙基、2’-O-甲氧基乙基、限制性乙基、3’-氟-HNA和双环糖。
在某些实施方式中,所述至少一个经修饰的糖是2’-O-甲氧基乙基和所述经修饰的反义寡核苷酸还包含双环糖,其包含4’(CH2)n-O-2’桥,其中n是1或2。
在某些实施方式中,所述经修饰的反义寡核苷酸的至少一个核苷包含经修饰的核碱基,其中所述至少一个核苷包含经修饰的核碱基,其中所述经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方式中,缀合物基团在经修饰的反义寡核苷酸的5’末端连接至经修饰的反义寡核苷酸,或者缀合物基团连接至经修饰的反义寡核苷酸的3’末端。
在某些实施方式中,所述经修饰的反义寡核苷酸的每个核苷间键选自磷酸二酯核苷间连接、磷酸三酯核苷间连接和硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施方式中,所述经修饰的反义寡核苷酸的每个核苷间连接选自磷酸二酯核苷间连接和硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施方式中,经修饰的寡核苷酸是单链的。
药物组合物
在某些实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含选自以下的ChAd载体:ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9,特别是ChAd63或ChAd155。在某些实施方式中,所述ChAd载体包含由编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔的HBc和HBs。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在某些实施方式中,HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:7或与其至少98%同源的氨基酸序列,或者SEQ IDNO:12或与其至少98%同源的氨基酸序列)。例如,HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:7),或者HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:12)。在一个特定的实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含ChAd155载体,其包含编码hIi、HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图13中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含ChAd载体,其包含编码SEQ IDNO:9的氨基酸序列或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在某些实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含ChAd载体,其包含具有在SEQ ID NO:10中给出的核苷酸序列或在SEQ ID NO:14中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个特定实施方式中,所述载体是ChAd155载体。因此,在某些实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在其他实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含ChAd155载体,其包含具有在SEQ ID NO:10中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在其他实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的组合物包含ChAd155载体,其包含具有在SEQ ID NO:14中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含MVA载体的组合物包含MVA载体,其包含由编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc和HBs,所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域。在一个特定的实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含MVA载体的组合物包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在一个实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含MVA载体的组合物包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含MVA载体的组合物包含MVA载体,其包含具有SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含重组HBs抗原、重组HBc抗原和佐剂的组合物包含以1∶1比率的重组HBc和重组HBs。在另一个实施方式中,在所述组合物中HBc与HBs的比率大于1,例如HBc与HBs的比率可以是1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1或更大,特别是3∶1至5∶1,如3∶1、4∶1或5∶1,特别是4∶1的比率。在特定实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含重组HBs抗原、重组HBc抗原和佐剂的组合物包含以4∶1或更高比率的重组HBc和重组HBs。在某些实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含重组HBs抗原、重组HBc抗原和佐剂的组合物包含全长重组乙型肝炎表面抗原(HBs)(例如,SEQ ID NO:1)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。在某些实施方式中,截短的重组HBc包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-49(例如,SEQ ID NO:2)。在一个实施方式中,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含重组HBs抗原、重组HBc抗原和佐剂的组合物包含全长重组HBs、HBc的氨基酸1-149以及包含MPL和QS-21的佐剂。例如,在治疗CHB和/或CHD的方法中使用的包含重组HBs抗原、重组HBc抗原和佐剂的组合物包含全长重组HBs(SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。
可用于所公开的方法的本文公开的组合物是合适的药学上可接受的组合物。适宜地,药物组合物将包括药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方式中,所述组合物包含经修饰的寡核苷酸的盐。
可以将反义寡核苷酸与用于制备药物组合物或制剂的药学上可接受的活性或惰性物质混合。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于很多标准,包括但不限于施用途径、疾病程度或所施用的剂量。
靶向HBV核酸的反义寡核苷酸可通过将ASO与合适的药学上可接受的稀释剂或载体组合而用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲液(PBS)。PBS是一种适用于胃肠外递送的组合物的稀释剂。因此,在一个实施方式中,在本文所述的方法中使用的是包含HBV ASO和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方式中,药学上可接受的稀释剂是PBS。包含HBV ASO的组合物可以通过将ASO或其药学上可接受的盐混悬在PBS或任何药学或生理学上可接受的载体例如等渗盐水、注射用水或其他合适的稀释剂中而制备用于施用。
包含ChAd或MVA载体的组合物可以通过将病毒载体颗粒悬浮于药学上或生理学上可接受的载体、诸如等渗盐水或其他等渗盐溶液中而制备用于施用。适当的载体对本领域技术人员将是显而易见的,并且将大部分取决于施用的途径。
包含重组蛋白抗原的组合物可以通过如下来制备:从表达它们的细胞培养物分离和纯化蛋白,悬浮于包含一种或多种盐、表面活性剂和/或冷冻保护剂的配制缓冲液中并冻干。例如,合适的配制缓冲液可以包含作为冷冻保护剂的糖或糖(例如蔗糖、海藻糖或三氯蔗糖)的混合物,和作为表面活性剂的非离子共聚物,例如泊洛沙姆。对于施用,将冻干的重组蛋白制剂在药学上或生理学上可接受的载体、诸如等渗盐水或其他等渗盐溶液中重构以用于注射或吸入。适当的载体对本领域技术人员将是显而易见的,并且将大部分取决于施用的途径。重构的组合物还可以包含佐剂或佐剂的混合物。在一个实施方式中,将冻干的重组蛋白在液体佐剂系统制剂中重构。
如本文所用的术语“载体”是指药理学上无活性的物质,诸如但不限于与治疗性活性成分一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。液体载体包括但不限于无菌液体,诸如在水和油中的盐水溶液,所述油包括石油、动物、植物或合成来源的那些,诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液以及含水右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体,特别是用于可注射溶液。合适的药学载体的实例描述于E.W.Martin的″Remington′s PharmaceuticalSciences″中。
除了组合物的ASO、载体或重组蛋白以外,用于本文公开的方法中使用的组合物可以包括佐剂系统。术语“佐剂”是指在细胞或体液水平加强、刺激、活化、强化或调节对组合物的抗原的免疫应答的试剂,例如,免疫佐剂刺激免疫系统对抗原的应答,但自身没有免疫学作用。无论组合物中包含的载体是否还编码“遗传佐剂”、诸如hIi,本文公开的免疫原性组合物都可以在制剂中包括佐剂作为分开的成分。
合适的佐剂是可以增强具有慢性病况和颠覆的免疫能力的受试者中的免疫应答的那些。CHB患者的特征在于其无法对病毒产生有效的先天性和适应性免疫应答,这使得有效的疫苗开发有挑战性。在这些患者中,佐剂化的疫苗制剂的一种关键功能应当旨在将细胞介导的免疫应答引导至公认为对除去细胞内病原体至关重要的T辅助1(Th1)概况。
合适的佐剂的实例包括但不限于:无机佐剂(例如无机金属盐诸如磷酸铝或氢氧化铝)、有机非肽佐剂(例如皂苷,诸如QS21或角鲨烯)、基于油的佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、微粒佐剂(例如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒体、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A(MPL),诸如3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)或胞壁酰基肽)、合成的佐剂(例如非离子的嵌段共聚物、胞壁酰基肽类似物或合成的脂质A)、合成的多核苷酸佐剂(例如聚精氨酸或聚赖氨酸)和含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。具体而言,所述佐剂可以是有机非肽佐剂(例如皂苷,诸如QS21或角鲨烯)和/或细菌佐剂(例如单磷酰脂质A(MPL),诸如3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)。
一种合适的佐剂是单磷酰脂质A(MPL),尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。在化学上,它经常作为具有4、5或6个酰化链的3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A的混合物供应。它可以通过在GB 2122204B中教导的方法纯化和制备,该参考文献也公开了二磷酰基脂质A及其3-O-去酰化变体的制备。已经描述了其他纯化的和合成的脂多糖[美国专利号6,005,099和EP0729473B1;Hilgers,1986;Hilgers,1987;和EP0549074B1]。
皂苷也是合适的佐剂[Lacaille-Dubois,1996]。例如,皂苷Quil A(源自南美洲树皂皮树的树皮)及其级分描述于美国专利号5,057,540和Kensil,1996;和EP 0 362 279B1。Quil A的纯化级分也被称为免疫刺激剂,诸如QS21和QS17;它们的生产方法公开在美国专利号5,057,540和EP 0 362 279 B1。QS21的用途进一步描述于Kensil,1991。QS21和聚山梨醇酯或环糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。包含QuilA的级分(诸如QS21和QS7)的微粒佐剂系统描述于WO 96/33739和Wo 96/11711中。
佐剂诸如上述的那些可以与载体诸如脂质体、水包油乳剂和/或金属盐(包括铝盐诸如氢氧化铝)一起配制。例如,可以将3D-MPL与氢氧化铝(EP 0 689 454)或水包油乳剂(WO 95/17210)一起配制;可以将QS21与含有胆固醇的脂质体(WO 96/33739)、水包油乳剂(WO 95/17210)或明矾(WO 98/15287)一起配制。
可以在公开的组合物中利用佐剂的组合,尤其是单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合(参见,例如,WO 94/00153;WO 95/17210;WO 96/33739;WO 98/56414;WO 99/12565;WO99/11241),更特别是如WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合,或其中将QS21在含有胆固醇的脂质体(DQ)中淬灭的组合物(如在WO 96/33739中公开的)。涉及在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的有效佐剂制剂描述在WO 95/17210中,且是可用于公开的组合物中的另一种制剂。因此,合适的佐剂系统包括,例如,单磷酰脂质A(优选3D-MPL)与铝盐一起的组合(例如如在WO00/23105中所述)。另一种示例性的佐剂包含QS21和/或MPL和/或CpG。可以将QS21在含有胆固醇的脂质体中淬灭,如在WO 96/33739中公开的。
因此,用于公开的免疫原性组合物中使用的合适的佐剂是AS01,含有MPL和QS-21的基于脂质体的佐剂。作为MPL和QS-21免疫增强剂的媒介物的脂质体由磷酸盐缓冲盐水溶液中的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇构成。AS01B-4是AS01佐剂的一种特别优选的变体,其由免疫增强剂QS-21(从皂树的树皮纯化的三萜糖苷)和MPL(3-D单磷酰脂质A)与DOPC/胆固醇脂质体(作为这些免疫增强剂的媒介物)以及PBS溶液中的山梨醇构成。具体而言,单人剂量的AS01B-4(0.5mL)含有50μg QS-21和50μg MPL。AS01E-4对应于AS01B-4的两倍稀释液,即其每人剂量含有25μg QS-21和25μg MPL。
在一个实施方式中,提供了在治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法中使用的免疫原性组合,所述免疫原性组合包含含有重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。在一个实施方式中,所述免疫原性组合包含一种组合物,其包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。在一个实施方式中,免疫原性组合包含一种组合物,其包含重组HBs、截短的重组HBc和AS01佐剂。在一个特定实施方式中,免疫原性组合包含一种组合物,其包含以4∶1或更高比率的截短的重组HBc和重组HBs,以及AS01佐剂,例如AS01B-4或AS01E-4。
在一个实施方式中,提供了在治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法中使用的免疫原性组合,所述免疫原性组合包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)的组合物;
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物,
其中所述方法包括向所述人类顺序或同时施用所述组合物。
在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,在所述方法的步骤a)中施用的HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
在另一个方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸、编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸以及编码融合至HBc的人类不变链(hIi)的核酸,其中所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及如本文所提供的至少一种其他免疫原性组合物。在一个实施方式中,所述组合物包含选自以下的ChAd载体:ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9,特别是ChAd63或ChAd155。在某些实施方式中,所述ChAd载体包含编码由间隔序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物,所述间隔序列引入编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列。在一个特定的实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码hIi、HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在另一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含具有SEQ ID NO:10中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在另一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含具有SEQ ID NO:14中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个进一步的方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体,其包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,其中所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及如本文所提供的至少一种其他免疫原性组合物。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含由间隔序列所分隔的HBc和HBs,所述间隔序列引入编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列。在一个特定的实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含具有在SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个进一步的方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)以及包含MPL和QS-21的佐剂,其中所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及如本文所提供的至少一种其他免疫原性组合物。在一个实施方式中,所述组合物包含截短的重组HBc,其包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149。在一个实施方式中,所述组合物包含全长重组HBc、HBc的氨基酸1-149以及包含MPL和QS-21的佐剂。更具体地,用于治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的组合物包含全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂,以及包含二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇的脂质体。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。在一个特定实施方式中,所述组合物包含以4∶1或更高比率的截短的重组HBc和全长重组HBs以及AS01佐剂。在某些实施方式中,所述组合物包含截短的核心抗原和AS01B-4,所述截短的核心抗原由以4∶1比率的HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)和全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)组成。
在一个进一步的方面中,提供了一种用于治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的组合物,所述组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO),其中所述方法包括以治疗方案施用所述组合物以及如本文所提供的至少一种免疫原性组合物。在一个实施方式中,所述组合物包含反义寡核苷酸,其具有选自WO2012/145697的SEQ ID NO:83-310的核苷酸序列。在特定实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸(HBV ASO)具有选自WO2012/145697的SEQ ID NO:224-227的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),其由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
在另一个方面中,提供了一种免疫原性组合,其包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBC)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
免疫原性组合可用于通过顺序或同时施用所述组合物来治疗人类CHB和/或CHD的方法中。
在一个实施方式中,所述组合的部分a)包含一种组合物,其包含具有选自WO2012/145697的SEQ ID NO:83-310的核苷酸序列的反义寡核苷酸。在特定实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸(HBV ASO)具有选自WO2012/145697的SEQ ID NO:224-227的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),其由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
在一个实施方式中,所述组合的部分b)包含一种组合物,其包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸、编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸和编码融合至HBc的人类不变链(hIi)的核酸。在一个实施方式中,所述组合物包含选自以下的ChAd载体:ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan5、Pan6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9,特别是ChAd63或ChAd155。在某些实施方式中,所述ChAd载体包含编码由间隔序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物,所述间隔序列引入编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列。在一个特定的实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码hIi、HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在另一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含具有SEQ ID NO:10给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在另一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含具有SEQ ID NO:14给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个实施方式中,所述组合的部分c)包含一种组合物,其包含MVA载体,所述载体包含编码由间隔序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物,所述间隔序列引入编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列。在一个特定的实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含具有SEQ ID NO:6中给出的多核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个实施方式中,所述组合的部分d)包含一种组合物,其包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)以及包含MPL和QS-21的佐剂。在一个实施方式中,所述组合物包含截短的重组HBc,其包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149。在一个实施方式中,所述组合物包含全长重组HBs、HBc的氨基酸1-149以及包含MPL和QS-21的佐剂。更具体地,用于治疗人类慢性乙型感染感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的组合物包含全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂,以及包含二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇的脂质体。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。在一个特定实施方式中,所述组合物包含以4∶1或更高比率的截短的重组HBc和全长重组HBs以及AS01佐剂。在某些实施方式中,所述组合物包含截短的核心抗原和AS01B-4,所述截短的核心抗原由以4∶1比率的HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)和全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)组成。
在另一个方面中,提供了免疫原性组合物在制备治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的药物中的用途,所述免疫原性组合物包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸、编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸和编码融合至HBc的人类不变链(hIi)的核酸,其中治疗慢性乙型肝炎感染的方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及如本文所提供的至少一种其他免疫原性组合物。在一个实施方式中,所述组合物包含选自以下的ChAd载体:ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9,特别是ChAd63或ChAd155。在某些实施方式中,所述ChAd载体包含编码由间隔序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物,所述间隔序列引入编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列。在一个特定的实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码hIi、HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图13中所示的结构的构建体的插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在某些实施方式中,HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:7或与其至少98%同源的氨基酸序列或SEQ ID NO:12或与其至少98%同源的氨基酸序列)。例如,HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:7),或者HBc(例如,SEQ ID NO:11)融合至hIi(例如,SEQ ID NO:12)。在一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个替代实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码具有SEQ ID NO:10中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个替代实施方式中,所述组合物包含ChAd155载体,其包含编码具有SEQ ID NO:14中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个进一步的方面中,提供了免疫原性组合物在制备治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的药物中的用途,所述免疫原性组合物包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,其中治疗慢性乙型肝炎感染的方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及如本文所提供的至少一种其他免疫原性组合物。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含编码由间隔序列所分隔的HBc和HBs的载体插入物,所述间隔序列引入编码口蹄疫病毒的2A切割区域的序列。在一个特定的实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含编码HBc、2A和HBs的多核苷酸载体插入物,例如,编码具有图12中所示结构的构建体的插入物。在某些实施方式中,所述载体插入物编码由编码间隔序列的序列所分隔的HBc(例如,SEQ ID NO:11或与其至少98%同源的氨基酸序列)和HBs(例如,SEQ ID NO:1或与其至少98%同源的氨基酸序列),所述间隔序列引入口蹄疫病毒的2A切割区域(例如,SEQ ID NO:3或与其至少98%同源的氨基酸序列)。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸载体插入物。在一个实施方式中,所述组合物包含MVA载体,其包含具有SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列的多核苷酸载体插入物。
在一个进一步的方面中,提供了免疫原性组合物在制备治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的药物中的用途,所述免疫原性组合物包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎核心抗原(HBc)以及包含MPL和QS-21的佐剂,其中治疗慢性乙型肝炎感染的方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及如本文所提供的至少一种其他免疫原性组合物。在一个实施方式中,所述组合物包含截短的重组HBc,其包含HBc的组装结构域,例如HBc的氨基酸1-149。在一个实施方式中,所述组合物包含全长重组HBs(例如,SEQ ID NO:1)、HBc的氨基酸1-149(例如,SEQ ID NO:2)以及包含MPL和QS-21的佐剂(例如,AS01佐剂,例如AS01B-4或AS01E-4)。在某些实施方式中,重组蛋白HBs和HBc抗原是病毒样颗粒形式。
在一个进一步的方面中,提供了组合物在制备治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的药物中的用途,所述组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)。在一个实施方式中,所述组合物包含具有选自WO2012/145697的SEQ ID NO:83-310的核苷酸序列的反义寡核苷酸。在特定实施方式中,靶向HBV核酸的反义寡核苷酸(HBV ASO)具有选自WO2012/145697的SEQ ID NO:224-227的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),其由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由分别包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
在一个实施方式中,提供了免疫原性组合在制备治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的药物中的用途,所述免疫原性组合包含:
i.包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)的组合物;
ii.包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
iii.包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
iv.包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物,
其中治疗慢性乙型肝炎感染的所述方法包括向所述人类顺序或同时施用所述组合物。
在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
在一个特定的实施方式中,免疫原性组合在制备治疗CHB和/或CHD的药物中的用途包括:
i.包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)的组合物;
ii.包含复制缺陷型ChAd载体的组合物,所述载体包含编码HBs的多核苷酸、编码HBc的核酸和编码hIi的多核苷酸;
iii.包含MVA载体的组合物,所述载体包含编码HBs的多核苷酸和编码HBc的核酸;和
iv.包含重组HBs、截短的HBc以及包含MPL和QS-21的佐剂的组合物,
其中治疗CHB和/或CHD的所述方法包括以下步骤:
a)向所述人类施用组合物i.;
b)向所述人类施用组合物ii.;
c)向所述人类施用组合物iii.;和
d)向所述人类施用组合物iv.,
其中所述方法的步骤依次进行,其中步骤a)在步骤b)之前,步骤b)在步骤c)之前和步骤c)在步骤d)之前。在一个进一步的实施方式中,重复步骤a)。在一个进一步的实施方式中,重复步骤d)且按照a)、b)、c)、c)、d)的顺序依次进行所述方法的步骤。在另一个实施方式中,步骤d)与步骤b)和/或与步骤b)同时进行。
在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
在一个进一步的方面中,本发明提供了一种试剂盒,其包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)的组合物;
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物,
以及用于治疗CHB和/或CHD的组分顺序或同时施用的说明书。
在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有与序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)85-95%同一性,所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。在一个特定的实施方式中,所述HBV ASO具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC(WO2012/145697的SEQ ID NO:226),所述序列与在核碱基1583-1602处的HBV基因组序列SEQ ID NO:16互补。
施用
在所公开方法的一个实施方式中,公开的组合经由鼻内、肌肉内、皮下、皮内或局部途径施用。优选地,经由肌肉内途径施用。
鼻内施用是将组合物施用于包括肺的整个呼吸道的粘膜。更具体地,将组合物施用于鼻的粘膜。在一个实施方案中,通过喷雾或气溶胶的方式实现鼻内施用。肌肉内施用是指将组合物注射至个体的任何肌肉中。将示例性肌肉内注射施用至三角肌、股外侧肌或腹臀和背臀区域中。优选地,施用至三角肌中。皮下施用是指将组合物注射至下皮中。皮内施用是指将组合物注射至皮肤层之间的真皮中。局部施用是将组合物施用于皮肤或粘膜的任何部分而不用针或相当装置穿透皮肤。可以将组合物局部施用于嘴、鼻、生殖器区域和/或直肠的粘膜。局部施用包括施用方式,诸如舌下和/或经颊施用。舌下施用是在舌下施用组合物(例如,使用经口薄膜(OTF))。经颊施用是经由脸颊的颊粘膜施用载体。
本文公开的方法可用于初免-强化免疫方案中。因此,本文公开了用于治疗CHB和/或CHD的方法中使用的组合物,其是初免-强化免疫方法。在许多情况下,免疫原性组合物的单次施用不足以生成有效保护或治疗上治疗疾病所需的许多长效免疫细胞。因此,为了建立针对特定病原体或疾病的持久和保护性免疫力或治疗或功能治愈给定疾病,可能需要用对于所述病原体或疾病特异性的生物制剂的重复攻击。包括重复施用针对相同病原体或疾病的免疫原性组合物或疫苗的施用方案被称为“初免-强化方案”。在一个实施方式中,初免-强化方案涉及针对乙型肝炎的免疫原性组合物的至少两次施用。免疫原性组合物的第一次施用被称为“初免”,并且相同免疫原性组合物或针对相同病原体的免疫原性组合物的任何随后施用被称为“强化”。应当理解,还考虑2、3、4或甚至5次施用用于强化免疫应答。初免和强化之间的时间段是任选地1周、2周、4周、6周、8周或12周。更具体地,其为4周或8周。如果进行多于一次强化,则在先前的强化后1周、2周、4周、6周、8周或12周、6个月或12个月施用随后的强化。例如,任何两次强化之间的间隔可以是4周或8周。
本文公开的组合物在治疗方案中施用,所述治疗方案涉及施用另外的免疫原性组分,其各自配制在不同的组合物中。所述组合物有利地在相同部位处或相同部位附近共位置地施用。例如,可以将所述组分肌肉内施用至相同侧或肢体(“同侧”施用)或相对侧或肢体(“对侧”施用)。例如,在对侧施用中,可以将第一组合物施用于左三角肌,并且可以将第二组合物依次或同时施用于右三角肌。或者,在同侧施用中,可以将第一组合物施用于左三角肌,并且可以将第二组合物也依次或同时施用于左三角肌。
一般制备方法
·ChAd155-hIi-HBV:
作为转基因插入重组复制缺陷的猿猴(黑猩猩来源的)腺病毒组C载体ChAd155中的DNA片段源自两种HBV蛋白抗原,核心核衣壳蛋白抗原HBc和小表面抗原HBs,其被口蹄疫病毒(FMDV)的自切割2A区域隔开[Donnelly等2001]。FMDV的2A区域允许将HBc-HBs融合体加工为分开的蛋白抗原。此外,已经将编码HBc蛋白的基因的N-末端部分融合至编码人主要组织相容性复合体(MHC)II类相关的恒定链p35同种型(hIi)的基因。hIi-HBV转基因序列的示意图提供于(图13)中。
2A区域(18个氨基酸)已经在其N-末端补充有6个氨基酸的间隔区;已经报道了该性质的间隔区增加2A介导的切割的效率。区域2A-介导的蛋白酶切割发生在2A氨基酸序列中恰好最后一个脯氨酸之前的2A的C-末端。脯氨酸保留在HBs蛋白的N-末端,而hIi-HBc-2A多肽保留脯氨酸切割位点之前的23个氨基酸。
由此,在蛋白酶加工之后,转基因的表达导致产生两个分开的多肽:hIi-HBc-间隔区-2A和HBs。为简洁起见,hIi-HBc-间隔区-2A多肽被称为hIi-HBc蛋白。当在细胞培养物中表达时,在细胞培养物上清液中检测到hIi-HBc抗原,而在细胞内级分中检测到HBs蛋白。
将以允许在宿主细胞中表达的方式可操作连接至调节组分的编码抗原蛋白的表达盒组装至如前所述的ChAd155载体质粒构建体中(参见WO2016/198621,其出于公开ChAd155载体序列和方法的目的通过引用并入),以得到ChAd155-hIi-HBV。hIi-HBV转基因在人巨细胞病毒(hCMV)启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号(BGH pA)的转录控制之下。表达盒编码HBs、HBc和hIi氨基酸序列,其中hIi序列融合至HBc的HBc N-末端,并且HBs和HBc序列被并入口蹄疫病毒的2A切割区域的间隔区隔开,用于将HBc和HBs加工成分开的蛋白。
为了生成复制缺陷的重组ChAd155腺病毒,缺失的腺病毒的复制和感染性所需的基因区域的功能必须由辅助病毒或细胞系(即,互补或包装细胞系)提供给重组病毒。一种特别合适的互补细胞系是Procell 92细胞系。Procell 92细胞系是基于表达腺病毒E1基因(在人磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子的控制下用Tet阻遏物转染)和G418-抗性基因的HEK293细胞(Vitelli等,PLOS One(2013)8(e55435):1-9)。Procell 92.S适合于在悬浮条件中生长,且可用于生产表达毒性蛋白的腺病毒载体。
ChAd155-hIi-HBV原料药的生产:
ChAd155-hIi-HBV病毒颗粒(原料药)的制备涉及感染时以5e5个细胞/ml细胞密度培养Procell-92.S细胞。然后,使用200vp/细胞的感染复数用ChAd155-hIi-HBV主病毒种子(MVS)感染细胞。在通过包括阴离子交换色谱的多步骤过程细胞裂解、裂解物澄清和浓缩(过滤步骤)后,纯化ChAd155-hIi-HBV病毒收获物。
疫苗配制和灌装
纯化的ChAd155-hIi-HBV散装原料药随后如下处理:
-在配制缓冲液中稀释纯化的ChAd155-hIi-HBV原料药。
-无菌过滤。
-灌装最终容器。
ChAd155-hIi-HBV疫苗是小瓶中含有的液体制剂。配制缓冲液包括Tris(10mM)、L-组氨酸(10mM)、NaCl(75mM)、MgCl(1mM)和EDTA(0.1mM)与蔗糖(5%w/v)、聚山梨醇酯-80(0.02%w/v)和乙醇(0.5%w/v),其用HCl调节至pH 7.4(注射用水至最终体积)。
·MVA-HBV:
MVA-HBV是一种重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA),其携带两种不同的HBV蛋白:核心和S蛋白,其被2A肽隔开。MVA-HBV构建体由MVA-Red载体系统生成[Di Lullo等2010],所述MVA-Red载体系统源自由Anton Mayr教授[Mayr,A.等1978]描述的来自减毒第571代(被称为MVA-571)的MVA病毒种子批次。
MVA-HBV转基因编码HBV的核心核衣壳蛋白HBc和小表面抗原HBs。HBc-HBs序列由口蹄疫病毒的自切割2A区域隔开,所述自切割2A区域允许融合蛋白加工成如上对于腺病毒载体所述的分开的HBc和HBs抗原。转基因的示意图提供于图12中。
在蛋白酶加工后,转基因的表达导致产生两个分开的多肽:HBc-间隔区-2A和HBs。为简洁起见,HBc-间隔区-2A多肽被称为HBc蛋白。
将表达盒亚克隆至MVA穿梭载体p94-elisaRen中,生成转移载体p94-HBV。p94-HBV含有抗原表达盒,其在牛痘P7.5早期/晚期启动子控制下,且侧接侧翼III-2区域和侧翼III-1区域,以允许通过同源重组插入MVA的delIII中。
重组病毒的产生基于CEF细胞中的体内重组的两个事件。
简而言之,原代鸡胚成纤维细胞(CEF)用MVA-Red感染,且然后用携带抗原转基因(以及在合成启动子sP的控制下的EGFP标记基因)的p94-HBV转染。第一重组事件发生在MVA-Red基因组和转移载体p94-HBV两者中均存在的同源序列(侧翼III-1和-2区域)之间,并且导致Hcred蛋白基因被转基因/eGFP盒替代。含有MVA-Green中间体的感染细胞通过FACS分选进行分离,并用于感染新鲜CEF。由第一重组产生的中间重组MVA携带转基因和eGFP盒两者,但由于存在重复的Z区域而不稳定。
因此,涉及Z区域的自发的第二重组事件发生并除去eGFP盒。所得的重组MVA是无色的,并且携带转基因盒。
最后,通过FACS分选无标记的重组病毒(MVA-HBV)感染的细胞,通过终末稀释克隆MVA-HBV,并通过常规方法在CEF中扩增。
MVA-HBV原料药的生产
在鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞的原代细胞培养物中制备MVA-HBV病毒颗粒(原料药)至1E6和2E6细胞/ml之间的细胞密度,且然后用MHC-HBV主病毒种子(MVS)以0.01和0.5PFU/细胞之间的感染复数感染。MVA-HBV病毒收获物通过多步骤过程纯化,所述多步骤过程基于通过离心沉淀、重悬浮和分级梯度离心步骤。
疫苗配制和灌装
纯化的MVA-HBV散装原料药随后如下处理:
-在配制缓冲液中稀释纯化的MVA-HBV DS。
-灌装最终容器。
MVA-HBV疫苗是小瓶中含有的液体制剂。配制缓冲液包括Tris(羟甲基)氨基甲烷pH7.7(10mM)、NaCl(140mM)和注射用水至最终体积。
·HBs-HBc重组蛋白混合物:
HBc原料药的生产
HBc重组蛋白(原料药)制备过程由以下组成:使用重组大肠杆菌工作种子接种预培养烧瓶,随后为发酵过程和多步骤纯化过程,包括收获、提取、澄清以及多次色谱和过滤步骤。
HBs原料药的生产
HBs重组蛋白(原料药)制备过程由以下组成:使用重组酿酒酵母工作种子接种预培养烧瓶,随后为发酵过程和多步骤纯化过程,包括收获、提取、澄清以及多次色谱和过滤步骤。
疫苗配制和灌装
将纯化的HBs原料药和HBc原料药在包括作为冷冻保护剂的蔗糖和作为表面活性剂的泊洛沙姆的配制缓冲液中稀释,填充并冻干在4mL透明玻璃小瓶中。
虽然已经根据某些实施方式具体描述了本文所述的某些化合物、组合物、方案和方法,但以下实施例仅用于说明本文所述的化合物、组合物、方案和方法,并不旨在对其进行限制。本申请中引用的每篇参考文献均通过引用整体并入本文。
实施例
非临床实验的目的:
强烈和功能性的CD8+和CD4+T细胞应答,特别是对HBcAg的应答,已经与HBV清除和解决性感染相关[Boni,2012;Li,2011;Liang,2011;Lau,2002;Bertoletti,2012]。此外,抗S抗体防止HBV传播至未感染的肝细胞,并且可以对于控制治疗后HBV复制反弹是关键的[Rehermann2005;Neumann2010]。提出的接种疫苗方案包括用编码乙型肝炎核心(HBc)和乙型肝炎表面(HBs)抗原的两种病毒载体化疫苗(ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV)的异源的引发-加强时间表,以诱导强烈的CD8+T-细胞应答,连同依次或同时施用AS01B-4-佐剂化的HBc-HBs蛋白,以诱导CHB患者中的强烈的抗原特异性CD4+T-细胞和抗体应答。这种疫苗诱导的免疫应答最终应转化为HBsAg浓度的实质下降或HBsAg损失(即HBsAg浓度低于可检测的水平),其被视为HBV感染的完全和持久控制的标志。反义疗法可以直接靶向HBV抗原的mRNA转录物,调节HBV mRNA和蛋白的表达,从而降低血清HBeAg和HBsAg水平。非临床实验的一个目的是评估HBV ASO与疫苗方案的组合,以克服对HBs的耐受性(抗HBs Ab滴度),诱导T细胞应答并降低循环HBs抗原和HBV DNA水平。
涉及反义寡核苷酸的实施例的材料和方法
RNA分离
可以对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法是本领域中众所周知的。使用本领域众所周知的方法制备RNA,例如,根据生产厂商推荐的方案,使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)。对靶点水平或表达的抑制的分析
可以在本领域公知的多种方法中测定HBV核酸的水平或表达的抑制。例如,靶核酸水平可以通过例如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量。可以在总细胞RNA或poly(A)+mRNA上进行RNA分析。RNA分离的方法是本领域众所周知的。Northern印迹分析在本领域中也是常规的。定量实时PCR可以使用市售的ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统方便地完成,该系统可从PE-Applied Biosystems,Foster City,CA获得并根据制造商的说明使用。
靶RNA水平的定量实时PCR分析
根据制造商的说明,可以使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)通过实时定量PCR来完成靶RNA水平的定量。定量实时PCR的方法是本领域众所周知的。
在进行实时PCR之前,分离的RNA需要进行逆转录酶(RT)反应,产生互补DNA(cDNA),然后将其用作实时PCR扩增的底物。在同一样品孔中顺序进行RT和实时PCR反应。RT和实时PCR试剂可以来自Invitrogen(Carlsbad,CA)。RT实时PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)靶点量使用表达恒定的基因(如亲环蛋白A)的表达水平进行标准化,或使用RIBOGREEN(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA。亲环蛋白A的表达通过实时PCR进行定量,方法是与靶点同时运行、多路复用或单独运行。使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)对总RNA进行定量。在Jones,L.J.等(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中教导了通过RIBOGREEN进行RNA定量的方法。将CYTOFLUOR 4000仪器(PE Applied Biosystems)用于测量RIBOGREEN荧光。
将设计探针和引物设计为与HBV核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法是本领域众所周知的,并且可以包括使用软件如PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)。
靶DNA水平的定量实时PCR分析
根据制造商的说明,可以使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)通过实时定量PCR来完成靶DNA水平的定量。定量实时PCR的方法是本领域众所周知的。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)靶点量使用表达恒定的基因(如亲环蛋白A)的表达水平进行标准化,或使用RIBOGREEN(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)定量总DNA。亲环蛋白A的表达通过实时PCR进行定量,方法是与靶点同时运行、多路复用或单独运行。使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)对总DNA进行定量。在Jones,L.J.等(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中教导了通过RIBOGREEN进行DNA定量的方法。将CYTOFLUOR 4000仪器(PE Applied Biosystems)用于测量RIBOGREEN荧光。
将设计探针和引物设计为与HBV核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法是本领域众所周知的,并且可以包括使用软件如PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)。
实施例1:通过MOE间隔体对HepG2.2.15细胞中HBV病毒mRNA的反义抑制
HepG2.2.15细胞是用于体外研究乙型肝炎病毒的广泛使用的细胞模型。在这些细胞中,HBV基因组整合至细胞DNA中的若干位点中。细胞最初来源于人肝母细胞瘤细胞系HepG2,且其特征在于在培养系统中具有稳定的HBV表达和复制。
反义寡核苷酸被设计为靶向HBV病毒核酸,并在体外测试了其对HBV mRNA的影响。使用15,000nM反义寡核苷酸电穿孔,以每孔25,000个细胞的密度转染培养的HepG2.2.15细胞。在大约24小时的处理期后,从细胞中分离出RNA,并通过定量实时PCR测量HBV mRNA水平。将病毒引物探针组RTS3370(正向序列CTTGGTCATGGGCCATCAG,本文中指定为SEQ ID NO:17;反向序列CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA,本文中指定为SEQ ID NO:18;探针序列TGCGTGGAACCTTTTCGGCTCC,本文中指定为SEQ ID NO:19)用于测量mRNA水平。RTS3370检测全长mRNA以及pre-S1、pre-S2和pre-C mRNA转录物的第二部分。还使用另外的引物探针组检测间隔体。将病毒引物探针组RTS3371(正向序列CCAAACCTTCGGACGGAAA,本文中指定为SEQ ID NO:20;反向序列TGAGGCCCACTCCCATAGG,本文中指定为SEQ ID NO:21;探针序列CCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAT,本文中指定为SEQ ID NO:22)也用于测量mRNA水平。RTS3371检测全长mRNA以及pre-S1、pre-S2和pre-C mRNA转录物的第二部分,类似于RTS3370,但在不同区域。将病毒引物探针组RTS3372(正向序列ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT,本文中指定为SEQ ID NO:23;反向序列CGACGCGGCGATTGAG,本文中指定为SEQ ID NO:24;探针序列AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG,本文中指定为SEQ IDNO:25)也用于测量mRNA水平。RTS3372检测全长基因组序列将。病毒引物探针组RTS3373MGB(正向序列CCGACCTTGAGGCATACTTCA,本文中指定为SEQ ID NO:26;反向序列AATTTATGCCTACAGCCTCCTAGTACA,本文中指定为SEQ ID NO:27;探针序列TTAAAGACTGGGAGGAGTTG,本文中指定为SEQ ID NO:28)用于测量mRNA水平。RTS3373MGB检测全长mRNA以及pre-S1、pre-S2、pre-C和pre-X mRNA转录物的第二部分。
将表1中的嵌合反义寡核苷酸设计为5-10-5 MOE间隔体、3-10-3 MOE间隔体或2-10-2 MOE间隔体。5-10-5 MOE间隔体的长度为20个核苷,其中中心间隔区段包含十个2’-脱氧核苷并且两侧(在5’和3’方向)均为分别包含五个核苷的翼。3-10-3 MOE间隔体的长度为16个核苷,其中中心间隔区段包含十个2’-脱氧核苷并且两侧(在5’和3’方向)均为分别包含三个核苷的翼。2-10-2 MOE间隔体的长度为14个核苷,其中中心间隔区段包含十个2’-脱氧核苷并且两侧(在5’和3’方向)均为分别包含两个核苷的翼。在5’翼区段中的每个核苷和在3’翼区段中的每个核苷均具有MOE糖修饰。在中心间隔区段的每个核苷均具有脱氧糖修饰。每个间隔体中的核苷间连接均为硫代磷酸酯(P=S)连接。每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5’-甲基胞嘧啶。
“起始位点”表示间隔体靶向病毒基因序列中的5’-大多数核苷酸。“终止位点”表示间隔体靶向病毒基因序列中的3’-大多数核苷酸。表1中列出的每个间隔体靶向病毒基因组序列,在本文中称为SEQ ID NO:16(GENBANK登录号U95551.1)。
实施例2:靶向BALB/c小鼠中的HBV的MOE间隔体的耐受性
BALB/c小鼠(Charles RiVer,MA)是频繁用于安全性和有效性检测的小鼠的多用途模型。用选自上文实施例1的反义寡核苷酸治疗小鼠,并评价各种代谢标志物水平的变化。
每组四只BALB/c小鼠皮下注射50mg/kg的WO2012/145697的所有序列编号SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:116、SEQID NO:187、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:40和SEQ ID NO:74,一周两次,持续3周。一组四只BALB/c小鼠皮下注射50mg/kg反义寡核苷酸,一周两次,持续3周,其中所述反义寡核苷酸具有序列CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC(WO2012/145697的SEQ ID NO:320),5-10-5 MOE间隔体,其与任何人类或小鼠基因序列无已知同源性。另一组4只BALB/c小鼠用PBS皮下注射,一周两次持续3周。将该组小鼠作为对照组。在各时间点最后一次给药后三天,称取体重,将小鼠安乐死并收集器官和血浆以便进一步分析。
体重和器官重量
在给药前和每个治疗期结束时测量小鼠的体重。体重列于表2中,表示为治疗开始前体重的百分比变化。在研究结束时测量肝脏、脾脏和肾脏的重量,并以与PBS对照的各个器官重量的百分比差异呈现在表3中。结果表明,大多数ISIS寡核苷酸不会对体重或器官重量造成任何不利影响。
表2反义寡核苷酸治疗后BALB/c小鼠的体重变化(%)(WO2012/145697的所有序列编号)
表3反义寡核苷酸治疗后BALB/c小鼠的器官重量变化(%)(WO2012/145697的所有序列编号)
治疗 | 肝脏 | 肾脏 | 脾脏 |
PBS | - | - | - |
SEQ ID NO:320 | 3 | -3 | -9 |
SEQ ID NO:83 | 10 | 1 | 13 |
SEQ ID NO:224 | 19 | -3 | 4 |
SEQ ID NO:88 | -4 | -7 | 9 |
SEQ ID NO:103 | 1 | -16 | 23 |
SEQ ID NO:20 | 12 | -4 | 9 |
SEQ ID NO:116 | 7 | -2 | 14 |
SEQ ID NO:187 | 5 | -6 | 7 |
SEQ ID NO:210 | 7 | -6 | 0 |
SEQ ID NO:212 | 12 | -7 | 5 |
SEQ ID NO:226 | 8 | 0 | 3 |
SEQ ID NO:24 | 17 | 14 | 200 |
SEQ ID NO:39 | -4 | -9 | 3 |
SEQ ID NO:46 | 18 | -9 | 79 |
SEQ ID NO:50 | 6 | -6 | 2 |
SEQ ID NO:140 | 0 | -2 | 15 |
SEQ ID NO:17 | 2 | 1 | 8 |
SEQ ID NO:27 | 5 | -2 | 58 |
SEQ ID NO:40 | 12 | -8 | 7 |
SEQ ID NO:74 | 20 | -8 | 49 |
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响,使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆浓度。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆浓度,并且结果在表4中以IU/L表示。还使用相同的临床化学分析仪测量了胆固醇和甘油三酯的血浆水平,结果也列于表4。
表4 BALB/c小鼠的肝脏中反义寡核苷酸治疗对代谢标志物的影响(WO2012/145697的所有序列编号)
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响,使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血尿素氮(BUN)的血浆浓度。结果在表5中显示,以mg/dL表示。
表5反义寡核苷酸治疗对BALB/c小鼠肾脏标志物的影响(WO2012/145697的所有序列编号)
实施例3:靶向转基因小鼠中的HBV的MOE间隔体的有效性
使用携带HBV基因片段的小鼠(Guidotti,L.G等J.Virol.1995,69,6158-6169)。用选自上述研究的反义寡核苷酸治疗小鼠并评估其在该模型中的有消息。
每组6只小鼠皮下注射50mg/kg的SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:145(WO2012/145697的所有序列编号),一周两次,持续4周。用PBS皮下注射10只小鼠的对照组,一周两次,持续4周。在最后一次给药之后48小时将小鼠安乐死,并收集肝脏用于进一步分析。
DNA和RNA分析
使用引物探针组RTS3370,从肝脏组织提取RNA以进行HBV DNA的实时PCR分析。将DNA水平归一化至picogreen。在RT-PCR分析之后,还用引物探针组RTS3370测定HBV RNA样品。将mRNA水平归一化至数据在表6中显示,以与对照组相比的抑制百分比表示。如在表6中所示,大部分反义寡核苷酸相对于PBS对照实现了HBV DNA和RNA降低。结果表示为相对于对照的HBV mRNA或DNA抑制百分比。
表6在转基因小鼠的肝脏中HBV RNA和DNA的抑制百分比(WO2012/145697的所有序列编号)
选择用于包括疫苗治疗的实施例的动物模型的基本原理:
使用HLA.A2/DR1小鼠(对人HLA-A2和HLA-DR1分子转基因的)来评价候选疫苗诱导HBc-特异性CD8+T-细胞应答的能力。在相同HLA.A2/DR1小鼠中评价了HBV特异性CD4+T-细胞和抗体。
可用于评价治疗性疫苗的有消息的动物模型受限制,因为HBV仅自然感染黑猩猩和人。已经开发了小鼠模型,其中通过将病毒基因组整合于宿主基因组中(HBV转基因小鼠)或者通过用复制性HBV DNA或表达HBV基因组的载体感染来表达整个HBV基因组。尽管这些不重现慢性HBV发病机理,但可以在肝脏中检测到病毒复制中间体和蛋白,并且观察到免疫耐受性。
AAV2/8-HBV-转导的HLA.A2/DR1小鼠模型重现慢性HBV感染的病毒学和免疫学特征,并且进行选择[Dion,2013;Martin,2015]。
涉及疫苗治疗的实施例的材料和方法:
在非临床免疫原性研究中使用的AS01佐剂系统的剂量
AS01B-4佐剂系统由免疫增强剂QS-21(从皂树的树皮纯化的三萜糖苷)和MPL(3-D单磷酰脂质A)与作为这些免疫增强剂的媒介物的脂质体以及山梨醇构成。具体而言,单人剂量的AS01B-4(0.5mL)含有50μg QS-21和50μg MPL。人剂量的1/10(即50μl)是在小鼠中注射的体积(对应于5μg QS-21和MPL)。
细胞免疫应答-细胞内细胞因子染色(ICS)
在不同时间点收集的脾细胞或肝脏浸润性淋巴细胞的新鲜合并物用11aa重叠、覆盖HBc或HBs序列的15-聚体的合并物离体刺激6小时。通过ICS测量表达IFN-γ和/或IL-2和/或肿瘤坏死因子(TNF)-α的CD4+或CD8+T-细胞的量来评估HBc和HBs-特异性细胞应答。考虑ICS结果的技术接受标准包括获取的CD8+T或CD4+T细胞的最小数量>3000个事件。
体液免疫应答-酶联免疫吸附测定(ELISA)
通过ELISA对在不同时间点来自免疫小鼠的血清测量HBc-和HBs-特异性抗体应答。简而言之,96-孔板用HBc或HBs抗原包被。各个血清样品然后以连续稀释度添加,并孵育2小时。然后添加生物素化的抗小鼠F(ab)’2片段,并通过与链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物酶复合物和过氧化物酶底物邻苯二胺二盐酸盐/H2O2孵育来揭示抗原-抗体复合物。对于每个时间点和每种抗原(HBc、HBs),在log10滴度(包括组、研究和相互作用作为固定效应)上且使用异质方差模型(假设各组之间没有相同的方差)拟合方差分析(ANOVA)模型。该模型用于估算几何平均值(及其95%CI)以及几何平均比率及其95%CI。由于未设置任何预先定义的标准,该分析是描述性的,并且在不调整多重性的情况下计算各组之间的比率的95%CI。
ALT/AST测量
使用以下商业试剂盒定量小鼠血清中的ALT和AST的水平:
·丙氨酸转氨酶活性测定试剂盒Sigma Aldrich目录号MAK052
·天冬氨酸转氨酶活性测定试剂盒Sigma Aldrich目录号MAK055。
血清HBs抗原定量
使用来自BIO-RAD(目录号72566)的Monolisa Anti-HBs PLUS和国际标准(AbbottDiagnostics)定量小鼠血清中的循环的HBs抗原。
组织病理性分析
收集肝脏(每个肝脏一个叶)并保存在10%甲醛固定剂中。用于显微镜检查的所有样品都基于RITA指南限uehl-Fehlert,2003;Kittel 2004;Morawietz2004]进行修整,包埋在石蜡中,以近似4微米的厚度切片,并用H&E染色。根据METAVIR评分系统进行组织学活性(坏死性炎性病变)和纤维化的分级[Bedossa,1996;Mohamadnejad,2010;Rammeh,2014]。根据Desmet评分进行炎性细胞灶的分级,如Buchmann等人[Buchmann,2013]所述。
在涉及每个单独研究的部分中详述每个研究中进行的统计分析。
实施例4-在HLA.A2/DR1转基因小鼠中
ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV/HBs-HBc/AS01B-4疫苗方案的免疫原性评价
目的
本研究的目的是评价不同疫苗方案的免疫原性,所述疫苗方案由使用ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV病毒载体的初免/强化,后接或共同施用两剂的重组蛋白乙型肝炎核心抗原(HBcAg 4μg)以及乙型肝炎表面抗原(HBsAg 1μg)以及佐剂AS01B-4(书写为:HBc-HBs 4-1/AS01B-4)组成。
研究设计
第一组小鼠(N=16)在第0天用ChAd155-hIi-HBV免疫,随后在第28天用MVA-HBV免疫。在该初免/强化病毒载体方案之后相隔14天注射两剂HBc-HBs 4-1μg/AS01B-4(表4)。第二组小鼠(N=16)在第0天用ChAd155-hIi-HBV和HBc-HBs 4-1/AS01B-4免疫,随后在第28天后用MVA-HBV共同施用HBc-HBs 4-1/AS01B强化免疫。MVA-HBV和HBc-HBs4-1/AS01B的两个连续共免疫相隔14天进行(表4)。第三组小鼠(N=8)使用NaCl注射作为阴性对照。第二次免疫接种后(7dpII)和第四次免疫接种后(7dpIV)7天处死小鼠,以确定HBc和HBs特异性体液(血清)和细胞免疫应答(在脾细胞和肝脏浸润淋巴细胞上)。
这项研究是描述性的,并且未进行统计样本量的论证和分析。
表7:治疗组
结果
HBc和HBs特异性CD8+T细胞应答(脾细胞)
当与在7dpII时仅注射ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV(第1组)比较时,将HBc-HBs 4-1/AS01B-4与作为初免的ChAd155-hIi-HBV载体和作为强化的MVA-HBV载体共同施用(第2组)诱导HBc特异性CD8+T细胞应答的4倍增加(图1)。在这两组中诱导针对HBs的类似CD8+T细胞应答(图1)。
在7dpIV时,在连续施用HBc-HBs/AS01B-4之后,HBc而非HBs特异性CD8+T细胞应答明显地强化(与7dpII相比,增加5倍)(第1组)。当共同施用另外两剂MVA-HBV/HBc-HBs 4-1/AS01B-4时,未观察到HBc或HBs特异性CD8+T细胞的进一步增加(第2组)。
HBc和HBs特异性CD4+T细胞应答(脾细胞)
在初免-强化ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV免疫接种(中值分别为0.17%和0.11%)之后检测到较低水平的HBc和HBs特异性CD4+T细胞(第1组),而在7dpII时将HBc-HBs 4-1/AS01B-4与初免-强化ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV共同施用时(第2组)观察到针对两种抗原的有效应答(图2)。
在ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV初免-强化(第1组)之后,HBc-HBs4-1/AS01B-4的连续施用实质上增强在7dpIV时的HBc和HBs特异性CD4+T细胞应答(中值分别为1.64%和2.32%)。最后,当在相同时间点将两个另外剂量的HBc-HBs/AS01B-4共同施用至已用HBc-HBs/AS01B-4共同施用初免强化ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV免疫接种的小鼠中时(第2组),观察到HBs特异性CD4+T细胞的稳定增加。在彼此相同组中,HBc特异性CD4+T细胞保持在与7dpost II时相同的水平下。
在肝脏漫润淋巴细胞中CEL的HBc和HBs特异性T细胞应答
在最后一次免疫接种后7天,通过ICS考察肝脏中疫苗接种诱导的T细胞应答的存在情况。为了具有足够数量的肝脏浸润淋巴细胞以进行体外再刺激和ICS,每个数据点由3或4个肝脏灌注后回收的细胞混合物构成。由于数据点数量较少,未进行统计学分析,并且结果是描述性的。
两种疫苗方案都引发了在接种疫苗的小鼠肝脏中可检测到的HBc和HBs特异性CD4+T细胞(图3)。在接种两种疫苗方案的动物的肝脏中测量到了强烈的HBc特异性CD8+T细胞应答,而测量到的HBs特异性CD8+T细胞的频率要低得多。
HBc和HBs特异性抗体应答
在7dpII时,共同施用ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV和HBc-HBs4-1/AS01B-4(第2组)诱导最大量的抗HBc抗体(图4)。随后注射MVA-HBV+HBc-HBs/AS01B-4不会进一步增加抗HBc抗体应答(7dpIV)的水平。在用ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV初步免疫的小鼠中注射HBc-HBs/AS01B-4后,在7dpIV时观察到抗HBc特异性抗体应答明显增加(第1组)。
HBc-HBs/AS01B-4组分的存在似乎在引发有效抗HBs抗体的时间表中很重要,因为在用ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV免疫后在动物中未检测到抗HBs抗体应答(图4)。在最后一次免疫后,在共同施用组(第2组)中观察到最高程度的应答。
结论
在HLA.A2/DR1转基因小鼠中,ChAd155-hii-HBV/MVA-HBV引发较低但可检测的HBc特异性CD4+T细胞应答,HBc-HBs 4-1/AS01B-4明显增强了这些应答。用ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV进行的初始初免-强化免疫可诱导强效的HBc和HBs特异性CD8+T细胞应答,HBc-HBs/AS01B-4强化免疫后,HBc特异性应答进一步增加。
有趣的是,当ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV与HBc-HBs 4-1/AS01B-4共同施用时,仅在两次免疫后,就诱导了高水平的HBc和HBs特异性CD4+和CD8+T细胞以及抗体。使用MVA-HBV+HBc-HBs/AS01B-4的进一步免疫未进一步增加这些应答的水平。
此外,还在使用两种疫苗方案接种的动物的肝脏中也检测到疫苗诱导的HBc和HBs特异性CD4+和CD8+T细胞。
实施例5-在AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠中评价
ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV/HBc-HBs/AS01B-4疫苗方案的免疫原性和安全性
目的
AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠模型再现了慢性HBV感染的病毒学和免疫学特征。在该模型中,用携带有复制能力的HBV DNA基因组的腺相关病毒血清型2/8(AAV2/8)载体转导小鼠肝脏。
单次尾静脉注射5x1010vg(病毒基因组)AAV2/8-HBV载体导致AAV2/8-HBV转导小鼠肝脏中的HBV复制和基因表达[Dion;2013]。HBV DNA复制中间体、HBV RNA转录物和HBc抗原在注射后长达1年的肝脏中检测到,而没有相关的显著肝脏炎症。HBs和HBe抗原和HBV DNA可以在血清中检测到长达1年。此外,在这种慢性HBV感染的替代模型中观察到对HBV抗原的免疫耐受性的建立。
在AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠中进行的这项研究的目的是
·证明该疫苗方案能够克服对HBs和HBc抗原的耐受性
·评价肝脏浸润HBc特异性CD8+T细胞(潜在地靶向表达HBcAg的肝细胞)对肝脏的组织学(H&E染色)以及AST和ALT含量的影响,作为肝功能的替代参数。
研究设计
测试了基于用ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV(这两者均编码HBV核心[HBc]和表面[HBs]抗原)顺序免疫接种单独或与HBc-HBs 4-1/AS01B-4组合,随后是两个另外剂量的HBc-HBs 4-1/AS01B-4(单独或与MVA-HBV组合)的两种不同疫苗方案(表6)
第1组、第2组和第3组的HLA.A2/DR1小鼠在第0天经5x1010vg的AAV2/8-HBV载体转导(静脉内施用),而第4组充当免疫原性的阳性对照(疫苗接种之前不建立耐受性)。
第1组(N=21)的动物在第31天用ChAd155-hIi-HBV免疫,随后在第58天用MVA-HBV免疫。在该初免/强化病毒载体方案后第72天和第86天注射两剂的HBc-HBs 4-1μg/AS01B-4(表6)。
第2组(N=21)的动物在第31天用ChAd155-hIi-HBV免疫接种并与HBc-HBs 4-1/AS01B-4共同施用,随后在第58天用MVA-HBV强化,与HBc-HBs 4-1/AS01B共同施用。MVA-HBV和HBc-HBs 4-1/AS01B的两个连续共免疫在第72天和第86天进行(表6)。
第3组(N=21)的动物使用NaCl在第31天、第58天、第72天和第86天注射,作为阴性对照。
第4组(N=8)的动物接受与第2组相同的疫苗方案(除了其未使用AAV2/8-HBV转导以外)。
所有疫苗均肌内施用。
在第23天、第65天和第93天的血清中测量HBs循环抗原的水平(第1组、第2组和第3组)。
在第23天(AAV2/8-HBV转导后)、第65天(第二次免疫接种后7天)和第93天(第四次免疫接种后7天)通过ELISA在来自所有动物的血清中测量HBs和HBc特异性抗体应答。在离体再刺激和ICS之后,在第65天(9只动物/组)和第93天(12只动物/组)在脾细胞和肝脏浸润淋巴细胞中评价HBs和HBc特异性CD4+和CD8+T细胞应答(第1组、第2组和第3组)。对于来自第4组(8只动物)的动物,这些免疫原性读取仅在第93天进行。
对于肝脏相关安全性参数,在第38天、第65天和第93天在血清中测量AST和ALT的水平,并在第65天和第93天进行用H&E染色的肝脏切片的显微镜检查,以检测潜在的疫苗相关组织病理学变化或炎症(第1组、第2组和第3组)。
表8:治疗组
*在第65天之前在第3组和在第93天之前在第2组发现1只小鼠死亡。
统计学分析
AST和ALT的水平
使用非结构化协方差结构,在log10-转化的酶促活性值上拟合重复量度(包括性别、天、组和三个两两交互作用)的ANOVA模型。验证模型假设。从模型中除去在5%水平上不显著的相互作用。对于两种酶,最终模型包括性别、天、组以及组和天之间的相互作用。从该模型推导在每个时间点每组的酶促活性的几何平均值。通过还从该模型推导的几何平均值比率(GMR)报告目标组比较。所有这些统计值都呈现有双侧95%置信区间。当计算这些GMR时未考虑多重性。
使用SAS 9.2进行所有分析。
体液应答
进行描述性统计以计算应答者的数目。抗HBc或抗HBs抗体应答的应答性的截止值基于第3组(AAV2/8-HBV转导但未接种疫苗)中计算的几何平均滴度定义。
细胞应答
进行描述性分析以定义HBc-、HBs-特异性CD4+或CD8+T细胞的应答者的数目。应答性的截止值被定义为第3组(AAV2/8-HBV转导但未接种疫苗)中进行的测量值的第95个百分位数。
结果
HBc特异性CD8+和CD4+T细胞
在AAV2/8-HBV-转导的HLA-A2/DR1小鼠中,在所有测试的时间点,在没有免疫的情况下,HBc-特异性CD8+或CD4+T细胞的背景水平非常低至检测不到(第3组)。
用单独(第1组)或与HBc-HBs 4-1/AS01B-4组合(第2组)的ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV载体的免疫诱导HBc-特异性CD8+T细胞(在II后7天,分别有6/7和9/9个应答者),表明绕过对HBc抗原的耐受性(图5A)。单独或与MVA-HBV组合的两个额外剂量的HBc-HBs 4-1/AS01B-4仅适度增加这些HBc-特异性CD8+T细胞应答,如在第四次给药后7天所测量,在第1组中达到1%的中值频率,且在第2组中达到1.45%的中值频率。由与第2组中相同的疫苗方法诱导的HBc-特异性CD8+T细胞的频率在来自第4组的非转导的HLA.A2/DR1小鼠中更高(8/8个应答者,其中在IV后7天频率高~4倍),如由于对HBc抗原的免疫耐受性所预期。在接种疫苗的小鼠的肝脏中也检测到HBc-特异性CD8+T细胞,其中概况与脾脏中相同(图5B)。
两种疫苗方案在AAV2/8-HBV-转导的HLA-A2/DR1小鼠(第1组和第2组)中引发的HBc特异性CD4+T细胞非常低至检测不到,而在未转导的小鼠(第4组)中测量到稳健的应答,表明疫苗方案在这些实验条件下没有克服对HBc抗原的CD4+T细胞耐受性(图6A,B)。
HBs特异性CD8+和CD4+T细胞
在AAV2/8-HBV转导的小鼠中,用单独(第1组)或与HBc-HBs4-1/AS01B-4组合(第2组)的ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV载体的免疫引发HBs-特异性CD8+T细胞,其中在单独或与MVA-HBV组合的两个额外剂量的HBc-HBs 4-1/AS01B-4后的强度没有进一步增加(图7A)。在接种疫苗时间表结束时(第四次给药后7天),在来自第1组和第2组的动物中测量的HBs-特异性CD8+T细胞的频率接近于在第4组中检测到的频率(未转导的HLA.A2/DR1小鼠,IV后7天的中值=0.62%,5/8个应答者),表明对HBs抗原的T细胞耐受性得到克服。在大多数接种疫苗的动物中,在来自第1、2和4组的动物的肝脏中检测到HBs-特异性CD8+T细胞(图7B)。
在施用单独或与载体组合的HBc-HBs 4-1/AS01B-4后,在第2组中从第二次接种疫苗后7天起以及在第1组中从第四次接种疫苗后7天起,诱导HBs-特异性CD4+T细胞(图8A)。与来自第1组的动物中使用的疫苗时间表(IV后7天的中值=1.34%,11/12个应答者)相比,来自第2组的动物中使用的疫苗时间表引发HBs-特异性CD4+T细胞的频率高约3倍(IV后7天的中值=3.7%,11/11个应答者),达到与第4组中相似的水平(未转导的HLA.A2/DR1小鼠,IV后7天的中值=3%,8/8个应答者),表明对HBs抗原的T细胞耐受性得到完全克服。与全身CD4+T细胞应答相似,在所有接种疫苗的动物中,在来自第1、2和4组的动物的肝脏中检测到HBs-特异性CD4+T细胞(图8B)。
HBs-和HBc特异性抗体应答
在注射AAV2/8-HBV载体后23天,在HLA.A2/DR1小鼠中未检测到抗HBs抗体应答,表明对HBs抗原的强烈的体液耐受性。用单独的ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV载体免疫(第1组)没有破坏这种耐受性,而与HBc-HBs 4-1/AS01B-4组合的载体的免疫导致在第65天21只动物中的15只中的抗HBs抗体应答的诱导(第2组)(图9A)。在第1组中进一步施用2个剂量的HBc-HBs 4-1/AS01B-4引发可检测到的抗HBs抗体(在第93天116.8的几何平均滴度(GMT)和8/12个应答者),并且第2组中的2个额外剂量的与HBc-HBs 4-1/AS01B-4组合的MVA-HBV将抗HBs抗体应答的强度进一步增加直至775的GMT(11/11个应答者),而在第93天保持比来自第4组的非-AAV2/8-HBV转导的动物(GMT=3933;8/8个应答者)中低~5倍。
类似地,只有当在疫苗方案中存在HBc-HBs 4-1/AS01B-4组分时,才诱导抗HBc抗体应答,其中与第1组(GMT=442.8;12/12个应答者)相比,在第93天来自第2组的动物中测量的水平高3倍(GMT=1335,5;11/11个应答者)(图9B)。用与第2组中相同的疫苗方案,在非转导小鼠(第4组)中诱导的抗HBc抗体滴度更高(~27倍,GMT=357822;8/8个应答者)。
这些结果显示,疫苗方案中的佐剂化蛋白组分的存在对于打破对HBc和HBs抗原两者的体液耐受性至关重要。此外,在第2组中使用的疫苗方案(含有HBc-HBs 4-1/AS01B-4的4次施用)引发最高的抗HBc和抗HBs抗体应答,但仍然低于非-AAV2/8-HBV转导的小鼠(第4组)中。
AST/ALT水平
作为肝脏相关的炎症参数,在第38天(第一次接种疫苗后7天)、第65天(第二次接种疫苗后7天)和/或第93天(第四次接种疫苗后7天)(所有组)测量AST和ALT的血清活性。总体而言,AST和ALT水平在AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠中的疫苗方案(第1组和第2组)的过程期间是稳定的,并且类似于未接受疫苗的小鼠(第3组)中测量的水平(图10)。在第65天,与对照组3相比,发现AST水平在来自疫苗组(第1组和第2组)的动物中统计学显著更高。然而,在第65天,与动力学的剩余部分相比,在来自第3组的动物中,AST水平令人惊讶地低,表明这些差异相当地是由于在该时间点在对照组3中获得的尤其出乎意料地低的值,而不是疫苗组(第1组和第2组)中的AST水平的升高(图10A)。
在第38天,与来自第3组的对照动物相比,来自第1组的动物中测量到略微低的ALT水平,但这种差异不被认为是临床相关的(图10B)。
肝脏显微镜检查
肝脏显微镜检查在第65天和第93天进行用H&E染色的肝脏切片的显微镜检查,以检测潜在的疫苗相关的组织病理学改变或炎症(第1组、第2组和第3组)(表7)。
在第65天(在注射第二种病毒载体化疫苗、有或没有HBc-HBs4-1/AS01B-4的MVA-HBV后7天)或第93天(在最后一次注射后7天)在AAV2/8-HBV转导的HLA-A2/DR小鼠中没有测试项目相关的显微镜发现,即没有可以与疫苗组分ChAd155-hIi-HBV、MVA-HBV和HBc-HBs4-1/AS01B-4的使用相关的组织病理学变化。
另外,除了对照动物3.13(其呈现局灶性1级零碎坏死),动物无一呈现慢性肝炎的形态学体征。
在治疗的动物中注意到的其他显微镜发现被认为是偶然的变化,因为它们也发生在对照组中,发病率/幅度低,和/或在类似周龄的小鼠中是常见的背景发现[McInnes,2012]。
来自AAV2/8-HBV注射的小鼠的血清中的HBs抗原水平
如Dion等[Dion,2013]中已经报道,用AAV2/8-HBV载体注射后23天,与雌性相比,雄性中的HBs抗原水平更高。这些水平在所有组中都保持稳定,没有接种疫苗方案的可检测到的影响(图11)。然而,AAV2/8-HBV注射的小鼠不是用于研究疫苗对HBsAg的效力的动物模型。
结论
在其中建立对HBc和HBs抗原的免疫耐受性的慢性HBV感染的替代模型(即AAV2/8-HBV转导的HLA-A2/DR1小鼠)中,两种测试的疫苗方案均通过诱导HBc-和HBs-特异性IgG和CD8+T细胞应答以及HBs-特异性CD4+T细胞应答而绕过耐受性,尽管水平比未转导的小鼠中更低,如由于强烈的免疫耐受性所预期。当将ChAd155-hIi-HBV/MVA-HBV载体与HBc-HBs4-1/AS01B-4共同施用时,疫苗诱导的抗体和T细胞应答的强度高于其中依次施用载体和佐剂化蛋白的疫苗方案。此外,在通过测量AST和ALT的血清活性和通过进行肝脏组织病理学评估来评价疫苗相关的肝脏炎症的同时,当与未接种疫苗的组相比,在疫苗组中未检测到肝脏酶的增加,并且没有显微镜发现可以与疫苗治疗相关。总而言之,这些结果显示,在这些实验条件下,测试的疫苗候选物成功地恢复HBs-和HBc-特异性抗体和CD8+T细胞应答以及HBs-特异性CD4+T细胞应答,而未检测到肝脏改变的相关体征。
实施例6-在AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠中HBV
ASO/ChAd155-hIi-HBV/
MVA-HBV/HBc-HBs/AS01B方案的有效性、免疫原性和安全性评价
目的
本研究利用如实施例5中所述的慢性HBV感染的AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠模型。
本研究的目的是
·证明与单独的疫苗方案相比,HBV ASO与疫苗方案的组合可以进一步克服对HBs的耐受性(抗HBs Ab滴度)
·证明与单独的疫苗方案相比,HBV ASO与疫苗方案的组合可以降低循环HBs抗原水平
·评估HBc特异性CD8+T细胞对HBV ASO与疫苗方案的组合的应答
·评估HBV ASO与疫苗方案的组合对血清HBV DNA病毒载量的影响
·评价AST和ALT水平,作为肝功能的替代参数。
研究设计
在使用或不使用HBV ASO治疗的情况下检测两种不同疫苗方案,其是基于用ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV(两者均编码HBV核心[HBc]和表面[HBs]抗原)顺序免疫接种单独或与HBc-HBs 4-1/AS01B组合,随后是两种另外剂量的HBc-HBs 4-1/AS01B(单独或与MVA-HBV组合)(表10)。
第1组至第6组中的HLA.A2/DR1小鼠在第0天使用5x1010vg AAV2/8-HBV载体转导(静脉内施用,尾静脉),而第7组作为疫苗方案的安全性和免疫原性的阳性对照(无HBV ASO治疗,并且在治疗之前未建立耐受性)。
第1组至第6组的动物在第30天、第33天和第37天使用HBV ASO(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)或NaCl预治疗,随后每周继续进行该治疗,同时施用特定疫苗方案(或NaCl)至第100天。
来自分别使用HBV ASO或NaCl治疗的第1组和第2组的动物在第44天使用ChAd155-hIi-HBV免疫接种,随后在第92天使用MVA-HBV免疫接种。在该初免/强化病毒载体方案之后的第86天和第100天施用两剂HBc-HBs4-1μg/AS01B(表10)。
来自分别使用HBV ASO或NaCl治疗的第3组和第4组的动物在第44天用ChAd155-hIi-HBV与HBc-HBs 4-1/AS01B共同施用来免疫接种,随后在第72天用MVA-HBV与HBc-HBs4-1/AS01B共同施用来强化。MVA-HBV和HBc-HBs 4-1/AS01B的两个连续共免疫在第86天和第100天进行(表10)。
来自分别使用NaCl或HBV ASO治疗的第5组和第6组的动物在第44天、第72天、第86天和第100天注射NaCl作为疫苗方案的阴性对照。
方案的所有组分均肌内施用。
在第0天(在诱导CHB模型前)、第21天(为证实CHB模型的诱导)、第44、58、72、79、86、100、107、114、128和142天测量血清HBsAg和血清HBV DNA的水平。
通过ELISA在来自所有动物的血清中在第0、21、44、58、72、79、86、100、107、114、128和142天测量HBs和HBc特异性抗体应答。
在第79天(第1-4组和第7组)、第107天和第142天(所有组),将小鼠分组用于处死和评估HBs-和HBc-特异性CD4+和CD8+T细胞应答(ICS-脾脏和灌注肝脏)。
对于肝脏相关安全性参数,在第0、44、58、86、100、114、128和142天在血清中测量AST和ALT酶的水平。
实施例7-在AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠中HBV-ASO/ChAd155-hIi-HBV/
MVA-HBV/HBc-HBs/AS01B方案的有消息、免疫原性和安全性
目的
本研究利用如实施例5中所述的慢性HBV感染的AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1小鼠模型。
本研究的目的与实施例6的那些相同:
·证明与单独的疫苗方案相比,HBV ASO与疫苗方案的组合可以进一步克服对HBs的耐受性(抗HBs Ab滴度)
·证明与单独的疫苗方案相比,HBV ASO与疫苗方案的组合可以降低循环HBs抗原水平
·评估HBc特异性CD8+T细胞对HBV ASO与疫苗方案的组合的应答
·评估HBV ASO与疫苗方案的组合对血清HBV DNA病毒载量的影响
·评价AST和ALT水平,作为肝功能的替代参数,并且还进行主要器官(肝脏、肺、心脏、脑、肾脏、胸腺)的组织病理学检查,用于评价潜在全身性毒性。
研究设计
在使用或不使用HBV ASO治疗的情况下检测两种不同疫苗方案,其是基于用ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV(两者均编码HBV核心[HBc]和表面[HBs]抗原)顺序免疫接种单独或与HBc-HBs 4-1/AS01B组合,随后是两种另外剂量的HBc-HBs 4-1/AS01B(单独或与MVA-HBV组合)(表11)。另外,使用HBV ASO治疗在第44天施用第一疫苗之前停止,或继续直至第100天。
第1组至第6组以及第8组至第10组中的HLA.A2/DR1小鼠在第0天用1010vg AAV2/8-HBV载体转导(静脉内施用,尾静脉),而第7组作为疫苗方案的安全性和免疫原性的阳性对照(无HBV ASO治疗,且在治疗之前未建立耐受性)。
第1组、第6组和第8组的动物在第31天、第35天和第38天用HBV ASO(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)预治疗。随后该治疗持续每周一次,同时施用特定疫苗方案(或NaCl)至第100天。
第3组、第4组和第10组动物也在第31天、第35天和第38天用HBV ASO(WO2012/145697的SEQ ID NO:226)预治疗。然而,在第42天进行另外的HBV ASO施用,且随后停止用HBV ASO治疗。
第2组、第5组和第9组的动物在第31天、第35天和第38天用HBV ASO或NaCl预治疗,随后该治疗持续每周一次,同时施用特定疫苗方案(或NaCl)至第100天。
来自使用HBV ASO或NaCl治疗的第1组、第2组和第3组的动物在第44天使用ChAd155-hIi-HBV免疫接种,随后在第72天使用MVA-HBV免疫接种。在该初免/强化病毒载体方案之后的第86天和第100天施用两剂HBc-HBs 4-1μg/AS01B(表11)。
来自使用HBV ASO或NaCl治疗的第8组、第9组和第10组的动物在第44天用ChAd155-hIi-HBV与HBc-HBs 4-1/AS01B共同施用来免疫接种,随后在第72天用MVA-HBV与HBc-HBs 4-1/AS01B共同施用来强化。MVA-HBV和HBc-HBs 4-1/AS01B的两个连续共免疫在第86天和第100天进行(表11)。
来自用NaCl或HBV ASO治疗的第4组、第5组和第6组的动物在第44天、第72天、第86天和第100天注射NaCl作为疫苗方案的阴性对照。
方案的所有组分均肌内施用。
在第0天(在诱导CHB模型前)、第21天(为证实CHB模型的诱导)、第42、56、70、80、84、98、107、113、127和141天测量血清HBsAg和血清HBV DNA的水平。
通过ELISA在来自所有动物的血清中在第0、21、42、56、70、80、84、98、107、113、127和141天测量HBs和HBc特异性抗体应答。
在第80天(第1、2、3组和第7组)、第107天和第141天(所有组),将小鼠分组用于处死和评估HBs-和HBc-特异性CD4+和CD8+T细胞应答(ICS-脾脏和灌注肝脏)。
对于肝脏相关安全性参数,在第0、42、80、107和141天在血清中测量AST和ALT酶的水平。
序列表
SEQ ID NO:1:HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:2:HBc截短物的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:引入口蹄疫病毒的2A切割区域的间隔序列的氨基酸序列
SEQ ID NO:4:编码引入口蹄疫病毒的2A切割区域的间隔序列的核苷酸序列
SEQ ID NO:5:HBc-2A-HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:6:编码HBc-2A-HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:7:hIi的氨基酸序列
SEQ ID NO:8:编码hIi的核苷酸序列
SEQ ID NO:9:hIi-HBc-2A-HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:10:编码hIi-HBc-2A-HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:11:HBc的氨基酸序列
SEQ ID NO:12:hIi替代变体的氨基酸序列
SEQ ID NO:13:编码hI替代变体的核苷酸序列
SEQ ID NO:14:hIi-HBc-2A-HBs的替代核酸序列
SEQ ID NO:15:hIi-HBc-2A-HBs的替代氨基酸序列
SEQ ID NO:16:乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列(GENBANK登录号U95551.1)
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Zoutendijk R,Hansen BE,van Vuuren AJ,Boucher CA,Janssen HL.SerumHBsAg decline during long-term potent nucleos(t)ide analogue therapy forchronic hepatitis B and prediction of HBsAg loss.J Infect Dis.2011;204(3):415-8.
序列表
<110> 葛兰素史密丝克莱恩公司
<120> 乙型肝炎免疫方案和组合物
<130> PR66724 WO
<150> US 62/814261
<151> 2019-03-05
<160> 28
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 1
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
115 120 125
Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205
Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 2
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBc截短的氨基酸序列
<400> 2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val
145
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 引入口蹄疫病毒2A切割区的间隔序列的氨基酸序列
<400> 3
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码引入口蹄疫病毒2A切割区的间隔序列的核苷酸序列
<400> 4
gcccctgtga agcagaccct gaacttcgac ctgctgaagc tggccggcga cgtggagagc 60
aatcccggcc ct 72
<210> 5
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBc-2A-HBs的氨基酸序列
<400> 5
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145 150 155 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
165 170 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu
180 185 190
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
195 200 205
Pro Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu
210 215 220
Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser
225 230 235 240
Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val
245 250 255
Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr
260 265 270
Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg
275 280 285
Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu
290 295 300
Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro
305 310 315 320
Gly Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro
325 330 335
Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr
340 345 350
Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala
355 360 365
Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu
370 375 380
Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp
385 390 395 400
Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser
405 410 415
Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp
420 425 430
Val Tyr Ile
435
<210> 6
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HBc-2A-HBs的核苷酸序列
<400> 6
atggacatcg atccctacaa ggaatttggc gccaccgtgg agctgctgag cttcctgccc 60
agcgacttct tccccagcgt gagggacctc ctggacaccg ccagcgccct gtacagggag 120
gccctggaat ctcccgagca ctgcagccca caccacaccg cactgaggca ggccatcctg 180
tgctggggag agctgatgac cctcgccacc tgggtgggca acaacctgga ggaccccgcc 240
agcagggacc tggtggtgaa ctacgtcaac accaacatgg gcctgaagat caggcagctg 300
ctgtggttcc acatcagctg cctgaccttc ggcagggaga ccgtgctgga gtacctggtg 360
agcttcggcg tgtggatcag gacacctccc gcctacagac cccccaacgc ccccatcctg 420
agcaccctgc ccgagaccac agtggtgagg aggagggaca ggggcaggtc acccaggagg 480
aggactccaa gccccaggag gaggaggagc cagagcccca ggagaaggag gagccagagc 540
agggagagcc agtgcgcccc tgtgaagcag accctgaact tcgacctgct gaagctggcc 600
ggcgacgtgg agagcaatcc cggccctatg gagaacatca ccagcggctt cctgggcccc 660
ctgctggtgc tgcaggcagg cttcttcctg ctgaccagga tcctgaccat cccccagagc 720
ctggacagct ggtggaccag cctgaacttc ctcggcggga gccccgtgtg cctgggccag 780
aacagccagt ctcccaccag caatcacagc cccaccagct gccccccaat ctgtcctggc 840
taccggtgga tgtgcctgag gaggttcatc atcttcctgt tcatcctgct cctgtgcctg 900
atcttcctgc tggtgctgct ggactaccag ggaatgctgc cagtgtgtcc cctgatcccc 960
ggctcaacca ccactaacac cggcccctgc aaaacctgca ccacccccgc tcagggcaac 1020
agcatgttcc caagctgctg ctgcaccaag cccaccgacg gcaactgcac ctgcattccc 1080
atccccagca gctgggcctt cgccaagtat ctgtgggagt gggccagcgt gaggttcagc 1140
tggctcagcc tgctggtgcc cttcgtccag tggtttgtgg gcctgagccc caccgtgtgg 1200
ctgagcgcca tctggatgat gtggtactgg ggccccagcc tgtactccat cgtgagcccc 1260
ttcatccccc tgctgcccat tttcttctgc ctgtgggtgt acatc 1305
<210> 7
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIi的氨基酸序列
<400> 7
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu
100 105 110
Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met Gln
115 120 125
Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His Leu
130 135 140
Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Ser Phe
145 150 155 160
Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile Asp Trp
165 170 175
Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu Met Ser
180 185 190
Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys Glu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Gly Val Thr Lys Gln Asp Leu
210 215 220
Gly Pro Val Pro Met
225
<210> 8
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hIi的核苷酸序列
<400> 8
atgcacagga ggaggagcag gagctgcagg gaggaccaga agcccgtgat ggacgaccag 60
cgcgacctga tcagcaacaa cgagcagctg ccaatgctgg gcaggaggcc cggagcaccc 120
gaaagcaagt gcagcagggg cgccctgtac accggcttca gcatcctggt gaccctcctg 180
ctggccggcc aggccaccac cgcctatttc ctgtaccagc agcagggcag gctcgataag 240
ctgaccgtga cctcccagaa cctgcagctg gagaacctga ggatgaagct gcccaagccc 300
cccaagcccg tgagcaagat gaggatggcc acccccctgc tgatgcaggc tctgcccatg 360
ggggccctgc cccagggccc catgcagaac gccaccaaat acggcaacat gaccgaggac 420
cacgtgatgc acctgctgca gaacgccgat cctctgaagg tgtacccacc cctgaaaggc 480
agcttccccg agaacctcag gcacctgaag aacaccatgg agaccatcga ctggaaggtg 540
ttcgagagct ggatgcacca ctggctgctg ttcgagatga gccggcacag cctggagcag 600
aagcccaccg acgcccctcc caaggagagc ctcgagctcg aggacccaag cagcggcctg 660
ggcgtgacca agcaggacct gggccccgtg cccatg 696
<210> 9
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIi-HBc-2A-HBs的氨基酸序列
<400> 9
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu
100 105 110
Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met Gln
115 120 125
Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His Leu
130 135 140
Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Ser Phe
145 150 155 160
Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile Asp Trp
165 170 175
Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu Met Ser
180 185 190
Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys Glu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Gly Val Thr Lys Gln Asp Leu
210 215 220
Gly Pro Val Pro Met Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala
225 230 235 240
Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
245 250 255
Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu
260 265 270
Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile
275 280 285
Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn
290 295 300
Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr
305 310 315 320
Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys
325 330 335
Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly
340 345 350
Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile
355 360 365
Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Ala Pro Val Lys Gln Thr
370 375 380
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
385 390 395 400
Gly Pro Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val
405 410 415
Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln
420 425 430
Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro
435 440 445
Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro
450 455 460
Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg
465 470 475 480
Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu
485 490 495
Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile
500 505 510
Pro Gly Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr
515 520 525
Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro
530 535 540
Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe
545 550 555 560
Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser
565 570 575
Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val
580 585 590
Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr
595 600 605
Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu
610 615 620
Trp Val Tyr Ile
625
<210> 10
<211> 1998
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hIi-HBc-2A-HBs的核苷酸序列
<400> 10
atgcacagga ggaggagcag gagctgcagg gaggaccaga agcccgtgat ggacgaccag 60
cgcgacctga tcagcaacaa cgagcagctg ccaatgctgg gcaggaggcc cggagcaccc 120
gaaagcaagt gcagcagggg cgccctgtac accggcttca gcatcctggt gaccctcctg 180
ctggccggcc aggccaccac cgcctatttc ctgtaccagc agcagggcag gctcgataag 240
ctgaccgtga cctcccagaa cctgcagctg gagaacctga ggatgaagct gcccaagccc 300
cccaagcccg tgagcaagat gaggatggcc acccccctgc tgatgcaggc tctgcccatg 360
ggggccctgc cccagggccc catgcagaac gccaccaaat acggcaacat gaccgaggac 420
cacgtgatgc acctgctgca gaacgccgat cctctgaagg tgtacccacc cctgaaaggc 480
agcttccccg agaacctcag gcacctgaag aacaccatgg agaccatcga ctggaaggtg 540
ttcgagagct ggatgcacca ctggctgctg ttcgagatga gccggcacag cctggagcag 600
aagcccaccg acgcccctcc caaggagagc ctcgagctcg aggacccaag cagcggcctg 660
ggcgtgacca agcaggacct gggccccgtg cccatggaca ttgaccccta caaggagttc 720
ggcgccaccg tcgaactgct gagcttcctc cccagcgact tcttcccctc cgtgagggat 780
ctgctggaca cagctagcgc cctgtacagg gaggccctgg agagccccga gcactgcagc 840
ccccaccaca cagccctgag gcaggccatc ctctgttggg gcgagctgat gaccctggcc 900
acctgggtgg gcaataacct ggaggacccc gccagcaggg acctggtggt caactacgtg 960
aacaccaaca tgggcctgaa gatcaggcag ctgctgtggt tccacatcag ctgcctgacc 1020
tttggcaggg agaccgtcct ggagtacctg gtgagcttcg gcgtgtggat caggactccc 1080
ccagcctaca ggccccctaa cgcccccatc ctgtctaccc tgcccgagac caccgtggtg 1140
aggaggaggg acaggggcag aagccccagg agaaggaccc ctagccccag gaggaggagg 1200
agccagagcc ccaggaggag gaggagccag agccgggaga gccagtgcgc ccctgtgaag 1260
cagaccctga acttcgacct gctgaagctg gccggcgacg tggagagcaa tcccggccct 1320
atggaaaaca tcaccagcgg cttcctgggc cccctgctgg tgctgcaggc cggcttcttc 1380
ctgctgacca ggatcctgac cattccccag tcactggaca gctggtggac cagcctgaac 1440
ttcctcggcg ggagccccgt gtgcctgggc cagaatagcc agagccccac cagcaaccac 1500
tctcccactt cctgcccccc tatctgcccc ggctacaggt ggatgtgcct gaggaggttc 1560
atcatcttcc tgttcatcct gctgctgtgc ctgatcttcc tgctggtgct gctggactac 1620
cagggaatgc tgcccgtgtg tcccctgatc cccggaagca ccaccaccaa caccggcccc 1680
tgcaagacct gcaccacccc cgcccagggc aactctatgt tccccagctg ctgctgcacc 1740
aagcccaccg acggcaactg cacttgcatt cccatcccca gcagctgggc cttcgccaaa 1800
tatctgtggg agtgggccag cgtgaggttt agctggctga gcctgctggt gcccttcgtg 1860
cagtggtttg tgggcctgag ccccaccgtg tggctgagcg ccatctggat gatgtggtac 1920
tggggcccct ccctgtacag catcgtgagc cccttcatcc ccctcctgcc catcttcttc 1980
tgcctgtggg tgtacatc 1998
<210> 11
<211> 185
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 11
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145 150 155 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
165 170 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180 185
<210> 12
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIi替代变体的氨基酸序列
<400> 12
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro
100 105 110
Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met
115 120 125
Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His
130 135 140
Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly
145 150 155 160
Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile
165 170 175
Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu
180 185 190
Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys
195 200 205
Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys
210 215 220
Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro
225 230
<210> 13
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hI替代变体的核苷酸序列
<400> 13
atgcacagga ggagaagcag gagctgtcgg gaagatcaga agccagtcat ggatgaccag 60
cgcgacctta tctccaacaa tgagcaactg cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg 120
gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac acaggctttt ccatcctggt gactctgctc 180
ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa 240
ctgacagtca cctcccagaa cctgcagctg gagaacctgc gcatgaagct tcccaagcct 300
cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg 360
ggagccctgc cccaggggcc catgcagaat gccaccaagt atggcaacat gacagaggac 420
catgtgatgc acctgctcca gaatgctgac cccctgaagg tgtacccgcc actgaagggg 480
agcttcccgg agaacctgag acaccttaag aacaccatgg agaccataga ctggaaggtc 540
tttgagagct ggatgcacca ttggctcctg tttgaaatga gcaggcactc cttggagcaa 600
aagcccactg acgctccacc gaaagagtca ctggaactgg aggacccgtc ttctgggctg 660
ggtgtgacca agcaggatct gggcccagtc ccc 693
<210> 14
<211> 1998
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIi-HBc-2A-HBs的替代核酸序列
<400> 14
atgcacagga ggagaagcag gagctgtcgg gaagatcaga agccagtcat ggatgaccag 60
cgcgacctta tctccaacaa tgagcaactg cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg 120
gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac acaggctttt ccatcctggt gactctgctc 180
ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa 240
ctgacagtca cctcccagaa cctgcagctg gagaacctgc gcatgaagct tcccaagcct 300
cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg 360
ggagccctgc cccaggggcc catgcagaat gccaccaagt atggcaacat gacagaggac 420
catgtgatgc acctgctcca gaatgctgac cccctgaagg tgtacccgcc actgaagggg 480
agcttcccgg agaacctgag acaccttaag aacaccatgg agaccataga ctggaaggtc 540
tttgagagct ggatgcacca ttggctcctg tttgaaatga gcaggcactc cttggagcaa 600
aagcccactg acgctccacc gaaagagtca ctggaactgg aggacccgtc ttctgggctg 660
ggtgtgacca agcaggatct gggcccagtc cccatggaca ttgaccctta taaagaattt 720
ggagctactg tggagttact ctcgtttttg ccttctgact tctttccttc cgtcagagat 780
ctcctagaca ccgcctcagc tctgtatcga gaagccttag agtctcctga gcattgctca 840
cctcaccata ctgcactcag gcaagccatt ctctgctggg gggaattgat gactctagct 900
acctgggtgg gtaataattt ggaagatcca gcatccaggg atctagtagt caattatgtt 960
aatactaaca tgggtttaaa gatcaggcaa ctattgtggt ttcatatatc ttgccttact 1020
tttggaagag agactgtact tgaatatttg gtctctttcg gagtgtggat tcgcactcct 1080
ccagcctata gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 1140
agacgacggg accgaggcag gtcccctaga agaagaactc cctcgcctcg cagacgcaga 1200
tctcaatcgc cgcgtcgcag aagatctcaa tctcgggaat ctcaatgtgc ccctgtgaag 1260
cagaccctga acttcgacct gctgaagctg gccggcgacg tggagagcaa tcccggccct 1320
atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 1380
ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 1440
tttctagggg gatcacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 1500
tcaccaacct cctgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 1560
atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat 1620
caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccaa tacgggacca 1680
tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggc aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 1740
aaacctacgg atggaaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa 1800
tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 1860
cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgtggtat 1920
tgggggccaa gtctgtacag catcgtgagt ccctttatac cgctgttacc aattttcttt 1980
tgtctctggg tatacatt 1998
<210> 15
<211> 666
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIi-HBc-2A-HBs的替代氨基酸序列
<400> 15
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro
100 105 110
Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met
115 120 125
Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His
130 135 140
Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly
145 150 155 160
Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile
165 170 175
Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu
180 185 190
Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys
195 200 205
Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys
210 215 220
Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe
225 230 235 240
Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro
245 250 255
Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala
260 265 270
Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln
275 280 285
Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly
290 295 300
Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
305 310 315 320
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
325 330 335
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
340 345 350
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
355 360 365
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp
370 375 380
Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg
385 390 395 400
Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
405 410 415
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
420 425 430
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg
450 455 460
Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn
465 470 475 480
Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro
485 490 495
Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr
500 505 510
Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu
515 520 525
Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu
530 535 540
Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro
545 550 555 560
Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser
565 570 575
Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile
580 585 590
Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val
595 600 605
Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val
610 615 620
Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr
625 630 635 640
Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu
645 650 655
Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
660 665
<210> 16
<211> 3182
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 16
aattccacaa cctttcacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60
gctggtggct ccagttcagg agcagtaaac cctgttccga ctactgcctc tcccttatcg 120
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180
ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240
ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 300
cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaact 360
tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 420
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480
ctaattccag gatcctcaac caccagcacg ggaccatgcc gaacctgcat gactactgct 540
caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 600
tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 660
cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 780
ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840
ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc tgaattttat gggttatgtc attggaagtt 900
atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 960
ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 1020
ctgccccatt tacacaatgt ggttatcctg cgttaatgcc cttgtatgca tgtattcaat 1080
ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 1140
acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200
ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcgtgcg tggaaccttt tcggctcctc 1260
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1320
acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tctcccgcaa atatacatcg tatccatggc 1380
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440
cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1500
gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620
cgtgaacgcc caccgaatgt tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctctgc 1680
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1740
gttgggggag gagattagat taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800
ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1860
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat 1920
aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1980
gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 2040
cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg 2100
actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag catctagaga cctagtagtc 2160
agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct 2220
tgtctcactt ttggaagaga aaccgttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2280
cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggaaact 2340
actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400
aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aacctcaatg ttagtattcc 2460
ttggactcat aaggtgggga actttactgg tctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520
tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2580
atgtgaacag tttgtaggcc cacttacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat 2640
gcctgctagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 2700
ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct 2760
atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2820
accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2880
tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacaca gcaaatccag 2940
attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 3000
cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 3060
agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagacag 3120
gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3180
gg 3182
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3370的一部分
<400> 17
cttggtcatg ggccatcag 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3370的一部分
<400> 18
cggctaggag ttccgcagta 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3370的一部分
<400> 19
tgcgtggaac cttttcggct cc 22
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3371的一部分
<400> 20
ccaaaccttc ggacggaaa 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3371的一部分
<400> 21
tgaggcccac tcccatagg 19
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3371的一部分
<400> 22
cccatcatcc tgggctttcg gaaaat 26
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3372的一部分
<400> 23
atcctatcaa cacttccgga aact 24
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3372的一部分
<400> 24
cgacgcggcg attgag 16
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3372的一部分
<400> 25
aagaactccc tcgcctcgca gacg 24
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3373MGB的一部分
<400> 26
ccgaccttga ggcatacttc a 21
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3373MGB的一部分
<400> 27
aatttatgcc tacagcctcc tagtaca 27
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒引物探针组RTS3373MGB的一部分
<400> 28
ttaaagactg ggaggagttg 20
Claims (33)
1.一种治疗人类中的慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,其包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)向所述人类施用包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)向所述人类施用包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及
d)向所述人类施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中依次进行所述方法的步骤b)、c)和d),其中步骤b)在步骤c)之前和步骤c)在步骤d)之前。
3.根据权利要求2所述的方法,其中重复所述方法的步骤d)。
4.根据权利要求1所述的方法,其中重复步骤a)。
5.根据权利要求2所述的方法,其中在步骤b)之前重复步骤a)。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法,其中在每个步骤之间的时间段是1周、2周、4周、6周、8周、12周、6个月或12个月,例如4周或8周。
7.根据权利要求1所述的方法,其中步骤d)与步骤b)和/或与步骤c)同时进行。
8.根据权利要求7所述的方法,其中重复步骤a)。
9.一种治疗人类中的慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法,其包括以下步骤:
a)向所述人类施用包含靶向HBV核酸的长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)向所述人类施用i)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;以及,同时施用ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物;和
c)向所述人类施用i)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,以及,同时施用包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
10.根据权利要求10所述的方法,其中重复步骤a),且步骤a)在步骤b)之前,和步骤b)在步骤c)之前。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体(gapmer)”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述经修饰的寡核苷酸间隔体具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC,其由以下组成:由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
13.一种用于治疗人类中的慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法的免疫原性组合,所述免疫原性组合包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)(HBV ASO)的组合物;
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物,
其中所述方法包括向所述人类顺序或同时施用所述组合物。
14.根据权利要求13所述的免疫原性组合,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的免疫原性组合,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述经修饰的寡核苷酸间隔体具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC,其由以下组成:由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
16.一种在治疗人类中的慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法中使用的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO),和复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸、编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸以及编码融合至所述HBc的所述人类不变链(invariant chain)(hIi)的核酸,其中所述方法包括以初免-强化方案(prime-boost regimen)施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。
17.根据权利要求16使用的免疫原性组合物,其进一步包含一种或多种重组HBV蛋白抗原。
18.一种在治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法中使用的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO);经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体,其包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,其中所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。
19.根据权利要求18使用的免疫原性组合物,其进一步包含一种或多种重组HBV蛋白抗原。
20.一种在治疗人类慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎感染(CHD)的方法中使用的免疫原性组合,所述免疫原性组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO);以及重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和包含MPL和QS-21的佐剂,其中所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。
21.根据权利要求20使用的免疫原性组合物,其中在所述组合物中HBc与HBs的比率大于1。
22.根据权利要求21使用的免疫原性组合物,其中在所述组合物中HBc与HBs的比率是4:1。
23.根据权利要求20至22中任一项使用的免疫原性组合物,其进一步包含一种或多种编码一种或多种HBV抗原的载体。
24.根据权利要求16至23中任一项使用的免疫原性组合物,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC。
25.根据权利要求16至24中任一项使用的免疫原性组合物,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述经修饰的寡核苷酸“间隔体”具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC,其由以下组成:由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
26.一种免疫原性组合物在制备用于治疗人类中的慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎(CHD)感染的药物中的用途,所述免疫原性组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)和复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸、编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸以及融合至编码HBc的所述核酸的编码所述人类不变链(hIi)的核酸,其中治疗慢性乙型肝炎感染和/或CHD感染的所述方法包括以初免-强化方案施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。
27.一种免疫原性组合物在制备用于治疗人类中的慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎(CHD)感染的药物中的用途,所述免疫原性组合物包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO)和经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体,其包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸,其中所述治疗慢性乙型肝炎感染和/或CHD感染的方法包括初免-强化方案施用所述组合物以及至少一种其他免疫原性组合物。
28.一种免疫原性组合在制备用于治疗人类中的慢性乙型肝炎感染(CHB)和/或慢性丁型肝炎(CHD)感染的药物中的用途,所述免疫原性组合包含:
a)靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(HBV ASO);
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物,
其中所述治疗慢性乙型肝炎感染和/或CHD感染的方法包括向所述人类顺序或同时施用所述组合物。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的免疫原性组合物在制备药物中的用途,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的免疫原性组合物在制备药物中的用途,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述经修饰的寡核苷酸间隔体具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC,其由以下组成:由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
31.一种免疫原性组合,其包含:
a)包含靶向HBV核酸的长度10至30个核苷的反义寡核苷酸(ASO)的组合物(HBV ASO);
b)包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;
c)包含经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)载体的组合物,所述载体包含编码乙型肝炎表面抗原(HBs)的多核苷酸和编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的核酸;和
d)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂的组合物。
32.根据权利要求31所述的免疫原性组合,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的免疫原性组合,其中靶向HBV核酸的所述反义寡核苷酸是由20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸“间隔体”,其中每种核苷间连接是硫代磷酸酯连接和每种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶,所述经修饰的寡核苷酸间隔体具有序列GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC,其由以下组成:由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷GCAGA组成的5’翼区段、后接十个连接的脱氧核苷GGTGAAGCGA和由各自包含2’-O-甲氧基乙基糖的五个连接的核苷AGTGC组成的3’翼区段组成。
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