UA79735C2 - Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах - Google Patents

Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах Download PDF

Info

Publication number
UA79735C2
UA79735C2 UA2003021025A UA2003021025A UA79735C2 UA 79735 C2 UA79735 C2 UA 79735C2 UA 2003021025 A UA2003021025 A UA 2003021025A UA 2003021025 A UA2003021025 A UA 2003021025A UA 79735 C2 UA79735 C2 UA 79735C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antigen
hepatitis
vaccine
thiomersal
free
Prior art date
Application number
UA2003021025A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Хейдер Кун Дє
Петер Сху
Мішель Серантоні
Опстель Омер ван
Original Assignee
Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0019728.5A external-priority patent/GB0019728D0/en
Priority claimed from GB0101334A external-priority patent/GB0101334D0/en
Application filed by Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. filed Critical Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А.
Publication of UA79735C2 publication Critical patent/UA79735C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
    • A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Винахід належить до способу отримання антигену гепатиту В, що є прийнятним для використання у вакцині, до способу, що передбачає очищення антигену у присутності цистеїну, а також до вакцин, які містять такі антигени.

Description

Опис винаходу
Винахід стосується нового процесу виробництва вакцини гепатиту В для використання при лікуванні або 2 профілактиці вірусних інфекцій гепатиту В (НВМ). Крім того, він стосується НВМ-вакцини, отриманої за допомогою цього нового процесу за винаходом.
Хронічна вірусна інфекція гепатиту В (НВУ), для якої існуюче в даний час лікування є обмеженим, складає глобальну проблему охорони здоров'я величезної важливості. Хронічні носії НВМ, число яких оцінюють більше ніж З00 мільйонів в усьому світі, піддані ризикові розвитку хронічного активного гепатиту, цирозу і первинної 70 злоякісної гепатоми.
Багатьом вакцинам, які доступні в даний час, для запобігання розкладання необхідний консервант.
Консервантом, який часто використовують є тіомерсал, що є ртутєвмісною сполукою. З приводу використання ртуті у вакцинах виникли деякі занепокоєння, хоча коментатори підкреслюють, що потенційної небезпеки тіомерсалвмісних вакцин, не слід перебільшувати (ОП; Р.А. ЗУАМА Мої.283; Мо: 16)Ї. Проте був би корисним 79 пошук нових і потенційно безпечних способів отримання вакцин, для того щоб замінити використання тіомерсалу в процесі виробництва. Таким чином, існує необхідність у розробці вакцин, що є вільними від тіомерсалу, зокрема, вакцин гепатиту В.
За першим аспектом винаходу запропонований спосіб отримання антигену гепатиту В, що підходить для використання у вакцині, при якому цей антиген очищують у присутності відновного агента, що містить вільну -ЗН 20 групу.
За винаходом переважно запропонований спосіб отримання стабільного антигену гепатиту В без слідів тіомерсалу, при якому цей антиген очищують у присутності відновного агента, що містить вільну -ЗН групу.
Звичайно препаратом антигену є препарат без слідів тіомерсалу, коли тіомерсал не знайдений в очищеному антигенному продукті при використанні абсорбційної спектрофотометрії ртуті, як описано у винаході. с 25 Препарат антигену гепатиту переважно містить менше ніж 0,025мкг ртуті на 2Омкг білка, що відповідним (9 чином виміряне за допомогою абсорбційної спектрофотометрії.
Переважно очищення здійснюють у відсутності тіомерсалу, і очищений антиген є цілком вільним від тіомерсалу.
Переважно цей антиген є стабільним, відповідно, по суті таким же стабільним, як і антиген гепатиту, о 30 очищений у присутності тіомерсалу, як, наприклад, викладено у Прикладі 1 винаходу. со
Переважно антиген гепатиту є імуногенним.
Переважно відновний агент додають у процесі очищення антигену, переважно після вирощування клітин, - експресуючих цей антиген. Ф
Переважно відновним агентом є цистеїн, дитіотрейтол, Д-меркаптоетанол або глутатіон, причому
Зо найпереважнійшим є цистеїн. т
Відповідно, за винаходом переважно запропонований спосіб отримання стабільного імуногенного антигену гепатиту В без слідів тіомерсалу, при якому цей антиген очищують у присутності цистеїну.
Переважно очищення здійснюють у присутності розчину цистеїну. «
Переважно цистеїн, у розчині або в порошкоподібній формі, додають під час процесу до кінцевої З7З 70 концентрації від 1 до 1О0ММ, переважно від 1 до 5ММ. Найбільш переважно цистеїн додають до кінцевої с концентрації приблизно 2мММ. "з Переважно цистеїном є І -цистеїн.
Крім того, за винаходом запропонований спосіб отримання стабільного антигену гепатиту В без слідів тіомерсалу, при якому неочищений антиген піддають гель-проникаючій хроматографії, піддають іонообмінній хроматографії і змішують з відновним агентом, що має вільну -5Н групу. - Переважно іонообмінною хроматографією є аніонообмінна хроматографія. (Се) Крім того, за винаходом запропонований антиген гепатиту В, вільний від тіомерсалу, який отримують способом виробництва за винаходом, причому цей антиген є щонайменше таким же імуногенним і антигенним, - як і антиген гепатиту В, виготовлений у присутності тіомерсалу. о 250 За винаходом також запропонований імуногенний антиген гепатиту В, що має середнє співвідношення ЕГІЗА (імуноферментний твердофазний аналіз; епгуте-ййпКей іттипозогрепі аззау)/білок більше ніж 1,5 і вміст КЕ1 зі сл значенням ІКБО, яке щонайменше в З рази нижче, ніж для поверхневого антигену гепатиту В, виготовленого у присутності тіомерсалу.
Наступний аспект винаходу стосується способу отримання антигену гепатиту, що підходить для 59 використання у вакцині, при якому цей антиген очищують у присутності тіомерсалу з наступною обробкою
ГФ) антигену у присутності відновного агента, що містить вільну -ЗН групу. т Відповідно, за цією обробкою іде стадія очищення, така як стадія діалізу, для видалення тіомерсалу.
Переважно відновним агентом є цистеїн, дитіотрейтол (ДТТ), глутатіон або р-меркаптоетанол.
Антиген гепатиту В за винаходом можна використовувати або для лікування, або для профілактики інфекцій 60 гепатиту В, особливо для лікування або профілактики, наприклад, хронічних інфекцій гепатиту В.
Крім того, за винаходом запропонований вакцинний препарат, що містить антиген гепатиту В за винаходом у сполученні з ад'ювантом. Переважно цим ад'ювантом є сіль алюмінію або переважний стимулятор ТН1-клітинної відповіді.
Переважно антигеном є поверхневий антиген гепатиту В. бо Отримання поверхневого антигену гепатиту В добре відомо з літератури. |Дивися, наприклад, Напога еї а).
іп Оемеїор. ВіоЇї. 5іапдагай 54, раде 125 (1983), Сгедуд ей аїЇ. іп Віоїесппоіоду, 5, раде 479 (1987),
ЕР-А-0226846, ЕР-А-0299108 та наведені в цих документах посилання).
Вираз "поверхневий антиген гепатиту В" або "НВзАд", як воно використано тут, включає в себе будь-який
НВзАЯ антиген або його фрагмент, що виявляє антигенність поверхневого антигену НВУ. Варто розуміти, що на додаток до 226 амінокислотної послідовності антигену НВзАд 5 |див. ТіоїІаіїв еї аЇ. Майшге, 317, 489 (1985) і наведені там посилання), НВзАд, як описано тут, може, якщо бажано, містити при-5-послідовність цілком або частину її, як описано в наведених вище посиланнях і в (ЕР-А-0278940). НВзАд, як описано тут, може також відноситися до варіантів, наприклад до "мутанта, що вислизнув", (езсаре тшапі"), описаному в (МО 91/147031. 70 НВзгАад може також відноситися до поліпептидів, описаних у (ЕР 0198474 або ЕР 03045781.
Звичайно НВзАд буде знаходитися у формі частки. У особливо переважному втіленні НВзАд буде складатися по суті з НВзАд 5-антигену, згаданого вище.
Вакцина може переважно містити в собі фармацевтично прийнятний ексципіент, такий як підходящий ад'ювант. Підходящі ад'юванти є у продажу, такі як, наприклад, неповний ад'ювант Фрейнда (Ргешйпа'з Іпсотрієеїе 7/5 Аа)имапу і повний ад'ювант Фрейнда (Егеппаз Сотрієїе АдіимапО) (Оїїсо І арогайогіез, ЮОейгоїї, МІ); ад'ювант 65 Мегск (МетгскК апа Сотрапу, Іпс., Капжшау, МУ); АБ-2 (ЗтіййКіїпе Вееспат, РпПїйадеїрнпіа, РА); солі алюмінію, такі як гель гідроксиду алюмінію (галуни) або фосфат алюмінію; солі кальцію, заліза або цинку; нерозчинна суспензія ацильованого тирозину; ацильовані цукру; катіонно або аніонно перетворені полісахариди; поліфосфазени; мікросфери, що біологічно розпадаються; монофосфорилліпід А та Оці А. Цитокіни, такі як гранулоцитарно-моноцитарний колонієстимулуючий фактор (ЗМ-С5БЕ) або інтерлейкін-2, -7 або -12, можна також використовувати як ад'юванти.
У препаратах за винаходом переважно, щоб ад'ювантна композиція індукувала імунну відповідь переважно
ТНІ-типу. Високі рівні цитокінів Тп1-типу (наприклад ІФН-у, ФНО-о, ІЛ-2 та ІЛ-12) мають тенденцію до переважної індукції клітинно-опосередкованих імунних відповідей на введений антиген. У переважному втіленні, с у якому відповіддю є відповідь переважно ТИ1-типу, рівень цитокінів Тп1-типу буде зростати в більшому ступені, ніж рівень цитокінів Тп2-типу. Рівні цих цитокінів легко оцінити, використовуючи стандартні аналізи. о
Як огляд сімейств цитокінів |дивися Мозтапп апа Сойтап, Апп. Кему. Іттипо). 7: 145-173, 19891.
Відповідно, підходящі ад'юванти для використання при індукції відповіді переважно Тп1-типу мають, наприклад, комбінацію монофосфорилліпіду А, переважно З-дез-О-ацильованого монофосфориліпіду А (юю зо («З0О-МРУ), разом із сіллю алюмінію. Інші відомі ад'юванти, що переважно індукують імунну відповідь ТНІ1-типу, мають СроО-вмісні олігонуклеотиди. Ці олігонуклеотиди характеризуються тим, що динуклеотид Сро є і. неметилованим. Такі олігонуклеотиди добре відомі та описані, наприклад, у МО 96/02555). Імуностимуляторні ї- послідовності ДНК також описані, наприклад, ІЗаю еї аї., Зсіепсе 273:352, 1996). Іншим переважним ад'ювантом є сапонін, переважно 0521 |Адийа Віорпагтасеціїсаів Іпс., Егатіпдапат, МА), який можна використовувати іа
Зз5 окремо або у комбінації з іншими ад'ювантами. Наприклад, у посилену систему включена комбінація ї- монофосфорилліпіду А та похідного сапоніну, така як комбінація 20521 і ЗО-МРЇ,, як описано в (МО 94/00153), або менш реактогенна композиція, де 0521 блокований холестерином, як описано в (МУО 96/33739). Інші переважні препарати містять емульсію "олія у водії та токоферол. Особливо сильний ад'ювантний препарат, у який включені 0521, ЗО-МРІ. і токоферол в емульсії "олія у воді", описаний у (МО 95/17210). «
Особливо ефективний ад'ювантний препарат, у який включені 0521, 3О-МРІ і токоферол в емульсії олія у Ш- с воді", описаний у (МО 95/17210) і є переважним препаратом. й Відповідно до одного втілення винаходу запропонована вакцина, що містить поверхневий антиген гепатиту В и? за винаходом, що додатково містить ТНІ1-індукуючий ад'ювант. Переважним втіленням є вакцина, в якій цей
ТНІ-індукуючий ад'ювант обраний із групи ад'ювантів, що містить: ЗО-МРІ, 9521, суміш 0521 і холестерину, і СрО-олігонуклеотид. Іншим переважним втіленням є вакцина, що містить поверхневий антиген гепатиту В, який -і як ад'ювант має монофосфорилліпід А або його похідне, 0521 і токоферол в емульсії "олія у воді".
Переважно вакцина додатково містить сапонін, найбільш переважно 0521. Інший конкретний підходящий о ад'ювантний препарат, що включає Ср і сапонін, описаний у (МО 00/09159) і є переважним препаратом. -І Найбільш переважним сапоніном у даному конкретному препараті є 0521. Переважно цей препарат додатково
Містить емульсію "олія у воді" і токоферол. о За винаходом також запропонований вакцинний препарат, що містить поверхневий антиген гепатиту В за сл винаходом разом з ад'ювантом і який додатково має один або більш ніж один антиген, обраний із групи, що складається з: дифтерійного анатоксину (0), правцевого анатоксину (Т), безклітинних коклюшних антигенів (Ра), інактивованого вірусу поліомієліту (ІРМ), антигену Наеторпйиз іпПшепгае (Нів), антигену гепатиту А, вірусу простого герпесу (НБУ), хламидії, 55В, НРУ, антигенів Зігеріососсиз рпетопіае і Меїівзегіа.
Антигени, що дають захист від інших захворювань, можна також комбінувати у вакцинному препараті за іФ) винаходом. ко В одному конкретному втіленні вакцинний препарат містить поверхневий антиген гепатиту В, отриманий способом виробництва за винаходом, разом з ад'ювантом і інактивованим вірусом поліомієліту. во За винаходом також запропонований спосіб лікування та/або профілактики вірусних інфекцій гепатиту В, при якому суб'єктові людині або тварині, що страждає вірусною інфекцією гепатиту В або сприйнятливому до неї, вводять безпечну й ефективну кількість вакцини за винаходом для профілактики та/або лікування інфекції гепатиту В.
У даному винаході також запропоноване використання поверхневого антигену гепатиту В за винаходом у 65 виготовленні ліків для лікування пацієнтів, що страждають вірусною інфекцією гепатиту В, такою як хронічна вірусна інфекція гепатиту В.
Вакцина за винаходом буде містити імунопротективну кількість цього антигену, і її можна отримати за допомогою загальноприйнятих методик.
Вакцинний препарат в цілому описаний у (Рпагтасеціїса! ВіоФесппоіоду, МоІ.61 Массіпе Юевідп - (Те зирипії апа адіомапі арргоасі, едйедй ру РомжеїЇ апа Мемжм/тап, Ріепит Ргезз, 1995. Мем/ Тгепаз апа ОемеІортепів іп
Массіпез, ейдіей ру МойПег еї аїЇ.,, Опімегейу Рагк Ргезвз, Ватоге, Магуїапа, ОА, 1978). Інкапсуляція у ліпосоми описана, наприклад, Ешегіюоп, |(патент США 4235877). Кон'югація білків з макромолекулами розкрита, наприклад, Гікпїе, |(патент США 4372945), і (Аттог еї аі., патент США 4474757). Використання Оці А розкрите
Оаїізгдаага еї аї!., (Асіа Меї Зсапа. 18:349 (1977)). ЗО-МРІ. доступний від Кірі Іттипоспет, ОЗА, і розкритий у 7/0 Ізваявці на патент Великобританії Ме2220211 і в патенті США 4912094). 2521 розкритий у (патенті США
Мо5057540).
Винахід проілюстрований, але не обмежений наступними прикладами, де: на Фіг.1 проїілюстрований процес отримання Епдегіх В м, вільний від тіомерсалу; на Фіг.2 проілюстрований електрофоретичний аналіз у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію 75 «ЗО5-РАСЕ) серій із загальної маси антигену; і на Фіг.3 показані залишкові дріжджові білки в серіях із загальної маси антигену, отриманого за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу.
Приклад 1:
Процес отримання поверхневого антигену гепатиту В у присутності тіомерсалу
Поверхневий антиген гепатиту В (НВзАд) моновалентної вакцини гепатиту В від ЗВ ВіоіодісаІз (Епдегіх Втм) експресується у вигляді рекомбінантного білку в Засспаготусевз сегемізіае |дивися Напога еї. аї. ос. сій.
Білок 24кД продукується внутрішньоклітинно і накопичується в рекомбінантних дріжджових клітинах. Наприкінці ферментації дріжджові клітини збирали та руйнували у присутності м'якого сурфактанту, такого як Твін 20, для вивільнення бажаного білка. Після цього клітинний гомогенат, що містить розчинні частки поверхневого Га р; антигену, повторно очищали в серії осаджень, а потім концентрували ультрафільтрацією.
Подальше очищення рекомбінантного антигену проводили в послідовних хроматографічних поділах. На і) першій стадії неочищений концентрат антигену піддавали гель-проникаючій хроматографії на середовищі сефароза 4В. Тіомерсал був присутній у буфері для елюції на стадії гель-проникаючої хроматографії 48. Буфер для елюції мав наступний склад: 10мММ Трис, 595 етиленгліколь, рН7,0, 5Омг/л тіомерсалу. Тіомерсалвключалив даний буфер для контролю біологічних забруднень. Більшу частину цього тіомерсалу видаляли під час наступних стадій очищення, включаючи іонообмінну хроматографію, ультрацентрифугування та знесолення Шк (гель-проникаюча хроматографія), так щоб препарати очищеної маси антигену, отримані за допомогою ч- основного процесу, містили приблизно 1,2мкг і менше ніж 2мкг тіомерсалу на 2Омкг білка.
Стадію іонообмінної хроматографії проводили, використовуючи ДЕАЕ-матрицю, а потім цей пул піддавали б ультрацентрифугуванню в градієнті цезію на 4-х попередньо встановлених шарах різних концентрацій хлориду /-|ч« цезію. Частки антигену відокремлювали від забруднюючих клітинних складових частин відповідно до їх щільності в зазначеному градієнті і елюювали наприкінці процесу центрифугування. Потім хлорид цезію видаляли з даного пулу за допомогою другої гель-проникаючої хроматографії на сефарозному гелі. «
Коли НВзАд отримували за допомогою процесу, що містить тіомерсал у буфері для гель-проникаючої хроматографії на 4В, концентрації білка більше ЗОмг/мл виділяли у вигляді об'єднаного НВзАд, що містить - с фракції з градієнта СзСіІ, що відповідають еквівалентній концентрації НВзАд, як оцінювали за допомогою набору ц АМБАУМЕ від АББОїй І арогайгієв. "» Стадія ультрацентрифугування в СзСІ успішно елімінує залишкові ліпіди, ДНК і мінорні білкові забруднення з препарату НВздАа. Її проводили шляхом зонального центрифугування в роторі Ті 15 від Весктап Іпзігитепів,
Ешегіоп, Саїйогпіа, зі швидкістю З0000об/хв протягом приблизно від 40 до 60 годин. Зразок, який підлягає -І очищенню, наносили на шари розчину Сз8Сїі з кінцевими концентраціями 0,75, 1,5, 2,5 і 3,25М Свсї. Наприкінці со центрифугування цей градієнт елюювали у вигляді фракцій. Фракції, що містять НВзАд, можна ідентифікувати по поглинанню УФ при 280нм або тестуванням розведень цих фракцій з використанням набору АЛОЗ2УМЕ. Смуга -і НВзАаЯ присутня при щільності від 1,17 до 1,23Зг/см3. сю 50 Розчин, що містить очищений НВвАд, стерильно фільтрували перед використанням для отримання вакцинного препарату. сл Очищення з дріжджового клітинного лізату є складним, оскільки антиген продукується внутрішньоклітинно, і для отримання очищеної маси антигену необхідний ряд методик розподілу, призначених для елімінації різних типів (дріжджових) забруднюючих речовин.
Стадії очищення є важливими, оскільки продукт, що підлягає очищенню, є ліпопротеїновою часткою, що о містить множинні копії поверхневого антигенного поліпептиду, і ця структура повинна бути збережена протягом усього процесу очищення. Особливість даного процесу полягає в тому, що він дає частки поверхневого антигену, іме) які є цілком імуногенними, без необхідності подальшої хімічної обробки для посилення імуногенності (у порівнянні з (ЕРО1354351). 60 Деталі цього процесу отримання додатково описані в |вропейському патенті 0199698).
Приклад 2
Отримання і характеристика НВзАд дріжджового походження за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу 1. Отримання та очищення НВзАд дріжджового походження 1.1. Опис процесу отримання бБ Поверхневий антиген гепатиту В можна отримати шляхом ферментації відповідного штаму Засспаготусевз сегемізіде, наприклад описаного ві| Напога еї аї (Іос. сіс)|.
Наприкінці великомасштабного процесу ферментації рекомбінантного штаму дріжджів клітини збирали та руйнували у присутності м'якого сурфактанту, такого як Твін 20. Потім поверхневий антиген виділяли за допомогою багатостадійної процедури екстракції та очищення, так само як описано вище в Прикладі 1, аж до стадії першої гель-проникаючої хроматографії на сефарозі 48. 1.2. Процес очищення, вільний від тіомерсалу
У процес, вільний від тіомерсалу, внесли наступні дві зміни у порівнянні з процесом, описаним у Прикладі 1. 1. Буфер для елюції на стадії гель-проникаючої хроматографії на 48 більше не мав тіомерсал. 2. Цистеїн (кінцева концентрація 2мММ) додавали до пулу елюату зі стадії аніонообмінної хроматографії. 70 Виявлено, що виключення тіомерсалу з буфера для гель-проникаючої хроматографії на 48 може призвести до осадження часток НВзАд під час стадії центрифугування в градієнті щільності С8СіІ із втратою продукту та агрегацією або грудкуванням виділеного антигену.
Додавання цистеїну в кінцевій концентрації 2мММ у пул елюату з попередньої стадії аніонообмінної хроматографії запобігає осадженню і втрату антигену під час центрифугування в градієнті щільності С8СІ.
Цистеїн є переважною речовиною для даної обробки, оскільки він є амінокислотою, що зустрічається в природі, і його можна видалити на наступній стадії знесолення на колонці для гель-проникаючої хроматографії, використовуючи як матрицю колонки сефарозу 4ВСІ ЕР.
Ніяких інших змін у процес виробництва у порівнянні з процесом, описаним у Прикладі 1, не вносилося.
Процес, вільний від тіомерсалу, дає загальну масу антигену зі ступенем чистоти і властивостями, порівнянними з антигеном, отриманим у процесі Прикладу 1. 1.2а
Гадають, що тіомерсал, доданий у буфер 4В в концентрації 5Омкг/мл, розкладається, і отримана в результаті етилртуть може ковалентно приєднуватися до вільних сульфгідрильних груп на цистеїнових залишках білка. Цей білок містить 14 цистеїнових. залишків, з яких 7 локалізовані між положеннями 101 і 150. сч
Вважають, що дана ділянка білка локалізована на поверхні частки і має головну антигенну ділянку НВзАд, що включає імунодомінантну ділянку а та сайт розпізнавання для моноклонального антитіла КЕ1 |МУаїегз . еї аї, і)
Розідгад. Меа. 9., 1987:63 (Зиррі.2): 51-56 і Авпіоп-Кіскагаї апа Мигтгау, 9. Мей. Мігоіоду, 1989: 29: 1961).
Антиген, очищений з використанням тіомерсалу, який присутній у буфері для гель-проникаючої хроматографії на 48, містить приблизно 0,5-0,бмкг ртуті наприкінці процесу очищення. Ця ртуть цілком не віддаляється простим ю зо Діалізом.
В одному експерименті на препараті із загальної маси антигену визначили 0,5бмкг ртуті на 20мкг білка. Цей о препарат піддавали діалізові протягом 16 годин при кімнатній температурі проти 150мМ Масі, 10МмМ МаРо М буфера з р 6,9. Наприкінці діалізу визначили концентрацію 0,3Змкг На на 2Омкг білка.
Навпроти, діаліз у присутності відновного агента, такого як І -цистеїн у концентрації від 0,1 до 5,Омг/мл, (22) дитіотрейтол (ДТТ) у концентрації 5ОММ або 2-меркаптоетанол у концентрації О,5М, з наступним другим діалізом ї- для видалення відновного агента, призводив до зниження вмісту ртуті в препараті антигену до концентрації менше ніж 0,025мкг ртуті на 20мкг білка. Ця концентрація є самою низькою границею виявлення даного способу.
Вміст ртуті визначали абсорбційною спектрофотометрією. Антиген розбавляли в розчині, що містить 0,0190 мас/об біхромату калію (КоСг2О7) і 595 об/об азотної кислоти. Стандартні розчини готували з тіомерсалом як « джерело ртуті. Атомну абсорбцію зразка і стандартних розчинів вимірювали після випару в парогенераторі з з с ртутєспецифічним катодом при 253,7нм. Атомну абсорбцію рідини, що розбавляє, виміряли як контроль. Вміст
Й ртуті в зразку обчислювали за допомогою каліброваних кривих, отриманих на підставі стандартних розчинів. и?» Результати виражали в мкг ртуті на 2Омкг білка. 1.3 Отримання загальної маси антигену, вільного від тіомерсалу
Стадії процесу очищення загальної маси антигену показані на Фіг.1. -І 1.4 Склад вакцинного препарату, виготовленого без тіомерсалу
Типовий кількісний склад для вакцини гепатиту В без консерванту, виготовленої з антигену, отриманого за ік допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, представлений у Таблиці 1. -І й о сл з о іме)
Цей склад можна варіювати додаванням 3О-МР'. та/або інших ад'ювантів. во 2. Характеристика антигену із загальної маси і вакцини, отриманих за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу 2.1 Тести та аналізи очищеної маси антигену 2.1.1 Основа для порівняння
Три серії із загальної маси антигену були отримані за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, 65 відповідно до даного прикладу (Приклад 1.2) та ідентифіковані як НЕРОО1, НЕРОО02 ії НЕРОО3. Ці серії порівняли із серією із загальної маси антигену (НЕР2055), отриманого за допомогою попереднього процесу (як описано в
Прикладі 1) у присутності тіомерсалу. 2.1.2 Тести та аналізи антигену із загальної маси
Три серії із загальної маси антигену, отримані за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, були протестовані, і результати підсумовані в Таблиці 2.
Вміст білка вимірювали методом І оу/гу еї аї! |У. Віої. Спет. 1951:193:265)І.
Вміст ендотоксину вимірювали за допомогою методики утворення гелю І ітиїшв5, використовуючи наявний у продажу набір від Саре Сой Аззосіа(ез, (704 Маїп 5ї., Раітоцій, МА 02540, ОА). Цей реагент стандартизований по еталонному стандарту ендотоксину 05 РІагт. Епдоїохіп Кетегепсе 5іапаага. 70 Твін 20 вимірювали методом Ниааіезіюоп апа Аїгеа |). Атег. ОЇЇ Спетіві Зос, 1965:42:983І.
Вміст НВзАд вимірювали за допомогою наявних у продажу набору Аи57УМЕ від АбБбої І арогайогіев, Опе
Аррої Рагк Коад, АБрброїї Рагк, І 60064, О5А. Використовували методику В від виробника. Серію із загальної маси антигену, очищеного за допомогою процесу, що містить тіомерсал, використовували як стандарт для побудови кривої доза-відповідь.
Полісахариди вимірювали методом Юирбоїз еї а/!. (АпаІ. Спет. 1956:28:350).
Ліпіди виміряли, використовуючи наявний у продажу набір (Мегкоїеві Тоїа! І ірідз 3321) від Е.Мегск, В.Р. 4119, Оагтвіад О-6100, Сегтапу.
Вміст ДНК вимірювали методом ТПгезпоїд, використовуючи апарат і реагенти, доступні від МоІесшаг ЮОемісев
Согр., ошепрегозігаВе 10, Ізтапіпд, Мипіси, Сегтапу.
Значення, визначені в цих тестах і аналізах, знаходяться в діапазоні, що спостерігається для серій із загальної маси антигену, виробленого з використанням тіомерсалу в буфері для елюції на стадії гель-проникаючої хроматографії на сефарозі 4В, за винятком антигенної активності згідно ЕГІЗА. Значення для даного вимірювання для трьох препаратів НЕЕ вище (1,63-2,25), ніж виявлені для серії із загальної маси антигену НЕР2О55, що має співвідношення ЕЇ ІЗА/білок 1,13. Співвідношення ЕЇ ІЗА/білок, виміряні за допомогою сч набору АОЗ7ЛУМЕ для тіомерсалвмісних серій із загальної маси антигену, як правило, дорівнюють приблизно 1,0 і знаходяться в межах діапазону 0,8-1,2 і дуже рідко перевищують 1,4. (8) 2.1.3 Електрофоретичний аналіз у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (ЗО5-РАСЕ)
Препарати із загальної маси антигену аналізували за допомогою електрофоретичного аналізу в поліакриламідному гелі з ЗОЗ у відновних умовах і при фарбуванні Кумасі синім. В усіх зразках виявлена ю зо основна смуга при 24 К із слідами димерного білка. Чистоту зразків оцінили як високу (ступінь очищення 29995), що визначили на підставі відсутності видимих смуг забруднюючих білків. о
Зразки (мкг) препаратів із загальної маси антигену аналізували за допомогою електрофоретичного аналізув М поліакриламідному гелі з ЗОЗ у відновних і не відновних умовах і при фарбуванні сріблом (Фіг.2). У відновних умовах у зразках виявили інтенсивну смугу, що мігрує при 24 К, із слідами димерних і мультимерних форм. ме)
Картини гелів невідмітні від картини НЕР20О55 як порівняння. Пробіг зразків також проводили у не відновних ї- умовах. В цих умовах менша кількість матеріалу мігрувала при 24 К і кількість поліпептиду, що мігрує в димерних і мультимерних положеннях, збільшилася. Серії із загальної маси антигену, вільного від тіомерсалу, очевидно, мають трохи більш високу ступень полімеризації, ніж порівняльна серія НЕР2О55.
Ідентичність 24 К поліпептиду, виявленого фарбуванням Кумасі синім або сріблом, підтвердили за « допомогою Вестерн-блотінгу з використанням поліклональних антитіл кролика, індукованих проти НВзАд плазми. пт) с У препаратах із загальної маси антигену виявлена основна смуга при 24 К разом з димерними і тримерними формами. Ця методика дозволила виявити мінорні сліди продуктів розпаду білка поверхневого антигену. Не ;» було різниці між антигеном із загальної маси, отриманого за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, і серією НЕР2О55.
Присутність залишкових дріжджових білків аналізували за допомогою електрофоретичного аналізу в -І поліакриламідному гелі з 505 у відновних умовах і Вестерн-блотінгу з кролячою поліклональною антисироваткою, індукованою проти дріжджових білків (Фіг.3). Ця методика є якісною і не дозволяє здійснити се) кількісне визначення домішок. -І Однакова картина смуг виявлена для всіх трьох серій із загальної маси антигену, отриманих за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, і серії НЕР20О55 за одним винятком. о Більш важка смуга фарбування, що присутня при -23К в НЕР2О55 із загальної маси антигену, практично 4 відсутня у З препаратах НЕР. Вестерн-блотінг показав, що результатом процесу очищення, вільного від тіомерсалу, є більш чистий антигенний продукт. св о тест ю рве ввів вв во вв
Вміст ліпідів 13,7мкг 12,мкг 12,9мкг 11,вмкг
2.1.4 Інші біохімічні тести та аналізи 2.1.4.1 Вміст ДНК 9 Вміст ДНК у З серіях із загальної маси антигену вимірювали методом ТПпгезпоід (МоіІесшаг ЮОемісев Согр.).
Виміряні кількості були менші ніж 1Опкг ДНК на 2Омкг білка (Таблиця 2); той же рівень вмісту ДНК спостерігали для антигену із загальної маси, виробленого за допомогою апробованого на даний час процесу. 2.1.4.2 Амінокислотний склад
Амінокислотний склад трьох серій НЕЕ із загальної маси антигену визначали після кислотного гідролізу з то використанням бн. НСІ шляхом хроматографії амінокислот на іонообмінній колонці із виявленням нінгідриновим методом після колонки. Пролін і триптофан не визначали. Результати представлені в Таблиці 3.
Виявлені склади знаходяться в гарній відповідності з визначеними на НЕР2О55 і з очікуваним складом, виведеним на підставі послідовності ДНК. Хоча число гліцинових залишків, визначене для НЕР2О55, близько до очікуваного складу, для препаратів із загальної маси антигену більш звичайного визначали значення від 16 до то 17 залишків. Середнє число виявлених цистеїнових залишків дорівнює очікуваному числу 14, яке показує, що додаткові цистеїни не зв'язуються з часткою в результаті обробки на стадії градієнта щільності Св8сСІ. 2.1.4.3 Кількісне визначення вільного цистеїну
Кількість вільного цистеїну, що присутнє у препаратах із загальної маси антигену, отриманого відповідно до описаного способу, визначали після окислювання часток пероксимурашиною кислотою без попереднього кислотного гідролізу. Окислені вільні цистеїнові залишки розділяли на іонообмінній колонці з виявленням нінгідриновим методом після колонки. Границя виявлення цистеїну цим способом складає мкг на мл.
У З препаратах антигену НЕР неможливо було вимірити вільний цистеїн при тестуванні у вихідних концентраціях білка, наданих у Таблиці 2. ря За цією методикою виміряють як вільні цистеїнові залишки, що присутні у буфері, так і цистеїнові залишки, см що приєднані до білка НВзАд за допомогою дисульфідного зв'язку, але які не складають частину поліпептидної о послідовності. 2.1.4.4 Аналіз М-кінцевої послідовності
Наявність можливих білкових забруднень і продуктів розпаду в трьох серіях із загальної маси антигену, ою отриманих за допомогою модифікованого процесу, оцінювали за допомогою аналізу М-кінцевої послідовності, заснованого на деградації по Едману. У М-кінцевій послідовності МЕМІТ5... білка НВвзАд не знайшли с інтерференції з іншими послідовностями. Також підтвердили, що М-кінцевий метіонін на 60-7595 блокований М ацетилуванням, як раніше спостерігали для поліпептиду НВзАд, отриманого за допомогою загальноприйнятого процесу. (о) щі - «
Й - с т 77740746 ю568 г» пе до дом в ме 00118174 1 4100740017181008 - ї-о мет |вбв | вл мовам - я. о тв вврвввввв17060 с о лю | вдо) вдо! вдо! в 3 ка 2.1.4.5 Аналіз лазерного світлорозсіювання
Порівняння розмірів часток між частками НВзАд, отриманими при використанні модифікованого процесу, і бр еталонною серією НЕР2О55 проводили за допомогою лазерного світлорозсіювання (Таблиця 4). Визначені середні молекулярні маси показали хорошу відповідність між цими препаратами.
Мй
НЕРЕОО1 3,07х106
2.1.4.6 Електронна мікроскопія
Препарати із загальної маси антигену досліджували за допомогою електронної мікроскопії після фіксації і фарбування уранілацетатом.
Частки, що спостерігалися, були аналогічні у всіх зразках і мали конформацію часток -20нм напівсферичної 70 форми або форми кругляка, типову для НВзАд. Частки, що спостерігалися в З серіях НЕБЕ, були невідмітні від
НЕР2О55. 2.1.5 Імунологічні аналізи 2.1.5.1 Реактивність з моноклональним антитілом КЕ1
Три препарати з загальної маси антигену тестували на їхню реактивність з моноклональним антитілом КЕ1 з 75 використанням аналізу інгібування ЕГІЗА. Показано, що моноклональне антитіло КЕЇ захищає шимпанзе від контрольного зараження НВУ, і, як вважають, воно розпізнає захисний конформаційний епітоп на частці НВзАд
Гмагвгоп 5. еї аї, 1985, 9. Мед. Мігої., 16: 89-96).
Гібридому КЕ1 можна культивувати в черевній порожнині мишей Ваїрс або в культурі тканини.
Асцитичну рідину, розведену в концентрації 1/50000 у буфері насичення (фосфатно-сольовий буфер (ФСБ), що містить 195 бичачого сироваткового альбуміну (БСА), 0,195 Твін 20), змішували 1:1 з різними розведеннями зразків НВзАаЯ, які підлягають тестуванню, у ФСБ (кінцеві концентрації, що знаходяться в діапазоні від 100мкг до О,О05мкг/мл).
Суміші інкубували в імунологічних планшетах Мипс (96 лунок) протягом 1 години при 372С, після чого їх переносили на 1 годину при 372С на планшети, покриті стандартним препаратом НВзАд. Цей стандартний с препарат НВзАЯ є серією із загальної маси антигену (Нер 286), очищеного за допомогою процесу, що містить (3 тіомерсал. Після стадії відмивання ФСБ, що містить 0,195 Твін 20, додавали кон'югований з біотином баранячий антимишачий Ідс, розведений 1/1000 у буфері насичення, і інкубували протягом 1 години при 37 2С. Після стадії відмивання в ті ж лунки додавали стрептавідин-біотінілірований пероксидазний комплекс, розведений 11000 у буфері насичення, та інкубували протягом ЗОхв. при 37 «С. Планшети відмивали та інкубували з що розчином ОРОА 0,0495, НО» 0,0395 у О,1М цитратному буфері з рН4,5 протягом 20хв. при кімнатній температурі. «9
Реакцію зупиняли додаванням 2н. Н.О, і вимірювали оптичні щільності (0.0.) при 490/63Онм і наносили їх на графік. -
ЇК50О, визначену як концентрація антигену (інгібуюча концентрація), що інгібує 5095 зв'язування антитіла з (о) покритим НВзгАЯ, обчислювали, використовуючи рівняння з 4 параметрами, і виражали в нг/мл.
Також тестували ряд серій антигену НЕР разом з антигеном 90 вірусу простого герпесу як негативний - контроль. У цьому аналізі виміряють здатність кожного антигену, який тестують, інгібувати зв'язування КЕ1 зі стандартним препаратом антигену (НЕР286),. зв'язаним з титраційними мікропланшетами.
У Таблиці 5 надані концентрації кожного антигену, для якого виявлене інгібування 5095 зв'язування КЕ1 з « дю фіксованим антигеном. з с » " моноклонального антитіла КЕ1 з НВзАд 4 -
Ф в о» 70 сл
Результати показують, що для інгібування зв'язування КЕ1 необхідно в 4-7 разів менше антигену НЕЕ (Таблиця 5). Це свідчить про те, що антиген, отриманий за допомогою модифікованого процесу, має підвищену о презентацію епітопу КЕ1 у порівнянні з НЕР із загальної маси антигену. ко Такий же тип аналізу інгібування проводили, використовуючи людську сироватку від вакцинованих
Еподегіх Втм замість КЕ1 тАБ, і не виявили різниці між антигенами серій НЕР і антигенами НЕР. 60 2.1.5.2 Афінність зв'язування з моноклональним КЕ1
Кінетичні параметри зв'язування моноклонального антитіла КЕТ з З серіями антигену НЕЕ і з НЕР2О55 виміряли на підставі резонансу поверхневого плазмону, використовуючи апарат Віасоге 2000 від Атегепат
Ріпагтасіа Віоїесй, Атегепат Ріасе, І іШе Спанопі, Виске ОК.
Виміряні кінетичні параметри були слідуючими: 65 Ка: константа швидкості асоціації (М 87;
кд: константа швидкості дисоціації (873;
Ка: константа рівноваги або афінності (М), де Ка-ка/кд
Виявлені значення надані в Таблиці 6.
Загальна маса антигену ка | кдд | ка ю
Три серії антигену НЕЕ дали аналогічні значення констант асоціації/дисоціації та афінності зв'язування.
Навпаки, НЕР2О55 має більш слабку афінність зв'язування з КЕ1.
Ці результати відповідають результатами аналізу інгібування ЕЇ ІЗА, який показав, що антиген, отриманий за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, має підвищену презентацію епітопу КЕ1. 2.2 Тест і аналізи вакцинного препарату з антигеном, отриманим за допомогою модифікованого процесу
Три серії антигену НЕР адсорбували на гідроксиді алюмінію і включали в препарат у вигляді вакцини відповідно до складу, наведеному в Таблиці 1. Ця вакцина була представлена у вигляді дорослої дози у флаконах (2Омкг антигенного білка в мл). Серії ідентифікували як ОЕМЗООТА4, ОЕМ5О02А4 і ОЕМБООЗАЯ.
Ефективність вакцини визначали на підставі іп міго аналізу вмісту антигену, використовуючи набір АЛОЗАУМЕ СІ ЕПЗА від АБрої І арогафогіез і класичну серію вакцини, у препарат якої включено 50мкг/мл тіомерсалу, як (5) стандарт. Ефективність вакцини визначали, використовуючи спосіб В, як описано в |Рпагтавигора 5Зресіа! Ізвие
Віо97-2 (ЮОесетрег 1997)). Три серії НЕЕР дали високі значення вмісту антигену, майже в двічі вище встановленого вмісту 20мкг антигенного білка. 2.2.1 Реактивність вакцини ОЕМ з моноклональним антитілом КЕ1 ІФ)
Антигенність адсорбованої вакцини додатково тестували в аналізі інгібування з моноклональним антитілом с
КЕТ1. У цьому аналізі вимірюють здатність зразка вакцини інгібувати зв'язування КЕ1 з фіксованим антигеном із загальної маси (НЕР 286). -
Асцитичну рідину, розведену в концентрації 1/50000 у буфері насичення (ФСБ, що містить 195 БСА, 0,195 Твін Ф 20), змішували 1:1 з різними розведеннями зразків вакцини, що підлягають тестуванню, у ФСБ (концентрація, що з5 знаходиться в діапазоні від 20мкг до О,05мкг/мл). -
Суміші інкубували в імунологічних планшетах Мипс (96 лунок) протягом 2 годин при 372С при струшуванні, після чого їх переносили на планшети, покриті НВзАд. Препарат НВзАа, який використовували для покриття, був серією із загальної маси антигену (Нер 286), очищеного за допомогою процесу, що містить тіомерсал. Потім ці « планшети інкубували протягом 2 годин при 372С при струшуванні. Після стадії відмивання ФСБ, що містить 0,190
Твін 20, додавали кон'югований з біотином баранячий антимишачий Ідс, розведений 1/1000 у буфері насичення, З с та інкубували протягом 1 години при 37 оС. Після стадії відмивання в ці лунки додавали "» стрептавідин-біотинілірований пероксидазний комплекс, розведений 1/1000 у буфері насичення, і інкубували " протягом ЗОхв. при 37 "С. Планшети відмивали та інкубували протягом 20Охв. при кімнатній температурі з розчином, що містить ОРОА 0,0495, НьО» 0,0395 у О,1М цитратному буфері рН4,5. Реакцію зупиняли додаванням 2н. НьЬЗо, і вимірювали оптичні щільності (0.0.) при 490/6ЗОнм і наносили їх на графік.
Ше ЇК50О, визначену як концентрація антигену (інгібуюча концентрація), що інгібує 5095 зв'язування антитіла з
Те) покритим НВзгАЯ, обчислювали, використовуючи рівняння з 4 параметрами, і виражали в нг/мл.
Вакцину, виготовлену з загальної маси антигену, отриманого за допомогою модифікованого процесу,
Ше порівнювали з вакциною Епдегіх Втм, у препарат якої включений класичний антиген із загальної маси НЕР, і 9) 20 без тіомерсалу як консервант.
Аналізи проводили в трьох повторностях. сл Результати надані в Таблиці 7, і вони показують, що приблизно половина кількості вакцини ОЕМ5 необхідна для досягнення 5095 інгібування зв'язування КЕ1 у порівнянні з вільною від консерванту вакциною Епдегіх В тм,
Ці результати відображають підвищену презентацію епітопу КЕ1 на антигені НЕР/ОЕМ5, що відповідає тестам, 59 які були проведені з антитілом КЕ1 на очищеній масі антигену. о "
КЕ1 препаратом вакцини бо ОЕМБООЗАХ в17 бв5 БВ? 695
; (1) концентрація вакцини, яка інгібує 5095 зв'язування антитіла КЕ1 з фіксованим антигеном 2.2.2 |Імуногенність вакцини ОЕМЗ на мишах
Дослідження проводили на мишах Ваїр/С з метою порівняння імуногенності трьох серій консистенції ОЕМ5 з
Епдегіх Втм, отриманої відповідно до звичайного процесу виробництва антигену, у препарат якої включений 70 тіомерсал.
Тестували наступні серії:
Я ОЕМЗООТА4
ЯрЕМЗОО02АХ
ЯрЕМЗООЗАХ т ЯЕМО2953А4/О як порівняння
У короткому викладі, групи з 12 мишей імунізували внутрішньом'язово двічі з 2-тижневим інтервалом дозами вакцини, що відповідають 1/10 (2мкг) або 1/50 (0,4мкг) дорослій дозі для людини. Моніторинг антитільної відповіді на НВзАа та ізотипічного профілю, індукованого вакцинацією, проводили на сироватках, взятих на добу 28.
Схема експерименту
Групи з 12 мишей Ваї!р/С імунізували внутрішньом'язово в обидві лапи (2х5Омкл) на добу 0 і 15 наступними дозами вакцини: см о ою зо
Фо м в обетеденя куРоммасі ом лик
Ф зв 8 оожеденняєкуРОгчасі мк од ч
На добу 15 (2 тижні після І) і 28 (2 тижні після ІІ) кров брали з ретроорбітального синусу.
Для схеми даного експерименту (4 препарати х 2 дози з 12 мишами на групу) імуногенність оцінювали « апріорі з використанням статистичної програми РАБ5. Статистичну програму РАЗЗ (Рожшег апа Затріе 5іге) отримали від МС55, 329 Мой 1000 Еаві, КаузуШе, (ап 84037. Для 2-факторного дисперсійного аналізу - с 2,5-кратна різниця СМТ (середньогеометричні титри) між препаратами з помилкою альфа 595 повинна бути ц виявлена при імуногенності 29090. ,» Результати
Серологія:
Гуморальні відповіді (сумарні Ід та ізотопи) виміряли за допомогою аналізу ЕГІЗА, використовуючи НВзАд - І (Нер286) як покриваючий антиген і кон'юговані з біотином антимишачі антитіла для виявлення зв'язування анти-НВз антитіла. Аналізували тільки сироватки після ЇЇ. ї-о У Таблиці 9 показані середнє і МТ (середньогеометричні титри) відповідей анти-НВз Ід антитіл, виміряні - І на індивідуальних сироватках через 2 тижні після Ії.
Порівнянні антитільні відповіді були індуковані ОЕМЗ і класичними препаратами гепатиту В: МТ, що
Мн знаходиться в діапазоні від 2304 до 3976ЕШ/мл для серій ОЕМ5 у порівнянні з 2882ЕШ/мл для моновалентної сл вакцини гепатиту В від 5В Віоіодісаів (Епдегіх Втм), при дозі 2мкг, і СМТ, що знаходиться в діапазоні від 696 до 1182ЕШ/мл для серій ОЕМ5 у порівнянні з 627ЕШ/мл для моновалентної вакцини гепатиту В від ЗВ ВіоіодісаЇв (Еподегіх Втм), при дозі 0,4мкг. - Як очікувалося, ефект діапазону дозування чистого антигену спостерігали для всіх препаратів при дозах о 2мкг і О,4мкг із 3-6-кратною різницею у СМТ. - Спостерігалися чотири миші, які не індукували відповідь (титри «Б5ОЕШ/мл), без чіткого зв'язку з дозами іме) або серіями антигену, використовуваними для ін'єкції (групи 1, 2, З і 8; одна миша на групу).
На підставі статистичного аналізу (тест Грабса) ці миші були виключені з подальшого аналізу. 60
Група Вакцина Доза Число вв 2 Одмкг 11 1283. 1182 вам» | вт 610000 соя» | вв 1 оямк мо) з) в
Статистичний аналіз: 70 2-факторний дисперсійний аналіз проводили на титрах анти-НВз після перетворення в од даних після Ії, використовуючи вакцини (4 серії) і дози антигену (2мкг і 04мкг) як фактори. Даний аналіз підтвердив, що спостерігається статистично значима різниця між двома дозами антигену (значення р «0,001), і не показав будь-якої значимої різниці між серіями вакцини (значення р-0,2674). Як згадано раніше, імуногенність оцінювали апріорі, і схема експерименту було такою, що 2,5-кратна різниця МТ з помилкою альфа 595 може бути виявлена між препаратами при імуногенності 290965.
Ізотипічний профіль:
У Таблиці 10 показаний перерозподіл ізотипів (401, Ідбс2а і Ідс25), обчислене на підставі аналізу об'єднаних сироваток після ІІ. - Як очікувалося, цими вакцинами на основі галунів індукована чітка ТНо2-відповідь, оскільки спостерігалися головним чином антитіла ІдС1.
У відношенні ізотипічного профілю не спостерігали різницю між серіями ОЕМЗ або моновалентною вакциною гепатиту В від ЗВ Віоіодісаїв. ся » Група | Вакцина | Доза о вола вою 21 оммервтуі в |в ю зо 41000000 зоммервиуі в т о 5 зрЕМеоозАя о омео вв 1 т 6 | .юрл оямк в я | з 7 зЕмогевадно | гмео |в 84 Ф о лоиме)вв) в з ї-
Приклад 3. Препарат комбінованих вакцин
Загальна маса антигену за винаходом є особливо підходящою для приготування препарату у вигляді комбінованої вакцини, яка містить інактивований вірус поліомієліту (ІРМ). « 20 Дослідження стабільності, проведені на вихідних серіях комбінованої вакцини ЮОТРа-НВМУ-ІРМУ, показали ш-в зниження ефективності ІРМ-Компонента, зокрема антигену поліомієліту типу 1, при використанні в імунологічному с аналізі іп міго (визначення вмісту Ю-антигену за допомогою ЕЕ! ІЗА) і в тесті на ефективність іп мімо у :з» пацюків. Не спостерігалося втрати ефективності для типу 3. Для типу 2 втрата ефективності знаходилася в межах очікуваного діапазону (не більш ніж 10905 втрат на рік збереження).
Були початі дослідження для визначення причини зазначеної втрати ефективності в комбінованій вакцині - ОтТРАа-НВУ-ІРУ. На підставі спостереження того факту, що стабільність ІРМ у вакцині ОТРа-ІРМ від 5В ВіоіодісаЇв є задовільною (втрата не більш ніж 1095 вмісту антигену на рік збереження), зробили висновок, що се) НВМ-компонент, імовірно, відповідальний за нестабільність ІРМ у вакцині ОТРа-НВМ-ІРМ. - НВм-компонент, використовуваний у вихідному препараті ОТРа-НВМ-ІРМ, є очищений НВзАд, отриманий 5р Методом рекомбінантної ДНК із культури дріжджів, що також використовували для виробництва моновалентної о вакцини гепатиту В від ЗВ Віоіодіса!в і отримали, як описано в Прикладі 1. «п Як першу спробу визначити, який елемент у НВМ-компоненті є несприятливим для ІРУМ, загальну масу НВзАд аналізували на присутність тіомерсалу. Раніше було виявлено |Оамізвоп еї аї., 1956, 9 ар. Сіїп. Меа. 47:8-191), що тіомерсал, використовуваний як консервант у ЮТР-вакцинах, "є несприятливим для вірусу поліомієліту у комбінації ОТР-ІРМ. Це спостереження було враховано виробниками вакцини, які замінили тіомерсал іншими консервантами для виготовлення препаратів ІРМ-вмісних вакцин. Зовсім недавно вплив (Ф) тіомерсалу на ефективність ІРМ в умовах тривалого збереження при 42 досліджували повторно. Повідомляли ко про втрату ефективності антигену вірусу поліомієліту типу 1 до невиявлених рівнів після 4-6 місяців |Замуег
Г.А. еї а). 1994, Массіпе 12: 851-856). во Використовуючи атомно-адсорбційну спектроскопію, знайшли приблизно 0,5мкг ртуті (На) на 20мкг НВзАаЯ в антигені, очищеному відповідно до Приклада 1.
Зазначена кількість ртуті (у вигляді тіомерсалу і хлориду етилртуті, продукту розкладання тіомерсалу) може знизити до невиявлених рівнів відповідь ЕГІ5А на вміст О-антигену типу 1 у концентраті ІРМ із загальної маси, інкубованому при 372С протягом 7 діб. 65 Встановлений спосіб вивільнення ртуті, яка присутня у загальній масі НВзАд. Припустили, що ртуть може бути зв'язана з тіоловими групами на частці НВзАад і може, отже, вивільнятися в присутності відновних агентів.
Після експериментування з іншими відновними агентами, був обраний І -цистеїн як агент для вивільнення ртуті з частки НВзАа. Після діалізу загальної маси НВзАад проти фізіологічного розчину, що містить 5,7ММ І -цистеїну, в утриманому розчині не знайшли ртуті (границя виявлення цього способу тестування: 25нг На/20мкг НВзАад).
Діалізований антиген змішували з концентратом ІРМ із загальної маси та оцінювали стабільність вірусу типу 1 шляхом виміру вмісту О-антигену після інкубації при 372 протягом 7 діб. Концентрат ІРМ із загальної маси, не змішаний і змішаний з НВзАд, не оброблений цистеїном, використовували як контрольні. Порівняльний титр
ЕПЗА отримали на зразках, що зберігалися при температурі від 422 до 82С протягом 7 діб.
Результати підсумовані в Таблиці 11. твенсс | тато ів
Дані, отримані на цих лабораторних препаратах, чітко демонструють, що стабільність вірусу поліомієліту типу 1 значно поліпшується, якщо НВвзАд оброблений цистеїном для видалення залишкової ртуті перед змішуванням з ІРМ.
Дані, представлені вище, також показують втрату вмісту О-антигену на 2395 у порівнянні з препаратом ІРМ с після інкубації протягом 7 діб при 37 С. Ці дані підтверджують нестабільність, властиву вірусові поліомієліту
Мапопеу типу 1, як повідомляли раніше |Замуег Г..А. еї а. (1994), Массіпе 12: 851-856). і)
Хоча комерційні серії вакцин ОТРа-НВУ-ІРМ і ОТРА-НВУ-ІРУ/НІЬ отримали, використовуючи процес діалізу з 5,7ММ І-цистеїном для видалення залишкової ртуті і збереження стабільності ІРМ, цей процес діалізу не підходить для великомасштабного виробництва і має серію додаткових стадій для отримання НВзАа, вільного ю зо Від тіомерсалу або ртуті.
Навпроти, НВзАд за винаходом, отриманий без тіомерсалу, можна безпосередньо використовувати в Ше препаратах комбінованих вакцин, що особливо містять ІРМ. ч- 4. Висновки
Раніше використовуваний процес очищення поверхневого антигену дріжджового походження містить стадію б»
Зв Гель-проникаючої хроматографії, де утримуюча ртуть протимікробна сполука тіомерсал включена в буфер для ч- елюції для контролю біологічних забруднень.
Від тіомерсалу не цілком очищаються під час наступних стадій процесу, так що приблизно 1,2мкг тіомерсалу на 2Омкг білка присутнє в очищеній масі антигену.
З метою отримання маси антигену, цілком вільного від тіомерсалу (ртуті), процес очищення змінили на двох « стадіях. шщ с - Тіомерсал виключили з буфера для елюції на стадії гель-проникаючої хроматографії на сефарозі 48. - Цистеїн (кінцева концентрація 2мм) додавали в пулу елюата зі стадії аніонообмінної хроматографії. Це ;» запобігає осадженню антигену під час центрифугування в градієнті щільності СвСІі.
Інших змін у процес виробництва не вносилося.
Охарактеризований антиген із загальної маси, отриманий за допомогою цього модифікованого процесу. -і Фізико-хімічні тести та аналізи показують, що антиген, вільний від тіомерсалу, не відрізняється за своїм властивостям від антигену, отриманого за допомогою раніше використовуваного процесу. Частки антигену ее, мають ті ж складові частини. -і Цей модифікований процес не впливає на ідентичність та цілісність поліпептиду НВзАад, про що можна судити 5р на підставі електрофоретичного аналізу в поліакриламідному гелі з БО5, Вестерн-блотіингу з використанням о поліклональних анти-НВзАд антитіл, аналізу М-кінцевої послідовності та амінокислотного складу. Електронна с мікроскопія та аналіз лазерного світлорозсіювання показують, що ці частки є частками типової форми і розміру, очікуваних для НВзАд дріжджового походження. Аналіз за допомогою Вестерн-блотінгу із сироваткою проти дріжджових білків показує, що антиген, отриманий за допомогою вільного від тіомерсалу процесу, має аналогічну ов Картину забруднюючих дріжджових білків. Однак, кількість забруднюючої смуги, що мігрує при 23К, значно знижено в З серіях НВзАд, отриманих при використанні даного модифікованого процесу. (Ф, Імунологічні аналізи показують, що частки, вільні від тіомерсалу, мають підвищену антигенність. Ці частки ка є більш реактивними при використанні набору АБрої АОЗ2АМУМЕ (який має суміш моноклонапьних антитіл), даючи співвідношення ЕЇ ІЗА/білок від 1,6 до 2,25. Така підвищена антигенність також показана з захисним антитілом бо КР. Для інгібування зв'язування КЕ1 зі стандартним фіксованим антигеном необхідно приблизно в 4-7 разів менше антигену, вільного від тіомерсалу. Криві інгібування зв'язування вільного від тіомерсалу і класичного антигену попадають у два різних сімейства. Така різниця також показана за допомогою вимірів константи афінності зв'язування для КЕ при використанні резонансу поверхневого плазмону. Афінності зв'язування препаратів, вільних від тіомерсалу, у 3-4 рази вище в порівнянні із серією класичного антигену із загальної маси. 65 Препарати антигену із загальної маси включали в препарат у вигляді вакцини шляхом адсорбції на гідроксиді алюмінію і без консерванту.
Тестування на ефективність іп міго при використанні набору для ЕГІЗА АБрої АОЗ2УМЕ і такої що містить тіомерсал моновалентної вакцини гепатиту В від ЗВ Віоіодісаїє як стандарт показало, що отримано високі значення ефективності іп міго. Вміст антигену, виміряний за допомогою цього тесту, було майже в двічі вище
Встановленого значення 2Омкг білка на мл.
Підвищену реактивність вакцини, отриманої на основі антигену, вільного від тіомерсалу, також спостерігали в аналізі інгібування з моноклональним антитілом КЕ1 на зв'язування з фіксованим антигеном. Для отримання 5090 інгібування зв'язування КЕ1 з фіксованим антигеном була потрібна приблизно половина кількості вакцини, вільної від тіомерсалу, у порівнянні з антигеном, очищеним за допомогою раніше використовуваного процесу і 7/0 Включеним у препарат без консерванту.
Така підвищена антигенність вакцини, вільної від тіомерсалу, у відношенні КЕ1 відповідає результатами тесту на ефективність іп мйго (вміст антигену) і з тестами з використанням антитіла КЕ1, проведеними на препаратах антигену із загальної маси.
Тест на імуногенність на мишах проводили, використовуючи праймінг і бустерні вакцинації з інтервалом 2 /5 Тижні і дозами 2 і 0,4мкг антигену. У мишей брали кров на добу 28, через 14 діб після бустерної вакцинації.
Сироватки аналізували на титр антитіл і ізотипічний склад. Ефект дози чистого антигену спостерігали для цих двох введених доз, але не спостерігали статистично достовірної різниці у відповіді у відношенні титрів антитіл (МТ) між вільною від тіомерсалу і вільною від консерванту вакцинами.
У ізотипічних профілях не спостерігали ніякої істотної різниці.

Claims (1)

  1. Формула винаходу
    1. Спосіб отримання вакцини гепатиту В, яка містить очищений поверхневий антиген гепатиту В, що містить сч ов Менш ніж 0,025 мкг ртуті на 20 мкг білку, та фармацевтично прийнятний ексципієнт, при якому цей антиген очищують у присутності відновного агента, що має вільну -5Н групу. о
    2. Спосіб за п. 1, де вакцина не містить консервант.
    3. Спосіб за п. 2, де консервантом є тіомерсал.
    4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, при якому антиген гепатиту адсорбують на гідроксиді алюмінію. ю зо 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, при якому неочищений препарат антигену гепатиту В (а) піддають гель-проникаючій хроматографії; о (б) піддають іонообмінній хроматографії; і їч- (в) змішують з відновним агентом, що має вільну -5Н групу.
    б. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, де відновним агентом є цистеїн, глутатіон, дитіотрейтол або (22) р- меркаптоетанол . -
    7. Спосіб за п. 6, де відновним агентом є цистеїн.
    8. Спосіб за п. 7, при якому цистеїн додають до кінцевої концентрації від 1 до 10 мм.
    9. Спосіб за п. 8, при якому цистеїн додають до кінцевої концентрації приблизно 2мММ. «
    10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, при якому антиген очищають у присутності тіомерсалу перед обробкою відновним агентом. - с 11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, де очищений антиген є цілком вільним від тіомерсалу. и 12. Спосіб за п. 11, де вакцина є вакциною, вільною від тіомерсалу. ,» 13. Вакцинна композиція, яка містить очищений антиген гепатиту В, що містить менш ніж 0,025 мкг ртуті на 20 мкг білка, що отриманий способом за будь-яким з пп. 1-12.
    14. Вакцинна композиція за п. 13 у сполученні з ад'ювантом. -| 15. Вакцинна композиція за п. 14, де ад'ювантом є сіль алюмінію. с 16. Вакцинна композиція за п. 15, де сіль алюмінію є гідроксидом алюмінію.
    17. Вакцинна композиція за пп. 13-16, що містить ТН-1-індукуючий ад'ювант. -і 18. Вакцинна композиція за п. 17, де ТН-1-індукуючий ад'ювант вибраний із групи, що містить: 3-ОМРІ, сю 50....0521, З-ЮМРІ і 90521 та олігонуклеотид Сро.
    19. Вакцинна композиція за будь-яким з пп. 13-18, що додатково містить один або більш ніж один антиген, сл вибраний із групи, що складається з: дифтерійного анатоксину (0), правцевого анатоксину (Т), безклітинних коклюшних антигенів (Ра), інактивованого вірусу поліомієліту (ІРМ), антигену Наеторпйиз іпПчепгае (НІВ), антигену гепатиту А, вірусу простого герпесу (НМ), хламідії, ОВ, НРУ, антигенів Зігеріососсив рпеитопіає і Меїіззегіа. о 20. Використання поверхневого антигену гепатиту В, що містить менш ніж 0,025 мкг ртуті на 20 мкг білка, у виготовленні вакцини проти гепатиту, вільної від консерванту, причому цей антиген отриманий шляхом іме) очищення в присутності відновного агента, що має вільну -5Н групу.
    21. Спосіб отримання поверхневого антигену гепатиту В, що придатний для використання у вакцині, при бо якому цей антиген очищають у присутності відновного агента, що має вільну -ЗН групу, причому цей антиген очищують у присутності тіомерсалу перед обробкою відновним агентом.
    22. Спосіб отримання антигену гепатиту В за п. 21, де очищений антигенний продукт містить менш ніж 0,025 мкг ртуті на 20 мкг білка.
    23. Спосіб отримання антигену гепатиту В за п. 21 або 22, при якому неочищений препарат антигену гепатиту 65 В: (а) піддають гель-проникаючій хроматографії;
    (6б)) піддають іонообмінній хроматографії; і (в) змішують з відновним агентом, що має вільну -5Н групу.
    24. Спосіб отримання антигену гепатиту В за пп. 21-23, де відновним агентом є цистеїн, глутатіон, дитіотрейтолабо д--меркаптоетаноло-
    25. Імуногенний антиген гепатиту В, що містить менш ніж 0,025 мкг ртуті на 20 мкг білка, отриманий шляхом очищення у присутності відновного агента, що має вільну -ЗН групу, і де цей антиген очищений у присутності тіомерсалу перед обробкою відновним агентом.
    26. Вакцина, що містить антиген гепатиту В за п. 25.
    27. Спосіб лікування та/або профілактики вірусних інфекцій гепатиту В, при якому суб'єктові - людині або тварині, що страждає вірусною інфекцією гепатиту В або сприйнятливому до неї, вводять безпечну та ефективну кількість вакцини за будь-яким з пп. 13-19 та 26. с щі 6) ІС) (зе) ча (о)
    м. -
    с . и? -І се) -І о) 70 сл іме) 60 б5
UA2003021025A 2000-08-10 2001-07-08 Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах UA79735C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) 2000-08-10 2000-08-10 Novel treatment
GB0101334A GB0101334D0 (en) 2001-01-18 2001-01-18 Novel compounds
PCT/EP2001/009100 WO2002012287A1 (en) 2000-08-10 2001-08-07 Purification of hbv antigens for use in vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA79735C2 true UA79735C2 (uk) 2007-07-25

Family

ID=26244821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2003021025A UA79735C2 (uk) 2000-08-10 2001-07-08 Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах

Country Status (36)

Country Link
US (3) US20030235590A1 (uk)
EP (2) EP1307473B1 (uk)
JP (2) JP2004505992A (uk)
KR (1) KR100804922B1 (uk)
CN (1) CN1468256B (uk)
AP (1) AP2003002734A0 (uk)
AR (1) AR030325A1 (uk)
AT (2) ATE313558T1 (uk)
AU (2) AU8207301A (uk)
BG (1) BG66038B1 (uk)
BR (1) BRPI0113155C1 (uk)
CA (2) CA2427475C (uk)
CY (2) CY1106310T1 (uk)
CZ (1) CZ303217B6 (uk)
DE (2) DE60136400D1 (uk)
DK (2) DK1307473T3 (uk)
DZ (1) DZ3470A1 (uk)
EA (1) EA006433B1 (uk)
EG (1) EG25829A (uk)
ES (2) ES2254464T3 (uk)
HK (1) HK1056884A1 (uk)
HU (1) HU228932B1 (uk)
IL (2) IL154301A0 (uk)
MX (1) MXPA03001235A (uk)
MY (1) MY128999A (uk)
NO (1) NO20030635L (uk)
NZ (1) NZ524012A (uk)
OA (1) OA12361A (uk)
PE (1) PE20020287A1 (uk)
PL (1) PL204736B1 (uk)
PT (1) PT1666487E (uk)
SI (2) SI1307473T1 (uk)
SK (2) SK288079B6 (uk)
UA (1) UA79735C2 (uk)
UY (1) UY26882A1 (uk)
WO (1) WO2002012287A1 (uk)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
GB0202901D0 (en) * 2002-02-07 2002-03-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
BRPI0613025A2 (pt) * 2005-07-11 2010-12-14 Globeimmune Inc composiÇço para reduzir a resistÊncia a um agente, mÉtodo para a preparaÇço de um veÍculo de levedura e uso da composiÇço
EA014314B1 (ru) * 2005-08-02 2010-10-29 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл Пониженная интерференция между маслосодержащими адъювантами и антигенами, содержащими поверхностно-активные вещества
GB0522765D0 (en) * 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0612142D0 (en) 2006-06-20 2006-08-02 Secr Defence Spreading modulation spectrum control
EP2066344B2 (en) 2006-09-07 2016-06-29 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Inactivated Poliovirus combination vaccine
EA201490303A1 (ru) 2007-05-02 2014-05-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина
WO2009057699A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Kyocera Corporation 弾性波装置
US8250102B2 (en) * 2008-03-14 2012-08-21 Microsoft Corporation Remote storage and management of binary object data
KR100959145B1 (ko) 2008-03-21 2010-05-25 중앙대학교 산학협력단 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법
CA2725329C (en) * 2008-05-23 2013-10-01 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
EA020617B1 (ru) * 2009-05-27 2014-12-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Конструкции casb7439
PT2705365T (pt) * 2011-01-14 2016-09-19 Hal Allergy Holding B V Imunoensaio para determinação direta do teor de antigénio de produtos compreendendo partículas de antigénio acoplado a adjuvante
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
CA3070039A1 (en) 2017-07-18 2019-01-24 Serum Institute Of India Pvt Ltd. An immunogenic composition having improved stability, enhanced immunogenicity and reduced reactogenicity and process for preparation thereof
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
CA3132601A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b immunisation regimen and compositions
AU2020403296A1 (en) * 2019-12-13 2022-07-07 Grand Theravac Life Science (Nanjing) Co., Ltd. Immunostimulatory composition and use thereof

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1030777A (en) * 1963-12-06 1966-05-25 Ciba Ltd Method of preparing a vaccine against trypanosoma cruzi infections
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4720385A (en) * 1983-03-29 1988-01-19 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
JPS6013718A (ja) 1983-07-05 1985-01-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｂ型肝炎ワクチン
KR850001534A (ko) 1983-08-22 1985-03-30 제임스 에프. 나우톤 형질전환된 효모로 부터 유도된 면역원성 HBsAg
US4683294A (en) 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
US4895800A (en) 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
EP0278940A3 (en) 1987-01-30 1988-12-07 Smithkline Biologicals S.A. Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
DE3789866T2 (de) 1987-07-17 1994-09-22 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh DNA-Moleküle, die für FMDH-Kontrollabschnitte und Strukturgene für ein Protein mit FMDH-Aktivität kodieren, sowie deren Anwendung.
EP0314240A3 (en) * 1987-10-26 1990-03-28 Merck & Co. Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
JPH085804B2 (ja) 1988-04-28 1996-01-24 財団法人化学及血清療法研究所 Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5242812A (en) * 1989-02-07 1993-09-07 Bio-Technology General Corp. Method for production and purification of hepatitis B vaccine
US5274081A (en) * 1989-09-20 1993-12-28 Immuno A.G. Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen
GB9007024D0 (en) 1990-03-29 1990-05-30 Imperial College Novel vaccine
WO1992011291A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
JP3026029B2 (ja) 1991-04-26 2000-03-27 財団法人阪大微生物病研究会 組換え水痘ウイルスとその作製法
AU657168B2 (en) 1991-09-18 1995-03-02 Amgen, Inc. Hepatitis B vaccine with bile salt adjuvant
US6620414B2 (en) * 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
HU219808B (hu) 1992-06-25 2001-08-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Adjuvánst tartalmazó vakcinakompozíció és eljárás annak előállítására
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
CA2194761C (en) 1994-07-15 2006-12-19 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
DE69535530D1 (de) * 1994-10-24 2007-08-16 Ophidian Pharm Inc Impfstoff und Antitoxine zur Behandlung und Vorbeugung von C. Difficile Krankheiten
KR960023066A (ko) * 1994-12-10 1996-07-18 성재갑 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
BR9908599A (pt) * 1998-03-09 2000-11-14 Smithkline Beecham Biolog Composições combinadas de vacina
JP4620251B2 (ja) 1998-08-10 2011-01-26 アンチジェニックス・インコーポレイテッド Ｃｐｇおよびサポニンアジュバントの組成物並びにその方法
JP2002532116A (ja) * 1998-12-23 2002-10-02 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 改良された組換えｂ型肝炎表面抗原
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах

Also Published As

Publication number Publication date
EP1666487B1 (en) 2008-10-29
AP2003002734A0 (en) 2003-03-31
BG107545A (bg) 2004-01-30
AU8207301A (en) 2002-02-18
CA2427475C (en) 2011-07-05
BRPI0113155B1 (pt) 2018-11-21
DK1307473T3 (da) 2006-05-01
DE60116107T2 (de) 2006-08-03
PL362322A1 (en) 2004-10-18
CZ2003385A3 (cs) 2003-06-18
JP2012255015A (ja) 2012-12-27
BRPI0113155B8 (pt) 2019-08-13
BRPI0113155C1 (pt) 2021-05-25
AU2001282073B2 (en) 2005-01-20
MY128999A (en) 2007-03-30
DK1666487T3 (da) 2009-01-12
DE60116107D1 (de) 2006-01-26
IL154301A0 (en) 2003-09-17
BR0113155A (pt) 2003-07-08
EP1666487A1 (en) 2006-06-07
UY26882A1 (es) 2002-03-22
PT1666487E (pt) 2008-12-26
KR100804922B1 (ko) 2008-02-20
ATE412665T1 (de) 2008-11-15
EP1307473A1 (en) 2003-05-07
AR030325A1 (es) 2003-08-20
ES2254464T3 (es) 2006-06-16
HU228932B1 (en) 2013-06-28
ES2314555T3 (es) 2009-03-16
US20090123496A1 (en) 2009-05-14
PE20020287A1 (es) 2002-06-20
CN1468256A (zh) 2004-01-14
EA006433B1 (ru) 2005-12-29
DE60136400D1 (de) 2008-12-11
CY1108789T1 (el) 2014-04-09
US8624004B2 (en) 2014-01-07
KR20030029127A (ko) 2003-04-11
SK288069B6 (sk) 2013-05-03
SK288079B6 (sk) 2013-06-03
CZ303217B6 (cs) 2012-05-30
SI1666487T1 (sl) 2009-02-28
OA12361A (en) 2004-04-13
EA200300129A1 (ru) 2003-10-30
DZ3470A1 (fr) 2002-02-14
BG66038B1 (bg) 2010-11-30
CN1468256B (zh) 2010-10-27
SI1307473T1 (sl) 2006-04-30
NZ524012A (en) 2004-02-27
WO2002012287A1 (en) 2002-02-14
HUP0302951A3 (en) 2004-10-28
SK1692003A3 (en) 2003-08-05
EP1307473B1 (en) 2005-12-21
MXPA03001235A (es) 2004-07-16
HK1056884A1 (en) 2004-03-05
JP2004505992A (ja) 2004-02-26
US20030235590A1 (en) 2003-12-25
NO20030635D0 (no) 2003-02-07
HUP0302951A2 (hu) 2003-12-29
CA2427475A1 (en) 2002-02-11
US20060159705A1 (en) 2006-07-20
CA2740282A1 (en) 2002-02-11
EG25829A (en) 2012-09-02
IL154301A (en) 2009-11-18
PL204736B1 (pl) 2010-02-26
JP5559847B2 (ja) 2014-07-23
ATE313558T1 (de) 2006-01-15
CY1106310T1 (el) 2011-10-12
NO20030635L (no) 2003-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA79735C2 (uk) Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
US5151023A (en) Hepatitis a,b-combined adjuvanted vaccine
AU2001282073A1 (en) Purification of HBV antigens for use in vaccines
US8591908B2 (en) Immunogen for preparation of therapeutic vaccines or drugs for treatment of hepatitis B and the producing method and use thereof
TW202203967A (zh) 不活化ＳＡＲＳ—ＣｏＶ—２病毒疫苗
WO2013003579A1 (en) Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of dengue virus infection
JPS6112894B2 (uk)
CA2086610A1 (en) Transfer factor and methods of use
WO2016083583A1 (en) Meningitis b vaccine
JP4974441B2 (ja) 抗原性凝集物を得る方法と製剤におけるその使用
BG100212A (bg) Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2
KR100587944B1 (ko) 보강제 및 ＨＢＶ 백신 성분인 Ｂ형 간염 바이러스의ｐｒｅ Ｓ단백질
NO20130773L (no) Metode for fremstilling av en vaksine
EP1256804B1 (en) HBcAg expression and diagnostic and therapeutic uses
Lobaina et al. Comparison of the immune response induced in mice by five commercial vaccines based on recombinant HBsAg from different sources, implications on their therapeutic use