JP2022524007A - Ｂ型肝炎免疫化レジメンおよび組成物 - Google Patents

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Abstract

ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；ｃ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；およびｄ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。

Description

本発明は、慢性Ｂ型肝炎の治療のために特に適した免疫化レジメン、慢性Ｂ型肝炎の治療方法ならびにそのようなレジメンおよび方法における使用のための組成物に関する。該レジメンおよび方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、Ｂ型肝炎抗原を送達するベクターを含む組成物および組換えＢ型肝炎抗原タンパク質を含む組成物の投与を含む。
Ｂ型肝炎ウイルスは、部分的に二本鎖の環状ＤＮＡゲノムを有するＤＮＡウイルスであり、その全長鎖は３０２０～３３２０ヌクレオチド長であり、より短い鎖は１７００～２８００ヌクレオチド長である。ウイルスＤＮＡは、細胞への感染の直後に細胞核中に見出される。感染後に、細胞のＤＮＡポリメラーゼによりウイルスゲノムは完全に二本鎖となり、両端端が結合される。ウイルスコア（Ｃ）遺伝子、表面（Ｓ）遺伝子およびＸ遺伝子はゲノム中のウイルスポリメラーゼ（Ｐ）遺伝子とそれぞれオーバーラップしている。Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、プレコアおよびＨＢｅＡｇは、２個の別個の開始コドンを有する１個の遺伝子から差次的なプロセシングにより産生される。同様に、表面遺伝子は３個の開始コドンを有し、異なる長さの３種のタンパク質、ラージ（プレＳ１＋プレＳ２＋Ｓ）、ミドル（プレＳ２＋Ｓ）およびスモール（Ｓ）表面抗原を産生する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症は大きな公衆衛生問題である。世界的に、約２億５７００万人がＨＢＶに感染している［WHO, 2017］。ＨＢＶ感染症の臨床経過および転帰は主に、感染時の年齢ならびにウイルスおよび宿主免疫応答の間の複雑な相互作用により推進される［Ott, 2012; Maini, 2016］。そのため、ＨＢＶへの曝露は、自発的に消散する急性肝炎に繋がり得るか、または、不活性Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）キャリア状態、慢性肝炎、硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）を含めて、様々な形態の慢性感染症に進行し得る［Liaw, 2009］。成人集団中のＨＢｓＡｇの保有率は＞２％であり、東南アジアおよび中国において５～８％ならびにアフリカ地域において＞８％の割合である。慢性Ｂ型肝炎感染症（血清ＨＢｓＡｇが６か月よりも長期間検出されるＢ型肝炎感染症として定義される）を有する人の１５～４０％は肝臓の続発症を発症し、そのうちで肝硬変（ＬＣ）、肝臓代償不全およびＨＣＣが主な合併症である。
全乳児における予防的Ｂ型肝炎の予防接種の実施は多くの流行国におけるＢ型肝炎の発生率および保有率の低減において非常に有効であったが、青年および成人における慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）の保有率の強い減少には未だに繋がっておらず、導入から数十年後まではＨＢＶ関連死に影響することは期待されない。２０１５年に、Ｂ型肝炎は、８８７，０００人の死亡の原因となり、大部分が肝硬変及びＨＣＣによるものであった［WHO, 2017］。
慢性Ｂ型肝炎の臨床管理は、疾患の進行を予防し、その結果としてＨＣＣの発症を予防することによって、生存および生活の質を向上させることを目的とする［Liaw, 2013］。現行の治療戦略は、ＨＢＶ誘導性肝臓疾患の安定化を達成するためおよび進行を予防するためのＨＢＶ ＤＮＡ複製の長期抑制に主に基づく。血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルはすべての現行の治療モダリティーの礎石となるエンドポイントである。（検出可能な）Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の消失の達成は別の有益なバイオマーカーであるが、抗ＨＢｓセロコンバージョンを伴うまたは伴わないＨＢｓＡｇ消失は、ＨＢＶ複製およびウイルスタンパク質発現の強い抑制を指し示すので、「機能的治癒」を表す最適なエンドポイントであると一般に考えられる［Block, 2017; Cornberg, 2017］。現在、ペグ化インターフェロンアルファ（ＰｅｇＩＦＮα）またはヌクレオシド／ヌクレオチドアナログ（ＮＡ）のいずれかによる、ＣＨＢ患者のための２種の主な治療オプションが存在する［EASL, 2017］。有限期間の治療による長期免疫制御の誘導を目的とするＰｅｇＩＦＮαは持続的な治療中止後制御（off-treatment control）を達成することがあるが、永続性のあるウイルス学的応答およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の消失は低い割合の患者に限定される。さらに、その乏しい忍容性と長期安全性の懸念とのため、かなりの数の患者はこの種類の治療に不適格である。
ＮＡは、ＨＢＶポリメラーゼ逆転写酵素活性の阻害を通じてＤＮＡ複製を抑制することにより作用する。欧州においてＨＢＶ治療のために承認されたＮＡとしては、ＨＢＶ耐性に対する高い障壁と関連付けられるエンテカビル（ＥＴＶ）、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ＴＤＦ）およびテノホビルアラフェンアミド（ＴＡＦ）の他に、ＨＢＶ耐性に対する低い障壁と関連付けられるラミブジン（ＬＡＭ）、アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）およびテルビブジン（ＴＢＶ）が挙げられる。耐性に対する高い障壁を有する強力なＮＡを用いる治療の主な利点はその予測可能な高い長期抗ウイルス有効性であり、これは服薬遵守患者の大部分におけるＨＢＶ ＤＮＡ抑制の他に、好都合な安全性プロファイルに繋がる。ＮＡ治療の欠点はその長期治療レジメンであり、その理由は、ＮＡはＨＢＶの根絶を通常達成せず、ＮＡの中止はＨＢＶの再発に繋がり得るためである［Kranidioti, 2015］。機能的治癒を表すＨＢｓＡｇの消失は現在、ＣＨＢにおけるゴールドスタンダードの治療エンドポイントであるが［Block, 2017; Cornberg, 2017］、ＮＡ治療によっては滅多に達成されない［Zoutendijk, 2011］。
ＨＢｓＡｇ血清クリアランスの低い割合［Zoutendijk, 2011］およびＮＡ中止後のウイルス再発の高いリスク［Kranidioti, 2015］のため、ほとんどの患者は長期またはさらには無期限のＮＡ療法下に維持され、これは療法に対する患者コンプライアンスの低減、経済的コストの増加ならびに長期曝露による薬物毒性および薬物耐性変異のリスクの増加と関連付けられ得る［Terrault, 2015］。したがって、有限のレジメンを用いて「機能的治癒」を達成するためにＮＡ療法に補足するための新たな戦略が必要である。
アンチセンス療法は、ＲＮＡ転写物を抗原に直接的に標的化し、それにより血清ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇレベルを低減させることができるという点でヌクレオシド療法とは異なる。アンチセンス療法および新規の抗ウイルス薬に加えて、現在研究されている新たな治療戦略としては、ＨＢＶ特異的な適応免疫応答を増強するまたは肝内の自然免疫を活性化させる免疫療法戦略が挙げられる［Durantel, 2016］。これまでのところ、これらの実験的治療のいずれも有効であることが示されていない。評価されたワクチン接種戦略の中で、いずれも、ウイルスに対する免疫制御を回復させるための鍵となる重要性を有するＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に対する堅牢な多機能性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することはできなかった［Lau, 2002; Li, 2011; Liang, 2011; Bertoletti, 2012; Boni, 2012］。ＨＢＶ表面および／またはプレＳ抗原に基づく組換えワクチンに関する早期の努力は抗体応答を予備的に誘導したがＨＢＶ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導せず、臨床的利益もウイルス学的利益も有しなかった［Jung, 2002; Vandepapeliere, 2007］。ＨＢＶエンベロープを発現するＤＮＡワクチンはＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに特異的なＴ細胞応答を回復させず、そのためＮＡ中止後の患者において再発のリスクを減少させなかった［Fontaine, 2015］。新たな送達システムを用いた場合、Ｓ、プレＳ１／Ｓ２をコードするＤＮＡワクチン（プライムワクチン）およびＭＶＡウイルスベクターワクチン（ブーストワクチン）はウイルス血症においてＴ細胞の誘導も低減も示さず、ＨＢＶプレＳおよび表面抗原は単独では患者を治癒するために十分でないことを示唆した［Cavenaugh, 2011］。より最近では、複数のＨＢＶ抗原を標的化するワクチン戦略および新たな送達システムが研究されている。組換えＨＢｓＡｇ／ＨＢｃＡｇワクチンは患者の半数のみにおいて非常に低いレベル（すなわち、約５０ＩＵ／ｍＬ）までのウイルス量の減少に繋がった［Al-Mahtab, 2013］。ラミブジンと共に遺伝学的にアジュバント添加されたＩＬ－１２を伴うＳ、プレＳ１／Ｓ２、コア、ポリメラーゼおよびＸタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは患者の半数において多特異的なＴ細胞応答およびウイルス量における＞２ｌｏｇ１０の減少を誘導した。しかしながら、ＨＢｓＡｇの定量的検出における変化、ＨＢｓＡｇの消失またはＨＢｓＡｇセロコンバージョンはいずれの患者においても観察されなかった［Yang, 2012］。ＨＢＶのラージＳ、コアおよびＸタンパク質を発現する酵母ベースのＴ細胞ワクチンであるＧＳ－４７７４ワクチンは、ウイルス抑制されたＣＨＢ患者においてＨＢｓＡｇの有意な低減を提供しなかった［Lok, 2016］。
ウイルス学的再発も臨床的再発も伴わずに患者がＮＡ療法を安全に中止することを可能とするためにＨＢｓＡｇをクリアランスできる慢性Ｂ型肝炎に対する治療の満たされていない要求が依然として存在する。
Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）（肝炎デルタとも呼ばれる）は、その複製のためにＢ型肝炎ウイルスを必要とするウイルスである。ＨＤＶ感染はＨＢＶと同時にまたはそれとの重感染として起こる。ＨＤＶは、感染個体の血液または他の体液との接触を通じて伝染する。母から子への垂直感染は稀である。慢性ＨＢＶを有する人々の少なくとも５％はＨＤＶにも同時感染しているが、多くの国はＨＤＶの保有率を報告していないのでこれは過小評価である可能性がある。Ｄ型肝炎感染症はＢ型肝炎ワクチン接種により予防することができ、１９８０年代の国家的ＨＢＶ予防ワクチン接種キャンペーンの導入の成功以来、ＨＤＶ感染症の数もまた減少した。ＨＢＶ－ＨＤＶ同時感染は、肝臓関連死および肝細胞癌へのより急速な進行に起因して最も重篤な形態の慢性ウイルス性肝炎であると考えられる。治療はペグ化インターフェロンの投与を介するが、持続的なウイルス学的応答の率は低い［WHO 2018］。現在、治療率もまた低い。ＨＤＶにより引き起こされる慢性肝炎の進行を停止させ、もしくは逆転させることができる、かつ／あるいは慢性ＨＤＶ感染（慢性Ｄ型肝炎－ＣＨＤ）またはＨＢＶ／ＨＤＶ同時感染（ＣＨＢ／ＣＨＤ）をクリアランスすることができる治療の満たされていない要求が依然として存在する。
一態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；
ｃ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；および
ｄ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
を含む、方法が提供される。
一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップｂ）はステップｃ）に先行し、かつ、ステップｃ）はステップｄ）に先行する。場合により、ステップａ）は繰り返されてもよい。場合により、ステップｄ）は繰り返されてもよい。別の実施形態において、ステップｄ）はステップｂ）および／またはステップｃ）と同時に実施される。
特定の一実施形態において、ステップａ）は繰り返され、次に中止され、その後にステップｂ）、ステップｃ）およびステップｄ）が順次実施される。場合により、ステップｄ）は繰り返されてもよい。別の実施形態において、ステップａ）は繰り返され、次に任意のその後のステップの前に中止され、かつ、ステップｄ）はステップｂ）および／またはステップｃ）と同時に実施される。これらの実施形態において、ステップａ）のＡＳＯは他の組成物の前に投与される。
したがって、別の態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用（concomitantly）投与するステップ；ならびに
ｃ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物、および組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ
を含む、方法が提供される。
一実施形態において、方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、かつ、ステップｂ）はステップｃ）に先行する。場合により、ステップａ）は繰り返されてもよい。場合により、ステップｃ）は繰り返されてもよい。
特定の一実施形態において、ステップａ）は繰り返され、次に中止され、その後にステップｂ）およびステップｃ）は順次実施される。場合により、ステップｃ）は繰り返されてもよい。これらの実施形態において、ステップａ）のＡＳＯはその他の組成物の前に投与される。
別の態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組合せ（Immunogenic combination）であって、
前記免疫原性組合せが、
ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含み、
前記方法が、前記組成物をヒトに順次投与または併用投与することを含む、免疫原性組合せが提供される。
別の態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物が、
ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）、および
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸と、前記ＨＢｃに融合したヒトインバリアント鎖（ｈＩｉ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクター
を含む組成物を含み、
前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物が提供される。ある特定の実施形態において、慢性ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための免疫原性組成物は１種以上の組換えＨＢＶタンパク質抗原をさらに含む。
さらなる態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物が、
ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）、および
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター
を含む組成物を含み、
前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物が提供される。ある特定の実施形態において、慢性ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための免疫原性組成物は１種以上の組換えＨＢＶタンパク質抗原をさらに含む。
さらなる態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物が、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）と、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、Ｃ末端切断型組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、ＭＰＬ（３－ＤモノホスホリルリピドＡ）およびＱＳ－２１（キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）の樹皮から精製されたトリテルペングリコシド）を含有するアジュバントとを含み、
前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物が提供される。ある特定の実施形態において、慢性ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための免疫原性組成物は、１種以上のＨＢＶ抗原をコードする１種以上のベクターをさらに含む。
さらなる態様において、以下の組成物：
ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含む、免疫原性組合せが提供される。
免疫原性組合せは、プライム－ブーストレジメンにおける前記組成物の投与により慢性Ｂ型肝炎（ＣＢＨ）を治療する方法において用途を有し得る。
免疫原性組合せは、前記組成物の順次投与または併用投与によりヒトにおいてＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において用途を有し得る。
別の態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；および
ｃ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
を含む、方法が提供される。
一実施形態において、方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、かつ、ステップｂ）はステップｃ）に先行する。場合により、ステップａ）は繰り返されてもよい。場合により、ステップｃ）は繰り返されてもよい。別の実施形態において、ステップｃ）はステップｂ）と同時に実施される。
特定の一実施形態において、ステップａ）は繰り返され、次に中止され、その後にステップｂ）およびステップｃ）は順次実施される。場合により、ステップｃ）は繰り返されてもよい。別の実施形態において、ステップｃ）はステップｂ）と同時に実施される。これらの実施形態において、ステップａ）のＡＳＯはその他の組成物の前に投与される。
したがって、別の態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；ならびに
ｂ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ
を含む、方法が提供される。
一実施形態において、方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行する。場合により、ステップａ）は繰り返されてもよい。場合により、ステップｂ）は繰り返されてもよい。
別の態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組合せであって、
前記免疫原性組合せが、
ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；および
ｃ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含み、
前記方法が、前記組成物をヒトに順次投与または併用投与することを含む、免疫原性組合せが提供される。
さらなる態様において、以下の組成物：
ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；および
ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含む、免疫原性組合せが提供される。
免疫原性組合せは、プライム－ブーストレジメンにおける前記組成物の投与により慢性Ｂ型肝炎（ＣＢＨ）および／またはＣＨＤを治療する方法において用途を有し得る。
免疫原性組合せは、前記組成物の順次投与または併用投与によりヒトにおいてＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において用途を有し得る。
一実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する。そのような一実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、前記ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、前記ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、前記ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである。
図１Ａは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目および４回目の投与の７日後のＨＢｃ（Ａ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図１Ｂは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目および４回目の投与の７日後のＨＢｓ（Ｂ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図２Ａは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目および４回目の７日後におけるＨＢｃ（Ａ）特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図２Ｂは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目および４回目の７日後におけるＨＢｓ（Ｂ）特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図３は、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの４回目の投与から７日後の肝臓浸潤性リンパ球におけるＨＢｃおよびＨＢｓ特異的なＣＤ４＋（Ａ）およびＣＤ８＋（Ｂ）Ｔ細胞（３または４個体のプールをメジアン値と共に示す）を示す図である。 図４Ａは、プライムブーストワクチンレジメン後のＨＢｃ特異的（Ａ）な抗体応答（個々の個体を幾何平均と共に示す）を示す図である。 図４Ｂは、プライムブーストワクチンレジメン後のＨＢｓ特異的（Ｂ）な抗体応答（個々の個体を幾何平均と共に示す）を示す図である。 図５Ａは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｃ特異的な脾臓（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図５Ｂは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｃ特異的な肝臓（Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図６Ａは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｃ特異的な脾臓（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図６Ｂは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｃ特異的な肝臓（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図７Ａは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｓ特異的な脾臓（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図７Ｂは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｓ特異的な肝臓（Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図８Ａは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｓ特異的な脾臓（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図８Ｂは、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後におけるＨＢｓ特異的な肝臓（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図９Ａは、２３、６５および９３日目（投薬前、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後）における抗ＨＢｓ（Ａ）結合性抗体応答（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図９Ｂは、２３、６５および９３日目（投薬前、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与から７日後および４回目の投与から７日後）における抗ＨＢｃ（Ｂ）結合性抗体応答（個々の個体をメジアン値と共に示す）を示す図である。 図１０Ａは、３８、６５および９３日目（ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの１回目、２回目および４回目の投与の７日後；群１、２、３）または９３日目（群４）におけるマウス（群１、２、３および４）からの血清において測定されたＡＳＴ（Ａ）レベルを示す図である。 図１０Ｂは、３８、６５および９３日目（ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの１回目、２回目および４回目の投与の７日後；群１、２、３）または９３日目（群４）におけるマウス（群１、２、３および４）からの血清において測定されたＡＬＴ（Ｂ）レベルを示す図である。 図１１は、投薬前、ＮａＣｌ、後続の組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストまたは併用的な組換えタンパク質による異種ベクタープライム－ブーストの２回目の投与の７日後および４回目の投与の７日後におけるＡＡＶ２／８－ＨＢＶ注射マウスからの血清におけるＨＢｓ抗原レベルを示す図である。 図１２は、ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓ構築物の構造を示す図である。 図１３は、ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓ構築物の構造を示す図である。
配列表
配列番号１：ＨＢｓのアミノ酸配列
配列番号２：ＨＢｃ切断型のアミノ酸配列
配列番号３：口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーのアミノ酸配列
配列番号４：口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードするヌクレオチド配列
配列番号５：ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓのアミノ酸配列
配列番号６：ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓをコードするヌクレオチド配列
配列番号７：ｈＩｉのアミノ酸配列
配列番号８：ｈＩｉをコードするヌクレオチド配列
配列番号９：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓのアミノ酸配列
配列番号１０：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓをコードするヌクレオチド配列
配列番号１１：ＨＢｃのアミノ酸配列
配列番号１２：ｈＩｉの代替バリアントのアミノ酸配列
配列番号１３：ｈＩの代替バリアントをコードするヌクレオチド配列
配列番号１４：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓの代替的な核酸配列
配列番号１５：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓの代替的なアミノ酸配列
配列番号１６：Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのヌクレオチド配列（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号Ｕ９５５５１．１）
発明の詳細な説明
定義
他に定義されなければ、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、本明細書において使用されるある特定の用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されるように定義される。
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体を通じて、文脈が他に要求しなければ、「含む」（comprise）という語、ならびに変形形態、例えば「含む」（comprises）および「含む」（comprising）は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが、任意のその他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を除外しないことを含意することが理解される。
いくつかの文献が本明細書の全体を通じて参照される。本明細書において参照される文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、使用説明書などを含む）のそれぞれは、上記または下記のいずれであれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなる記載も、本発明は先行発明を理由としてそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。本発明の一態様の文脈において本明細書において提供されるすべての定義はまた、本発明のその他の態様に適用される。
「２’－Ｏ－メトキシエチル」（ならびに２’－ＭＯＥおよび２’－Ｏ（ＣＨ２）２－ＯＣＨ３）は、フラノース環の２’位におけるＯ－メトキシ－エチル修飾を指す。２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。
「２’－ＭＯＥヌクレオシド」（および２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド）は、２’－ＭＯＥ修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
「２’置換ヌクレオシド」は、フラノシル環の２’位にＨまたはＯＨ以外の置換基を含むヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態において、２’置換ヌクレオシドは、二環式糖修飾を有するヌクレオシドを含む。
「５－メチルシトシン」は、５位に取り付けられたメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５－メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
「約」は値の±７％以内を意味する。例えば、「化合物はＨＢＶの約７０％の阻害に影響した」と記載される場合、ＨＢＶレベルが６３％～７７％の範囲内で阻害されることが含意される。
「有効医薬剤」は、個体に投与された場合に治療的な利益を提供する物質または医薬組成物中の物質を意味する。例えば、ある特定の実施形態において、ＨＢＶに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは有効医薬剤である。
「急性Ｂ型肝炎感染症」は、Ｂ型肝炎ウイルスに曝露された人がウイルス性肝炎の徴候および症状を発症し始める場合の結果である。潜伏期間と呼ばれる、曝露ならびに感染症の徴候および症状の発症の間の時間的期間は平均で９０日であるが、４５日もの短さまたは６か月もの長さとなることがある。ほとんどの人々にとってこの感染症は軽度から中等度までの不快感を引き起こすが、ウイルスとの闘いに身体の免疫応答が成功することで自然に無くなる。しかしながら、一部の人々、特には免疫系不全を有する人々、例えばＡＩＤＳを患っている、化学療法を受けている、免疫抑制薬を服用している、またはステロイドを服用している人々は、急性ＨＢＶ感染症の結果として非常に深刻な問題を有し、より重篤な状態、例えば劇症肝不全になる。
「慢性Ｂ型肝炎感染症」は、人々が最初に急性感染症を患い、その後に感染症を撃退できない場合に起こる。出生時に感染した乳児の約９０％は慢性疾患に進行する。しかしながら、歳をとるにつれて慢性感染症のリスクは減少し、その結果、子供のときに感染した人々の２０％～５０％およびより高齢の子供または成人のときに感染した人々の１０％未満が急性から慢性感染症へと進行する。慢性ＨＢＶ感染症は本発明の実施形態の主要な治療目標であるが、本発明の組成物はまた、ＨＢＶ関連状態、例えば炎症、線維症、硬変、肝臓がん、血清肝炎などを治療することができる。
「ペプチド」は、少なくとも２個のアミノ酸をアミド結合（ペプチド結合とも称される）により連結することにより形成される分子を意味する。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は本明細書において交換可能に使用され、長さ、翻訳時または翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド結合した鎖を指す。「融合タンパク質」（または「キメラタンパク質」）は、ペプチド結合している２種以上のタンパク質を含む組換えタンパク質である。融合タンパク質は、元々は別個のタンパク質をコードしていた２種以上の遺伝子の連結を通じて作製される。この融合遺伝子の翻訳は単一の融合タンパク質を結果としてもたらす。タンパク質またはポリペプチドに関して、組換え体は、タンパク質が組換えポリヌクレオチドから発現されることを意味する。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は本明細書において交換可能に使用され、ヌクレオチド単量体から作られたポリマー性高分子を指す。好適には本発明のポリヌクレオチドは組換え体である。組換え体は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限もしくはライゲーションステップ、または天然に見出されるポリヌクレオチドとは別個のポリヌクレオチドを結果としてもたらすその他の手順のうちの少なくとも１つの製造物であることを意味する。
異種核酸配列は、宿主生物中に見出される天然に存在する核酸配列から単離されたものでもなく、それに由来するものでもなく、それに基づくものでもない任意の核酸配列を指す。「天然に存在する（naturally occurring）」は、天然に見出され、かつ合成的に調製されたものでも改変されたものでもない配列を意味する。配列は、供給源から単離されているが、供給源遺伝子の正常な機能を妨害しないように好適に（例えば、欠失、置換（変異）、挿入、またはその他の改変により）改変されている場合に供給源に「由来する」。
好適には、本発明において使用されるポリヌクレオチドは単離されている。「単離された」ポリヌクレオチドは、その元々の環境から取り出されたポリヌクレオチドである。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドは、天然の系中の共存する材料の一部またはすべてから分離されている場合に単離されている。ポリヌクレオチドは、例えば、その天然の環境の部分ではないベクターにクローニングされた場合またはｃＤＮＡ内に含まれる場合に単離されていると考えられる。
「治療」は、疾患または状態の変更または改善に影響するように組成物を投与することを指す。「治療する」という用語は、慢性Ｂ型肝炎感染症に関して本明細書において使用される場合、ＣＨＢの症状を低減させること、ＣＨＢの進行を予防することまたはＣＨＢの１種以上の検出可能なマーカーのレベルを低減させることを意図した好適な組成物の投与を指す。例えば、ＣＨＢの進行を予防することは、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）レベル、肝臓線維症またはその他の好適な検出可能なマーカーにより指し示されるように、肝臓疾患の開始を予防することまたは既存の肝臓疾患を安定化させることを含んでもよい。ＣＨＢの他のマーカーとしては、ウイルス複製の指標である血清ＨＢＶ ＤＮＡレベル、およびウイルス量の指標である血清ＨＢｓ抗原レベルが挙げられ、そのためＣＨＢを治療することは、血清ＨＢｓＡｇ（例えば定量的イムノアッセイにより決定される）またはＨＢＶ ＤＮＡ（例えばＣｏｂａｓ（登録商標）ＨＢＶアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）もしくは同等のものにより決定される）のレベルを検出不可能なレベルまで低減させる（ＨＢｓＡｇまたはＨＢＶ ＤＮＡを「クリアランス」する）ことを含んでもよい。「治療する」という用語は、慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）に関して本明細書において使用される場合、上記に準じて解釈される。
「投与する」は、個体に医薬剤を提供することを意味し、医療専門家により投与することおよび自己投与することが挙げられるがこれらに限定されない。
「併用投与される（administered concomitantly）」は、両方の薬理学的効果が患者において同時に（at the same time）現れる任意の方式での２種の剤の共投与（co-administration）を指す。併用投与（concomitant administration）は、両方の剤が単一の医薬組成物中で、同じ投薬形態で、または同じ投与経路により投与されることを要求しない。「併用」投与は、ワクチンレジメンの成分に関して本明細書において使用される場合、同じ進展中の免疫応答の間の投与を指し、「併用」は上記に準じて解釈される。好ましくは、両方の成分は同時に投与される（例えばベクターを含んでなる組成物およびタンパク質を含んでなる組成物の併用投与）が、１種の成分がその他の成分の数分以内（例えば、同じ医療予約（medical appointment）もしくは通院時）または数時間以内に投与されてもよい。そのような投与は共投与とも称される。別個の成分の併用投与は、同じ投与経路、例えば、筋肉内注射を介して行われてもよい。あるいは、別個の成分の併用投与は、異なる投与経路、例えば、筋肉内注射および皮内注射、筋肉内および鼻腔内投与、吸入および皮下投与などを介して行われてもよい。一部の実施形態において、併用投与は、アデノウイルスベクターおよびタンパク質成分の投与を指すことがある。その他の実施形態において、共投与は、アデノウイルスベクターおよび別のウイルスベクター、例えばポックスウイルス、例えばＭＶＡの投与を指す。その他の実施形態において、共投与は、アデノウイルスベクターおよびタンパク質成分の投与であり、タンパク質成分がアジュバント添加されている投与を指す。
「順次」投与（“sequential” administration）は、第１の組成物の投与に続いて相当な時間の後の第２の組成物の投与を指す。２つの順次投与の間の時間的期間は１週間～１２か月間、例えば２週間～１２週間、例えば、１週間、２週間、４週間、６週間、８週間または１２週間、６か月間または１２か月間である。より特には、それは４週間～８週間であり、例えば順次投与の間の時間的期間は４週間であってもよい。そのため、順次投与は、プライム－ブーストの状況における第１およびその後の投与、すなわち、第２の組成物の投与が第１の投与により生み出された進展中の免疫応答の間には実行されない場合を包含する。
「免疫原性組合せ（Immunogenic combination）」は、本明細書において使用される場合、単一の免疫化レジメン、例えば、プライム－ブーストレジメンにおいて順次投与および／または併用投与される複数の別個に調合された免疫原性組成物であって、各別個に調合された免疫原性組成物が免疫原性組合せの成分であるものを指す。
「アンチセンス化合物」は、水素結合を通じて標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるオリゴマー化合物を意味する。アンチセンス化合物の例としては、一本鎖および二本鎖化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびサテライトリピートが挙げられる。
「アンチセンス阻害」は、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の非存在下での標的核酸レベルと比較して該アンチセンス化合物の存在下での標的核酸レベルの低減を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントへのハイブリダイゼーションを許容する核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
「相補性」は、第１の核酸および第２の核酸の核酸塩基の間の対合する能力を意味する。
「塩基相補性」は、標的核酸中の対応する核酸塩基とのアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の正確な塩基対合（すなわち、ハイブリダイゼーション）の能力を指し、対応する核酸塩基の間のワトソン－クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合により媒介される。
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸分子のアニーリングを意味する。ある特定の実施形態において、相補的な核酸分子としてはアンチセンス化合物および核酸標的が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、相補的な核酸分子としてはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび核酸標的が挙げられるがこれらに限定されない。
「完全に相補的」または「１００％相補的」は、第１の核酸の各核酸塩基が第２の核酸中に相補的な核酸塩基を有することを意味する。ある特定の実施形態において、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、かつ、標的核酸は第２の核酸である。
「連続する核酸塩基」は、互いに直接隣接している核酸塩基を意味する。
「連続する核酸塩基」は、互いに直接隣接している核酸塩基を意味する。
「デオキシリボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドを意味する。デオキシリボヌクレオチドは、様々な置換基のいずれかで修飾されていてもよい。
「希釈剤」は、薬理活性を欠いているが薬学的に必要なまたは望ましい組成物中の成分を意味する。例えば、注射される薬物中で、希釈剤は液体、例えば、食塩水溶液であってもよい。
「投薬単位」は、医薬剤が提供される形態、例えば、丸剤、錠剤、または当該技術分野において公知の他の投薬単位を意味する。
「用量」は、単回投与において、または指定された期間において提供される医薬剤の指定された量を意味する。ある特定の実施形態において、用量は、２以上のボーラス、錠剤または注射において投与されてもよい。例えば、皮下投与が所望されるある特定の実施形態において、所望の用量は、単一の注射によっては容易に収容されない体積を要求する。そのような実施形態において、所望の用量を達成するために２以上の注射が使用されてもよい。ある特定の実施形態において、用量は、個体において注射部位の反応を最小化するために２以上の注射において投与されてもよい。その他の実施形態において、医薬剤は、長期間にわたりまたは連続的に注入により投与される。用量は、時間、日、週または月当たりの医薬剤の量として記載されることがある。
「投薬レジメン」は、１以上の所望の効果を達成するために設計された用量の組合せである。
「ＨＢＶ」は、ヒトＢ型肝炎ウイルスを含めて、哺乳動物Ｂ型肝炎ウイルスを意味する。該用語は、Ｂ型肝炎ウイルス、特にはヒトＢ型肝炎ウイルスの地理的な遺伝子型の他に、Ｂ型肝炎ウイルスの地理的な遺伝子型のバリアント株を包含する。
「ＨＢＶ抗原」は、「Ｂ型肝炎コア抗原」または「ＨＢｃＡｇ」および「Ｂ型肝炎Ｅ抗原」または「ＨＢｅＡＧ」などのコアタンパク質、ならびに「ＨＢＶ表面抗原」または「ＨＢｓＡｇ」などのエンベロープタンパク質を含む任意のＢ型肝炎ウイルス抗原またはタンパク質も意味する。
「Ｂ型肝炎Ｅ抗原」または「ＨＢｅＡｇ」は、分泌型の非粒子形態のＨＢＶコアタンパク質である。ＨＢＶ抗原としてのＨＢｅＡｇおよびＨＢｃＡｇは一次アミノ酸配列を共有し、従って、Ｔ細胞レベルで交差反応性を示す。ＨＢｅＡｇは、研究によれば慢性感染の確立に必要とされる可能性があることを示唆されているが、ウイルスのアセンブリまたは複製には必要とされない。
「ＨＢＶ表面抗原」、または「ＨＢｓＡｇ」、または「ＨＢｓＡＧ」は、感染性ＨＢＶウイルス粒子のエンベロープタンパク質であるが、ＨＢＶウイルス粒子の１０００倍の血清レベルで非感染性粒子（デーン粒子）としても分泌される。感染したヒトまたは動物のＨＢｓＡｇの血清レベルは、１０００μｇ／ｍＬといった高いものであり得る(Kann and Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 9th ed. 745)。
「Ｂ型肝炎関連病態」または「ＨＢＶ関連病態」は、Ｂ型肝炎の感染、曝露または疾病により増悪される、により引き起こされる、に関連する、に伴うまたはに起因する任意の疾患、生物学的状態、医学的状態または事象も意味する。Ｂ型肝炎関連病態という用語には、慢性ＨＢＶ感染症、炎症、線維症、硬変、肝臓癌、血清肝炎、黄疸、肝臓癌、肝臓炎症、肝線維症、肝硬変、肝不全、びまん性肝細胞性炎症性疾患、血球貪食症候群、血清肝炎、ＨＢＶウイルス血症、移植に関連する肝疾患、および、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の存在に関する陽性判定、またはＢ型肝炎ウイルス抗原に特異的な抗体の存在に関する陽性判定と組み合わされた場合に、以下の病態：インフルエンザ様疾患、倦怠感、疼痛、頭痛、発熱、食欲不振、下痢、悪心および嘔吐、身体の肝臓領域の疼痛、粘土色または灰色の便、全身性のそう痒、および暗色の尿のいずれかまたはすべてを含み得る症状を有する病態が含まれる。
「発現または活性を阻害する」は、発現または活性の低下、遮断を指し、必ずしも発現または活性の全面的な排除を示さない。
「ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシド間の化学的結合を指す。
「連結したヌクレオシド」は、ヌクレオシド間結合によって相互に連結した隣接するヌクレオシドを意味する。
「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換またはいずれの変化も指す。
「ホスホロチオエート結合」は、非架橋酸素原子の１個を硫黄原子に置き換えることによってホスホジエステル結合が修飾されたヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
「修飾核酸塩基」はまた、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシル以外の任意の核酸塩基を意味する。「非修飾核酸塩基」は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。
「修飾ヌクレオシド」は、独立に修飾糖部分および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
「修飾ヌクレオチド」は、独立に修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖および／または修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
「修飾糖」は、天然糖部分の置換および／または任意の変化を意味する。
「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別の領域とは何らかの化学的違いがある、アンチセンス化合物の領域を指す。例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を持たないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
「モチーフ」は、アンチセンス化合物における非修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオシドのパターンを意味する。
「ギャップマー」は、ＲＮアーゼＨ切断を補助する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、１以上のヌクレオシドを有する内部領域間に位置し、内部領域を含むヌクレオシドが、外部領域を含む１または複数のヌクレオシドとは化学的に異なるキメラアンチセンス化合物を意味する。内部領域は「ギャップ」と呼ばれ、外部領域は「ウイング」と呼ばれることがある。
「ウイングセグメント」は、オリゴヌクレオチドに阻害活性の増強、標的核酸に対する結合親和性の増大、またはｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼによる分解に対する耐性などの特性を付与するために修飾された複数のヌクレオシドを意味する。
「天然糖部分」は、ＤＮＡ（２’－Ｈ）またはＲＮＡ（２’－ＯＨ）に見られる糖部分を意味する。
「非修飾」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。
「非修飾ヌクレオチド」は、天然に存在する核酸塩基、糖部分およびヌクレオシド間結合から構成されるヌクレオチドを意味する。特定の実施形態において、非修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β－Ｄ－リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β－Ｄ－デオキシリボヌクレオシド）である。
「核酸」は、モノマーヌクレオチドから構成される分子を指す。核酸としては、限定されるものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。
「核酸塩基」は、別の核酸の塩基と対合し得る複素環式部分を意味する。
「核酸塩基相補性」とは、別の核酸塩基と塩基対を形成し得る核酸塩基を指す。例えば、ＤＮＡの場合、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と相補的である。例えば、ＲＮＡにおいて、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と相補的である。特定の実施形態において、相補的核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基対を形成し得るアンチセンス化合物の核酸塩基を指す。例えば、アンチセンス化合物のある特定の位置の核酸塩基が標的核酸のある特定の位置の核酸塩基と水素結合することができれば、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、その核酸塩基対において相補的であると考えられる。
「核酸塩基配列」は、いずれの糖、結合および／または核酸塩基の修飾にもよらずに、連続する核酸塩基の順序を意味する。
「ヌクレオシド」は、糖と結合している核酸塩基を意味する。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合しているリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、それぞれが互いに無関係に修飾型または非修飾型であり得る連結したヌクレオシドのポリマーを意味する。
「非経口投与」は、注射（例えば、ボーラス注射）または注入による投与を意味する。非経口投与としては、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与または頭蓋内投与、例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内投与が挙げられる。
「医薬組成物」は、対象に投与するために適切な物質の混合物を意味する。例えば、注射による投与に適切な医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはワクチン成分と無菌水溶液とを含み得る。
「対象」は、治療または療法のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
相同性の割合に関しては、２つの配列のペアワイズアラインメントを見ると、２つの配列間の整列された同一の残基（「同一性」）を観察することができる。同一性（又は相同性）の割合は、（ａ）同一性の数と、参照配列の全長との間の商に１００を掛けることによって算出することができる（すなわち、同一性の割合＝（同一性の数×１００）／参照配列の長さ）。
レジメン
本開示は、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）処置のスケジュールとその後のＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）抗原およびＢ型肝炎表面（ＨＢｓ）抗原をコードする少なくとも１種のウイルスベクターを含む異種プライム－ブーストスケジュールとを提供するレジメンであって、強力な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗体応答を誘導するための、アジュバント化組換えＨＢｃおよびＨＢｓタンパク質の順次投与または併用投与を伴うレジメンを包含する。開示されるＡＳＯ処置は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて肝細胞で標的ＨＢＶ ＤＮＡおよびＲＮＡを首尾よく阻害する。開示されるワクチンレジメンは、ヒト慢性ＨＢＶ感染症のウイルス学的および免疫学的特徴を再現するマウスモデルにおいて、肝臓の変化の副作用の関連する兆候無しに、ＨＢｓおよびＨＢｃ特異的抗体およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ならびにＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を回復させる。これらのことを考え合わせると、ＡＳＯおよびワクチンレジメンの組合せは、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に対するロバストな多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導を伴った、ＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｓＡｇセロコンバージョンの低下を含むウイルス学的および臨床的応答を提供する。
より具体的には、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；
ｃ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；および
ｄ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
を含む方法が提供される。
一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、ステップｂ）はステップｃ）に先行し、ステップｃ）はステップｄ）に先行する。場合により、ステップａ）は、繰り返してよい。場合により、ステップｃ）は、繰り返してよい。特定の実施形態において、この方法のステップ間の期間は、２～１２週間、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間である。一実施形態において、この方法のステップ間の期間は、４～８週間である。一実施形態において、この方法に従う組成物の順次投与間の期間は、４週間である。一実施形態において、ステップａ）は、１週間隔もしくは２週間隔で、または３週間毎もしくは４週間毎に２～１２回、例えば、２～１０回、２～８回、２～７回、２～６回、２～５回、例えば、４回、３回または２回実施される。特定の実施形態において、ステップａ）は、１週間隔で２～１０回、１週間隔で２～８回、１週間隔で２～７回、１週間隔で２～６回、１週間隔で２～５回、例えば、１週間隔で４回、１週間隔３回または１週間あけて２回実施される。別の実施形態において、ステップａ）は、毎日繰り返され、その後、毎週繰り返される。例えば、ステップａ）は、毎日、２～４回実施され、その後、１週間隔で２～８回実施され得る。別の実施形態において、ステップａ）は、レジメンの１日目、３日目および５日目に３回繰り返され、その後、レジメンの１２日目に開始して１週間隔で２～８回、２～６回、２～４回、例えば、４回、３回または２回繰り返される。さらなる実施形態において、ステップａ）は、２０～３６日の期間にわたって４～８回、例えば、レジメンの１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目、２６日目および３０日目に、またはレジメンの１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目および２２日目に、またはレジメンの１日目、６日目、１１日目、１６日目、２１日目、２６日目、３１日目および３６日目に実施される。一実施形態において、ステップａ）は、ステップｂ）の前に毎日、交互の日におよび／または１週間隔で実施され、ステップｂ）は、ステップｃ）の前に実施され、ステップｃ）は、ステップｄ）の前に実施される。別の実施形態において、ステップａ）は、ステップｂ）の前に毎日、交互の日におよび／または１週間隔で実施され、ステップｂ）、ステップｃ）および／またはステップｄ）が実施される期間、１週間隔で繰り返される。別の実施形態において、ステップｄ）は、ステップａ）および／またはステップｂ）および／またはステップｃ）と同時に実施される。特定の実施形態において、同時ステップｂ）およびｃ）は、繰り返してよい。特定の実施形態において、同時ステップｃ）およびｄ）は、繰り返してよい。一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）は場合により繰り返され、ステップｃ）に先行し、ステップｃ）はステップｂ）に先行し、およびステップｄ）はステップｂ）の後か、またはステップｂ）および／もしくはステップｃ）と同時に実施される。一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）は、場合により繰り返され、ステップｄ）に先行し、ステップｄ）はステップｂ）に先行し、およびステップｂ）はステップｃ）に先行する。別の実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）は、場合により繰り返され、ステップｄ）に先行し、ステップｄ）はステップｃ）に先行し、およびステップｃ）はステップｂ）に先行する。さらなる実施形態において、ステップｄ）は繰り返され、およびこの方法のステップは、次の順序で実施される：ステップａ）（場合により、繰り返す）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｄ）、ステップｄ）。特定の実施形態において、この方法のステップｂ）、ｃ）およびｄ）間の期間は、２～１２週間、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間である。一実施形態において、この方法のステップｂ）、ｃ）およびｄ）間の期間は、４～８週間である。一実施形態において、この方法のステップｂ）、ｃ）およびｄ）による組成物の順次投与間の期間は、４週間である。特定の実施形態において、この方法は、１年間の期間にわたって実施される。特定の実施形態において、この方法は８～５０週間、例えば、８～４０週間、８～３０週間、８～２０週間、８～１６週間の期間にわたって実施され、例えば、この方法は、８週間、９週間、１０週間、１２週間、１４週間、１６週間にわたって、１０～１６週間、１２～１６週間、１６～２０週間、２０～４０週間または３０～５０週間の期間にわたって実施され得る。
別の態様において、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；および
ｃ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
を含む方法が提供される。
一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、かつ、ステップｂ）はステップｃ）に先行する。場合により、ステップａ）は、繰り返してよい。場合により、ステップｃ）は、繰り返してよい。別の実施形態において、ステップｃ）は、ステップｂ）と同時に実施される。特定の実施形態において、この方法のステップｂ）およびｃ）の間の期間は、２～１２週間、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間である。一実施形態において、この方法のステップｂ）およびｃ）の間の期間は、４～８週間である。一実施形態において、ステップａ）は、１週間隔もしくは２週間隔で、または３週間毎もしくは４週間毎に２～１２回、例えば、２～１０回、２～８回、２～７回、２～６回、２～５回、例えば、４回、３回または２回実施される。特定の実施形態において、ステップａ）は、１週間隔で２～１０回、１週間隔で２～８回、１週間隔で２～７回、１週間隔で２～６回、１週間隔で２～５回、例えば、１週間隔で４回、１週間隔で３回または１週間あけて２回実施される。別の実施形態において、ステップａ）は毎日繰り返され、その後、毎週繰り返される。例えば、ステップａ）は、毎日、２～４回実施され、その後、１週間隔で２～８回実施され得る。別の実施形態において、ステップａ）は、レジメンの１日目、３日目および５日目に３回繰り返され、その後、レジメンの１２日目に開始して１週間隔で２～８回、２～６回、２～４回、例えば、４回、３回または２回繰り返される。さらなる実施形態において、ステップａ）は、２０～３６日間の期間にわたって４～８回、例えば、レジメンの１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目、２６日目および３０日目に、またはレジメンの１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目および２２日目に、またはレジメンの１日目、６日目、１１日目、１６日目、２１日目、２６日目、３１日目および３６日目に実施される。一実施形態において、ステップａ）は、ステップｂ）の前に毎日、交互の日におよび／または１週間隔で実施され、ステップｂ）は、ステップｃ）の前に実施される。別の実施形態において、ステップａ）は、ステップｂ）の前に毎日、交互の日におよび／または１週間隔で実施され、ステップｂ）およびステップｃ）が実施される期間、１週間隔で繰り返される。別の実施形態において、ステップｃ）は、ステップａ）および／またはステップｂ）と同時に実施される。特定の実施形態において、同時ステップｂ）およびｃ）は、繰り返してよい。一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）は、場合により繰り返され、ステップｃ）に先行し、およびステップｃ）はステップｂ）に先行する。特定の実施形態において、この方法は、１年間の期間にわたって実施される。特定の実施形態において、この方法は、８～５０週間、例えば、８～４０週間、８～３０週間、８～２０週間、８～１６週間の期間にわたって実施され、例えば、この方法は、８週間、９週間、１０週間、１２週間、１４週間、１６週間にわたって、１０～１６週間、１２～１６週間、１６～２０週間、２０～４０週間または３０～５０週間の期間にわたって実施され得る。
特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与される組成物は、ＨＢＶ核酸に標的化された連結した１０～３０ヌクレオシド長のオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む。ＨＢＶ標的は、配列番号１６の配列内に含まれる配列を有する。従って、特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、ＨＢＶ核酸の領域を標的とする。特定の実施形態において、ステップａ）で投与される組成物は、配列番号１６のＨＢＶ核酸の標的化領域の等長の核酸塩基と相補的な連続する核酸塩基を有するＨＢＶ ＡＳＯを含む。例えば、ＨＢＶ ＡＳＯの連続する核酸塩基部分は、配列番号１６の領域の等長部分と相補的な連続する少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の核酸塩基であり得る。特定の実施形態において、ステップａ）で投与される組成物は、ＨＢＶ核酸に標的化され、配列番号１６の次のヌクレオチド領域：５８～７３、５８～７４、５８～７７、５９～７４、５９～７５、６０～７５、６０～７６、６１～７６、６１～７７、６２～７７、２５３～２７２、２５３～２６９、２５４～２７０、２５５～２７１、２５６～２７２、４１１～４３７、４１１～４２６、４１１～４２７、４１１～４３０、４１２～４２７、４１２～４２８、４１２～４３１、４１３～４２８、４１３～４２９、４１３～４３２、４１４～４２９、４１４～４３０、４１４～４３３、４１５～４３０、４１５～４３１、４１５～４３４、４１６～４３１、４１６～４３２、４１６～４３５、４１７～４３２、４１７～４３３、４１７～４３６、４１８～４３３、４１８～４３４、４１８～４３７、４５７～４７２、４５７～４７３、４５８～４７３、６７０～７０６、６７０～６８５、６７０～６８６、６７１～６８６、６７１～６８７、６７２～６８７、６７２～６８８、６７３～６８８、６８７～７０２、６８７～７０３、６８７～７０６、６８８～７０３、６８８～７０４、６８９～７０４、６８９～７０５、６９０～７０５、６９０～７０６、６９１～７０６、１２６１～１２８５、１２６１～１２７６、１２６１～１２７７、１２６１～１２８０、１２６２～１２７７、１２６２～１２７８、１２６２～１２８１、１２６３～１２７８、１２６３～１２７９、１２６３～１２８２、１２６４～１２７９、１２６４～１２８０、１２６４～１２８３、１２６５～１２８０、１２６５～１２８１、１２６５～１２８４、１２６６～１２８１、１２６６～１２８２、１２６６～１２８５、１２６７～１２８２、１２６７～１２８３、１２６８～１２８３、１２６８～１２８４、１２６９～１２８４、１２６９～１２８５、１２７０～１２８５、１５７７～１６０６、１５７７～１５９２、１５７７～１５９３、１５７７～１５９６、１５７８～１５９３、１５７８～１５９４、１５７８～１５９７、１５７９～１５９４、１５７９～１５９４、１５７９～１５９８、１５８０～１５９５、１５８０～１５９６、１５８０～１５９９、１５８１～１５９６、１５８１～１５９７、１５８１～１６００、１５８２～１５９７、１５８２～１５９８、１５８２～１６０１、１５８３～１５９８、１５８３～１５９９、１５８３～１６０２、１５８４～１５９９、１５８４～１６００、１５８４～１６０３、１５８５～１６００、１５８５～１６０１、１５８５～１６０４、１５８６～１６０１、１５８６～１６０２、１５８６～１６０５、１５８７～１６０２、１５８７～１６０３、１５８７～１６０６、１５８８～１６０３、１５８８～１６０４、１５８９～１６０４、１５８９～１６０５、１５９０～１６０５、１５９０～１６０６、１５９１～１６０６、１７７８～１８００、１７７８～１７９３、１７７８～１７９４、１７７８～１７９７、１７７９～１７９４、１７７９～１７９５、１７７９～１７９８、１７８０～１７９５、１７８０～１７９６、１７８０～１７９９、１７８１～１７９６、１７８１～１７９７、１７８１～１８００、１７８２～１７９７、１７８２～１７９８、１７８３～１７９８、１７８３～１７９９、１７８４～１７９９，および１７８４～１８００のうちの１つのヌクレオチド領域内に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、ステップａ）で投与される組成物は、連続する核酸塩基部分が配列番号１６のＨＢＶ核酸の領域の等長部分と相補的な１６、１７、１８、１９または２０個の連続する核酸塩基であるＨＢＶ ＡＳＯを含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６の次のヌクレオチド領域：５８～７７、２５３～２７２、４１１～４３０、４１２～４３１、４１３～４３２、４１４～４３３、４１５～４３４、４１６～４３５、４１７～４３６、４１８～４３７、６８７～７０６、１２６１～１２８０、１２６２～１２８１、１２６３～１２８２、１２６４～１２８３、１２６５～１２８４、１２６６～１２８５、１５７７～１５９６、１５７８～１５９７、１５７９～１５９８、１５８０～１５９９、１５８１～１６００、１５８２～１６０１、１５８３～１６０２、１５８４～１６０３、１５８５～１６０４、１５８６～１６０５、１５８７～１６０６、１７７８～１７９７、１７７９～１７９８、１７８０～１７９９および１７８１～１８００またはその一部のうち１つと相補的な連続する１６～２０個の核酸塩基を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６の次のヌクレオチド領域：５８～７７、２５３～２７２、４１１～４３０、４１２～４３１、４１３～４３２、４１４～４３３、４１５～４３４、４１６～４３５、４１７～４３６、４１８～４３７、６８７～７０６、１２６１～１２８０、１２６２～１２８１、１２６３～１２８２、１２６４～１２８３、１２６５～１２８４、１２６６～１２８５、１５７７～１５９６、１５７８～１５９７、１５７９～１５９８、１５８０～１５９９、１５８１～１６００、１５８２～１６０１、１５８３～１６０２、１５８４～１６０３、１５８５～１６０４、１５８６～１６０５、１５８７～１６０６、１７７８～１７９７、１７７９～１７９８、１７８０～１７９９および１７８１～１８００のうち１つと相補的な連続する２０個の核酸塩基を有する。
特定の実施形態において、ステップａ）で投与される組成物は、ＨＢＶ核酸に標的化された、配列番号１６の次のヌクレオチド領域：１５８３～１６０２内で相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６の次のヌクレオチド領域：１５８３～１６０２内で相補的な連続する１６～２０個の核酸塩基を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６の次のヌクレオチド領域：１５８３～１６０２に対して相補的な連続する２０個の核酸塩基を有する。
特定の実施形態において、ステップａ）で投与される組成物は、ＷＯ２０１２／１４５６９７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３４５５０、２０１２年４月２０日出願）の配列番号８３～３１０から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）は、ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２４～２２７から選択されるヌクレオチド配列、またはＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２４～２２７から選択される配列と８５～９５％の同一性を有する配列を有する。特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。
特定の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、ＣｈＡｄ１５７、Ｐａｎ ５、Ｐａｎ ６、Ｐａｎ ７（Ｃ７とも呼ばれる）およびＰａｎ ９、特に、ＣｈＡｄ６３またはＣｈＡｄ１５５からなる群から選択されるＣｈＡｄベクターを含む。特定の実施形態において、ＣｈＡｄベクターは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）をコードする。特定の実施形態において、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）は、ｈＩｉ（例えば、配列番号７またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列または配列番号１２、またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）に融合されている。例えば、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１）がｈＩｉ（例えば、配列番号７）に融合されているか、またはＨＢｃ（例えば、配列番号１１）がｈＩｉ（例えば、配列番号１２）に融合されている。特定の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、ｈＩｉ、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１３に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、配列番号９のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄベクターを含む。特定の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列または配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄベクターを含む。特定の一実施形態において、このベクターはＣｈＡｄ１５５ベクターである。よって、特定の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。他の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。他の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。
一実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードする。特定の実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）をコードする。一実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。
一実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物は、組換えＨＢｃおよび組換えＨＢｓを１：１比で含む。別の実施形態において、組成物中のＨＢｓに対するＨＢｃの比は１より大きく、例えば、ＨＢｓに対するＨＢｃの比は、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１またはそれ以上、特に、３：１～５：１、例えば、３：１、４：１または５：１、特に、４：１の比であり得る。特定の実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物は、組換えＨＢｃおよび組換えＨＢｓを４：１またはそれを超える比で含む。特定の実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物は、全長組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）、Ｃ末端で切断された組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）およびアジュバントを含む。特定の実施形態において、末端切断型組換えＨＢｃは、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）を含む。一実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物は、全長組換えＨＢｓ、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９ならびにＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントを含む。例えば、この方法のステップｄ）において投与される組成物は、全長組換えＨＢｓ（配列番号１）、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（配列番号２）ならびにＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。
さらなる実施形態において、ヒトにおいてＣＨＢおよび／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；
ｃ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；
ｄ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ；および
ｅ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
を含む方法が提供される。
特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。
本発明の別の態様において、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ；ならびに
ｃ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物、および組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ
を含む方法が提供される。
特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。
本発明のこの態様の一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、かつ、ステップｂ）はステップｃ）に先行する。場合により、ステップａ）は、繰り返してよい。場合により、ステップｂ）は、繰り返してよい。場合により、ステップｃ）は、繰り返してよい。一実施形態において、これらの方法ステップは、ステップａ）、その後、ステップａ）、その後、ステップｂ）、その後、ステップｃ）の順序で実施される。別の実施形態において、これらの方法ステップは、ステップａ）、その後、ステップｂ）、その後、ステップｃ）、その後、ステップｃ）の順序で実施される。一実施形態において、これらの方法ステップは、ステップａ）、その後、ステップｂ）、その後、ステップｂ）、その後、ステップｃ）の順序で実施される。場合により、ステップａ）は、２回以上繰り返されてよい。場合により、ステップａ）およびステップｃ）の両方を繰り返してよい。本発明のこの態様の一実施形態において、これらの方法ステップは、ステップａ）、その後、ステップａ）、その後、ステップｂ）、その後、ステップｃ）、その後、ステップｃ）の順序で実施される。別の実施形態において、これらの方法ステップは、ステップｂ）、その後、ステップａ）、その後、ステップｂ）、その後、ステップｂ）の順序で実施される。さらなる実施形態において、これらの方法ステップは、２～８回繰り返されるステップａ）、その後、ステップｂ）、その後、ステップｃ）、その後、ステップｃ）、場合により、その後、ステップｃ）の順序で実施される。特定の実施形態において、この方法のステップ間の期間は、２～１２週間、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間である。一実施形態において、この方法のステップ間の期間は４～８週間である。一実施形態において、この方法に従う組成物の順次投与間の期間は４週間である。
よって、本発明のこの態様の別の実施形態では、ヒトにおいてＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ；
ｃ）前記ヒトに、ｉ）ＨＢｓ抗原をコードするポリヌクレオチドと、ＨＢｃ抗原をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＨＢｓタンパク質抗原と、組換えＨＢｃタンパク質抗原と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ；
ｄ）前記ヒトに、ｉ）ＨＢｓ抗原をコードするポリヌクレオチドと、ＨＢｃ抗原をコードする核酸とを含むＭＶＡベクターを含む組成物、および、ｉｉ）組換えＨＢｓタンパク質抗原と、組換えＨＢｃタンパク質抗原と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ；および
ｅ）前記ヒトに、ｉ）ＨＢｓ抗原をコードするポリヌクレオチドと、ＨＢｃ抗原をコードする核酸とを含むＭＶＡベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＨＢｓタンパク質抗原と、組換えＨＢｃタンパク質抗原と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ
を含む方法が提供される。
特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、この方法のステップａ）において投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。
特定の実施形態において、ステップａ）は、繰り返してよい。特定の実施形態において、ステップａ）は、毎日または１週間隔で２～１２回繰り返される。特定の実施形態において、この方法のステップｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）間の期間は、２～１２週間、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間である。一実施形態において、この方法のステップｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）間の期間は、４～８週間である。一実施形態において、この方法に従う組成物の順次投与間の期間は４週間である。一実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物ｉ）は、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、ＣｈＡｄ１５７、Ｐａｎ ５、Ｐａｎ ６、Ｐａｎ ７（Ｃ７とも呼ばれる）およびＰａｎ ９、特に、ＣｈＡｄ６３またはＣｈＡｄ１５５からなる群から選択されるＣｈＡｄベクターを含む。特定の実施形態において、ＣｈＡｄベクターは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードする。特定の実施形態において、ＨＢｃは、ｈＩｉに融合される。特定の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物ｉ）は、ｈＩｉ、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１３に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）をコードする。特定の実施形態において、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）は、ｈＩｉ（例えば、配列番号７またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列または配列番号１２またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）に融合される。例えば、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１）がｈＩｉに融合されるか（例えば、配列番号７）、またはＨＢｃ（例えば、配列番号１１）がｈＩｉに融合される（例えば、配列番号１２）。一実施形態において、この方法のステップｂ）において投与される組成物ｉ）は、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。特定の実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｃ末端で切断された組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）およびアジュバントを含む。特定の実施形態において、末端切断型組換えＨＢｃは、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９を含む。一実施形態において、この方法のステップｂ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）ならびにＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。
一実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物ｉ）は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）をコードする。特定の実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物ｉ）は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｃ末端で切断された組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）およびアジュバントを含む。特定の実施形態において、末端切断型組換えＨＢｃは、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９を含む。一実施形態において、この方法のステップｃ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）ならびにＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。
一実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物ｉ）は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）をコードする。特定の実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物ｉ）は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｃ末端で切断された組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）およびアジュバントを含む。特定の実施形態において、末端切断型組換えＨＢｃは、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９を含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。一実施形態において、この方法のステップｄ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）ならびにＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントを含む。
一実施形態において、この方法のステップｅ）で投与される組成物ｉ）は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）をコードする。特定の実施形態において、この方法のステップｅ）で投与される組成物ｉ）は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクター含む。一実施形態において、この方法のステップｅ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、この方法のステップｅ）で投与される組成物ｉ）は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、この方法のステップｅ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｃ末端で切断された組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）およびアジュバントを含む。特定の実施形態において、末端切断型組換えＨＢｃは、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９を含む。一実施形態において、この方法のステップｅ）で投与される組成物ｉｉ）は、全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）ならびにＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。
本発明はまた、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを有するヒトにおいて細胞性免疫応答および体液性免疫応答、特に、ＣＤ４＋応答およびＣＤ８＋応答および抗体応答を誘導する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；
ｃ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；および
ｄ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
を含む方法も提供する。
一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、ステップｂ）はステップｃ）に先行し、かつ、ステップｃ）はステップｄ）に先行する。場合により、ステップａ）は、繰り返してよい。場合により、ステップｄ）は、繰り返してよい。別の実施形態において、ステップｄ）は、ステップｂ）および／またはステップｃ）と同時に実施される。さらなる実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを有するヒトにおいて細胞性免疫応答および体液性免疫応答、特に、ＣＤ４＋応答およびＣＤ８＋応答および抗体応答を誘導する方法は、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ；ならびに
ｃ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物、および、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ
を含む。
一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、ステップｂ）はステップｃ）に先行する。場合により、ステップｃ）は、繰り返してよい。
本発明はまた、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを有するヒトにおいて血清ＨＢｓＡｇレベルおよび／または血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルを低減する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；
ｃ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；および
ｄ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
を含む方法も提供される。
一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、ステップｂ）はｃ）に先行し、かつ、ステップｃ）はｄ）に先行する。場合により、ステップａ）は、繰り返してよい。場合により、ステップｄ）は、繰り返してよい。別の実施形態において、ステップｄ）は、ステップｂ）および／またはステップｃ）と同時に実施される。
さらなる実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを有するヒトにおいて血清ＨＢｓＡｇレベルおよび／または血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルを低減する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
ｂ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ；ならびに
ｃ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ
を含む。
一実施形態において、この方法のステップは順次実施され、ステップａ）はステップｂ）に先行し、かつ、ステップｂ）はステップｂ）に先行する。場合により、ステップａ）は、繰り返してよい。場合により、ステップｃ）は、繰り返してよい。さらなる実施形態において、血清ＨＢｓＡｇレベルは、定量的イムノアッセイで決定した場合に検出不能なレベルに低減される。別の実施形態において、血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、Ｃｏｂａｓ（登録商標）ＨＢＶアッセイまたは等価なもので決定した場合に検出不能なレベルに低減される。別の実施形態において、血清ＨＢｓＡｇレベルおよび／または血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、検出不能なレベルに低減され、少なくとも６か月間、検出不能なレベルで維持される。別の実施形態において、血清ＨＢｓＡｇレベルおよび／または血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、検出不能なレベルに低減され、検出不能なレベルで維持され、ＡＬＴレベルは、少なくとも６か月間、正常範囲に維持される。
抗原
ＨＢＶの少なくとも９個の遺伝子型（ＡからＩ）が同定されており、それらのゲノムは８％を超えて異なっている。所与のＨＢＶ遺伝子型内で、４～８％異なる複数の遺伝子亜型が同定されている。開示される方法において使用するための抗原は、複数の、好ましくはすべてのＨＢＶ遺伝子型にわたる免疫学的適用範囲を提供するように適切に選択される。Ｂ型肝炎コアタンパク質抗原（ＨＢｃ）は、遺伝子型および遺伝子亜型にわたって高度に保存されており、Ｂ型肝炎表面タンパク質抗原（ＨＢｓ）配列は、広範な中和応答の誘導を可能にする重要な交差遺伝子型保存(cross-genotype-preserved)Ｂ細胞エピトープを含むように適切に選択される。適切には、開示される方法および組成物において使用するためのＨＢｃおよびＨＢｓの配列は、遺伝子型／亜型Ａ２由来のものに基づく。
適切には、開示される方法および組成物において使用するためのＨＢｓ抗原は、スモール、ミドルまたはラージ表面抗原タンパク質から導出される。特に、適切なＨＢｓ抗原は、ＨＢＶ ａｄｗ２株、遺伝子型Ａのスモール（Ｓ）タンパク質を含む。例えば、適切なＨＢｓ抗原は、配列番号１のアミノ酸配列の２２６アミノ酸を有する。組換えタンパク質として使用する場合、ＨＢｓ抗原は、好ましくは、ウイルス様粒子に会合する。この抗原は、よく研究された市販のＢ型肝炎予防ワクチン（エンジェリックスＢ(Engerix B)、フェンドリックス(Fendrix)、ツインリックス(Twinrix)およびその他）に含まれ、遺伝子型にわたってＢ型肝炎に対する防御作用があることが実証されている。好ましくは、組換えＨＢｓタンパク質抗原は、酵母から発現され、本発明のワクチン組成物および方法において使用するために精製される。発現および精製のための適切な方法は、例えばＥＰ１３０７４７３Ｂ１から公知である。
Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）は、ウイルスゲノムをパッケージングするヌクレオカプシドシェルの主要な成分である。このタンパク質（１８３～１８５アミノ酸長）は、感染細胞の細胞質で発現され、グリコシル化されないままである。ＨＢｃは、１４９残基のアセンブリドメインおよび３４～３６残基のＲＮＡ結合ドメイン（Ｃ末端における）を含む。開示される方法および組成物において使用するためのＨＢｃ抗原は、全長であっても、またはＣ末端切断型タンパク質（ＲＮＡ結合Ｃ末端を欠く）、例えば、野生型コア抗原タンパク質のアセンブリドメインの１４５～１４９アミノ酸、例えば、野生型Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質のアミノ酸１～１４５、１～１４６、１～１４７、１～１４８またはアミノ酸１～１４９を含んでもよい。切断型タンパク質は、ヌクレオカプシド粒子に会合する能力を保持する。開示される方法および組成物において使用するのに適したＨＢｃ抗原は、ＨＢＶ ａｄｗ２株、遺伝子型Ａ由来のアミノ酸配列を有する。組換えタンパク質として使用される場合、ＨＢｃ抗原は、Ｃ末端で野生型から適切に切断され、特に、抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有してもよい。好ましくは、組換えＨＢｃタンパク質抗原は、大腸菌(E. coli)から発現され、本発明のワクチン組成物および方法において使用するために精製される。大腸菌におけるウイルスタンパク質の組換え発現の方法は、当技術分野で周知である。
組換えタンパク質として使用する場合、ＨＢｃ抗原は、好ましくは、ウイルス様粒子に会合する。ウイルスベクターから発現される場合、ＨＢｃ抗原は、全長または切断型であってよく、例えば、適切には全長ＨＢｃ抗原（例えば、配列番号１１）である。本明細書に開示される方法において使用するための組換えＨＢｓ抗原の適切な用量は、投与あたり１０μｇ～投与あたり１００μｇ、例えば、投与あたり１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇまたは１００μｇである。本明細書に開示される方法において使用するための組換えＨＢｃ抗原の適切な用量は、投与あたり１０μｇ～投与あたり１００μｇ、例えば、投与あたり１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇまたは１００μｇである。
抗原は、体内で免疫応答、とりわけ抗体の産生を誘導する物質である。抗原は、外来性、すなわち、病原性起源であっても、または生物自体に由来してもよく、後者は自己抗原(self- or auto antigen)と呼ばれる。抗原は、ＭＨＣ分子によって抗原提示細胞の表面上に提示され得る。ＭＨＣ分子には２つのクラス、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）およびＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）がある。ＭＨＣ－ＩＩ分子は、小胞体で合成され、ＭＨＣクラスＩＩコンパートメントにおいて小胞体を離れる膜結合受容体である。内因性ペプチド、すなわち自己抗原が、ＭＨＣ－ＩＩ分子に結合し、提示されて免疫応答を生じるのを防ぐために、新生ＭＨＣ－ＩＩ分子は、ＭＨＣ－ＩＩ分子のペプチド結合溝をブロックする別のタンパク質であるインバリアント鎖と結合する。ヒトインバリアント鎖（ｈＩｉ、細胞膜上で発現される場合はＣＤ７４としても知られる）は、細胞内および免疫系全体でいくつかの役割を有する進化的に保存されたタイプＩＩ膜タンパク質である[Borghese, 2011]。ＭＨＣクラスＩＩコンパートメントが、貪食されて分解された外来タンパク質を含有する後期エンドソームに融合すると、インバリアント鎖は切断されて、ＭＨＣ－ＩＩ分子に結合したＣＬＩＰ領域のみが残る。第２のステップにおいて、ＣＬＩＰは、ＨＬＡ－ＤＭ分子によって除去され、ＭＨＣ－ＩＩ分子が外来タンパク質の断片に自由に結合できるようになる。ＭＨＣクラスＩＩコンパートメントが細胞膜と融合すると、この断片は、抗原提示細胞の表面上に提示され、従って、その他の細胞、主にＴヘルパー細胞に外来抗原を提示する。
インバリアント鎖および抗原の融合物をコードするアデノウイルス発現系が、ワクチン接種に使用される場合、抗原に対する免疫応答が増加することが知られており（ＷＯ２００７／０６２６５６（ＵＳ２０１１／０２９３７０４としても公開され、インバリアント鎖配列を開示する目的で参照により組み込まれる）を参照）、すなわち、インバリアント鎖は、抗原の免疫原性を増強し、ｈＩｉなどのインバリアント鎖は、時には、この効果の認識において「遺伝的アジュバント」と呼ばれる。さらに、アデノウイルス構築物は、プライム－ブーストワクチン接種レジメンの関係において免疫応答をプライミングするのに有用であることが判明している（ＷＯ２０１４／１４１１７６（ＵＳ２０１６／００００９０４としても公開される）；およびＷＯ２０１０／０５７５０１（ＵＳ２０１０／０２７８９０４としても公開され、インバリアント鎖配列およびインバリアント鎖配列をコードするアデノウイルスベクターを開示する目的で参照により組み込まれる）を参照）。特に、ｈＩｉ配列およびｈＩｉは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増加させる可能性を有する[Spencer, 2014; Capone, 2014]。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法、使用および組成物において使用するためのベクター内に含まれるヌクレオチド配列は、ｈＩｉをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。開示されるアデノウイルスベクターＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶに含まれ得るｈＩｉについてのアミノ酸配列は、配列番号７に示され、代替配列は、配列番号１２に示される。これらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８および配列番号１３に示される。適切には、ｈＩｉポリペプチドがＨＢｃ抗原にＮ末端で融合している融合タンパク質を生成するように、ｈＩｉをコードするヌクレオチド配列は、ＨＢｃ抗原をコードするヌクレオチド配列に融合している。
ベクター
抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド（本明細書では「インサート」とも呼ばれる）に加えて、本明細書に開示される方法および組成物において使用するためのベクターはまた、ベクターによりトランスフェクトされた細胞における転写、翻訳および／または発現を可能にするように、コード化ポリヌクレオチドに作動可能に連結される従来の制御エレメントを含んでもよい。従って、タンパク質抗原をコードするベクターインサートポリヌクレオチドは、適切な制御エレメントを有する発現カセットに組み込まれる。
発現制御エレメントは、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、例えば、ウサギβ－グロビンポリＡ；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および、所望の場合、コードされる生成物の分泌を増強する配列を含む。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、細菌、酵母、植物、ウイルスおよび哺乳動物（ヒトを含む）由来のプロモーターが挙げられる。多数の発現制御配列、例えば、内在的、天然、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターは当技術分野で公知であり、利用してもよい。
構成的プロモーターの例としては、ＴＢＧプロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを有し、例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照）、ＣＡＳＩプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１ａプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。適切には、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはそのバリアント、より適切にはヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）プロモーターまたはそのバリアントである。
アデノウイルスベクター
アデノウイルスは、様々な標的組織で非常に効率的な遺伝子導入を達成するその能力、およびその大きな導入遺伝子収容力に起因して、遺伝子導入用途に広く使用されている。通常、アデノウイルスのＥ１遺伝子は、欠失され、選択したプロモーター、目的の遺伝子のｃＤＮＡ配列、およびポリＡシグナルからなる導入遺伝子カセットで置き換えられ、複製欠損組換えウイルスをもたらす。ヒトアデノウイルスベクターは、動物モデルおよびヒトにおいて、導入遺伝子に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導のための強力なベクターであることが示されている。アデノウイルスは、広い指向性(tropism)を有し、複製細胞および非複製細胞に感染する能力を有する。ヒトアデノウイルスに基づくベクターの臨床適用の主な制限は、一般集団における中和抗体の高い保有率である。代替種から単離されたアデノウイルスは、ヒトにおける既存の抗アデノウイルス免疫の問題を回避するための潜在的なワクチンベクターと考えられている。それらの中で、チンパンジー、ゴリラまたはボノボから導出されるサルアデノウイルスは、抗原の送達、およびヒトにおけるそれらの抗原に対する標的化Ｔ細胞および／または液性応答の誘発に使用するのに適している可能性がある。サルアデノウイルス、例えば、チンパンジーから導出されるサルアデノウイルスは、臨床研究において試験されている。チンパンジーアデノウイルスベクターのヒト集団における血清学的保有率は、低い／全くない。チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒトにおいて病理学的疾患を引き起こすことが知られておらず、一部のＣｈＡｄベクターは、臨床グレード材料の生成に以前使用された細胞株、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）において高力価まで増殖させることができる。
複製不能または複製欠損アデノウイルスは、少なくとも機能的欠失（または「機能喪失」変異）、すなわち、遺伝子を完全に除去することなく遺伝子の機能を損なう欠失または変異、例えば、人為的停止コドンの導入、活性部位または相互作用ドメインの欠失または変異、遺伝子の調節配列の変異または欠失など、あるいはウイルス複製に必須である遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３およびＥ４から選択されるアデノウイルス遺伝子の１以上（例えば、Ｅ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８、Ｅ３ ＯＲＦ９、Ｅ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２および／またはＥ４ ＯＲＦ１））の完全な除去を含むように遺伝子操作されているため、複製することができないアデノウイルスである。適切には、Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠失される。より適切には、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４遺伝子が欠失される。
本明細書に開示される方法および組成物において使用するのに適したベクターは、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクター、例えば、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、ＣｈＡｄ１５７、Ｐａｎ ５、Ｐａｎ ６、Ｐａｎ ７（Ｃ７とも呼ばれる）またはＰａｎ ９である。そのような株の例は、ＷＯ０３／０００２８３、ＷＯ２００５／０７１０９３、ＷＯ２０１０／０８６１８９およびＷＯ２０１６／１９８６２１に記載されている。ＣｈＡｄ１５５ベクター（ＷＯ２０１６／１９８６２１（ＣｈＡｄ１５５ベクター配列および方法を開示する目的で参照により組み込まれる）を参照）は、ＣｈＡｄ３ベクターと同じ系統発生アデノウイルス群（群Ｃ）に属する。一実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物において使用するためのベクターは、系統発生群ＣのＣｈＡｄベクター、例えば、ＣｈＡｄ３またはＣｈＡｄ１５５である。特定の一実施形態において、本明細書に開示される慢性Ｂ型肝炎を治療する方法は、ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む組成物を投与するステップを含む。本明細書に開示される方法において使用するためのＣｈＡｄベクターの適切な用量は、投与あたり１×１０８～１×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）、例えば、投与あたり約１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０または１×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）である。
より具体的には、一実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物において使用するためのベクターは、２種のＨＢＶタンパク質：ＨＢｃ（コア、ヌクレオカプシドタンパク質）およびＨＢｓ（スモール表面抗原）から導出される配列の融合物をコードする複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターＣｈＡｄ１５５である。ある特定の実施形態において、ベクターは、ＨＢｃおよびＨＢｓを別個のタンパク質にプロセシングするための、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の２Ａ切断領域[Donnelly et al. 2001]をコードする配列を組み込んだスペーサーである配列番号３（上流タンパク質のＣ末端における２３アミノ酸尾部および下流タンパク質のＮ末端における単一プロリンをもたらす）によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするＣｈＡｄ１５５である。表面抗原からのコアの切断により、ＨＢｓの適切なフォールディングが可能になり、表面抗原に対する抗体応答の生成が可能になる。あるいは、アデノウイルスベクターは、ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原の独立した発現を可能にするデュアルプロモーター（バイシストロニック）ベクターであってもよい。
特定の実施形態において、ＨＢｃタンパク質をコードする遺伝子のＮ末端部分は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合インバリアント鎖ｐ３５アイソフォーム（すなわち、ｈＩｉまたはＣＤ７４）をコードする遺伝子に融合されていてもよい。従って、本明細書に開示される方法および組成物において使用するための特定のＣｈＡｄ１５５ベクターは、ｈＩｉ、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓを含む、図１３に示される構造を有する構築物をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含む。そのような構築物のアミノ酸配列は、配列番号９に示され、構築物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０に示される。代替のそのような構築物のアミノ酸配列は、配列番号１５に示され、構築物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４に示される。
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、ヒトおよびその他の哺乳動物において複製欠損であり、ワクシニアウイルスから導出される。これはポックスウイルス科に属し、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中でのワクシニアウイルスの５７０回を超える継代（これは複数の欠失をもたらし、その後、ウイルスは高度に弱毒化され、ヒトおよびその他の哺乳動物において複製欠損であった）によって天然痘ワクチン接種の安全性を改善するために最初に開発された。複製欠損は、ウイルスおよび組換え遺伝子発現が損なわれないようにビリオンアセンブリの後期に生じ、ＭＶＡを、哺乳動物に感染を引き起こすことができない効率的な単一ラウンド発現ベクターにする。ＭＶＡは、その後、動物モデルおよびヒトの両方において、導入遺伝子に対する抗原特異的免疫を誘導するウイルスベクターとして広く使用されている。ＭＶＡの記載は、Mayr A, et.al. (1978)およびMayr, A., et.al. (1975)に見出すことができる。
一実施形態において、ＭＶＡは、ＣＥＦ細胞上のワクシニアウイルスの５７１回目の継代から得られたウイルスシードバッチ４６０ ＭＧから導出される。別の実施形態において、ＭＶＡは、ウイルスシードバッチＭＶＡ ４７６ ＭＧ／１４／７８から導出される。さらなる実施形態において、ＭＶＡは、１９７８年１２月３１日より前に導出または作製され、プリオン汚染がない。本明細書に開示される方法において使用するためのＭＶＡベクターの適切な用量は、投与あたり１×１０６～１×１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）、例えば、投与あたり約１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８または１×１０９ｐｆｕである。
特定の一実施形態において、本明細書に開示される慢性Ｂ型肝炎を治療する方法は、ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含むＭＶＡベクターを含む組成物を投与するステップを含む。
より具体的には、一実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物において使用するためのベクターは、２種のＨＢＶタンパク質：ＨＢｃ（コアヌクレオカプシドタンパク質）およびＨＢｓ（スモール表面抗原）から導出される配列の融合物をコードするＭＶＡである。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物において使用するためのベクターは、ＨＢｃおよびＨＢｓを別個のタンパク質にプロセシングするための、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列を組み込んだスペーサーである配列番号３（上流タンパク質のＣ末端における２３アミノ酸尾部および下流タンパク質のＮ末端における単一プロリンをもたらす）によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするＭＶＡである。従って、本明細書に開示される方法および組成物において使用するための特定のＭＶＡベクターは、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓを含む、図１２に示される構造を有する構築物をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含む。そのような構築物のアミノ酸配列は、配列番号５に示され、アミノ酸インサート構築物をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６に示される。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
細胞がＤＮＡによってコードされたタンパク質を発現するためには、そのＤＮＡの一方の鎖がＲＮＡの相補鎖の合成のための鋳型として働く。鋳型ＤＮＡ鎖は転写鎖と呼ばれ、その配列は、元の二本鎖ＤＮＡのセンス配列と同じ配列を有するｍＲＮＡ転写産物に対してアンチセンス、または相補的である。ＤＮＡは二本鎖であるので、アンチセンス配列と相補的な鎖は、非転写鎖、またはセンス鎖と呼ばれ、ｍＲＮＡ転写産物と同じ配列を有する（ただし、ＤＮＡ配列の核酸塩基Ｔは、ＲＮＡ配列では核酸塩基Ｕに置換されている）。
ＤＮＡから転写されたＲＮＡと相補的な核酸は、その塩基配列が遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、すなわち、「センス」配列と相補的であるので、「アンチセンス」オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）と呼ばれる。従って、５’－ＡＡＧＧＴＣ－３”のセンス配列を有するコードＤＮＡ領域は、転写されると５’－ＡＡＧＧＵＣ－３’のセンス配列を有するｍＲＮＡを生成し、従って、このセンス配列に対するアンチセンスオリゴマーは、ＲＮＡ核酸塩基を含む場合には３’－ＵＵＣＣＡＧ－５’、またはアンチセンスオリゴマーがＤＮＡ核酸塩基を含む場合には３’－ＴＴＣＣＡＧ－５’の配列を有する。
現在、アンチセンス療法の主要な焦点は、標的化タンパク質の発現または翻訳を担う特定の「センス」（５’から３’方向）ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列と相補的となるように合成されるおよそ２０ヌクレオチド／ヌクレオシド長のオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドの使用を含む。
細胞に導入されると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン－クリック結合によってその対応するｍＲＮＡ配列とハイブリダイズしてヘテロ二重鎖を形成する。二重鎖が形成されると、結合したｍＲＮＡの配列によりコードされるタンパク質の翻訳が阻害される。従って、アンチセンス療法は、ＲＮＡ転写産物を抗原に直接ターゲティングし、それにより、血清ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇレベルを低減することができる。ＨＢＶ感染時に生産される複数のオーバーラップする転写産物のために、単一のアンチセンスオリゴマーが２種以上のＨＢＶ抗原のＨＢＶ ＤＮＡを低減する機会もある。
オリゴヌクレオチド／ｍＲＮＡ二重鎖がその後の翻訳を妨げ得るいくつかの機構が提案されている。最も広く受け入れられている説明は、遍在性の酵素ＲＮアーゼＨによるヘテロ二重鎖のｍＲＮＡの分解を含む。ＲＮアーゼＨはヘテロ二重鎖に誘引され、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列をそのまま残しつつ結合したｍＲＮＡを切断し、ＡＳＯが対応するｍＲＮＡ配列の探索と結合を続けることを可能とする。ＲＮアーゼＨ活性と別にまたは一緒に生じ得る、アンチセンス療法による翻訳阻害のいくつかの他の受け入れられている説明としては、限定されるものではないが、リボゾーム複合体の翻訳能を損なう適当なリボソームアセンブリの遮断、ＲＮＡスプライシングの遮断、および／またはｍＲＮＡの適当な輸送の妨げが挙げられる。
アンチセンス療法の分野において、化学的に修飾されたヌクレオシドの核酸分子、特にＲＮＡへの導入は、外因性ＲＮＡに固有のｉｎ ｖｉｖｏ安定性およびバイオアベイラビリティの潜在的制限を克服する上で有力なツールを提供する。例えば、化学的に修飾された核酸分子は血清中でより長い半減期を有する傾向にあるので、化学的に修飾された核酸分子の使用は、治療効果に対して特定の核酸分子の低用量化を可能とする。さらに、ある種の化学修飾は、特定の細胞もしくは組織の標的化および／または核酸分子の細胞取り込みの改善によって核酸分子のバイオアベイラビリティを改善することができる。従って、化学的に修飾された核酸分子の活性が、天然の核酸分子に比べて、例えば、全ＲＮＡ核酸分子と比較した場合に、低下するとしても、修飾核酸分子の全活性は、分子の改善された安定性および／または送達のために天然分子よりも大きくなり得る。
ロックド核酸（ＬＮＡ：locked nucleic acid）と呼ばれる１つの有用な化学修飾は、１以上のＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオシド部分において、２’Ｏ－４’Ｃ－アルキレン架橋を導入し、このアルキレン架橋は、Ｃ１－６アルキレン架橋、より詳しくは、２’Ｏ－４’Ｃ－メチレン架橋である。ＬＮＡがアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴマーに導入される場合、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子の安定性を大幅に高めること、よって、宿主細胞によって取り込まれた際のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡのバイオアベイラビリティを大幅に高めることが示されている。アンチセンスオリゴマーの安定性およびバイオアベイラビリティを高めるためにアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴマーに導入することができるその他の有用な化学修飾としては、ホスホロチオエート結合、またはホスホトリエステル結合、個々のＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド間の天然ホスホジエステル結合の置換が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の方法、レジメンおよび免疫組合せにおいて使用するための、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物は、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＨＢＶ ＡＳＯを含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホトリエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホトリエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾糖は、２’－Ｏ－メトキシエチル基（２’－Ｏ（ＣＨ２）２－ＯＣＨ３）を含む。特定の実施形態において、修飾糖は、２’－Ｏ－ＣＨ３基を含む。
特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾糖は、二環式糖である。特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾糖である二環式糖は、４’－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－２’架橋を含み、ｎは１または２である。特定の実施形態において、二環式糖は、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む。特定の実施形態において、二環式糖は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ）連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）連結したヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；およびｃ）連結したヌクレオシドからなる３’ウイングセグメントを含む。ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連結した１５～３０個のヌクレオシド、例えば、連結した１５、１６、１７、２０、２５または３０個のヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは連結した７～１５個のデオキシヌクレオシド、例えば、連結した７、８、９、１０、１２または１５個のデオキシヌクレオシドからなり、５’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、３’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含み、少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、少なくとも１つのシトシンが５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連結した１５～３０個のヌクレオシド、例えば、連結した１５、１６、１７、２０、２５または３０個のヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは連結した７～１５個のデオキシヌクレオシド、例えば、連結した７、８、９、１０、１２または１５個のデオキシヌクレオシドからなり、５’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、３’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、各ウイングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含み、少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシンは５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連結した１５～３０個のヌクレオシド、例えば、連結した１５、１６、１７、２０、２５または３０個のヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは連結した７～１５個のデオキシヌクレオシド、例えば、連結した７、８、９、１０、１２または１５個のデオキシヌクレオシドからなり、５’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、３’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、各ウイングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、少なくとも１つのシトシンが５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは連結した１５～３０個のヌクレオシド、例えば、連結した１５、１６、１７、２０、２５または３０個のヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは連結した７～１５個のデオキシヌクレオシド、例えば、連結した７、８、９、１０、１２または１５個のデオキシヌクレオシドからなり、５’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、３’ウイングセグメントは連結した３～８個のヌクレオシド、例えば、連結した３、５、７または８個のヌクレオシドからなり、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシンは５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは連結した２０個のヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなり、５’ウイングセグメントは連結した５個のヌクレオシドからなり、３’ウイングセグメントは連結した５個のヌクレオシドからなり、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシンは５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上の部分またはコンジュゲートに共有結合されてよい。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール部分、脂質部分および糖鎖が挙げられる。特定の実施形態において、コンジュゲート基は糖鎖である。特定の実施形態において、コンジュゲート基は糖である。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）糖などのアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）結合部分を含む糖鎖である。特定の実施形態において、コンジュゲート基の糖鎖は、
Figure 2022524007000001
 を含むＧａｌＮＡｃ糖である。
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、以下の構造：
Figure 2022524007000002
 を有する糖鎖基にコンジュゲートされたＷＯ２０１２／０１４５６９７の配列番号２２６（ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ）の上記のようなギャップマー、またはその薬学上許容可能な塩（この塩はＨ２ＳＯ４塩またはＨＣｌ塩である）を含む。
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２０１２／０１４５６９７の配列番号２２６からなる核酸塩基配列を有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドであり、この修飾オリゴヌクレオチドは、
連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、このギャップセグメントは５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含み、各シトシン残基は５－メチルシトシンであり、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の構造：
Figure 2022524007000003
 を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である（塩はＨ２ＳＯ４塩またはＨＣｌ塩である）。
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコンジュゲート基を含み、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは連結した１２～３０個のヌクレオシドからなり、配列番号１６（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ９５５５１．１）の等長部分と相補的な少なくとも連続する８個の核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１６の１２～３０個のヌクレオチドフラグメントと少なくとも８０％相補的であり；コンジュゲート基は、
Figure 2022524007000004
 を含む。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖を含み、修飾糖は、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、拘束エチル、３’－フルオロ－ＨＮＡおよび二環式糖から選択される。
特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾糖は、２’－Ｏ－メトキシエチルであり、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、４’－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－２’架橋（ｎは１または２である）を含む二環式糖をさらに含む。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含み、少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含み、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。
特定の実施形態において、コンジュゲート基は、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端で修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに連結されるか、またはコンジュゲート基は、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に連結される。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホトリエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される。
特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは一本鎖である。
医薬組成物
特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、ＣｈＡｄ１５７、Ｐａｎ ５、Ｐａｎ ６、Ｐａｎ ７（Ｃ７とも呼ばれる）およびＰａｎ ９からなる群から選択されるＣｈＡｄベクター、特にＣｈＡｄ６３またはＣｈＡｄ１５５を含む。特定の実施形態において、ＣｈＡｄベクターは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサー（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）をコードする配列によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）をコードする。特定の実施形態において、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）は、ｈＩｉ（例えば、配列番号７もしくはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列、または配列番号１２もしくはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）に融合している。例えば、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１）は、ｈＩｉ（例えば、配列番号７）に融合しているか、またはＨＢｃ（例えば、配列番号１１）は、ｈＩｉ（例えば、配列番号１２）に融合している。特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、ｈＩｉ、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１３に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、配列番号９のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄベクターを含む。特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列または配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄベクターを含む。特定の一実施形態において、ベクターは、ＣｈＡｄ１５５ベクターである。従って、特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。その他の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。その他の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを含む組成物は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。
一実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するためのＭＶＡベクターを含む組成物は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列によって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードする。特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するためのＭＶＡベクターを含む組成物は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサー（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）をコードする配列によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）をコードする。一実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するためのＭＶＡベクターを含む組成物は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するためのＭＶＡベクターを含む組成物は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。
一実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための組換えＨＢｓ抗原、組換えＨＢｃ抗原およびアジュバントを含む組成物は、組換えＨＢｃおよび組換えＨＢｓを１：１の比で含む。別の実施形態において、組成物中のＨＢｓに対するＨＢｃの比は、１より大きく、例えば、ＨＢｓに対するＨＢｃの比は、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１以上、とりわけ３：１～５：１、例えば３：１、４：１または５：１、特に４：１の比であってもよい。特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための組換えＨＢｓ抗原、組換えＨＢｃ抗原およびアジュバントを含む組成物は、組換えＨＢｃおよび組換えＨＢｓを４：１以上の比で含む。特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための組換えＨＢｓ抗原、組換えＨＢｃ抗原およびアジュバントを含む組成物は、全長組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）（例えば配列番号１）、Ｃ末端で切断された組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）およびアジュバントを含む。特定の実施形態において、切断型組換えＨＢｃは、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）を含む。一実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための組換えＨＢｓ抗原、組換えＨＢｃ抗原およびアジュバントを含む組成物は、全長組換えＨＢｓと、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントとを含む。例えば、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法において使用するための組換えＨＢｓ抗原、組換えＨＢｃ抗原およびアジュバントを含む組成物は、全長組換えＨＢｓ（配列番号１）と、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（配列番号２）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントとを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。
開示の方法において用途が見出される本明細書に開示される組成物は、適切には、薬学上許容可能な組成物である。適切には、医薬組成物は、薬学上許容可能な担体または希釈剤を含む。特定の実施形態において、組成物は、修飾オリゴヌクレオチドの塩を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の調製のための薬学上許容可能な有効成分または不活性成分と混合してもよい。医薬組成物の製剤のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むいくつかの基準によって決まる。
ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＳＯを適切な薬学上許容可能な希釈剤または担体と合わせることによって医薬組成物中で使用可能である。薬学上許容可能な希釈剤としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。ＰＢＳは、非経口的に送達される組成物における使用に適切な希釈剤である。よって、一実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるのは、ＨＢＶ ＡＳＯおよび薬学上許容可能な希釈剤を含む医薬組成物である。特定の実施形態において、薬学上許容可能な希釈剤はＰＢＳである。ＨＢＶ ＡＳＯを含む組成物は、ＰＢＳ、または等張性生理食塩水、注射水、もしくはその他の適切な希釈剤などの任意の薬学上もしくは生理学上許容可能な担体にＡＳＯまたはその薬学上許容可能な塩を懸濁させることによって、投与のために調製され得る。
ＣｈＡｄまたはＭＶＡベクターを含む組成物は、等張性生理食塩水またはその他の等張性塩溶液などの薬学上または生理学上許容可能な担体にウイルスベクター粒子を懸濁させることによって、投与のために調製され得る。適当な担体は当業者には自明であり、投与経路に大きく依存する。
組換えタンパク質抗原を含む組成物は、それらが発現される細胞培養物からのタンパク質の単離および精製、１以上の塩、界面活性剤および／または凍結保護剤を含む調合緩衝液中での懸濁によって調製し、凍結乾燥してもよい。例えば、適切な調合緩衝液は、凍結保護剤としての糖、または糖の混合物、例えば、スクロース、トレハロースもしくはスクラロース、ならびに界面活性剤としての非イオン性コポリマー、例えば、ポロキサマーを含んでもよい。投与のために、凍結乾燥された組換えタンパク質製剤は、注射または吸入用の等張食塩水またはその他の等張塩溶液などの薬学上または生理学上許容可能な担体中で再構成される。適切な担体は、当業者には自明であり、投与経路に大きく依存する。再構成された組成物はまた、アジュバント、またはアジュバントの混合物を含んでもよい。一実施形態において、凍結乾燥された組換えタンパク質は、液体アジュバント系製剤において再構成される。
用語「担体」は、本明細書で使用される場合、治療有効成分が一緒に投与される、限定されるものではないが、希釈剤、賦形剤またはビヒクルなどの薬理学的に不活性な物質を指す。液体担体としては、限定されるものではないが、水および油、例えば、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などにおける食塩溶液などの無菌液体が挙げられる。食塩溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液はまた、特に注射可能溶液のための、液体担体として使用することができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる”Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
本明細書に開示される方法において使用するための組成物は、ＡＳＯ、組成物のベクターまたは組換えタンパク質に加えて、アジュバント系を含んでもよい。用語「アジュバント」は、細胞性レベルまたは液性レベルのいずれかで、組成物の抗原に対する免疫応答を増大させ、刺激し、活性化し、強化し、または調節する薬剤を指し、例えば、免疫学的アジュバントは、抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体では免疫学的効果を有しない。本明細書に開示される組成物は、組成物に含まれるベクターが、ｈＩｉなどの「遺伝的アジュバント」もコードするか否かにかかわらず、製剤中に別個の成分としてアジュバントを含んでよい。
適切なアジュバントは、慢性状態および障害された免疫能力を有する対象において免疫応答を増強することができるものである。ＣＨＢ患者は、ウイルスに対する効率的な自然免疫応答および適応免疫応答を開始できないことを特徴とし、これにより、効率的なワクチン開発は困難になっている。これらの患者では、アジュバント化ワクチン製剤の１つの重要な機能は、細胞性免疫応答を、細胞内病原体の除去に重要であると認識されているＴヘルパー１（Ｔｈ１）プロファイルに向けることを目標とする必要がある。
適切なアジュバントの例としては、限定されるものではないが、無機アジュバント（例えば、無機金属塩、例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、有機非ペプチドアジュバント（例えば、サポニン、例えば、ＱＳ２１、またはスクアレン）、油性アジュバント（例えば、フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＧＭ－ＣＦＳ、およびＩＮＦ－γ）、粒子状アジュバント（例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、リポソーム、または生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌性アジュバント（例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、例えば、３－脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）、またはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ、または合成リピドＡ）、合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えば、ポリアルギニンまたはポリリジン）、および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドが挙げられる。特に、アジュバントは、有機非ペプチドアジュバント（例えば、サポニン、例えば、ＱＳ２１、またはスクアレン）および／または細菌性アジュバント（例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、例えば、３－脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ））であってもよい。
１つの適切なアジュバントは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、特に、３－脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）である。化学的には、それは、４、５または６個のアシル化鎖を有する３－脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物として供給されることが多い。それは、ＧＢ２１２２２０４Ｂで教示される方法によって精製および調製することができ、この参考文献は、ジホスホリルリピドＡおよびその３－Ｏ－脱アシル化バリアントの調製も開示する。その他の精製された合成リポ多糖が記載されている［米国特許第６，００５，０９９号およびＥＰ０７２９４７３Ｂ１；Hilgers, 1986； Hilgers, 1987；およびＥＰ０５４９０７４Ｂ１］。
サポニンもまた適切なアジュバントである[Lacaille-Dubois, 1996]。例えば、サポニンクイルＡ（saponin Quil A）（南米の木キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の樹皮から導出される）、およびその画分は、米国特許第５，０５７，５４０号およびKensil, 1996；およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されている。クイルＡの精製画分、例えばＱＳ２１およびＱＳ１７は、免疫刺激物質としても公知であり、それらの生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に開示されている。ＱＳ２１の使用は、Kensil, 1991にさらに記載されている。ＱＳ２１とポリソルベートまたはシクロデキストリンとの組合せも公知である（ＷＯ９９／１０００８）。クイルＡの画分、例えばＱＳ２１およびＱＳ７を含む粒子状アジュバント系は、ＷＯ９６／３３７３９およびＷＯ９６／１１７１１に記載されている。
上記のものなどのアジュバントは、担体、例えば、リポソーム、水中油型エマルション、および／または金属塩（アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムを含む）と共に調合してもよい。例えば、３Ｄ－ＭＰＬは、水酸化アルミニウム（ＥＰ０６８９４５４）または水中油型エマルション（ＷＯ９５／１７２１０）と共に調合してもよい；ＱＳ２１は、コレステロール含有リポソーム（ＷＯ９６／３３７３９）、水中油型エマルション（ＷＯ９５／１７２１０）またはアラム（ＷＯ９８／１５２８７）と共に調合してもよい。
アジュバントの組合せ、特に、モノホスホリルリピドＡおよびサポニン誘導体の組合せ（例えば、ＷＯ９４／００１５３；ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９６／３３７３９；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１を参照）、より具体的には、ＷＯ９４／００１５３に開示されるＱＳ２１および３Ｄ－ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されるように、ＱＳ２１が、コレステロール含有リポソーム（ＤＱ）中でクエンチされる組成物を、開示される組成物中に利用してもよい。水中油型エマルション中のＱＳ２１、３Ｄ－ＭＰＬおよびトコフェロールを含む強力なアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されており、開示される組成物において用途を見出し得る別の製剤である。従って、適切なアジュバント系は、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３Ｄ－ＭＰＬの、アルミニウム塩との組合せ（例えば、ＷＯ００／２３１０５に記載される）を含む。さらなる例示的なアジュバントは、ＱＳ２１および／またはＭＰＬおよび／またはＣｐＧを含む。ＷＯ９６／３３７３９に開示されるように、ＱＳ２１は、コレステロール含有リポソーム中でクエンチされてもよい。
従って、開示される組成物において使用するのに適したアジュバントは、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含有するリポソームベースのアジュバントであるＡＳ０１である。リポソームは、ＭＰＬおよびＱＳ－２１免疫エンハンサーのためのビヒクルであり、リン酸塩緩衝食塩溶液中のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびコレステロールで構成される。ＡＳ０１Ｂ－４は、ＡＳ０１アジュバントの特に好ましいバリアントであり、ＰＢＳ溶液中の、免疫エンハンサーのためのビヒクルとしてのＤＯＰＣ／コレステロールリポソーム、およびソルビトールと共に、免疫エンハンサーＱＳ－２１（キラヤ・サポナリアの樹皮から精製されたトリテルペングリコシド）およびＭＰＬ（３－ＤモノホスホリルリピドＡ）で構成される。特に、ＡＳ０１Ｂ－４の単回ヒト用量（０．５ｍＬ）は、５０μｇのＱＳ－２１および５０μｇのＭＰＬを含有する。ＡＳ０１Ｅ－４は、ＡＳ０１Ｂ－４の２倍希釈物に相当し、すなわち、ヒト用量あたり２５μｇのＱＳ－２１および２５μｇのＭＰＬを含有する。
一実施形態において、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組合せであって、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を含む、免疫原性組合せが提供される。一実施形態において、免疫原性組合せは、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、切断型組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を含む。一実施形態において、免疫原性組合せは、組換えＨＢｓと、切断型組換えＨＢｃと、ＡＳ０１アジュバントとを含む組成物を含む。特定の実施形態において、免疫原性組合せは、４：１以上の比の切断型組換えＨＢｃと、組換えＨＢｓと、ＡＳ０１アジュバント、例えばＡＳ０１Ｂ－４またはＡＳ０１Ｅ－４とを含む組成物を含む。
一実施形態では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組合せであって、
この免疫原性組合せが、
ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含み、
この方法が、前記組成物を前記ヒトに順次投与または併用投与することを含む、免疫原性組合せが提供される。
特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、この方法のステップａ）で投与されるＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。
別の態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸と、ＨＢｃに融合したヒトインバリアント鎖（ｈＩｉ）をコードする核酸とを含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含み、この方法が、前記免疫原性組成物の、本明細書で提供されるような少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物が提供される。一実施形態において、組成物は、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、ＣｈＡｄ１５７、Ｐａｎ ５、Ｐａｎ ６、Ｐａｎ ７（Ｃ７とも呼ばれる）およびＰａｎ ９からなる群から選択されるＣｈＡｄベクター、特にＣｈＡｄ６３またはＣｈＡｄ１５５を含む。特定の実施形態において、ＣｈＡｄベクターは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列を組み込んだスペーサーによって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含む。特定の実施形態において、組成物は、ｈＩｉ、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。
さらなる態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物、前記免疫原性組成物が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含み、この方法が、前記免疫原性組成物の、本明細書で提供されるような少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物が提供される。一実施形態において、組成物は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列を組み込んだスペーサーによって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、組成物は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。
さらなる態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、この免疫原性組成物が、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、Ｃ末端切断型組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含有するアジュバントとを含み、この方法が、前記免疫原性組成物の、本明細書で提供されるような少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物が提供される。一実施形態において、組成物は、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９を含む切断型組換えＨＢｃを含む。一実施形態において、組成物は、全長組換えＨＢｓと、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントとを含む。より具体的には、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための組成物は、全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）と、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントと、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびコレステロールを含むリポソームとを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。特定の実施形態において、組成物は、４：１以上の比の切断型組換えＨＢｃおよび全長組換えＨＢｓ、ならびにＡＳ０１アジュバントを含む。特定の実施形態において、組成物は、４：１の比のＨＢｃのアミノ酸１～１４９からなる切断型コア抗原（例えば、配列番号２）および全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）、ならびにＡＳ０１Ｂ－４を含む。
さらなる態様において、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、この免疫原性組成物が、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含み、この方法が、前記免疫原性組成物の、本明細書で提供されるような少なくとも１種の免疫原性組成物を用いた治療レジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物が提供される。一実施形態において、組成物は、ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号８３～３１０から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）は、ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２４～２２７から選択されるヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである。
別の態様において、以下の組成物：
ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含む免疫原性組合せが提供される。
特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。
免疫原性組合せは、組成物の順次投与または併用投与による、ヒトにおいてＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療するための方法において用途が見出せる。
一実施形態において、この組合せの部分ａ）は、ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号８３～３１０から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）は、ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２４～２２７から選択されるヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである。
一実施形態において、この組合せの部分ｂ）は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸と、ＨＢｃに融合したヒトインバリアント鎖（ｈＩｉ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を含む。一実施形態において、組成物は、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、ＣｈＡｄ１５７、Ｐａｎ ５、Ｐａｎ ６、Ｐａｎ ７（Ｃ７とも呼ばれる）およびＰａｎ ９、特に、ＣｈＡｄ６３またはＣｈＡｄ１５５からなる群から選択されるＣｈＡｄベクターを含む。特定の実施形態において、ＣｈＡｄベクターは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列を組み込んだスペーサーによって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含む。特定の実施形態において、組成物は、ｈＩｉ、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、この組成物は、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。
一実施形態において、この組合せの部分ｃ）は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列を組み込んだスペーサーによって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む組成物を含む。特定の実施形態において、組成物は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。
一実施形態において、この組合せの部分ｄ）は、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、Ｃ末端切断型組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含有するアジュバントとを含む組成物を含む。一実施形態において、組成物は、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えば、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９を含む末端切断型組換えＨＢｃを含む。一実施形態において、組成物は、全長組換えＨＢｓと、ＨＢｃのアミノ酸１～１４と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントとを含む。より具体的には、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法における使用のための組成物は、全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）と、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントと、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびコレステロールを含むリポソームとを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。特定の実施形態において、組成物は、４：１またはそれを超える比の末端切断型組換えＨＢｃおよび全長組換えＨＢｓと、ＡＳ０１アジュバントとを含む。特定の実施形態において、組成物は、４：１比のＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）とおよび全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）からなる末端切断型コア抗原と、ＡＳ０１Ｂ－４とを含む。
別の態様において、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療するための医薬の製造における免疫原性組成物の使用であって、この免疫原性組成物が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸と、ＨＢｃに融合したヒトインバリアント鎖（ｈＩｉ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含み、この慢性Ｂ型肝炎感染症を治療する方法が、前記免疫原性組成物の、本明細書で提供されるような少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、使用が提供される。一実施形態において、組成物は、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、ＣｈＡｄ１５７、Ｐａｎ ５、Ｐａｎ ６、Ｐａｎ ７（Ｃ７とも呼ばれる）およびＰａｎ ９、特に、ＣｈＡｄ６３またはＣｈＡｄ１５５からなる群から選択されるＣｈＡｄベクターを含む。特定の実施形態において、ＣｈＡｄベクターは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列を組み込んだスペーサーによって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含む。特定の実施形態において、組成物は、ｈＩｉ、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１３に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードする配列（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）をコードする。特定の実施形態において、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）は、ｈＩｉ（例えば、配列番号７またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列または配列番号１２またはそれと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列）に融合される。例えば、ＨＢｃ（例えば、配列番号１１）がｈＩｉ（例えば、配列番号７）に融合されるか、またはＨＢｃ（例えば、配列番号１１）がｈＩｉ（例えば、配列番号１２）に融合される。一実施形態において、組成物は、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＣｈＡｄ１５５ベクターを含む。
さらなる態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療するための医薬の製造における免疫原性組成物の使用であって、この免疫原性組成物が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含み、この慢性Ｂ型肝炎感染症を治療する方法が、前記免疫原性組成物の、本明細書で提供されるような少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、使用が提供される。一実施形態において、組成物は、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域をコードする配列を組み込んだスペーサーによって分離されたＨＢｃおよびＨＢｓをコードするベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、組成物は、ＨＢｃ、２ＡおよびＨＢｓをコードするポリヌクレオチドベクターインサート、例えば、図１２に示される構造を有する構築物をコードするインサートを含むＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターインサートは、口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサー（例えば、配列番号３またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）をコードする配列によって分離されたＨＢｃ（例えば、配列番号１１またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）およびＨＢｓ（例えば、配列番号１またはそれと少なくとも９８％相同なアミノ酸配列）をコードする。一実施形態において、組成物は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターインサートを含むＭＶＡベクターを含む。
さらなる態様では、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療するための医薬の製造における免疫原性組成物の使用であって、この免疫原性組成物が、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、Ｃ末端切断型組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含有するアジュバントとを含み、この慢性Ｂ型肝炎感染症を治療する方法が、前記免疫原性組成物の、本明細書で提供されるような少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、使用が提供される。一実施形態において、組成物は、ＨＢｃのアセンブリドメイン、例えばＨＢｃのアミノ酸１～１４９を含む切断型組換えＨＢｃを含む。一実施形態において、組成物は、全長組換えＨＢｓ（例えば、配列番号１）と、ＨＢｃのアミノ酸１～１４９（例えば、配列番号２）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバント（例えば、ＡＳ０１アジュバント、例えば、ＡＳ０１Ｂ－４またはＡＳ０１Ｅ－４）とを含む。特定の実施形態において、組換えタンパク質ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原は、ウイルス様粒子の形態である。
さらなる態様において、ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療するための医薬の製造における組成物の使用であって、この組成物は、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む。一実施形態において、組成物は、ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号８３～３１０から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）は、ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２４～２２７から選択されるヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９の配列番号２２６７）を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）を有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである。
一実施形態において、ヒトにおける慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）の治療のための医薬の製造における免疫原性組合せの使用であって、
この免疫原性組合せが、
ｉ．ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｉｉ．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
ｉｉｉ．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
ｉｖ．組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含み、
この慢性Ｂ型肝炎感染症を治療する方法が、前記ヒトに前記組成物を順次投与または併用投与することを含む、使用が提供される。
特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９の配列番号２２６７）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９の配列番号２２６７）を有する。
特定の実施形態において、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤの治療のための医薬の製造における免疫原性組合せの使用は、
ｉ．ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｉｉ．ＨＢｓをコードするポリヌクレオチドと、ＨＢｃをコードする核酸と、ｈＩｉをコードするポリヌクレオチドとを含む複製欠損ＣｈＡｄベクターを含む組成物；
ｉｉｉ．ＨＢｓをコードするポリヌクレオチドと、ＨＢｃをコードする核酸とを含むＭＶＡベクターを含む組成物；ならびに
ｉｖ．組換えＨＢｓと、末端切断型ＨＢｃと、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含むアジュバントとを含む組成物
を含み、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤを治療する方法は、
ａ）組成物ｉ．をヒトに投与するステップ；
ｂ）組成物ｉｉ．をヒトに投与するステップ；
ｃ）組成物ｉｉｉ．をヒトに投与するステップ；および
ｄ）組成物ｉｖ．をヒトに投与するステップ
を含み、この方法のステップは、順次実施され、ステップａ）がステップｂ）に先行し、ステップｂ）がステップｃ）に先行し、ステップｃ）がステップｄ）に先行する。さらなる実施形態において、ステップａ）が繰り返される。さらなる実施形態において、ステップｄ）が繰り返され、この方法のステップは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｃ）、ｄ）の順で順次実施される。別の実施形態において、ステップｄ）は、ステップｂ）および／またはステップｂ）と同時に実施される。
特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９の配列番号２２６７）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９の配列番号２２６７）を有する。
さらなる態様において、本発明は、ＣＨＢおよび／またはＣＨＤの治療のために構成要素を順次投与または併用投与するための説明書と共に、以下の組成物：
ａ）ＨＢＶ核酸に標的された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠損チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
を含むキットを提供する。
特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９の配列番号２２６７）と８５～９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、ＨＢＶ ＡＳＯは、配列番号１６のＨＢＶゲノム配列の核酸塩基１５８３～１６０２に対して相補的な配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９の配列番号２２６７）を有する。
投与
開示される方法の一実施形態において、開示される組成物は、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、または局所経路を介して投与される。好ましくは、投与は、筋肉内経路を介する。
鼻腔内投与は、肺を含む完全な気道の粘膜への組成物の投与である。より具体的には、組成物は、鼻の粘膜に投与される。一実施形態において、鼻腔内投与は、スプレーまたはエアロゾルによって達成される。筋肉内投与は、個体の任意の筋肉への組成物の注射を指す。例示的な筋肉内注射は、三角筋、外側広筋、または腹側臀部領域および背腹臀部領域に投与される。好ましくは、投与は、三角筋に行われる。皮下投与は、皮下組織への組成物の注射を指す。皮内投与は、皮膚の層の間の真皮への組成物の注射を指す。局所投与は、針または同等のデバイスで皮膚を貫通することなく、皮膚または粘膜の任意の部分に組成物を投与することである。組成物は、口、鼻、生殖器領域および／または直腸の粘膜に局所的に投与してもよい。局所投与は、舌下投与および／または頬側投与などの投与手段を含む。舌下投与は、舌の下に組成物を投与することである（例えば、経口薄膜（ＯＴＦ）を使用して）。頬側投与は、頬の頬側粘膜を介してベクターを投与することである。
本明細書に開示される方法は、プライム－ブースト免疫化レジメンの形をとることができる。従って、プライム－ブースト免疫化方法であるＣＨＢおよび／またはＣＨＤの治療方法において使用するための組成物が、本明細書に開示される。多くの場合、免疫原性組成物の単回投与は、有効な防御または疾患の治療的処置に必要とされる数の長期免疫細胞を生成するのに十分ではない。その結果として、特定の病原体または疾患に対する持続的かつ防御的な免疫を確立するために、または所与の疾患を治療または機能的に治癒するために、前記病原体または疾患に特異的な生物学的調製物を繰り返し投与することが必要であり得る。同じ病原体または疾患に対する免疫原性組成物またはワクチンの反復投与を含む投与レジメンは、「プライム－ブーストレジメン」と呼ばれる。一実施形態において、プライム－ブーストレジメンは、Ｂ型肝炎に対する免疫原性組成物の少なくとも２回の投与を含む。免疫原性組成物の最初の投与は、「プライミング」と呼ばれ、同じ免疫原性組成物、または同じ病原体に対する免疫原性組成物の任意の後続の投与は、「ブースティング」と呼ばれる。免疫応答をブーストするための２、３、４またはさらには５回の投与も企図されることが理解されるべきである。プライムとブーストとの間の期間は、場合により、１週間、２週間、４週間、６週間、８週間または１２週間である。より具体的には、それは、４週間または８週間である。２回以上のブーストが実施される場合、後続のブーストは、先行するブーストの１週、２週、４週、６週、８週もしくは１２週、６か月または１２か月後に投与される。例えば、任意の２つのブースト間の間隔は、４週間または８週間であってもよい。
開示される方法において使用するための組成物は、それぞれ異なる組成物において調合された、さらなる免疫原性成分の投与を含む治療レジメンで投与される。組成物は、好都合には、同じ部位でまたはその近くで、同位置に(co-locationally)投与される。例えば、成分は、同じ側もしくは四肢に（「同側(co-lateral)」投与）または反対の側もしくは四肢に（「反対側(contra-lateral)」投与）、筋肉内投与することができる。例えば、反対側投与では、第１の組成物を、左三角筋に投与し、第２の組成物を、右三角筋に順次投与または併用投与してもよい。あるいは、同側投与では、第１の組成物を、左三角筋に投与し、第２の組成物も、左三角筋に順次投与または併用投与してもよい。
一般的な製造プロセス
・ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ：
組換え複製欠損サル（チンパンジー由来）アデノウイルス群ＣベクターＣｈＡｄ１５５に導入遺伝子として挿入されるＤＮＡ断片は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の自己切断型２Ａ領域[Donnelly et al. 2001]によって分離される、２種のＨＢＶタンパク質抗原であるコアヌクレオカプシドタンパク質抗原ＨＢｃおよびスモール表面抗原ＨＢｓから導出される。ＦＭＤＶの２Ａ領域は、ＨＢｃ－ＨＢｓ融合物の、別個のタンパク質抗原へのプロセシングを可能にする。さらに、ＨＢｃタンパク質をコードする遺伝子のＮ末端部分は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合インバリアント鎖ｐ３５アイソフォーム（ｈＩｉ）をコードする遺伝子に融合している。ｈＩｉ－ＨＢＶ導入遺伝子配列の略図が、（図１３）に提供される。
２Ａ領域（１８アミノ酸）には、そのＮ末端に６アミノ酸のスペーサーが補充されている；この種のスペーサーは、２Ａを介した切断の効率を高めることが報告されている。領域２Ａを介したプロテアーゼ切断は、２Ａアミノ酸配列中の最後のプロリンの直前の、２ＡのＣ末端で生じる。プロリンは、ＨＢｓタンパク質のＮ末端に残り、一方、プロリン切断部位に先行する２３アミノ酸は、ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａポリペプチドと共に残る。
それにより、導入遺伝子の発現は、プロテアーゼプロセシングに続いて、２種の別個のポリペプチド：ｈＩｉ－ＨＢｃ－スペーサー－２ＡおよびＨＢｓの生成をもたらす。簡潔にするために、ｈＩｉ－ＨＢｃ－スペーサー－２Ａポリペプチドは、ｈＩｉ－ＨＢｃタンパク質と呼ばれる。細胞培養で発現させると、ｈＩｉ－ＨＢｃ抗原は、細胞培養上清で検出され、一方、ＨＢｓタンパク質は、細胞内画分で検出される。
抗原タンパク質をコードする発現カセット（宿主細胞における発現を可能にするように調節成分に作動可能に連結される）は、以前記載されたように（ＷＯ２０１６／１９８６２１（ＣｈＡｄ１５５ベクター配列および方法を開示する目的で参照により組み込まれる）を参照）、ＣｈＡｄ１５５ベクタープラスミド構築物に構築されて、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶを得る。ｈＩｉ－ＨＢＶ導入遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ ｐＡ）の転写制御下にある。発現カセットは、ＨＢｓ、ＨＢｃおよびｈＩｉアミノ酸配列をコードし、その中で、ｈＩｉ配列は、ＨＢｃのＨＢｃ Ｎ末端に融合し、ＨＢｓおよびＨＢｃ配列は、ＨＢｃおよびＨＢｓを別個のタンパク質にプロセシングするための口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込むスペーサーによって分離される。
複製欠損である組換えＣｈＡｄ１５５アデノウイルスを生成するために、アデノウイルスの複製および感染性に必要とされる欠失された遺伝子領域の機能は、ヘルパーウイルスまたは細胞株、すなわち、補完またはパッケージング細胞株によって、組換えウイルスに供給されなければならない。特に適切な補完細胞株は、Ｐｒｏｃｅｌｌ９２細胞株である。Ｐｒｏｃｅｌｌ９２細胞株は、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーターの制御下のＴｅｔリプレッサー、およびＧ４１８耐性遺伝子と共にトランスフェクトされた、アデノウイルスＥ１遺伝子を発現するＨＥＫ ２９３細胞に基づく(Vitelli et al. PLOS One (2013) 8(e55435):1-9)。Ｐｒｏｃｅｌｌ９２．Ｓは、浮遊状態での増殖に適合しており、毒性タンパク質を発現するアデノウイルスベクターの生成に有用である。
ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ原薬（Drug Substance）の生成：
ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶウイルス粒子（原薬）の製造は、感染時に５×１０５個細胞／ｍＬの細胞密度でのＰｒｏｃｅｌｌ－９２．Ｓ細胞の培養を含む。次いで、細胞に、２００ｖｐ／細胞の感染多重度を使用して、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶマスターウイルスシード（ＭＶＳ）を感染させる。ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶウイルス回収物は、細胞溶解、溶解物の清澄化、および濃縮（濾過ステップ）後に、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む多段階プロセスによって精製される。
ワクチン調合および充填
精製されたＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶバルク原薬は、その後、次のように処理される：
製剤化緩衝液中の精製ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ原薬の希釈。
滅菌濾過。
最終容器の充填。
ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶワクチンは、バイアルに入れられた液体製剤である。調合緩衝液は、トリス（Ｔｒｉｓ）（１０ｍＭ）、Ｌ－ヒスチジン（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（７５ｍＭ）、ＭｇＣｌ（１ｍＭ）およびＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）を、スクロース（５％ｗ／ｖ）、ポリソルベート－８０（０．０２％ｗ／ｖ）およびエタノール（０．５％ｗ／ｖ）と共に含み、ＨＣｌでｐＨ７．４に調整される（最終体積まで注射用水）。
・ＭＶＡ－ＨＢＶ：
ＭＶＡ－ＨＢＶは、ＨＢＶの２種の異なるタンパク質：コアおよびＳタンパク質（２Ａペプチドによって分離される）を保有する組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。ＭＶＡ－ＨＢＶ構築物は、Ａｎｔｏｎ Ｍａｙｒ教授によって記載された[Mayr, A. et al. 1978]弱毒継代５７１（ＭＶＡ－５７１と呼ばれる）からのＭＶＡウイルスシードバッチから導出された、ＭＶＡ－Ｒｅｄベクター系[Di Lullo et al. 2010]から生成された。
ＭＶＡ－ＨＢＶ導入遺伝子は、ＨＢＶのコアヌクレオカプシドタンパク質ＨＢｃおよびスモール表面抗原ＨＢｓをコードする。ＨＢｃ－ＨＢｓ配列は、アデノウイルスベクターについて上に述べたように、融合タンパク質を別個のＨＢｃおよびＨＢｓ抗原にプロセシングすることを可能にする、口蹄疫ウイルスの自己切断型２Ａ領域によって分離される。導入遺伝子の略図が、図１２に提供される。
導入遺伝子の発現は、プロテアーゼプロセシング後に、２種の別個のポリペプチド：ＨＢｃ－スペーサー－２ＡおよびＨＢｓの生成をもたらす。簡潔にするために、ＨＢｃ－スペーサー－２Ａポリペプチドは、ＨＢｃタンパク質と呼ばれる。
発現カセットは、ＭＶＡシャトルベクターｐ９４－ｅｌｉｓａＲｅｎにサブクローニングし、トランスファーベクターｐ９４－ＨＢＶを生成した。ｐ９４－ＨＢＶは、ＦｌａｎｋＩＩＩ－２領域およびＦｌａｎｋＩＩＩ－１領域に隣接する、ワクシニアＰ７．５初期／後期プロモーター制御下の抗原発現カセットを含有し、相同組換えによるＭＶＡのｄｅｌ ＩＩＩ中の挿入を可能にする。
組換えウイルスの生成は、ＣＥＦ細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏ組換えの２つの事象に基づいた。
簡単に述べると、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）にＭＶＡ－Ｒｅｄを感染させ、次いで、抗原導入遺伝子（および合成プロモーターｓＰの制御下にあるＥＧＦＰマーカー遺伝子）を保有するｐ９４－ＨＢＶによりトランスフェクトした。最初の組換え事象は、ＭＶＡ－Ｒｅｄゲノムおよびトランスファーベクターｐ９４－ＨＢＶの両方に存在する相同配列（ＦｌａｎｋＩＩＩ－１領域およびＦｌａｎｋＩＩＩ－２領域）の間で生じ、Ｈｃｒｅｄタンパク質遺伝子の、導入遺伝子／ｅＧＦＰカセットとの置換をもたらす。ＭＶＡ－Ｇｒｅｅｎ中間体を含有する感染細胞は、ＦＡＣＳソーティングによって単離され、新鮮なＣＥＦを感染させるために使用される。最初の組換えから生じる中間組換えＭＶＡは、導入遺伝子およびｅＧＦＰカセットの両方を保有するが、反復Ｚ領域の存在に起因して不安定である。
従って、Ｚ領域が関与する自発的な第２の組換え事象が生じ、ｅＧＦＰカセットを除去する。得られた組換えＭＶＡは無色で、導入遺伝子カセットを保有する。
最後に、マーカーレス(markerless)組換えウイルス（ＭＶＡ－ＨＢＶ）感染細胞を、ＦＡＣＳによって選別し、ＭＶＡ－ＨＢＶを、終末希釈(terminal dilution)によってクローニングし、従来の方法によってＣＥＦ中で増殖させた。
ＭＶＡ－ＨＢＶ原薬の生成
ＭＶＡ－ＨＢＶウイルス粒子（原薬）は、１×１０６～２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度までニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の初代細胞培養物中で製造し、次いで、ＭＶＡ－ＨＢＶマスターウイルスシード（ＭＶＳ）を、０．０１～０．０５ＰＦＵ／細胞の感染多重度で感染させる。ＭＶＡ－ＨＢＶウイルス回収物は、遠心分離によるペレット化、再懸濁、および分画勾配遠心分離ステップに基づく多段階プロセスによって精製される。
ワクチン調合および充填
精製されたＭＶＡ－ＨＢＶバルク原薬は、その後、次のように処理される：
調合緩衝液中の精製ＭＶＡ－ＨＢＶ ＤＳの希釈。
最終容器の充填。
ＭＶＡ－ＨＢＶワクチンは、バイアルに入れられた液体製剤である。調合緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンｐＨ７．７（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、および最終体積までの注射用水を含む。
・ＨＢｓ－ＨＢｃ組換えタンパク質混合物：
ＨＢｃ原薬の生成
ＨＢｃ組換えタンパク質（原薬）製造プロセスは、組換え大腸菌ワーキングシードを使用して前培養フラスコに接種すること、それに続く、発酵プロセス、ならびに回収、抽出、清澄化、および複数のクロマトグラフィーおよび濾過ステップを含む多段階の精製プロセスからなる。
ＨＢｓ原薬の生成
ＨＢｓ組換えタンパク質（原薬）製造プロセスは、組換え出芽酵母(S. cerevisiae)ワーキングシードを使用して前培養フラスコに接種すること、それに続く、発酵プロセス、ならびに回収、抽出、清澄化、および複数のクロマトグラフィーおよび濾過ステップを含む多段階の精製プロセスからなる。
ワクチン調合および充填
精製されたＨＢｓ原薬およびＨＢｃ原薬は、凍結保護剤としてのスクロース、および界面活性剤としてのポロキサマーを含む調合緩衝液中に希釈し、４ｍＬの透明なガラスバイアルに充填し、凍結乾燥させる。
本明細書に記載される特定の化合物、組成物、レジメンおよび方法を、特定の実施形態による特異性と共に記載してきたが、以下の実施例は本明細書に記載される化合物、組成物、レジメンおよび方法を単に説明するためのものであって、それらを限定することを意図しない。本願に列挙される参照文献はそれぞれ引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。
非臨床開発の目的：
特にＨＢｃＡｇに対する、強力で機能的なＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＨＢＶクリアランスおよび感染症の消散に関連している[Boni, 2012; Li, 2011; Liang, 2011; Lau, 2002; Bertoletti, 2012]。さらに、抗Ｓ抗体は、非感染肝細胞へのＨＢＶの広がりを予防し、ＨＢＶ複製の治療後のぶり返しを制御する鍵となり得る[Rehermann 2005; Neumann 2010]。提案されるワクチン接種レジメンは、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）抗原およびＢ型肝炎表面（ＨＢｓ）抗原をコードする２種のウイルスベクター化ワクチン（ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶ）を用いた異種プライム－ブーストスケジュールであって、ＣＨＢ患者において強力な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗体応答を誘導するための、ＡＳ０１Ｂ－４アジュバント化ＨＢｃ－ＨＢｓタンパク質の順次投与または併用投与を伴うものを含む。このワクチン誘導性免疫応答は、最終的に、ＨＢＶ感染症の完全で永続的な制御のマーカーと見なされるＨＢｓＡｇ濃度の実質的な減少またはＨＢｓＡｇ消失（すなわち、検出可能なレベルを下回るＨＢｓＡｇ濃度）につながるはずである。アンチセンス療法は、ＨＢＶ抗原のｍＲＮＡ転写産物を直接標的とし、ＨＢＶ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節し、それによって、血清ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇレベルを低下させることができる。非臨床実験の目的の１つは、ＨＢｓに対する寛容を克服し（抗ＨＢｓ Ａｂ力価）、Ｔ細胞応答を誘導し、循環ＨＢｓ抗原およびＨＢＶ ＤＮＡレベルを低下させることにおいて、ＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せを評価することである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む実施例の材料および方法
ＲＮＡの単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡにおいて実施することができる。ＲＮＡ単離の方法は、当技術分野で周知である。ＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を用いて、例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）を製造業者の推奨プロトコールに従って使用して、調製される。
標的レベルまたは発現の阻害の分析
ＨＢＶ核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野で公知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量的リアルタイムＰＣＲにより定量することができる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡにおいて実施することができる。ＲＮＡ単離の方法は、当技術分野で周知である。ノーザンブロット分析はまた、当技術分野では慣例である。定量的リアルタイムＰＣＲは、好都合には、ＰＥ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、ＣＡ）から入手可能で製造業者の指示に従って使用される、市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７６００、７７００、または７９００配列検出システムを使用して、実行することができる。
標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７６００、７７００または７９００配列検出システム（ＰＥ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用する定量的リアルタイムＰＣＲにより実行し得る。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は、当技術分野で周知である。
単離されたＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲの前に、逆転写酵素（ＲＴ）反応に供され、これにより、その後リアルタイムＰＣＲ増幅の基質として使用される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ反応は、同じサンプルウェルで順次実行される。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、ＣＡ）から入手できる。ＲＴリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に周知の方法により実施される。
リアルタイムＰＣＲによって得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的の量は、シクロフィリンＡなどの、発現が一定の遺伝子の発現レベルを用いて、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．カールスバッド、ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを定量化することによって、標準化される。シクロフィリンＡの発現は、標的と同時、多重または別個に実行されることにより、リアルタイムＰＣＲによって定量化される。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．ユージーン、ＯＲ）を使用して定量化される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＲＮＡ定量の方法は、Jones, L.J., et al (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)によって教示されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ ４０００装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がＲＩＢＯＧＲＥＥＮの蛍光を測定するのに使用される。
プローブおよびプライマーは、ＨＢＶ核酸にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムＰＣＲのプローブおよびプライマーを設計するための方法は、当技術分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）などのソフトウェアの使用を含み得る。
標的ＤＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＤＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７６００、７７００または７９００配列検出システム（ＰＥ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用する定量的リアルタイムＰＣＲにより実行し得る。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は、当技術分野で周知である。
リアルタイムＰＣＲによって得られる遺伝子（またはＤＮＡ）標的の量は、シクロフィリンＡなどの、発現が一定の遺伝子の発現レベルを用いて、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．カールスバッド、ＣＡ）を用いて全ＤＮＡを定量化することによって、標準化される。シクロフィリンＡの発現は、標的と同時、多重、または別個に実行されることにより、リアルタイムＰＣＲによって定量化される。全ＤＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．ユージーン、ＯＲ）を使用して定量化される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＤＮＡ定量の方法は、Jones, L.J., et al (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)によって教示されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ ４０００装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がＲＩＢＯＧＲＥＥＮの蛍光を測定するのに使用される。
プローブおよびプライマーは、ＨＢＶ核酸にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムＰＣＲのプローブおよびプライマーを設計するための方法は、当技術分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）などのソフトウェアの使用を含み得る。
実施例１：ＭＯＥギャップマーによるＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＨＢＶウイルスｍＲＮＡのアンチセンス阻害
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、Ｂ型肝炎ウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏで研究するために広く使用されている細胞モデルである。これらの細胞では、ＨＢＶゲノムは細胞ＤＮＡのいくつかの部位に組み込まれている。これらの細胞はもともとヒト肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２に由来し、培養系での安定したＨＢＶの発現および複製を特徴としている。
ＨＢＶウイルス核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＢＶ ｍＲＮＡに対するそれらの効果について試験した。ウェルあたり２５，０００細胞の密度の培養ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、１５，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでエレクトロポレーションを使用してトランスフェクトした。およそ２４時間の処理期間後に、細胞からＲＮＡを単離し、ＨＢＶ ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。ウイルスプライマープローブセットＲＴＳ３３７０（順方向配列 ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧ、本明細書において配列番号１７として示される；逆方向配列 ＣＧＧＣＴＡＧＡＧＴＴＣＣＧＣＡＧＴＡ、本明細書において配列番号１８として示される；プローブ配列 ＴＧＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧＧＣＴＣＣ、本明細書において配列番号１９として示される）を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＴＳ３３７０は、全長ｍＲＮＡならびにｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２およびｐｒｅ－Ｃ ｍＲＮＡ転写産物の第２の部分を検出する。ギャップマーはまた、追加のプライマープローブセットでも調べた。また、ウイルスプライマープローブセットＲＴＳ３３７１（順方向配列 ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡ、本明細書において配列番号２０として示される；逆方向配列 ＴＧＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＡＧ、本明細書において配列番号２１として示される；プローブ配列 ＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＧＧＡＡＡＡＴ、本明細書において配列番号２２として示される）を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＴＳ３３７１は、ＲＴＳ３３７０と同様であるが、異なる領域で、全長ｍＲＮＡならびにｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２およびｐｒｅ－Ｃ ｍＲＮＡ転写産物の第２の部分を検出する。ウイルスプライマープローブセットＲＴＳ３３７２（順方向配列 ＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴ、本明細書において配列番号２３として示される；逆方向配列 ＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＧＡＧ、本明細書において配列番号２４として示される；プローブ配列 ＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧ、本明細書において配列番号２５として示される）を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＴＳ３３７２は、全長ゲノム配列を検出する。ウイルスプライマープローブセットＲＴＳ３３７３ＭＧＢ（順方向配列 ＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＴＡＣＴＴＣＡ、本明細書において配列番号２６として示される；逆方向配列 ＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡ、本明細書において配列番号２７として示される；プローブ配列 ＴＴＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧ、本明細書において配列番号２８として示される）を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＴＳ３３７３ＭＧＢは、全長ｍＲＮＡならびにｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２、ｐｒｅ－Ｃおよびｐｒｅ－Ｘ ｍＲＮＡ転写産物の第２の部分を検出する。
ＨＢＶ ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定されたように、全ＲＮＡ含量に従って調整した。結果は、未処理の対照細胞に対する、ＨＢＶの阻害率として表している。
表１のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－１０－５ ＭＯＥギャップマー、３－１０－３ ＭＯＥギャップマーまたは２－１０－２ ＭＯＥギャップマーのいずれかとして設計された。５－１０－５ ＭＯＥギャップマーは２０ヌクレオシド長であり、中央のギャップセグメントが１０個の２’－デオキシヌクレオシドで構成され、両側（５’および３’方向）にそれぞれ５個のヌクレオシドを含むウイングが隣接している。３－１０－３ ＭＯＥギャップマーは１６ヌクレオシド長であり、中央のギャップセグメントが１０個の２’－デオキシヌクレオシドで構成され、両側（５’および３’方向）にそれぞれ３個のヌクレオシドを含むウイングが隣接している。２－１０－２ ＭＯＥギャップマーは１４ヌクレオシド長であり、中央のギャップセグメントが１０個の２’－デオキシヌクレオシドで構成され、両側（５’および３’方向）にそれぞれ２個のヌクレオシドを含むウイングが隣接している。５’ウイングセグメントの各ヌクレオシドおよび３’ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、ＭＯＥ糖修飾を有する。中央のギャップセグメントの各ヌクレオシドは、デオキシ糖修飾を有する。各ギャップマー全体のヌクレオシド間連結はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマー全体のすべてのシトシン残基は５’－メチルシトシンである。
「開始部位（start site）」は、ギャップマーがウイルス遺伝子配列において標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「停止部位（stop site）」は、ギャップマーがウイルス遺伝子配列において標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表１に示した各ギャップマーは、本明細書において配列番号１６（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ９５５５１．１）として示されるウイルスゲノム配列を標的としている。
Figure 2022524007000005
Figure 2022524007000006
Figure 2022524007000007
Figure 2022524007000008
Figure 2022524007000009
Figure 2022524007000010
実施例２：ＨＢＶを標的とするＭＯＥギャップマーのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける忍容性
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＭＡ）は、安全性および有効性試験にしばしば利用される多目的マウスモデルである。これらのマウスを、上記実施例１から選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、種々の代謝マーカーのレベルの変化について評価した
それぞれＢＡＬＢ／ｃマウス４個体からなる群に、５０ｍｇ／ｋｇの配列番号８３、配列番号２２４、配列番号８８、配列番号１０３、配列番号２０、配列番号１１６、配列番号１８７、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２２６、配列番号２４、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５０、配列番号１４０、配列番号１７、配列番号２７、配列番号４０および配列番号７４（すべての配列番号はＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号である）を週２回、３週間、皮下注射した。ＢＡＬＢ／ｃマウス４個体からなる一群に、５０ｍｇ／ｋｇの、配列ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号３２０）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ヒトまたはマウス遺伝子配列のいずれとも既知の相同性のない５－１０－５ ＭＯＥギャップマー）を週２回、３週間、皮下注射した。ＢＡＬＢ／ｃマウス４個体からなる別の群に、ＰＢＳを週２回、３週間、皮下注射した。このマウス群は、対照群としての役割を果たした。最終投与の３日後の各時点に、体重を測定し、マウスを安楽死させ、さらなる分析のために臓器および血漿を採取した。
体重および臓器重量
マウスの体重を投与前および各処置期間の最後に測定した。体重を表２に示し、処置開始前に測定した体重からの変化率として表している。肝臓、脾臓および腎臓の重量を研究の最後に測定し、ＰＢＳ対照のそれぞれの臓器重量とのパーセンテージの差として表３に示す。この結果は、ほとんどのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドが、体重または臓器重量に対して悪影響を全く及ぼさなかったことを示している。
Figure 2022524007000011
Figure 2022524007000012
肝臓機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、メルヴィル、ＮＹ）を使用して、測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定し、結果を表４に示し、ＩＵ／Ｌで表した。コレステロールとトリグリセリドの血漿レベルも同じ臨床化学分析器を使用して測定し、その結果もまた表４に示す。
Figure 2022524007000013
腎臓機能
腎臓機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の血漿濃度を、自動臨床化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、メルヴィル、ＮＹ）を使用して、測定した。結果を表５に示し、ｍｇ／ｄＬで表した。
Figure 2022524007000014
実施例３：ＨＢＶを標的とするＭＯＥギャップマーのトランスジェニックマウスにおける有効性
ＨＢＶ遺伝子断片を保有するマウス(Guidotti, L. G. et al., J. Virol. 1995, 69, 6158-6169)を使用した。これらのマウスを、上記研究から選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、このモデルにおける有効性について評価した。
それぞれマウス６個体からなる群に、５０ｍｇ／ｋｇの配列番号８３、配列番号２２６、配列番号２２４、配列番号１８１、配列番号１４３または配列番号１４５（すべての配列番号はＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号である）を週２回、４週間、皮下注射した。マウス１０個体からなる対照群に、ＰＢＳを週２回、４週間、皮下注射した。最終投与の４８時間後にマウスを安楽死させ、さらなる分析のために肝臓を採取した。
ＤＮＡおよびＲＮＡ分析
ＨＢＶ ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析のために、プライマープローブセットＲＴＳ３３７０を使用して、肝臓組織からＲＮＡを抽出した。ＤＮＡレベルは、ｐｉｃｏｇｒｅｅｎに対して標準化した。ＲＴ－ＰＣＲ分析後、ＨＢＶ ＲＮＡサンプルもまたプライマープローブセットＲＴＳ３３７０でアッセイした。ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）に対して標準化した。データを表６に示し、対照群に対する阻害率として表している。表６に示されるように、ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＢＳ対照よりもＨＢＶ ＤＮＡおよびＲＮＡの減少を達成した。結果は、対照に対する、ＨＢＶ ｍＲＮＡまたはＤＮＡの阻害率として表している。
Figure 2022524007000015
ワクチン処置を含む実施例のための動物モデルの選択のための原理：
ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウス（ヒトＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－ＤＲ１分子についてのトランスジェニック）を使用して、候補ワクチンがＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する能力を評価した。ＨＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗体を、同じＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおいて評価した。
ＨＢＶは自然にはチンパンジーおよびヒトのみに感染するため、治療ワクチンの効力を評価するために利用できる動物モデルは限られている。ＨＢＶゲノム全体が、宿主ゲノム中のウイルスゲノムの組み込みにより（ＨＢＶトランスジェニックマウス）、または複製ＨＢＶ ＤＮＡによる感染により、またはＨＢＶゲノムを発現するベクターにより発現される、マウスモデルが開発されている。これらは慢性ＨＢＶ病因を再現しないが、ウイルス複製中間体およびタンパク質は肝臓で検出することができ、免疫寛容が観察される。
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスモデルは、慢性ＨＢＶ感染症のウイルス学的および免疫学的特徴を再現し、それが選択された[Dion, 2013; Martin, 2015]。
ワクチン処置を含む実施例のための材料および方法
非臨床免疫原性研究で使用されるＡＳ０１アジュバント系の用量
ＡＳ０１Ｂ－４アジュバント系は、免疫エンハンサーＱＳ－２１（キラヤ・サポナリアの樹皮から精製されたトリテルペングリコシド）およびＭＰＬ（３－ＤモノホスホリルリピドＡ）と、これらの免疫エンハンサーのためのビヒクルとしてのリポソームと、ソルビトールとから構成される。特に、ＡＳ０１Ｂ－４の単回ヒト用量（０．５ｍＬ）は、５０μｇのＱＳ－２１および５０μｇのＭＰＬを含有する。ヒト用量の１／１０、すなわち、５０μＬは、マウスに注射される体積である（５μｇのＱＳ－２１およびＭＰＬに相当する）。
細胞性免疫応答－細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
様々な時点で収集される脾細胞、または肝臓浸潤リンパ球の新鮮なプールを、ＨＢｃまたはＨＢｓ配列をカバーする、１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのプールで、ｅｘ ｖｉｖｏで６時間刺激した。ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的細胞性応答を、ＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－２および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の量を測定するＩＣＳによって評価した。ＩＣＳの結果を考慮するための技術的な受入基準は、取得したＣＤ８＋ＴまたはＣＤ４＋Ｔ細胞の最小数が＞３０００事象であることを含む。
体液性免疫応答－酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的抗体応答を、様々な時点における免疫化されたマウスの血清に対するＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に述べると、９６ウェルプレートを、ＨＢｃまたはＨＢｓ抗原でコーティングした。次いで、個々の血清サンプルを、段階希釈で添加し、２時間インキュベートした。次いで、ビオチン化抗マウスＦ（ａｂ）’２断片を添加し、ストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体およびペルオキシダーゼ基質オルト－フェニレンジアミン二塩酸塩／Ｈ２Ｏ２とのインキュベーションにより、抗原－抗体複合体を明らかにした。各時点および各抗原（ＨＢｃ、ＨＢｓ）について、分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを、固定効果として群、研究および相互作用を含め、不均一分散モデルを使用して（群間の同一の分散は想定されなかった）、ｌｏｇ１０力価に適合させた。このモデルを使用して、幾何平均（およびそれらの９５％ＣＩ）ならびに幾何平均比およびそれらの９５％ＣＩを推定した。予め定義された基準が設定されていなかったため、分析は記述的であり、群間の比の９５％ＣＩを、多重性についての調整無しで計算した。
ＡＬＴ／ＡＳＴ測定
マウス血清中のＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを、以下の市販のキットを使用して定量化した：
・アラニンアミノトランスフェラーゼ活性アッセイキットＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃ＭＡＫ０５２
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性アッセイキットＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃ＭＡＫ０５５
血清ＨＢｓ抗原の定量化
マウス血清中の循環ＨＢｓ抗原を、ＢＩＯ－ＲＡＤ製のＭｏｎｏｌｉｓａ Ａｎｔｉ－ＨＢｓ ＰＬＵＳ（カタログ＃７２５６６）および国際標準（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して定量化した。
組織病理学分析
肝臓（肝臓１つあたり１葉を回収し、１０％ホルムアルデヒド固定液中で保存した。顕微鏡検査用のすべてのサンプルを、ＲＩＴＡガイドラインに基づいてトリミングし[Ruehl-Fehlert, 2003; Kittel 2004; Morawietz 2004]、パラフィンワックス中に包埋し、およそ４ミクロンの厚さに薄片化し、Ｈ＆Ｅで染色した。組織学的活動性（壊死性炎症性病変）および線維症の等級付けを、メタビル（ＭＥＴＡＶＩＲ）スコアリングシステムに従って実施した[Bedossa, 1996; Mohamadnejad, 2010; Rammeh, 2014]。炎症細胞病巣の等級付けを、Ｂｕｃｈｍａｎｎら[Buchmann, 2013]によって記載されるように、デスメット（Ｄｅｓｍｅｔ）スコアに従って行った。
各研究で実施される統計分析は、各個別の研究に関係するセクションで詳述される。
実施例４－ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶ／ＨＢｓ－ＨＢｃ／ＡＳ０１ Ｂ－４ ワクチンレジメンの免疫原性評価
目的
この研究の目的は、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶウイルスベクターによるプライム／ブーストと、それに続く、またはそれと共投与される２用量の組換えタンパク質Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ ４μｇ）とＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ １μｇ）およびアジュバントＡＳ０１Ｂ－４（ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と表記）からなる様々なワクチンレジメンの免疫原性を評価することであった。
研究設計
第１群のマウス（Ｎ＝１６）を、０日目にＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶにより免疫化し、続いて２８日後にＭＶＡ－ＨＢＶにより免疫化した。２用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１μｇ／ＡＳ０１Ｂ－４を、このプライム／ブーストウイルスベクターレジメン後に１４日間隔で注射した（表４）。第２群のマウス（Ｎ＝１６）を、０日目にＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４により免疫化し、続いて２８日後にＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂと共投与されるＭＶＡ－ＨＢＶによりブーストした。ＭＶＡ－ＨＢＶおよびＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂの２回の後続の共免疫化を、１４日間隔で実施した（表４）。第３群のマウス（Ｎ＝８）に、陰性対照としてＮａＣｌを注射した。マウスを、２回目および４回目の免疫化の７日後（それぞれ、７ｄｐＩＩ、７ｄｐＩＶ）に犠死させ、ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的体液性（血清）および細胞性免疫応答（脾細胞および肝臓浸潤リンパ球における）を決定した。
この研究は記述的であり、統計的なサンプルサイズの妥当性の検証および分析を実施しなかった。
Figure 2022524007000016
結果
ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（脾細胞）
ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４の、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶベクター（プライムとして）およびＭＶＡ－ＨＢＶベクター（ブーストとして）との共投与（群２）は、７ｄｐＩＩにおいて、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶのみ（群１）の注射と比較した場合、ＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の４倍増加を誘導した（図１）。ＨＢｓに対する同様のＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、両方の群において誘導された（図１）。
７ｄｐＩＶでは、ＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４の後続の投与後に明らかにブーストされた（７ｄｐＩＩと比較して５倍増加）が、ＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答はブーストされなかった（群１）。ＭＶＡ－ＨＢＶ／ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４の２回の追加用量が共投与された場合、ＨＢｃまたはＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のさらなる増加は観察されなかった（群２）。
ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（脾細胞）
低レベルのＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、プライム－ブーストＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶ免疫化後に検出され（それぞれメジアン値０．１７％および０．１１％）（群１）、一方、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４がプライム－ブーストＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶと共投与された場合、７ｄｐＩＩにおいて、両方の抗原に対する強力な応答が観察された（群２）（図２）。
ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶプライム－ブースト後のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４の後続の投与（群１）は、７ｄｐＩＶにおいてＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を大幅に増強した（それぞれメジアン値１．６４％および２．３２％）。最後に、ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４と共投与されるプライムブーストＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶですでにワクチン接種されているマウスに、２回の追加用量のＭＶＡ－ＨＢＶおよびＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４が共投与された場合、同じ時点において、ＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頑強な増加が観察された（群２）。ＨＢｃ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、その同じ群におけるＩＩの７日後（７ｄｐｏｓｔ ＩＩ）と同じレベルのままであった。
肝臓浸潤リンパ球において測定されたＨＢｃおよびＨＢｓ特異的Ｔ細胞応答
最後の免疫化の７日後に、肝臓におけるワクチン誘導Ｔ細胞応答の存在を、ＩＣＳによって調査した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激およびＩＣＳを実施するのに十分な数の肝臓浸潤リンパ球を確保するために、３または４個の肝臓の灌流後に回収された細胞のプールを、各データ点について構成した。データ点の数が少ないため、統計分析を実施せず、結果は記述的である。
両方のワクチンレジメンは、ワクチン接種されたマウスの肝臓において検出可能なＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発した（図３）。強力なＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、両方のワクチンレジメンでワクチン接種された動物の肝臓において測定され、一方、はるかに低い頻度のＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が測定された。
ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的抗体応答
ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶの、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４との共投与（群２）は、７ｄｐＩＩにおいて最高量の抗ＨＢｃ抗体を誘導した（図４）。ＭＶＡ－ＨＢＶ＋ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４の後続の注射は、抗ＨＢｃ抗体応答のレベルをさらに増加させなかった（７ｄｐＩＶ）。ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶで予備免疫化されたマウスにおいて、ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４の注射後に、７ｄｐＩＶにおいて、抗ＨＢｃ特異的抗体応答の明らかな増加が観察された（群１）。ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶによる免疫化後の動物において抗ＨＢｓ抗体応答が検出されなかったため、ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４成分の存在は、強力な抗ＨＢｓ抗体を誘発するためにスケジュールにおいて重要であるように思われた（図４）。応答の最大の大きさは、最後の免疫化後に共投与群（群２）において観察された。
結論
ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスでは、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶは、低いが検出可能なＨＢｃ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発し、これは、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４によって明らかに増強された。ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶによる最初のプライム－ブースト免疫化は、強力なＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、ＨＢｃ特異的応答は、順次与えられたＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４ブースト後にさらに増加した。
興味深いことに、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶが、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と共投与された場合、２回のみの免疫化後に、高レベルのＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびに抗体が誘導された。ＭＶＡ－ＨＢＶ＋ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１Ｂ－４によるさらなる免疫化は、これらの応答のレベルをさらに増加させなかった。
さらに、ワクチン誘導ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、両方のワクチンレジメンでワクチン接種された動物の肝臓において検出された。
実施例５－ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおけるＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶ／ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１ Ｂ－４ ワクチンレジメンの免疫原性および安全性の評価
目的
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスモデルは、慢性ＨＢＶ感染症のウイルス学的および免疫学的特徴を再現する。このモデルでは、マウスの肝臓は、複製能のあるＨＢＶ ＤＮＡゲノムを保有するアデノ随伴ウイルス血清型２／８（ＡＡＶ２／８）ベクターにより形質導入される。
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶベクターの５×１０１０ｖｇ（ウイルスゲノム）の単回尾静脈注射は、ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入マウスの肝臓においてＨＢＶ複製および遺伝子発現をもたらす[Dion; 2013]。ＨＢＶ ＤＮＡ複製中間体、ＨＢＶ ＲＮＡ転写産物およびＨＢｃ抗原は、関連する重大な肝臓炎症無しに、注射後最大１年、肝臓において検出される。ＨＢｓおよびＨＢｅ抗原ならびにＨＢＶ ＤＮＡは、最大１年、血清において検出することができる。さらに、ＨＢＶ抗原に対する免疫寛容の確立は、慢性ＨＢＶ感染症のこの代理モデルにおいて観察される。
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおいて実施されるこの研究の目的は、
・ワクチンレジメンが、ＨＢｓおよびＨＢｃ抗原に対する免疫寛容を克服することができることを実証すること
・肝臓の組織学（Ｈ＆Ｅ染色）ならびにＡＳＴおよびＡＬＴレベル（肝臓機能に対する代理パラメーターとして）に対する、ＨＢｃＡｇを発現する肝細胞を潜在的に標的とする肝臓浸潤ＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の影響を評価すること
であった。
研究設計
単独のまたはＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と組み合わせた、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶ（両方ともＨＢＶコア［ＨＢｃ］および表面［ＨＢｓ］抗原をコードする）と、それに続く、２回の追加用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４（単独でまたはＭＶＡ－ＨＢＶと組み合わせて）による順次免疫化に基づく、２つの異なるワクチンレジメンを試験した（表６）。
群１、２および３のＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスを、０日目に５×１０１０ｖｇのＡＡＶ２／８－ＨＢＶベクター（静脈内投与）により形質導入し、群４は、免疫原性についての陽性対照として用いた（ワクチン接種前に免疫寛容の確立無し）。
群１の動物（Ｎ＝２１）を、３１日目にＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶにより、続いて５８日目にＭＶＡ－ＨＢＶにより免疫化した。２用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１μｇ／ＡＳ０１Ｂ－４を、このプライム／ブーストウイルスベクターレジメン後、７２日目および８６日目に注射した（表６）。
群２の動物（Ｎ＝２１）を、３１日目にＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶにより免疫化し、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４を共投与し、続いて５８日目にＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂと共投与されるＭＶＡ－ＨＢＶによりブーストした。ＭＶＡ－ＨＢＶおよびＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂの２回の後続の共免疫化を、７２日目および８６日目に実施した（表６）。
群３の動物（Ｎ＝２１）に、３１日目、５８日目、７２日目および８６日目にＮａＣｌを陰性対照として注射した。
群４の動物（Ｎ＝８）は、群２と同じワクチンレジメンを受けた（ＡＡＶ２／８－ＨＢＶを形質導入されなかったことを除く）。
すべてのワクチンを、筋肉内に投与した。
ＨＢｓ循環抗原のレベルを、２３日目、６５日目および９３日目に血清において測定した（群１、２および３）。
ＨＢｓおよびＨＢｃ特異的抗体応答を、ＥＬＩＳＡによって、２３日目（ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入後）、６５日目（２回目の免疫化の７日後）および９３日目（４回目の免疫化の７日後）にすべての動物の血清において測定した。ＨＢｓおよびＨＢｃ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ｅｘ ｖｉｖｏ再刺激およびＩＣＳ後に、脾細胞および肝臓浸潤リンパ球において６５日目（９個体の動物／群）および９３日目（１２個体の動物／群）に評価した（群１、２および３）。これらの免疫原性読み取りを、群４の動物（８個体の動物）について９３日目にのみ実施した。
肝臓関連の安全性パラメーターに関して、ＡＳＴおよびＡＬＴのレベルを、３８日目、６５日目および９３日目に血清において測定し、Ｈ＆Ｅで染色した肝臓切片の顕微鏡検査を、６５日目および９３日目に実施して、潜在的なワクチン関連の組織病理学的変化または炎症を検出した（群１、２および３）。
Figure 2022524007000017
統計分析
ＡＳＴおよびＡＬＴレベル
性別、日、群および３つの２×２相互作用を含む反復測定についてのＡＮＯＶＡモデルを、非構造化共分散構造を使用して、ｌｏｇ１０変換された酵素活性値に適合させた。モデルの仮説を検証した。５％レベルで有意ではない相互作用を、モデルから排除した。両方の酵素について、最終的なモデルは、性別、日、群、および群と日との間の相互作用を含んだ。各時点での各群の酵素活性の幾何平均を、このモデルから導出した。目的の群比較は、幾何平均比（ＧＭＲ）（これもこのモデルから導出した）により報告される。これらすべての統計は、両側９５％信頼区間で表示される。これらのＧＭＲを計算する際、多重性を考慮しなかった。
すべての分析を、ＳＡＳ ９．２を使用して実施した。
体液性応答
応答個体の数を算出するために、記述的統計を実施した。抗ＨＢｃまたは抗ＨＢｓ抗体応答の応答性についてのカットオフを、群３（ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入されたがワクチン接種無し）で算出された幾何平均力価に基づいて定義した。
細胞性応答
ＨＢｃ、ＨＢｓ特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかについての応答個体の数を定義するために、記述的分析を実施した。応答性についてのカットオフを、群３（ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入されたがワクチン接種無し）で行われた測定の９５パーセンタイルとして定義した。
結果
ＨＢｃ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１マウスでは、ＨＢｃ特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞のバックグラウンドレベルは、試験したすべての時点で、免疫化無しでは非常に低いレベルから検出不可能なレベルであった（群３）。
単独の（群１）またはＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と組み合わせた（群２）、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶベクターによる免疫化は、ＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し（ＩＩの７日後にそれぞれ６／７および９／９応答個体）、このことは、ＨＢｃ抗原に対する免疫寛容の回避を実証した（図５Ａ）。単独のまたはＭＶＡ－ＨＢＶと組み合わせた、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４の２回の追加用量は、４回目の投与の７日後に測定すると、これらのＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を適度にのみ増加させ、群１において１％、および群２において１．４５％のメジアン値頻度に達した。群２におけるのと同じワクチンレジメンによって誘導されたＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、ＨＢｃ抗原に対する免疫寛容に起因して予想される通り、群４の非形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおいてより高かった（８／８応答個体、頻度はＩＶの７日後に約４倍高かった）。ＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、脾臓におけるのと同じプロファイルで、ワクチン接種されたマウスの肝臓において検出された（図５Ｂ）。
両方のワクチンレジメンは、ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１マウスにおいて、非常に低いレベルから検出不可能なレベルのＨＢｃ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発し（群１および２）、一方、非形質導入マウスでは頑強な応答が測定され（群４）、このことは、ワクチンレジメンが、これらの実験条件下で、ＨＢｃ抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞寛容を克服しなかったことを示唆した（図６Ａ、Ｂ）。
ＨＢｓ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞
単独の（群１）またはＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と組み合わせた（群２）、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶベクターによる免疫化は、ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入マウスにおいて、ＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発し、単独のまたはＭＶＡ－ＨＢＶと組み合わせた２回の追加用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４後に、強度のさらなる増加はなかった（図７Ａ）。ワクチン接種スケジュールの終了時（４回目の投与の７日後）、群１（４／１０応答個体）および２（８／１１応答個体）の動物の脾臓において測定されたＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、群４（非形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウス、ＩＶの７日後のメジアン値＝０．６２％、５／８応答個体）において検出されたものに近く、このことは、ＨＢｓ抗原に対するＴ細胞寛容の克服を示唆した。ＨＢｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ワクチン接種された動物のほとんどにおいて、群１、２および４の動物の肝臓において検出された（図７Ｂ）。
ＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、群２（９／９応答個体）において２回目のワクチン接種の７日後から、および群１（１１／１２応答個体）において４回目のワクチン接種の７日後から、単独のまたはベクターと組み合わせた、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４の投与後に誘導された（図８Ａ）。群２の動物において使用されたワクチンスケジュールは、群１（ＩＶの７日後のメジアン値＝１．３４％、１１／１２応答個体）の動物において使用されたワクチンスケジュールと比較して、ＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の約３倍高い頻度を誘発し（ＩＶの７日後のメジアン値＝３．７％、１１／１１応答個体）、群４（非形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウス、ＩＶの７日後のメジアン値＝３％、８／８応答個体）におけるのと同様のレベルに達し、このことは、ＨＢｓ抗原に対するＴ細胞寛容のほぼ完全な克服を示唆した。全身的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答と同様に、ＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、すべてのワクチン接種された動物において、群１、２および４の動物の肝臓において検出された（図８Ｂ）。
ＨＢｓおよびＨＢｃ特異的抗体応答
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶベクターの注射の２３日後、抗ＨＢｓ抗体応答は、ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおいて検出されず、このことは、ＨＢｓ抗原に対する強力な体液性寛容を示唆した。ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶベクター単独（群１）による免疫化は、この寛容を破壊せず、一方、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と組み合わせたベクターの免疫化は、６５日目に２１個体の動物のうち１５個体において、抗ＨＢｓ抗体応答の誘導をもたらした（群２）（図９Ａ）。群１における２用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４のさらなる投与は、検出可能な抗ＨＢｓ抗体を誘発し（９３日目において１１６．８の幾何平均力価（ＧＭＴ）および８／１２応答個体）、群２におけるＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と組み合わせた２回の追加用量のＭＶＡ－ＨＢＶは、１１／１１応答個体で、７７５のＧＭＴまで抗ＨＢｓ抗体応答の強度をさらに増加させた（９３日目において群４の非ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入動物（ＧＭＴ＝３９３３；８／８応答個体）におけるよりも約５倍低いままであるが）。
同様に、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４成分がワクチンレジメンに存在する場合にのみ、抗ＨＢｃ抗体応答が誘導され、群１（ＧＭＴ＝４４２．８；１２／１２応答個体）と比較して、群２（ＧＭＴ＝１３３５．５；１１／１１応答個体）の動物において９３日目に３倍高いレベルが測定された（図９Ｂ）。群２におけるのと同じワクチンレジメンで非形質導入マウス（群４）において誘導された抗ＨＢｃ抗体力価は、より高かった（約２７倍、ＧＭＴ＝３５７８２；８／８応答個体）。
これらの結果は、ワクチンレジメンにおけるアジュバント化タンパク質成分の存在が、ＨＢｃ抗原およびＨＢｓ抗原の両方に対する体液性寛容を破壊するのに重要であることを示す。さらに、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４の４回の投与を含む、群２において使用されるワクチンレジメンは、最も高い抗ＨＢｃおよび抗ＨＢｓ抗体応答を誘発した（非ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入マウス（群４）におけるよりも低いままであるが）。
ＡＳＴ／ＡＬＴレベル
肝臓関連の炎症パラメーターとして、ＡＳＴおよびＡＬＴの血清活性を、３８日目（１回目のワクチン接種の７日後）、６５日目（２回目のワクチン接種の７日後）、および／または９３日目（４回目の免疫化の７日後）に測定した（すべての群）。全体として、ＡＳＴおよびＡＬＴレベルは、ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおいてワクチンレジメンの過程中、安定しており（群１および２）、ワクチンを受けていないマウス（群３）において測定されたものと同様であった（図１０）。ＡＳＴレベルは、６５日目において、対照群３と比較して、ワクチン群（群１および２）の動物において統計的に有意に高いことが見出された。しかし、ＡＳＴレベルは、残りの動態と比較して、群３の動物において６５日目に驚くほど低く、このことは、これらの差が、ワクチン群（群１および２）におけるＡＳＴレベルの増加ではなく、この時点で、対照群３で得られた特に予想外に低い値に起因するものであったことを示唆した（図１０Ａ）。
群３の対照動物におけるのと比較して、群１の動物において３８日目にわずかに低いＡＬＴレベルが測定されたが、この差は、臨床的に関連があるとは見なされなかった（図１０Ｂ）。
肝臓顕微鏡検査
Ｈ＆Ｅで染色された肝臓切片の顕微鏡検査を、６５日目および９３日目に実施して、潜在的なワクチン関連の組織病理学的変化または炎症を検出した（群１、２および３）（表７）。
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲマウスにおいて、６５日目（ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４有りまたは無しの、２回目のウイルスベクター化ワクチンＭＶＡ－ＨＢＶの注射の７日後）、または９３日目（最後の注射の７日後）のいずれかに、検査項目に関連する顕微鏡的所見はなく、すなわち、ワクチン成分ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ、ＭＶＡ－ＨＢＶおよびＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４の使用に関連し得る組織病理学的変化はなかった。
さらに、対照動物３．１３（限局性グレード１のピースミール壊死(piecemeal necrosis)を示した）を除いて、いずれの動物も、慢性肝炎の形態学的兆候を示さなかった。
処置された動物で認められたその他の顕微鏡的所見は、対照群でも生じ、発生率／規模が小さく、および／または同様の週齢のマウスでよく見られる背景所見である[McInnes, 2012]ため、偶発的な変化と考えられた。
Figure 2022524007000018
ＡＡＶ２／８－ＨＢＶを注射したマウスの血清中のＨＢｓ抗原レベル
Ｄｉｏｎら[Dion, 2013]にすでに報告されているように、ＡＡＶ２／８－ＨＢＶベクターによる注射の２３日後、ＨＢｓ抗原レベルは、雌と比較して、雄においてより高かった。これらのレベルは、ワクチン接種レジメンの検出可能な影響無しに、すべての群で安定したままであった（図１１）。しかし、ＡＡＶ２／８－ＨＢＶを注射したマウスは、ＨＢｓＡｇに対するワクチン効力を研究するための動物モデルではない。
結論
ＨＢｃおよびＨＢｓ抗原に対する免疫寛容が確立されている慢性ＨＢＶ感染症の代替モデル、すなわち、ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１マウスでは、両方の試験されたワクチンレジメンは、強力な免疫寛容のために予想されるように、非形質導入マウスにおけるよりも低いレベルではあるが、ＨＢｃおよびＨＢｓ特異的ＩｇＧおよびＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ならびにＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導することによって免疫寛容を回避した。ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶベクターが、ＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ－４と共投与された場合、ワクチン誘導抗体およびＴ細胞応答の強度は、ベクターおよびアジュバント化タンパク質が順次投与されるワクチンレジメンを用いた場合よりも高かった。さらに、ＡＳＴおよびＡＬＴの血清活性を測定し、肝臓組織病理学的評価を実施することによって、ワクチン関連の肝臓炎症を評価したが、非ワクチン接種のものと比較した場合、ワクチン群において肝臓酵素の増加は検出されず、いずれの顕微鏡的所見もワクチン処置に関連する可能性はなかった。まとめると、これらの結果は、試験されたワクチン候補が、これらの実験条件下で、肝変化の関連する兆候の検出無しに、ＨＢｓおよびＨＢｃ特異的抗体およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ならびにＨＢｓ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を首尾よく回復させたことを示す。
実施例６－ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおけるＨＢＶ ＡＳＯ／ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶ／ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１ Ｂ レジメンの有効性、免疫原性および安全性の評価
目的
この研究は、実施例５に記載されるような慢性ＨＢＶ感染症のＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスモデルを利用する。
この研究の目的は、
・ＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せが、ワクチンレジメン単独と比較した場合にＨＢｓ（抗ＨＢｓ Ａｂ力価）に対する免疫寛容をさらに克服し得ることを実証すること、
・ＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せが、ワクチンレジメン単独と比較した場合に循環ＨＢｓ抗原レベルを低減し得ることを実証すること、
・ＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せに対するＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価すること、
・血清ＨＢＶ ＤＮＡウイルス量に対するＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せの影響を評価すること、
・肝機能に関する代替パラメーターとしてのＡＳＴおよびＡＬＴレベルを評価すること
である。
研究設計
単独のまたはＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂと組み合わせた、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶ（両方ともＨＢＶコア［ＨＢｃ］および表面［ＨＢｓ］抗原をコードする）と、それに続く、２回の追加用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ（単独でまたはＭＶＡ－ＨＢＶと組み合わせて）による順次免疫化に基づく、２つの異なるワクチンレジメンを、ＨＢＶ ＡＳＯ処置を伴ってまたは伴わずに試験する（表１０）。
０日目に群１～６のＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスに５×１０１０ｖｇのＡＡＶ２／８－ＨＢＶベクターを形質導入し（静脈内投与、尾静脈）、群７はワクチンレジメンの安全性および免疫原性に関する陽性対照として用いる（ＨＢＶ ＡＳＯ処置無し、処置前に免疫寛容を確立しない）。
群１～６の動物を３０日目、３３日目および３７日目にＨＢＶ ＡＳＯ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）またはＮａＣｌで前処置した後、この処置を毎週繰り返し、同時に、１００日目まで指定のワクチンレジメン（またはＮａＣｌ）の投与を行う。
ＨＢＶ ＡＳＯまたはＮａＣｌでそれぞれ処置した群１および２の動物を、４４日目にＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶで、次いで７２日目にＭＶＡ－ＨＢＶで免疫化した。２用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１μｇ／ＡＳ０１Ｂを、このプライム／ブーストウイルスベクターレジメンの後、８６日目および１００日目に投与する（表１０）。
ＨＢＶ ＡＳＯまたはＮａＣｌでそれぞれ処置した群３および４の動物を、４４日目のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂを共投与するＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ、次いで７２日目のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂを共投与するＭＶＡ－ＨＢＶのブーストで免疫化する。続いて、８６日目および１００日目にＭＶＡ－ＨＢＶとＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂの同時免疫化を２回行う（表１０）。
ＮａＣｌまたはＨＢＶ ＡＳＯでそれぞれ処置した群５および６の動物に、これらのワクチンレジメンの陰性対照として、４４日目、７２日目、８６日目および１００日目にＮａＣｌ注射する。
これらのレジメンの成分はすべて筋肉内に投与する。
血清ＨＢｓＡｇおよび血清ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを、０日目（ＣＨＢモデルの誘導前）、２１日目（ＣＨＢモデルの誘導を確認するため）、４４日目、５８日目、７２日目、７９日目、８６日目、１００日目、１０７日目、１１４日目、１２８日目および１４２日目に測定する。
ＨＢｓ特異的抗体応答およびＨＢｃ特異的抗体応答を、０日目、２１日目、４４日目、５８日目、７２日目、７９日目、８６日目、１００日目、１０７日目、１１４日目、１２８日目および１４２日目に全動物からの血清でＥＬＩＳＡにより測定する。
マウス群を犠死および７９日目（群１～４および群７）、１０７日目および１４２日目（全群）のＨＢｓおよびＨＢｃ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の評価（ＩＣＳ－脾臓および潅流した肝臓）の評価のために分割する。
肝臓関連の安全性パラメーターに関して、０日目、４４日目、５８日目、８６日目、１００日目、１１４日目、１２８日目および１４２日目に血清でＡＳＴおよびＡＬＴ酵素のレベルを測定する。
Figure 2022524007000019
実施例７－ＡＡＶ２／８－ＨＢＶ形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスにおけるＨＢＶ－ＡＳＯ／ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ／ＭＶＡ－ＨＢＶ／ＨＢｃ－ＨＢｓ／ＡＳ０１ Ｂ レジメンの有効性、免疫原性および安全性の評価
目的
この研究は、実施例５に記載されるような慢性ＨＢＶ感染症のＡＡＶ２／８－ＨＢＶ－形質導入ＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスモデルを利用する。
この研究の目的は、実施例６のものと同じである。
・ＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せが、ワクチンレジメン単独と比較した場合にＨＢｓ（抗ＨＢｓ Ａｂ力価）に対する免疫寛容をさらに克服し得ることを実証すること
・ＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せが、ワクチンレジメン単独と比較した場合に循環ＨＢｓ抗原レベルを低減し得ることを実証すること
・ＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せに対するＨＢｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価すること
・血清ＨＢＶ ＤＮＡウイルス量に対するＨＢＶ ＡＳＯとワクチンレジメンの組合せの影響を評価すること
・肝機能に関する代替パラメーターとしてのＡＳＴおよびＡＬＴレベルを評価すること、およびまた潜在的全身毒性の評価のための主要器官（肝臓、肺、心臓、脳、腎臓、胸腺）の組織病理学的検査を行うこと。
研究設計
単独のまたはＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂと組み合わせた、ＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶおよびＭＶＡ－ＨＢＶ（両方ともＨＢＶコア［ＨＢｃ］および表面［ＨＢｓ］抗原をコードする）と、それに続く、２回の追加用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂ（単独でまたはＭＶＡ－ＨＢＶと組み合わせて）による順次免疫化に基づく、２つの異なるワクチンレジメンを、ＨＢＶ ＡＳＯ処置を伴ってまたは伴わずに試験する（表１１）。加えて、ＨＢＶ ＡＳＯによる処置は、４４日目に、最初のワクチン投与の前に停止するか、または１００日目まで継続する。
０日目に、群１～６および８～１０のＨＬＡ．Ａ２／ＤＲ１マウスに、１０１０ｖｇのＡＡＶ２／８－ＨＢＶベクターを形質導入し（静脈内投与、尾静脈）、群７は、ワクチンレジメンの安全性および免疫原性に関する陽性対照として用いる（ＨＢＶ ＡＳＯ処置無し、処置前に免疫寛容を確立しない）。
３１日目、３５日目および３８日目に、群１、６および８の動物をＨＢＶ ＡＳＯ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）で前処置した。次に、この処置を毎週継続し、同時に１００日目まで指定のワクチンレジメン（またはＮａＣｌ）の投与を行う。
また、３１日目、３５日目および３８日目に、群３、４および１０の動物もＨＢＶ ＡＳＯ（ＷＯ２０１２／１４５６９７の配列番号２２６）で前処置する。ただし、追加のＨＢＶ ＡＳＯ投与は４２日目に行い、その後、ＨＢＶ ＡＳＯによる処置は停止する。
群２、５および９の動物を、３１日目、３５日目および３８日目にＨＢＶ ＡＳＯまたはＮａＣｌで前処置し、次いで、この処置を毎週継続し、同時に１００日目まで指定のワクチンレジメン（またはＮａＣｌ）の投与を行う。
ＨＢＶ ＡＳＯまたはＮａＣｌで処置した群１、２および３の動物を、４日目にＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶで、次いで、７２日目にＭＶＡ－ＨＢＶで免疫下する。２用量のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１μｇ／ＡＳ０１Ｂを、このプライム／ブーストウイルスベクターレジメンの後、８６日目および１００日目に投与する（表１１）。
ＨＢＶ ＡＳＯまたはＮａＣｌで処置した群８、９および１０の動物を、４４日目のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂを共投与するＣｈＡｄ１５５－ｈＩｉ－ＨＢＶ、次いで７２日目のＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂを共投与するＭＶＡ－ＨＢＶのブーストで免疫化する。続いて、８６日目および１００日目にＭＶＡ－ＨＢＶとＨＢｃ－ＨＢｓ ４－１／ＡＳ０１Ｂの同時免疫化を２回行う（表１１）。
ＮａＣｌまたはＨＢＶ ＡＳＯで処置した４、５および６の動物には、ワクチンレジメンの陰性対照として、４４日目、７２日目、８６日目および１００日目にＮａＣｌを注射する。
これらのレジメンの成分はすべて筋肉内に投与する。
血清ＨＢｓＡｇおよび血清ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを、０日目（ＣＨＢモデルの誘導前）、２１日目（ＣＨＢモデルの誘導を確認するため）、４２日目、５６日目、７０日目、８０日目、８４日目、９８日目、１０７日目、１１３日目、１２７日目および１４１日目に測定する。
ＨＢｓ特異的抗体応答およびＨＢｃ特異的抗体応答を、０日目、２１日目、４２日目、５６日目、７０日目、８０日目、８４日目、９８日目、１０７日目、１１３日目、１２７日目および１４１日目に全動物からの血清でＥＬＩＳＡにより測定する。
マウス群を犠死および８０日目（群１、２、３および７）、１０７日目および１４１日目（全群）のＨＢｓおよびＨＢｃ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の評価（ＩＣＳ－脾臓および潅流した肝臓）の評価のために分割する。
肝臓関連の安全性パラメーターに関して、０日目、４２日目、８０日目、１０７日目および１４１日目に血清でＡＳＴおよびＡＬＴ酵素のレベルを測定する。
Figure 2022524007000020
配列表
配列番号１：ＨＢｓのアミノ酸配列
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
配列番号２：ＨＢｃ末端切断体のアミノ酸配列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
配列番号３：口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーのアミノ酸配列
APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
配列番号４：口蹄疫ウイルスの２Ａ切断領域を組み込んだスペーサーをコードするヌクレオチド配列
GCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCT
配列番号５：ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓのアミノ酸配列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQCAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
配列番号６：ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓをコードするヌクレオチド配列
ATGGACATCGATCCCTACAAGGAATTTGGCGCCACCGTGGAGCTGCTGAGCTTCCTGCCCAGCGACTTCTTCCCCAGCGTGAGGGACCTCCTGGACACCGCCAGCGCCCTGTACAGGGAGGCCCTGGAATCTCCCGAGCACTGCAGCCCACACCACACCGCACTGAGGCAGGCCATCCTGTGCTGGGGAGAGCTGATGACCCTCGCCACCTGGGTGGGCAACAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGGGACCTGGTGGTGAACTACGTCAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCCTGACCTTCGGCAGGGAGACCGTGCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCAGGACACCTCCCGCCTACAGACCCCCCAACGCCCCCATCCTGAGCACCCTGCCCGAGACCACAGTGGTGAGGAGGAGGGACAGGGGCAGGTCACCCAGGAGGAGGACTCCAAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCCCAGGAGAAGGAGGAGCCAGAGCAGGGAGAGCCAGTGCGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAGAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCAGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCCTCGGCGGGAGCCCCGTGTGCCTGGGCCAGAACAGCCAGTCTCCCACCAGCAATCACAGCCCCACCAGCTGCCCCCCAATCTGTCCTGGCTACCGGTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTCCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTGCCAGTGTGTCCCCTGATCCCCGGCTCAACCACCACTAACACCGGCCCCTGCAAAACCTGCACCACCCCCGCTCAGGGCAACAGCATGTTCCCAAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAACTGCACCTGCATTCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTATCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGCTGGCTCAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTCCAGTGGTTTGTGGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGAGCGCCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCAGCCTGTACTCCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTGCTGCCCATTTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATC
配列番号７：ｈＩｉのアミノ酸配列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGGVTKQDLGPVPM
配列番号８：ｈＩｉをコードするヌクレオチド配列
Atgcacaggaggaggagcaggagctgcagggaggaccagaagcccgtgatggacgaccagcgcgacctgatcagcaacaacgagcagctgccaatgctgggcaggaggcccggagcacccgaaagcaagtgcagcaggggcgccctgtacaccggcttcagcatcctggtgaccctcctgctggccggccaggccaccaccgcctatttcctgtaccagcagcagggcaggctcgataagctgaccgtgacctcccagaacctgcagctggagaacctgaggatgaagctgcccaagccccccaagcccgtgagcaagatgaggatggccacccccctgctgatgcaggctctgcccatgggggccctgccccagggccccatgcagaacgccaccaaatacggcaacatgaccgaggaccacgtgatgcacctgctgcagaacgccgatcctctgaaggtgtacccacccctgaaaggcagcttccccgagaacctcaggcacctgaagaacaccatggagaccatcgactggaaggtgttcgagagctggatgcaccactggctgctgttcgagatgagccggcacagcctggagcagaagcccaccgacgcccctcccaaggagagcctcgagctcgaggacccaagcagcggcctgggcgtgaccaagcaggacctgggccccgtgcccatg
配列番号９：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓのアミノ酸配列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGGVTKQDLGPVPMMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
配列番号１０：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓをコードするヌクレオチド配列
ATGCACAGGAGGAGGAGCAGGAGCTGCAGGGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGACGACCAGCGCGACCTGATCAGCAACAACGAGCAGCTGCCAATGCTGGGCAGGAGGCCCGGAGCACCCGAAAGCAAGTGCAGCAGGGGCGCCCTGTACACCGGCTTCAGCATCCTGGTGACCCTCCTGCTGGCCGGCCAGGCCACCACCGCCTATTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCAGGCTCGATAAGCTGACCGTGACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGAGGATGAAGCTGCCCAAGCCCCCCAAGCCCGTGAGCAAGATGAGGATGGCCACCCCCCTGCTGATGCAGGCTCTGCCCATGGGGGCCCTGCCCCAGGGCCCCATGCAGAACGCCACCAAATACGGCAACATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAACGCCGATCCTCTGAAGGTGTACCCACCCCTGAAAGGCAGCTTCCCCGAGAACCTCAGGCACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGAGCCGGCACAGCCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCTCCCAAGGAGAGCCTCGAGCTCGAGGACCCAAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCCGTGCCCATGGACATTGACCCCTACAAGGAGTTCGGCGCCACCGTCGAACTGCTGAGCTTCCTCCCCAGCGACTTCTTCCCCTCCGTGAGGGATCTGCTGGACACAGCTAGCGCCCTGTACAGGGAGGCCCTGGAGAGCCCCGAGCACTGCAGCCCCCACCACACAGCCCTGAGGCAGGCCATCCTCTGTTGGGGCGAGCTGATGACCCTGGCCACCTGGGTGGGCAATAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGGGACCTGGTGGTCAACTACGTGAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCCTGACCTTTGGCAGGGAGACCGTCCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCAGGACTCCCCCAGCCTACAGGCCCCCTAACGCCCCCATCCTGTCTACCCTGCCCGAGACCACCGTGGTGAGGAGGAGGGACAGGGGCAGAAGCCCCAGGAGAAGGACCCCTAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCGGGAGAGCCAGTGCGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAAAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATTCCCCAGTCACTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCCTCGGCGGGAGCCCCGTGTGCCTGGGCCAGAATAGCCAGAGCCCCACCAGCAACCACTCTCCCACTTCCTGCCCCCCTATCTGCCCCGGCTACAGGTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTGCCCGTGTGTCCCCTGATCCCCGGAAGCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGCAACTCTATGTTCCCCAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAACTGCACTTGCATTCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAATATCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTTAGCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTTGTGGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGAGCGCCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCTCCCTGTACAGCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTCCTGCCCATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATC
配列番号１１：ＨＢｃのアミノ酸配列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
配列番号１２：ｈＩｉ代替バリアントのアミノ酸配列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVP
配列番号１３：ｈＩ代替バリアントをコードするヌクレオチド配列
ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCCGGCTGGACAAACTGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCAAGCCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGCCCAGTCCCC
配列番号１４：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓの代替核酸配列
ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCCGGCTGGACAAACTGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCAAGCCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGCCCAGTCCCCATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATT
配列番号１５：ｈＩｉ－ＨＢｃ－２Ａ－ＨＢｓの代替アミノ酸配列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQCAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
配列番号１６：Ｂ型肝炎ウイルスゲノム（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ９５５５１．１）のヌクレオチド配列
aattccacaa cctttcacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct
gctggtggct ccagttcagg agcagtaaac cctgttccga ctactgcctc tcccttatcg
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc
ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata
ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt
cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaact
tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct
ctaattccag gatcctcaac caccagcacg ggaccatgcc gaacctgcat gactactgct
caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc
tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc
cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc
ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc
ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc tgaattttat gggttatgtc attggaagtt
atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc
ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg
ctgccccatt tacacaatgt ggttatcctg cgttaatgcc cttgtatgca tgtattcaat
ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga
acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc
ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcgtgcg tggaaccttt tcggctcctc
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa
acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tctcccgcaa atatacatcg tatccatggc
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg
cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc
gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac
cgtgaacgcc caccgaatgt tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctctgc
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga
gttgggggag gagattagat taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt
ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat
aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca
gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag
cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg
actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag catctagaga cctagtagtc
agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct
tgtctcactt ttggaagaga aaccgttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt
cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggaaact
actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga
aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aacctcaatg ttagtattcc
ttggactcat aaggtgggga actttactgg tctttattct tctactgtac ctgtctttaa
tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa
atgtgaacag tttgtaggcc cacttacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat
gcctgctagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc
ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct
atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc
accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc
tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacaca gcaaatccag
attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag
cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc
agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagacag
gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt gg
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Claims (33)

  1. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
    ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
    ｂ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；
    ｃ）前記ヒトに、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物を投与するステップ；および
    ｄ）前記ヒトに、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を投与するステップ
    を含む、方法。
  2. 前記方法のステップｂ）、ｃ）およびｄ）が順次実施され、ステップｂ）がステップｃ）に先行し、ステップｃ）がステップｄ）に先行する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法のステップｄ）が繰り返される、請求項２に記載の方法。
  4. ステップａ）が繰り返される、請求項１に記載の方法。
  5. ステップａ）がステップｂ）の前に繰り返される、請求項２に記載の方法。
  6. 各ステップ間の期間が１週間、２週間、４週間、６週間、８週間、１２週間、６か月間または１２か月間、例えば、４週間または８週間である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ステップｄ）がステップｂ）および／またはステップｃ）と同時に実施される、請求項１に記載の方法。
  8. ステップａ）が繰り返される、請求項７に記載の方法。
  9. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法であって、以下のステップ：
    ａ）前記ヒトに、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物を投与するステップ；
    ｂ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物、およびｉｉ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ；ならびに
    ｃ）前記ヒトに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物、および組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物を併用投与するステップ
    を含む、方法。
  10. ステップａ）がステップｂ）に先行して繰り返され、ステップｂ）がステップｃ）に先行する、請求項９に記載の方法。
  11. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、
    前記ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、
    前記ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、
    前記ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組合せであって、
    前記免疫原性組合せが、
    ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
    ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
    ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
    ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
    を含み、
    前記方法が、前記組成物をヒトに順次投与または併用投与することを含む、免疫原性組合せ。
  14. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する、請求項１３に記載の免疫原性組合せ。
  15. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、
    前記ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、
    前記ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、
    前記ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、
    前記免疫原性組成物が、
    ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）、および
    Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸と、前記ＨＢｃに融合したヒトインバリアント鎖（ｈＩｉ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクター
    を含み、
    前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物。
  17. １種以上の組換えＨＢＶタンパク質抗原をさらに含む、請求項１６に記載の使用のための免疫原性組成物。
  18. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、
    前記免疫原性組成物が、
    ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）、および
    Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター
    を含み、
    前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物。
  19. １種以上の組換えＨＢＶタンパク質抗原をさらに含む、請求項１８に記載の使用のための免疫原性組成物。
  20. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療する方法において使用するための免疫原性組成物であって、
    前記免疫原性組成物が、ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）と、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、Ｃ末端切断型組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、ＭＰＬおよびＱＳ－２１を含有するアジュバントとを含み、
    前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、免疫原性組成物。
  21. 前記免疫原性組成物中のＨＢｓに対するＨＢｃの比が１より大きい、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
  22. 前記免疫原性組成物中のＨＢｃに対するＨＢｓの比が４：１である、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
  23. １種以上のＨＢＶ抗原をコードする１種以上のベクターをさらに含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  24. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  25. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、
    前記ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、
    前記ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、
    前記ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組成物。
  26. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療するための医薬の製造における免疫原性組成物の使用であって、
    前記免疫原性組成物が、
    ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）、および
    Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸と、ＨＢｃをコードする核酸に融合したヒトインバリアント鎖（ｈＩｉ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクター
    を含み、
    慢性Ｂ型肝炎感染症および／またはＣＨＤ感染症を治療する前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、使用。
  27. ヒトにおいて慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）を治療するための医薬の製造における免疫原性組成物の使用であって、
    前記免疫原性組成物が、
    ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンス（ＨＢＶ ＡＳＯ）、および
    Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター
    を含み、
    慢性Ｂ型肝炎感染症および／またはＣＨＤ感染症を治療する前記方法が、前記免疫原性組成物の、少なくとも１種のその他の免疫原性組成物を用いたプライム－ブーストレジメンにおける投与を含む、使用。
  28. ヒトにおける慢性Ｂ型肝炎感染症（ＣＨＢ）および／または慢性Ｄ型肝炎感染症（ＣＨＤ）の治療のための医薬の製造における免疫原性組合せの使用であって、
    前記免疫原性組合せが、
    ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ ＡＳＯ）；
    ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
    ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
    ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
    を含み、
    慢性Ｂ型肝炎感染症および／またはＣＨＤを治療する前記方法が、前記組成物をヒトに順次投与または併用投与することを含む、使用。
  29. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の医薬の製造における免疫原性組成物の使用。
  30. ＨＢＶ核酸に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、
    前記ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、
    前記ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、
    前記ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の医薬の製造における免疫原性組成物の使用。
  31. 以下の組成物：
    ａ）ＨＢＶ核酸に標的化された１０～３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＨＢＶ ＡＳＯ）を含む組成物；
    ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む複製欠陥チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを含む組成物；
    ｃ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）をコードする核酸とを含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む組成物；および
    ｄ）組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）と、組換えＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）と、アジュバントとを含む組成物
    を含む、免疫原性組合せ。
  32. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する、請求項３１に記載の免疫原性組合せ。
  33. ＨＢＶ核酸に標的化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣを有する連結した２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド「ギャップマー」であり、
    前記ギャップマーが、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＧＣＡＧＡからなる５’ウイング領域と、それに続く連結した１０個のデオキシヌクレオシドＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡと、それぞれのヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖を含む連結した５個のヌクレオシドＡＧＴＧＣからなる３’ウイング領域とからなり、
    前記ギャップマー中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、
    前記ギャップマー中の各シトシンが５－メチルシトシンである、請求項３１または３２に記載の免疫原性組合せ。
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