HU228932B1 - Purification of hbv antigens for use in vaccines - Google Patents

Purification of hbv antigens for use in vaccines Download PDF

Info

Publication number
HU228932B1
HU228932B1 HU0302951A HUP0302951A HU228932B1 HU 228932 B1 HU228932 B1 HU 228932B1 HU 0302951 A HU0302951 A HU 0302951A HU P0302951 A HUP0302951 A HU P0302951A HU 228932 B1 HU228932 B1 HU 228932B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antigen
vaccine
hepatitis
adjuvant
preparation
Prior art date
Application number
HU0302951A
Other languages
English (en)
Inventor
Heyder Koen De
Peter Schu
Michelle Serantoni
Opstel Omer Van
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0019728.5A external-priority patent/GB0019728D0/en
Priority claimed from GB0101334A external-priority patent/GB0101334D0/en
Application filed by Glaxosmithkline Biolog Sa filed Critical Glaxosmithkline Biolog Sa
Publication of HUP0302951A2 publication Critical patent/HUP0302951A2/hu
Publication of HUP0302951A3 publication Critical patent/HUP0302951A3/hu
Publication of HU228932B1 publication Critical patent/HU228932B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
    • A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

A találmány áj eljárásra vonatkozik hepatitisz B vakéba eiŐáMáste, amely hepatitisz R-vkus (BBV) fertőzések kezelésében vagyptoSlaxl^l» íékife&azfetró,
A krőmkws hegedsz Bú-dos (H8V) fertőzés, amelyre jelenleg ssfe korlátozott kezelés sll rendelkezésre, hatalmas méred!, .globális egészségügy! problémát jelent. A BBV kránikns hordáséi, amelyek számát több, mint 380 millióm besfedk világswfe, veoélyeme^ek s krónfeuz skfe« kepfeóísA cfefeés és primer májsejtkaminőma kifejlődése szempm'kjőfeő!.
Sok vakcinában, amely jelenleg hozzáférhető, konwválészerre van szükség ahhoz, hogy romlását megakadályozzák, Bgylk gyakma alkalmazott konzervákkmer a tiomerzáh amely egy híganytamlmd vegyűlet Az BF 314240 «gy HRsAg készítményt ismertet, amely a végső vakcina készítményben tiomerzáíl Mte. Bizonyos aggodalmak tóműitek fel a higany vakcmákban RkWŐ alkalmazását fekintve, noha a szerzők hangsályczták, hngy a inmmraállartahná vakolnák potenciális :feőkő|ős sem ssahsB tálbeesdfei (Ofetd P, A, JAMA 203(10)1. Azonban elfeyűs lenne tij és pomcsőlBen fcbdossőpsussbb eljárásokat í;dá.hd vakcinák előállítására, hogy a tiomerzá! alkalmazása elkerülhető legyen a gyártási folyamatban. TeMt igény vas olyan fejlesztett vakcinákra, és kiidfeősess hepatitisz B vakcinába, amelyek űomwdütél mentesek.
A találmány ebe vonatkozásban eljárást búfestt fedél, nnnwngéa hepatitisz 8 vakcina előállítására, amely a tiomerzál nyomaitól mentes, amely felérés tsmbsm®za sr alábbi Lgbsebz:
(a) hepstitws 8 felőled antigént (HBsAg) fejezőnk ki rebosdbfedes protein formájában Sacoharomyees cmvisiae->bem <b) az éfessfe sejteket feldolgozva nyers antigén preparátamet álltok elő;
fe) a nyers sarlgős preparátumot gé! permeáeíéa ktomategrafálásnak vetjak. .Bő, ahol a gél peoseaelős tematngmfeláshoz fekfeswod elúoiós puBbr nem tartalmaz tíemerzált;
(d) e fe) lépésben kapott; és se; antigént tartalmazó elnátamoi fesusérés kromak^rafálfesak vetjük elő; fe) a (d) lépés után kapod, és az antigént tartalmazó elnátmnfeoa olszteiai adagolunk?
(1) sv (e) fepes szerinti preparátumot cézmm«kk»ídos altrseeatrífegálásaak véljük fed és (g) a tisztított ffifeAgA gyógyazetészetileg alkalmazható bonfezőanyaggáí kombinálva stabil,
Immanögén hepatitisz R vakcinát álltok elő, síről a kapott vakcinához ttoemáli nem adagolnak.
Az songén késelfefeny általában bonészáfeyomből «metas, ha tiomsmál ma detektálható a tisztított aatigfe. msfekléo a higany abszorpciós spektzofeiomettiás rwghsfemzásának alkalmazásával, a leírásban foglaltak szerint.
A hepatitisz amsgés psepsfefem higaaylamtma előayfeen kevesebb, mint. 0,025 pg per 20 pg protein, cétaeően abszorpciós spektrofetometriás meghatározás szériát
A tisztítást efeyőssn tlowral iávfeléfefeso b^jek végső, és a tlsAsfeb antigén teljesen mentes tfenwfetől.
kWlfefefeÁ JM3
Φ ΧφΦΧ X* *·**Φ X φ Φ Φ Φ .χ φ V X Φ *
V- ΦΦΦΦ Φ Φ * * Α· φ Φ ΧΧΦΦ *Φ
Az antigén olősyőm stabil, sélszerfem lényegben eggnstolyan stabil, utiut a tiemerxál jeleeiétébeu tisatitott hepatitisz antigén. melyet pélüánl az 1. példában mnatinok be<
A hepatitise antigén előnyösen imnumogén,
A redukálásáért előnyösen az antigén tisztítási etjárés soréti trdégtüjnk, előnyöse» az antigént expresszáló sejtek szspertiásrt utáu,
A redukálásáét eiszntia,
A találmány előnyösen tiotoerzálnyomek nálktili stabil tosmunogén hepatitisz 8 antigén előállítására, alkalmas elírást biztosít, amelynek erteknéhen az asligén tisztítását cjsxteln jelenlétében végezzük.
A tisztítást előnyösen s «tisztein oldatának jefettiéáiben hajtjuk végre.
A eisxtótt előnyösen. - adásiban vagy per ibrtnsbsn - sz eljárás során 1 és lő mM közötti előnyösen 1 S ®M végtereentifóőbau adagoljuk. Még előnyösebben a etszíetat körülbelül 2 mhá vágkoneenlráoiábaa aáagoljiik,
A eisziesn előnyőse» L~eisztem<.
Az íenesetéíö kromaíográtia előnyőse» ankmcssrálő kmmato^ráSa,
A találmány szerinti eljárás tehát tionmrzéhöl mente hepatitisz 8 antigént biztosit, ebet az antigén legalább annyira ímmtmogéa és antigén tidsjdonságő. srini a tiptnerzél jelenlétében előállknü hepatitisz 8 antigén.
A ialáltnény exermtí eljárás immonogén hepatitisz 8 antigént biztosit, amely kőmét nagyobb átlagos EUSA protein erénnyel és legalább S-szor kisebb ICfes értéké RFi tartalommal rendelkezik, mint a tiemerxál jelenlétében előállított: hepatitisz 8 felületi astigén,
A találmány szerint elöslittint hepatitisz 8 antigén hepatitisz 8 fertőzések kezelésére vagy megelőzésére, különösen például krónikus hepatitisz 8 fertőzések kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatő,
A találmány szerint előállított hepatitisz 8 antigént tsrtelntazé készítmény egy sdjnváasssl együtt állítható elő. Az adjuváas előnyöse» egy akuttiniusnső, vagy a Tt-lt sejtvélasz valamely előnyös stimulálom.
Az antigén előnyösen egy hepatitisz B felületi antigén.
A hepatitisz ti felületi átttigétt előállítása jöl tiokametnéh (lásd például blsrferá és munkatársai, Deveiöp, Biot Standard 54, 12S 0$Ő3>, öregg és roonkntArsat, Sloteetinology 5, 479 (1927), Bti'A-O52ö24ö, RP-A0299!ö2, és az ezekben teláibstő hivatkozások].
A leírásban a fegntiitisz 8 ielüfeti antigén.'' vagy ilösÁg* kifejezés bármely HtisAg; antigént vagy ennek fegmentutnás jelentheti, amely a HBV felületi antigén antigén tulsjötwsgévnl snntielkezik, Magától értetődő, hogy a HBsAg ti tetigén 226 arósmavfeál étié «kweíáján kívül [lásd Tloilaís és nmntmtáwí, Natúré 31?. 4Ü9 (1925) év az abban .található hlvatkozésok'j a ütiátinátry szerinti HBsAg kívánt esetben egy pre3 szekveneiát vagy annak egy részét Is tartalmazhass, a fent idézett irodalmak: és az· ΕΒ-Ά41278940 szánná szabaásltnt bariban fesnarintetiek szerint A káráéban HtisAg alatt ásnák variánsait, ttéltiánl 'terepe mutánsát* is érijnk, amelyet a WO 91/14705 színül szabadakul ionban isnientetitek.
BBsAg alatt érijük tsz £F 0192474 vagy az EE tiKMd'78 szétüti szabadak»! iratokban. ismerteteti itegzsptidakei is.
Normállá esetben a HtisAg szemcsés iórnvtibatt van. Egy külörtösen előnyős megvalósítás szerint a .HSsAg alapvetően s festi essitiett: HtisAg S-antigsktből áll ~ 3 * φ .< * * φ * « * * φ*
A vakcina előnyösen egy gyógyászatilag elfogadható segédanyagot, például egy megfelelő adjuvánst Is tartalmazhat. A megfelelő aá|uváasok kereskedelmi forgalomból beszerezhetők, ilyenek például & Freunddéíe mra-teljes adjutáns és teljes ndjnváns (Difco iUrboratóries, Detmít, Ml); a M«sá Adjnvmrt 65 (Merck and Gxnpany, (ne.., Rátóvtiy, N7k m AS-2 (SmithRIme Beechatn, 'Philadelphia, FA); az aíumiahmasők, péklátó az alumbunn-hidmxid gél (da®) vagy az ahunhüamdnsz&t; a kalcium, vas vagy cirsk sói; az aciiezert tirozín oldhatatlan szoszpoeztója; sóstóitól cukrok; .k&tieaoszn vagy stnonossn derivatiaáit pofeaehs-tóksk; ptós&iszktzéísctó bitóégitólsg. lebontható mikrngőmhők; mosöfítóortl-lipid A és guíl A. Citókinek, példán! GM-CSP vagy interíeukm-2, -7 vagy Ί 2 Is alkahna^aató adprvánakónt.
A vakcina készítmények»^ előnyös, ka az adjnváns kempezfcié elsődlegesen UíMipusó immunválaszt bitóitól, A Tál -típusú eitóktnek (például lPN-γ, TA'.Fe, iL-2 és it-12) sutgy koncentrációkban hsgl&mosak előnyben söszesitetó a sejtósutóláttó immunválasz tótósfetógtó egy beadott antigénre. Abban az esetben, hs a válasz tóstóltogesen Rs I-típusú, a Thl-típusá ekeidnek szintje nagyobb mértékben növekedik, mim a ΊΤ2dpysú «tőidnek <oitó)e. A fend eitokhek stótójes egyszerűen meghatározhatók stóttóstó vizsgálatókkal. A elsőidnek osztályozását léül például Mosntann és Cedfiaan citóben (Asa. Rév, ínmmnol. .7, 145-173 (1949)(
A?, elsődlegesen IH 1 - ítpsssú válasz ki váltására tóktóínatótató adjuváns lehet -például monofoszforíl-l^id A, előnyösen 3-dez-O-acilezets. monofosz&ril-^pid Á (3D-MPL) és egy slundalunssö kombinációja. Egyéb ismert sdjuvánsok, assslyek elsődlegesen ΪΒΙ-típusú immunválaszt indukálnak, példás! a CpG-tórttótoú oligOistóieebáAk. .Az oiigonukleoddok jellemzője, begy a CpG dimtkleodd nem meülezett. A fenti oligenuláeötótok jól tsstehek, és például a WO ŐŐ/Ő255S számú ssstódstóii publikációban kertótsk ismertetésre. Az immunstimuláiő tóttósú DNS szekvenciák is ismertek (lásd például Sete és munkatársai, Stóesce 273, 352 G9§ú}j, További előnyős edjuvána a szapenin, előnyösen a QS2I. (Aqnlla 8ieplmnnacea.ti.cah tóé,, Fmstssigtóis, MA), amelyet alkalmazhatunk önmagában, vagy egyéb adjnvánsokk^ ksuÁisátóétóm, Például egy előnyős rendszer mortöfoszíbrii-lgnd A és egy szspíttósszázssszék kombinációját, péklátó g QS2I és a 3DMFí, köiitóíttóeiéjá! tartalmazza, a WO WŐÖ153 számú szabadalmi sasban isssestetsttek szertót, -vagy W kevésbé seoksogén összetételt, ahol a Q82!-et któesztó'tóoG gyengítik, a WO 95/33739 számé szabadalmi iratban letrtók szerint. További előnyös któzitóíéoyek egy ohj-s-tózben típusú emulziói és tokofesolt tartalmaznak. Egy különösen erős ndjuváns készítményt, amely QS2.1-et, 3D-MPL-Í és totóerolt tasialmaz egy olei-íi-vtótósi tlpusá eussbléhso, a WO 95/17210 számát szabadalmi publikációban ismertetnek, ágy különösen erős sdjnvtós készítményt ismertetnek a WO 95/17219 számó szabadalmi publikációban, amely QS21-et, 3D-MF.L-Í és totóétól! tartalmaz etói-e-tósbee típnsá emtózídbso, és ez egy előnyös késtóhtóssy,
A vakcinák a hepatitisz B ftótóeti antigén mellett tartalmazhatnak egy TKl-mdakáló ítójuvéest se, A TH1 -Indukáló adjuvánst ŐD-MPl,, QS2I , a QS21 ős koleszterin keveréke ős egy CpO oligonuldeodd közöl választjuk, A tópetólsz B íehtótó antigént tartalmazd vakcinák hatása ktabató nmnetezforil-Upid A~vai> vagy sónak származékával, QS2! -gyei ős tetóemllal olaj-a-víkben Öpusá emehdótón.
A vakcnsa ektóyiwt tartalmaz továbbá sgy-' szitpötótó, otég etóeydsefebeo QS2í-et. Egy másik különösen tótósyds adtóvéos késztitnétry Cpö-t és egy szepetónr tóáslíssz & WO 09959159 számú szsí-sstóthtó publskétóétóto leírtak szerint, és ez egy eiéoyitó késztóodoy. Legtódoydsehbee ez az előnyős készítmény sesposítótétó QSll-et: tartalmaz. A készíhuóny előnyösen egy otóH-vktó«o dpotói emulziót és íokoléssdt: is tartalmaz.
A vakcina készítmény a hepatitisz ti felületi antigén mellett mrtalmaxhat egy adjuvánst, és ezenkívül dlflérA tesold (D), tetanusz ioxoíti (T), aeeÜulárís pertussía antigének (Pák rnaktlváll polío-vírua (ÍPV), haemopbilus influenzás antigén (Hiti), hepatitis A antigén, tepes sitnptex viríts 0ISV), ohlatnytils, G$B,. HFV, strepmcoccus pnemnouiae és netawia antigének kézül választott egy vagy több antigént. Egyéb betegségek ellesi védelmet biztosító zntlgétsek is jelen lehetnek a vakcina készítményben,
A vakcina készítmény a hepatitisz B felületi antigén mellett tartalmazhat egy adjuvánst és egy iaaktivált poláo-vímst.
A hepatitis® B vatóna készítmények felhasztsálhatók hepatitisz B-virus feríézésífe kezelésére és/vagy megelőzésére, amelynek serén hepatitisz B-vhu$ fertőzésbasí. szenvedő'vagy m érzékeny embernek vagy állatnak ilyen vakcina hatékony és biztonságira mennyiségét adagoljak.
A hepatitisz ti felöleli antigén felhasználható hepatitisz B-vhus fertőzésbe?*» pólósai tónikoa hepatitisz ti~vlms fefttizésbeo szenvedő bráagek kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
A vakcina az antigén Immortprofelitiv mennyiségét tartalmazza, és szokásos módszerekkel állítható elé,
A vakcina slfelllltást áltelfeteaságbatr az alábbi irodalmi helyeken ismertetik: Pharmaeeuílcal Blotechnology ói, Vaceine Design - ítie sufeun.it: and adjuvaat appeoach, sasi Povvell aod Keeanan, Plennm Fmss, 1995:; éten? Trends and Öevelepmenta in Vaccisea, szesk. Veder és munkatársai, Univesshy Park Press., Baltimore, Maryfand, USA, 1775. A lípoezómákbs zárást például Ftiderton kje le az US 429597? számó szabadalmi iratban. A póstensok konjugációját makromolekulákká például Likltite (1)9 4972945) és Arsnov és munkatársai (159 447475?) issnmetik. A Qttil A alkalmazását Dalagaard és munkatársai Írják le [Acta Vet Seand 1.5,949 (19??)), A 9D-MPL a Bibi ímmunoebemdél (USA) szerezheti) be, és a 2229211 számé GB szabadalmi bejelentésből és sz US 4912994 zzfefe) szafesfetinti iratból ismert A QS2!~fe. az US 5957540 számó szabadalmi Iratban ismertetik.
A találmányt - a korlátozás zsáatléka nélkül - az alábbi példákkal illusztráljuk.
Az I. ábrán mohájuk he az tingerla B!'** eléulliiösáí tiomerzáltiti mentes eljárással,
A 2. ábrán mutatjuk be az antigén anyagok SDS-PAöE aaalizísét éa a 3. ábrás ssohtijuk lse a liomerzálmenfea eljárással előállított antigén anyaguk maradék éleszióproteln tartalmát.
LjfekU (ősszehasonlítő példa)
Hepatitisz B felületi antigén előállítása tlomerzál jelenlétében
Az SB Siologieaia hqsatitisz B monevalens vakcina (Bsgerfe ti!^j Hepatitis B felületi antigénjét (HBsAg) rekembittás proteinként espresszálják Saccbaromyees eerevisíss-fesn (lásd Harferd és munkatársai léc. olt.). A. 24 kD portéin intxaoetiuléman termelődik, és a rekomhináns élesztősejtekben halmozódik fel. A fetnteatáelé végén az élesztőseiteket Osszzgytlltlk, és enyhe ielülefektiv szer, például Tvseen .20 jelenlétében szétreoesoljákt begy a kívánt protein lélutebsálteáb, Az oldhstó felületi antigén szemcséket tartalmazó mjtímmogeaMtumot ezután. áooszfeos ktesapásokkal előtisztítják, majd nltmszfeéssnl koncentrálják.
A rekomhináns antigén további tisztítását est kővetően kromatográfiás szétválasztással hajtják végre. Első lépésben a nyers antigén ksmeetitiátumot gélpermsáeiós Uszstatesgsfe'hhtnk vetik alá hepfenuae éti közegen, A tínmerzál a 4ti gélpmwáeiés kromatográfiás lépésben az slőelős pnffesbsn van jelen, Az elóeiőa puffer összetétele: 19 mM Trés* 5% etiién-glikul. (pH 7,0), 59 mgd tiommál. A tiotnzrzál őzéit van jelen ebben a pufferben, hogy a hloferhelést szabályozza, A tiomeraál nagy részét a soron kővetkező, lonesetélb < * > * χ <· * <·* *
* ♦Λ** teomatogtáSából, uliráeentHfegálssből és zósnentasltésböl (géipernteáeite álló tisztítód lépések sorún eltávolítják, 8y módon az ereded eljárással előállított, ilsetrtett aaá'gáa pmparátmnok íkstnenznllrtrlálnsa kétife bsúül 1,2 pg, és kevesebb, srártt 2 ggöfe pg protein.
Az tooeaoréló kmnrnfegteiás lépési DBAK-ntátós alkalmazásával fesipnk végre, és esstíán az Ssssegyéjfek anyagot cázmm-gsádleas altóaeentól&gálásaak vetik alá síiévé eázlant-felodd fewmttfáe^cból előre kialakított tégy réteges. Az antigén szerűteket a wsaynző sejí^lkfeteszekiől sörüségök alapján választják el a gradiensbe», és e eenirirúgnlásr aljürás vágd» etelják. teáén a eézfenvkferfefe a pool-ból egy másodé gélpemsteiös krörnafegsútes lépéssel válaszlják el Septeose gélen.
Ha a HBsAg-t tinmertet tartalmazd 48 gálpsnneácíős púderrel állítják elé, 3(s mg/mt-nél nagyobb protein koncentrációkat nyernek ki a CsCl grátílettell kapott összegyűjtött HBsAg-tartahná ftakclókból, amely e HBsAg ekvivalens konemtrtóój&sak telel meg, AVSZVME feít-tel végzett vizsgáim szériái (Abbott Laboratenee).
A C-sCl grááfessssl végzett feteeeutófegslési lépéssel eélszesten etetellják a maradók llpkleksi, DNSi és kis mennyiségben jelen levő protein szennyeződéseket a HteAg készteényfeöl, Ezt zéséé eeeisiiegslésssi tejtjék végve Ti 1$ rotorban (Beekows Insömnentn, Fsterferg CaSIfama), 31X1Ö0 lerdnbégeve sebweggek körülbelül 40 - öl) árán keresztül. A tísztítastdó mintát a CCI ohfei rétegesre 0,75, 1,5, 2,5 és 3,25 M CsCI vőgkenceatráolóban vénák fel. A cemrlfegálás végén a gradienst rraksiőkbsrr ehtálják. A HBsAg-t tartalmazó teksáúk 280 mn-en UV absmmpcsójnk alapján, vagy a rrsteiök hlgitetersk A1JSZYMB kittel téten! vizsgálatával azonosíthatók. A HSsAg sav 1,17 -1,33 g-ter' sürőségrfel vart.
A tisztított HBsÁg-r tartalmazó oldatot sterilre szűrik, sáléiért vakcina készítmény el&sllitéséns alkalmaznák.
Az élesztőseit Iszáitssnböl történi! irsztüús bnrsynlnU, átível az aniigéu isíratelterissn setrsreiöásk, és az elválasztási tscbmkák antuznlúm van szükség a kölöofefe (éleseiéből sztornó) saenayezódásek eliminálására, licsgy issein antigén aayagot kapjanak. A tisztítási lépések fontosak, snsvel n tisztítandó tessék egy iipoprrtea részecske, amely n .felületi antigéa polípeptíd stsk kópiáiéi tetafenma, és ennek a szerkezetnek fenn kell snsrraánla a tisztítási eljárás sorún, A festi eljárás egyik jellemzője, hogy elven léiüieii nvtsgén részecskéket eredményez, amelyek teljesen ímmunogének, anélkül, begy további kente kezelési kellesse végezfe ne inmmswgén jelleg fekozésársr (szemben az EP-ÖI3443S-tel),
Az élőéi ütést eljárás további rtetefeit az EF-öl$$ö48 számé ssrissdste te tartalmazza, jLpteA
ÉtefeöfeŐI azámazé HBsAg Bomerzábaeatós etjátete fetenö előállítása és jellemzése
1, Élesztőből származó KBsAg ekWfete és tterlása
1,1 Előállítási eljárás vázlata
A hepatitise: 8 felületi antigént egy megfelelő Saetshamnytw serevísiae tees iéresentálnsával állíthatják elő, példáéi a ífeferá ős munkatársai (Isse, cfe) éltté lamerteteit törzzsel.
A mkmnbináns élettel töm rntgylőpiékü fermentációjának végén a sejteket ősszegs-iijtjők, és enyhe felületaktív szer, péklatü Trveerr 20 jelenlátóben feltárjuk, Ezután. & felöleli antigént egy febfelőgőses extrakciós és tisztesi eljárássá! teláilnk, poatosaa az 1. példéter ssntsrfetetfek szerte a bephsrose 4B-a végzett első géipsrttefelés temafegrátes lépésig.
« ** ♦*** * φ * * φ ♦ ***»*» · ο . »♦·· ϊ χ»ζ
1,2 Tfesmezdlssísttes tisztítási eljárás
A tio5oer?á.ioses;i»s eljárásban m alábbi két változtatást vezetjük be ss I, példában ismertetett eljáráshoz viszenyiíva.
1) A 4B gdlpessseáeiős ki'o«i;riogri!E;b lépésbe» »a «tüdős paSer már an tartalmaz tiometzáit.
2) Az amenezerélö kromatográfiás lépésből származó össz^yójtöd einásanbnz 2 mM végkoneení» rációban erszteiat adnak.
.Azt séíábsb, begy a tknaerzál elhagyása a 4É géipermeáeiés pallérból a HB&Ag részecskék kicsapódását etedmésgozheri a CsCi sfiröség-gxádlena esstehgsiiss lépés stírihg astelynek kómkeztében leemékvwteég éa a viaazasysri aot igét oggregáeiöjs vagy esomósodása lép lei.
Ha az előző asioneserélö krmaatográOás lépésből származó összegyűjtött élőáramhoz cisztaínt adask 2 mM végkísacexöxásiőhso. ezzel megakadályozzuk s kicsapódást és az mtigéaveszteséget & CsCi söritség'· grádiens centrifugális során.
A ciszteín előnyős anyag a festi kezeléshez, mivel ez égy természetben olőfenridő mnínosav, és a soron» következő sőmentesítési lépésben eltávolítható egy géipertneációs ossdopott, Sepharose 4BCLFE eszlop mátrix alkalmazásával.
Egyéb változtatás sincs sz előállítási eljárásban az 1. példában ismertetet eljáráshoz képest.
A tíemerzálmeaies eljárással kapott antigén anyag tisztasága és feilajőeeságső összeméretők az t. példa szerinti eljárte®! előállított antigénével,
Ida
A 4B pekhfte: SÓ pgbal kerseeetoáelőbae adott őomerzál valőszin&ieg elbomlik, és az Így képződött etOígssy hísvsdsossn bspeeolődte a proteinben lévő etoginmsmdékek szabad «hkldritesopm^aStöz, A protein 14 eisztómnamdéfeet tartalmaz, amelyek közül 7 a lől-es ás ISCFes helyset között helyezkedik eb
Felfetsfefek, hogy a psotemek ez a régiója a részecske lelőletéa iokaSxálőáik, és a HBsAg tb srőigeo régióját tartahnazza, betótve az irnnmadomtaáns g légiót és az RFi meaökteoális antitest .felismerési helyét (Waters X. és nsmks&tad, Fossad. Med, X Ohogpl, 2>, 5l-Ső (lök?); és Áshwriéfekasdt és Mozray, X Med, Vítolegy 29, 19ő <i$h9)?. A domesfeik tartalmazó 4B gélpemseáeiós pesfer alkahnazásával tisztított antigén köröihelSl ö„S » ö,ö pg higanyt tartalmaz s tisztítási eljárás végén. Ez a higany nem távoh&ató el teljeses egyszeri! dhdfeissel.
Egyik kísérletben 9,5Ő pg higanyt mértünk 29 pg proteinre vonatkoztatva az antigén anyag késsltmfeyhea, őzt a készítményt ló órán keresztül szohshŐreáAéhietes díaíizá&uk 1.59 mM MaCl-t fariabsazó Iö mM NaEÖ« pn&rrel (pH ó,ö) azembes. A dkdfefe végén a fógasytarialom 0,33 pg per 2ö pg protein veit
Ezzel ellentétben redakálószsr, például 9,1 »5,9 mgősl L«eisztein, 50 asM DTT vagy ö,S M 2-'merkepris<· etesd jeieslétében végzett dialízis, amelyet egy második dialízis követ a tcshAálószer eltávolítására, az antigén készítmény klgottytariubnássk kkehfe, mist 9,925 pg higany/29 pg proteinre történő csökkenését eredményezi. Éz a detektálási eljárás alsó hatta.
A higanyíariahnat abszorpciós spekhohíiustslriával hatámzíek meg. Az amigési 9,91 vegyeséi káiiwrto ófetsMtot (kjCfjO?) és 5 kkisigsdki stdöPosputvíp laxtabnazó oklititd higiiötpik. A standard oldatokat higasyAso'áskéstt riometuállal kősHWitk, A ssinta ás a shusdetd oldatok sdemabszorpeióját gőz^eserátotban lönőoö eigőzőlés srite mérőik egy feígasyspeeí9kw fedőddel 253,7 «a A hígító lólysdék atonmbawpciőját.
Φ φ* φφφφ λ φ φ. * * φ φ φ ♦ . ♦ φφφφ Φ * * * φ φ ΦΧΧ-Φ ** mértOk vslpteskéet. A steis. HlgsosytiO'fehsát & standard tédstéksl kapott kalibrációs görbéből szátéfeíte 11. Az etvtetósyeket n« iiigsay/20 ng proteinként fejeik ki.
X3 Tinmetzálmenfes nniigéo anyag etellfete
Az antigén anyag titóíttóm szolgáló ellátási lépéseket ez 1. ábrán materük be, .1,4 Titétetel néikái fennáll vteinokteteoény
A koazseváiószer nélküli és a tlotserzábnenfes eljárással etellitok antigénből előálltéit hepatitisz B vakcina készítmény ttpskna tetette·· összstéteté ez I. táblázat amfeiia.
.LMWat
Kompeness Mennyiségei
Hatóanyag - protehy. amelynek legalább 95%~a HBsAg 2öpg
Afetéteos-hltetél (adszorbens) (AljOs-ban kifejezve) 0,05 mg
Háitisssr-'lifend 9,0 mg {maximum)
Otetsnzzit'feteéWiibsdsáí 0,08 mg
Ntemtesitétogáotesztételfeíte 0,71 mg
hgteteészilésté alkalmsa víz g, s. ad HOtol
A késtenény XtéMFL «Avagy agyeb tiójovánsek tézteáásávzl vstétété,
2. Tfemétebntees eljárással eiááliifeit asáígés anyag és vaketaa jellemzése
2,1 Tisztáiéit soligén anyag vizsgálata
244 Gssznbssostltlás slag|s
Hiteo wzsot áli.téfete elő az antigén aoysgból sz 1,2 példa szerinti tiosnerzálmeotes eljárással, amelyek azonosítási száma HEF001, HEFÖÖ2 és HEF0Ö3. Fzste s tétábbi eljárással (teását lásd 1, példában) íténetzál jelenlétébe» előálltéit antigén aayaggai (RFF20SS) teteifette. össze.
24,2 Antigén anyag vizsgálata
A tétoetehsaníes djártenl előálltén látom zsiigéa sarzsot ossgvtégálfek, és az etedménytefe a 2» táblázatban dsszegeszök,
A pmieintartalmai Lawy éa munkatársai tteteteté tétetek st«g [X Biot Qm li(8, 265 <1951)].
Az etteietefertenoi Ltetes gélkongttéote módsamel tétek, tenstefefeil fertelemből beszerezhető tetet alkalma^sával (Cape Ced Assoeiaíes, 704 M'te St, Fshnoslh, MA 02540«. VSA). A rengeosete sz VS Fharm, Bnttetet Referense báteeteté szemben stedtelzáték.
A Tvmea 2CHat Hitelezte és Allte módszerével tétek (X Atner, 011 Cfeemist tés, £0 083 <19ö5)j,
A HteAg'isttete kereskedelmi festéteao lété AUSZY.MB készletéi tette (Abtéii Labezsferte One Abbott Park Rosti Abbéi Fark, IL 60064« VSA), A gyártó átél javasolt B vízsgátéí ellátási aftatmaztók. A tetévfez görbe tété feléhez stedtéikétá a tététel jteteiétes tettéit antigén anyag anyagot alkalmaztok.
A polHzaehtefetét tétess éa mnakatársaí módszerével issitezfek meg [Anai. Chem.. 78,350 (1056)1.
J.»,» .·> t’-ií « ΐ » »
A liprdekel kereskedelmi torgalomban tévő készlet (kirrkntest Totó Liplds 3321) alkalmazásával mértük. f£. hfcrek, B.P, 4119, Ifennsiadt KM 19(1, Nésnetországj.
A DNS4mtómat Hhmköld* eijstteal mériök a M'nfeaoiar Devices Corp, (G«te»hergsb«lle 10, ismattmg, München, Németország) áltó ibrgalmaztó készülék és reagensek alkalmazásával.
A vfesgakrtokban kapott értéke?/ beleesnek abba a iurtmnányhz, amelyet a Sepharose 4B gélpermeáeiös lépésben öomerzátó iartómazé elneiös puffer alkalmazásával előállítod antigén anyaggal kapttok, az EiJSA-val mért antigén aktivitás kivételével, A fenti mérés értékei a hámot HLF preparátumra snagasabbak (Lö - 2>25X mint a HEP2Ö55 antigén anyag sarzam kapott érték, smolynok feUSA/protesn aránya 1,13, Ax AUSZVMB tót nikahmizásávsá méri EUSA/protóa arányok a bonmrxáhartómú antigén anyag sarasokra általában 1,0, és a 0,8 - 1,2 tarteaásyea belül w, oagyoo ritkán haladja meg áss i ,4-et,
2.1.3 SD8-PAO gél mmifeb
Az antigén anyag készáinfenyokirt SDS-PAöE analízissel vizsgáltok redukáló körülmények között, Coomsssio-kék feeiőssel. Az összes minta tő sávja 24K-nál volt, egy tiánnr puttóin nyomaival, Megítélésünk szerint a minták nagy tisztaságnak: (»99%-«s tisztaság), melyre & smmyexé proteinek látható sáyjalnak hiányéból következtotfesfe..
Az antigén. anyag készítmény 1 ug mintáit SDS-PAGE analízissel, nídokáiö és tmrn-ttóukáíé körülmények között, és ezüst festéssel vfesgáhnk (X abrak keánkák) köraitnények között a minták egy «tűs sávot mutatók, amely 24K-val mozgott, fesztet és sotfeitaer tormák nyomaival. A gél mintázatok onrgkniösböz·· hetetieneh s ffiP2955-4el, tolni Összelstaoolhó anyaggal kapott mratáztóöl. A míntómt nsint-mfetkálö kéfeltaéoyek kozott is iaíttsiitsk. ilyen körülmények kozott kevesebb anyag mozog Sáüöval, és növekedik a dinw és melömer helyzeteknek asegíeiöfea vásdorlé pobpepiki tosottylaége, A trcmemálmentes antigén anyag sarasok láthatókig valamivel nagyobb poiáttósázaolés tokot oottstratk, tolni as ésszeitasonksáskéto alkalmazod HEF2Ö55 saras.
A Contsassie'-kék vagy ezüst festéssel ksísetsíoit 24K poíípepiiöet plazma HBsAg elleni nyál poliklonáhs antitestekkel végzett Western hiokisg-.gal szonnsitoiink As antigén anyag készítmények 24K-»ái rttnfetsntk egy ÍÖ sávot, dttoor és fettoer lortoákkái együtt, A módszerrel. a felületi antigén portéin bomlási tersnékeinek csekély nyontai is kimutathatók, Nioes kőiönbaág: a iiomerzálmenfes eljárással előállított antigén anyag; és a BKF2955 sem között,
A maradék élessfebporteinek jelenlétét redukáló körülmények között SDS-PAGB analízissel, és Western blnrting'gai, éíesxt&-pmtehek ellem nyél poliklonáhs antkzéroto aikehoazásávai (3, ábra) vizsgálink. A métter kvalitatív, és tsent teszi lehetővé a szennyeződések mennyiségi meghatározását
Állandó sáv mintázás látható a iiootenzákeentes eljárással előállított bárom aoiigétt anyag sarasban és a REPXláS ssazsbaa, egyetlen kivétellel, bgy ötösen festődé sáv vart jelen fekl Kosát a Hhfeéöáő antigén anyagban, amely láthatólag: hiányzik a bárom HEF ptepgfetnnfeöl. A Western blsrtbsg azt rnntója, hogy n tiomerzálttotmea tisatháal eljárás tisztább antigén tersfeket eroötnényoA ’**$ X Φ * φ
χ *
Φ X νΦ χ * * φφ
XlOéM
Tisxdttkt, tfenmrzálmwW antigén anyag vizsgálatával kapott eredmények
Vizsgálat Eredmény
DOW DÉiW ffiíW 110290
pH á,H o O
krotedtartalom towy szerint 1312 pg/utl. 8 éh ggZuti 913 pg/mi 99 5 pgőui
Endotmtin-tartalem <0,25 ED O«2S ED <05 ED <ö,.25 ED
'Tween 2S-wtaiota 'U Pál é,6pg Mpg 5 J pg
Amigán aktivitás ELIS.A szerint 295? ggönl 1505 pgj'ml 1485 pg/ssi IlikpgZml
k LISÁ/protem arány 2,25 09 1,Ó3 1,13
PoiiszaekaAÁ· tartalom 0,33 pg 0,35 pg 0,33 pg 0,3-4 pg
Lipidtartalem í:V pő 12,8 pg 12,9 pg lUpg
DNS-iamlorn Thteshold módszerrel <1 pg <:lpg <1 pg <i pb
2X4 Egyéb blnkémlai vizsgálatok
2X4,2DNS-tnrtalam
A .bárom antigén auyag wxs DNb-iortaíokP Tbmshöld ssódszermi {Jtótofef Devices Corp.} teázöztuk meg. A síén mennyiségek kisebbek voltak, sakk ÍÖ pg DNS/2Ö pg protein (2. táblázat}; ugyanilyen DNStartalmat kaptunk a jelenleg elübgadett eljárássá! előállított antigén anyagra. is.
2X4<2Amlua«av taet&t
A három HBF antigén aayag sam aminosav összetételéi 6 N sósavval tórténó savas hklttdixis után ax autútossvak ioncserélő oszlopos Wléoö krmnatogmláiásával hstárosrttik meg, eiahidtmes detektálással ax oszlop után. A ptolúst ás tripteBm nem batázozktk nmg. Ax mzdméayeksi a 3. táblázassa későijük,
Ax összetételek jő egyezést xoaiapíak a HEP2ÖS5 esetén kapuit eredményekkel, és & DES szekvenciából ssfeoaző várt összetételiek Néha a ffiP2855-te mert gliebsasmdákök száma kaséi veit & várt értékhez, ss antigén anyag pmpartenokfean gyakrabban iá - 17 matadőkot snértimk. A dszieimkss'sdáfek átlagos száma a vártnak toegtélel&s; I 4 veit, jelezvén, bogy nem kötődött extra cisxtein a részecskéhez a kezelés eredményeként a CsC! grádiess lépésűéi,
2X4D Szabad efeteb kvantítnöv meghatározása
Az ismerteteti eijáeteat efóáiliioti antigén aoyitg preparátumokba?* jelet* lévő szabad cisztein mennyiségét a túseeskék perhangyasavval történd oxiááte sdátt mérbik, eteeies savas hidrolízis nélkül, As; oxidált szabad oUzNluosarsdákokat lonewéld oszlupco választottak szét, a detektálást ainhidrtddel vőgezhtk az oszlop mán, A Nszieiu knmrtatási fesdám ezzel az eü-áráesal 1 pg/ml.
Nem leheteti szsísaő olsAaiut kamataim a három © antigén pr^sráhmáam, hs azt. a 2. táblázatban kezelt ksleáttiáei protein koncOTtrációkban vizsgállak.
Ezzel a módszerrel mésjök mind a púderben jelen lévő szabd Nsztcisava'adőkokat, mind azokat a obsiedmusmáéfekab amelyek a HBsÁg peeteíekez dtadfid kötéssel kapcsolódnak, azonban nem képezik a tvkpsptb szekvencia részét.
XíX4N~terntí»á8s szekveaela. a»al&d$
A móáödtoa eljárással előállítón hárma aatisáo anyag ssrzshssa a lehetséges protein szennyezők ás bsaalisi termékek jüeslátJ Edsm-féie fc&mnásm sIsaJó N4«má$úUs szekvencia határozlak meg,
A HBsÁg psWáí MENO'S N-terminális ssckvöacüjál az egyéb szekvescíákkal való interferencia aéWl detektáltak. Megerbslüdük, hogy az NAenainális smüüa ál) « ?5%»ban aecdleaéssel blöküsit, hasonlóan a ntdn eljárással üááíllüd HBsAg pclípeptidre kapott koaláid sae^gyeíéstas.
3,láblfea)
HBsÁg atresosav ősmAáicle
Ámíseszv BITÓM IffiW ÜFÜÜ3 Átlagos összetétel BIP26SS Vb! összetétel
Asp 11,3 i1,3 11J ÜJ 11J ü
Thr 17 J ÜJ 17 J 17,4 17,4 Ü
Ser 21J 21J 21J ÜJ 2ÖJ 23
Üb 11 11 II ÜJ ÜJ 9
Fre ed ed nd ad 24
öiy 17,1 16 J lój iáj 14,6 14
Aia ?J 7J 7,4 7,4 7J 6
Cys üj 14J.8 14J M,1 ÜJ 14
Vaí üj II ÜJ ÜJ ÜJ ü
Met áj 5J 7,1 6J 7.1 6
íle ÜJ ÜJ ÜJ ÜJ ÜJ 16
i.ea 2áJ 2á,á 26J 26,4 2áJ 33
Tyr áj áj áj áj 7 6
Phe 13 J 13 J ÜJ ÜJ ÜJ 15
HLs 3 2J 3,3 3J 3J 1
Lys 4 4 3J 4J 4J 3
Atg 8,7 SJ 5.7 5J á.l 5
| nd nd sxt ad 13
2.1.4.S téeerfény^szárásos analízis
A találmány szeried módosított eljárással eUáÜbon líBsAg részecskék ás a HEP20S5 referencia wzs részecskeméret Ssazehesoalitását iémfény»szórás<ss aas&dssei végeztők (4, ísbiásst), A meghatározott átlagos mőltómegak jé> egyezést matattak az egyes készítményeknél.
Atáblfeal
HBsAg részecske máltömcg iéxerfá»y~szárásssi wghaíámw.
Antigén sms Máühneg ffldísj
HEFÖ01 3,67 x Ü*
HEPÖÖ2 2Jás ü*
ISMJ3 2,7áxKj
ÜEÜJ.S5 3J4x Ü*
φφφφ* φ* # φ φ * « φ φ X φ * φ Φ> χ « Φ * Φ * Λ χ Φ Φ X X * * *
-' V 1 '
2> 1>4,ό .klektrossmkroszképis
Az saiigétí anyag preparátumokat etekümasdkreszkOpiávsl vizagállek fixálás és utantLaeetáhal tön&tü festés után,
A megfigyelt résaeosfók hasonlóak wltak aunáen vizsgák mfiáábas, és összhangba» voltak a EBsÁg-re jellemed *28 nm gémfeölyded vagy maeskakösmü részecskékkel, A három HEF preparátumban snsgfigyeit rászeeskákeí nem lehetett ns^kölöaMztmí a HBP283S fosz«kéfctöl.
X LA fosmsmoláglal analízis
2X&Í 8FÍ monshkmáfis snikesítel volé reaktivitás
A három antigén srsysg kütómsáuyt RF1 moaeklonálb aasíteztó vsté reaktivitásra BUSA gádási vizsgáisdai teszteltük. Az RF1 menokfooális antkeströí Ismérv hagy véli a esimptextot HEV-vel szemben, és lellmer egy védd koníormfóds epítópet a HBaAg részecskén iKvsssos S. és nmsfcaiám&í, í. Med. Vhol. M B-96{198S)j.
As RFI híbndóisét BslbC egerek hasüregében vagy szovetsesvészetixas .teher teovőszmos.
Teikési pufiméi (1% BSÁ-t és 0,1% Twxm 2fi«at tartalmazó RBS) 1 :50088 arányban bigitoá sszckesz folyadékot 1: 1 arányban. elegyítünk a vissgáboké HBaÁg sabáék PBS-sel készült különféle hígításaival (a végbsöcemtédék iOi; gg és 0,05 gg/ml késéit változnak).
Az elegyekeí 'Nnac immturkmruzeken ifiéO) 37 1 órán keresztül istefiiüjuk, majd standard HBsAg preparátummal bevont teniszekre visszük ár és ott I étén keresztül 3? inkubáljuk, .A standard HIásAg pssperáümt egy kosoemélos eljárással tisztított antigén anyag sem veit (HBF288). Bgy 0J% Tweee 2fk% tartaimuzó FBO-sei wténö mosást lépés után telítési pufiserei ItlOSO arányban hígítón htotínstri kossitigék birka sssbegér igö-t itésssk hozzá, és a leseesá 37 %Am 1 étán fesesssatül iakKbálfok. Mtssás etáu telítési pefforrel 1:1800 stáisyfeea higümt sirepizvkíisvfikstisfifezett eesusldés komplexet asbmk & rsamvsárokha, és 37 eC-on 30 perem keósszkii bámbáljuk a lemezeket A lemezeket mossnk, és 8,84% ÖPDA-g 8,03% HsQk sartstaaző 84 M csírát pufiméi {pH 4,3) szobabOmétsékfotm 20 pesv-ee keteszlkl sekafeáljok. A reakciót 2 N hozzáadásával állítjuk le, majd az optikai sűrűséget (O.Í3.) 400/630 tstn-en mérjük, és grafikusan áhrázoljtds.
Az Kss értéket - amely sz autígéa azou bermeairádóját jefeati, amely sz antitest HBsAg bevonathoz való kötődését 50%-fcal géMÍ* (iahibÖöf koncentráció} - 4 paraméteres egyenlet segítségével számítjuk Μ, és ngfod-ben fejezzük ki..
BBF antigén anyag sarzsok sorozatát- beleértve a lIEF2035dk is - b vizsgáltok herpes armpies gD aeiigemsei együtt segsbv koatrokkést. A vizsgálatban mértük sz egyes lesztek antigének RF1 kdtókését gátié képességét egy míkreírtráíö lemezhez kötött standard antigénpreparátumhoz 04fiP28fi).
Az 5. táblázatba» akink meg az egyes mmgéssek szén konemhációit, maelysk 50%~kal gátolják az RF1 kötődését a fixák antigénhez.
.l.Oósol·
RF1 mzmoídoaáds rmfitest WsAg-hez mdó kOhWsétiek gátlása
Antigén aayag ÍCís (ag/ml>*
HEF2SÓ 3S34
HBFÓ73 3437
HEP720 31SÖ
HFF285S 2304 .............................................. ...........................
φ φφφ *
S- φ X Φ φ
Φ X Φ Φ Φ * * * χ Φ χ Φ Φ Φ * Φ
Ásfigán anyag KRs (ng/ml)* )
HBEÖÖI 468 ΐ
HFF002 574 )
,KEF0Ö3 540 )
*ΚΜ ~ antigén keneenitádója (ag/ml), amely áOMtot gátolja az RPt kökkfeét s fixált ;mttgászho;í
Ax eredményekből láőtató, hogy 4*7-szer keveaebb HEF antigén kell az RF1 kötódéa gátlásához (5, táblázat). Ez tó matatja, hogy a módosított eljárással előállított antigénben az RF1 epitop nagyobb mennyiségben van jelen, okai a HEP antig&shen.
Ügyanüyea dpto ihhibíeiós vizsgálatot vágszthok Engem BlM-vel va&sináltafcból sztotazó l««nán sztornók alkalmazásával az REI mAfe helyett, ás nem to'dwk különbséget a KÉP anfig&t satzsok és a EBP antigének között
3.ER2 Mettoktolb RFHhss való kötődés affinitása
Az RF1 monokionális antitestnek a 3 HEP antigén smzdaoz ás a ÖEPSŐÜS-kóz való kötődésének kioskto gíízamtoto toito plazmán rezonaneíávat mértük, Biaeote 2900 készülék (Amersfeam Fharmaeia BtoM, Anwaham Plase, Líttle Chaiíto, Baeka, UK) alkalmazásával, A mén kinetifens paraméterek az alábbiak voltak:
ka: asszociáción állaadó fed: dissxoeitóös altodé (S'!)
Ka: zgystolyl vagy aOkátási állandó (MR ka ahol Ka - kel
A kapott értékeket a é, táblázatban összegezzük,
Ó,.táblázat
8P1 M.tokgkez való kötődésének afiltdtoi állandói
Antigén anyag ka R 10'R kd (X tó5) Ka (X 10'R
HFFÖ01 tol 3,21 21,9?
REF002 6,89 3R3 15,83
HEFÖÓ3 ?J0 4,6? 1.5,80
HEP2O55 R31 ó,30 531
A három MSP antigén sarza hasonló amzoeHeió&klísszöeíáciős állandóval és kötődési affinitás!
öítáksikkol rw.Wkezetfe Ezzel szemben a HBF2Ö55 affinitása gyoogább volt az RFl-hez való kötődésre.
Ez összhangban van az ELISA gátlásl vizsgálattal későit eredményekkel, amelyek azt mutatták, hogy a irottieszálmentes eljárással etollito: antigénben nagyobb mértékben volt jelen az RF1 opkdp.
Χ*χχ
JÍ X X X *
XX X X *
XsXXX X X ·Χ X ·| 1 ΧΧΧΧΧΧΧΧ
3,2 Módosított eljárással előállított antigént tételemé vakéba vfes^lata
A három DBF andgé® samot ahrmfoium>bidíozidon adszorbsátiok, ás az í. táblázatban bemutatott ősszetétoiö vakcinává föstelfök. A kiszerelés felnőtt dózis vnlt fiolában (20 gg antigén protein 1 ml~ben). A sorozatot DENSÖÖ1 A4, DENSÖ02A4 és D.ENSŐ03Á4 azonosító számmal láíhík el,
A vakcina erősségét in vitro antigéntartaiom vizsgálattal határoztak meg, az Abbott Laboratories ÁÜSAY.MF ELihA klt-tévek és stsudardkónt 50 pg/eö hetwzállsí fonnák klasszikus vakcinával. A vakcina erősségét a PharmaBurope Speskd Issue 131.037-2 (19$?, őecemher) helyen leírt 13 eljárás alkalmazásával tetőik. A. három H8F készítmény magas endgéstsrístetí adod, majdnem kétszer skteáí, mint a megadott 20 pg antigén protein tartalom.
3,3.1 BIRS vakéba RF1 monekteátls antitestei való eeakővhása
Az sdszoteáh vakcina astigenieításái egy hshihlcte vizsgálattal is tesztelték KF1 monokionáíis antitestté, Ehtes a vizsgálatban a vakcina minta RFI Etet «tógát anyaghoz (RBF2SŐ) való kötődését gátié képességéi májők.
Telítési pufforrei (1% BSA~t és Ο,ΙΗ Τββββ 2Q»at tartalmazó PBS} lAOölXt arányban hígított oszohosz folyadékot 1:1 arányban elegyítünk a vizsgálandó HBsAg minták FB$-sel kéteőí kdléoföfö hígításaival (a végkoooetefölök 100 pg és 0,05 pg/ml között változnak).
Az «legyeket Naae ímmunlemezeken (901;) 3? Éten teste közbe» 1 ötén keresztéi inknbáljuk, majd standard HSsAg prt^acáfommal bevont lemezekre visezök át. A standard HBsAg preparátum egy ímmerzálos eljárással tisztelt antigén any&g sarzs volt (HBF2ÖÓ). A lemezeket ezután 3? C-ort tetes késben 2 órán keresztül hikte&ljok, Egy 0,1% Tsveets 20-st tartalmazó P.8S-sel törléssé mosási lépés után telítési pttSértei 1; 1ŐÖ0 arányban hígított bíotirm&l. konjugált birkái anh-egör IgG-t adunk hozzá, és a lemezt 3? «C-en 1 órán keresztül ősktfoéiütk, Mosást lépés után telítési puffesreí ElőOÖ arányban hígított shejstísvíáin-bioífoilezett peroziste kssmpteeí adunk. a íe&enteokhp és 3? Etet 30 percest keresztül ttefoáljte a lemezeket A lemezeket mossak, és 0,04% OFDA-k §3,133% H;€te tartalmazó 0,1 M eltet ptelste (pH 4,5) íterfoáljtA szohföőtssét'sékletess 215 gereen kérésztől. A reakciói 2 N Etek hozzáadáséval állítjuk le, rtszjö az optikai sűrűséget (0.13,) 430/630 mm-ea trsérsük, és gmÜfcasau ábrázolj ok.
Az i€% értéket - amely ez antigén esc® koncentrációját jelend, atttely stz antitest .HBsAg bevonathoz való kötődését 50%-kal gátolja (íföhbltor koncentráció) - 4 ssnettfötetes egyenlet segítségévei számitjok ki, és ng/tó-bes fejezzük ki,
A eükíösiteh eljárással előállított antigén anyagból késztet vakcinát tt klasszikus HEP antigén anyagból és teserzál mist konzesváiősser eétel formált Engem vakcinával teoolkoíhik össze,
A vizsgálatot irípőkáthen végeztek.
Az eredményeket, a ?, tebiteítes kötelük, Látható, hogy a DEN3 vakolnának köteteiül föle menny isége tekségos az RF1 50%>os gsiiéteos, -a kosízctvélőszedéi mentes BngeHx vakcinával &smhasoaliiva. Ez az. 8F1 epitóp fokozott jelenlétét toteíjs «. EdsT/DENS anhgónen, és összhangban vas a őszötök antigé» anyagon ET 1 antitesttel végzett vizsgálatokkal.
Á.Mhíág&i kőtődás gátlása Osí-máit vatónávst
Vakelsa sarzs J£^ agWÍJ
1 Kisérlei 2 3 Adag
DBNS00IA4 913 ŐÓ2 603 726
ÖBNS002A4 388 715 52! ?08
ÜENSÖ03A4 81? 635 582 Ő95
FNÖ.51OOÁ2 1600 1514 1481 1534
BNG3WB9 1329 n?o 1286 1262
BNG3328Á9 141? 1194 1334 1.315
'k’A vakeioa &PI aotitesl fixált antigénhez való kötődéséi 503á-k&í gátió keneentiáelóta
2.2,2 DEM vakcina ImmnnagesifeMsa egérbe»
Vizsgálaktt végeztünk Balb/C egereken, hogy öaszebasosilisstb a hárem HSNS jelű vakcina immnongeoiclíásái az Esgsnx B5S> vakoméval, amely s -jelenlegi· antigén előállítási eljárással van előállítva ős tiomerzáitel w femaáíva.
Az alábbi sarzseknt vizsgáltuk;
#DEM001A4 /MMŐ02A4 ®EMW3A4 kENG2953A4/Q mfetwcfekéat
Röviden, a 12 egérből álló cAoperissfed Islramas'íkuláfl^s mmumizáítek a felnőtt barnán dózis 1/10 részének (2 gg) vagy 1/50 etessek (0,4 pg) megfelelő vakom dózisokkal. A KRs&g~re adott este. reakciót ás a vakcmálássai htdtásáb izsítpss praíllt a 22, napén vég ssénnnbőí ellenöríztök, öÁttelGásOgsó
A 12 üalb/C egérből álló csepettekat ín&smaszkulát'tesn immnuizáifek. mindkét lábakon (2 x 50 pl) a 0. napsai ás 15. napon az alábbi vakcina dózisokkal:
Uttas
Csoportok és vakdaa ti&Mt
C’snped Vsfeefea Térfegsí Antigéss dózis
1, DÉNSÖŐÍA4 100 μΐ 2 0&
2. •~»5~szőr8s hígítás KWNaCI-tel 1.00 pl 0,4 pg
3, DEÍMS0Ö2A4 100 μΐ 2 00
4, ~*5~szőrös hígítás FO4/NaCi-.lel 100 pl 0,4 pg:
5, DEMÖŐ3Á4 100 μΐ 2 μρ
6, --->5 awós hígítás KWbteCMel 100 pl 0,4 pg
?, OG29S3Á4/Q 100 μΙ 2 08
8, •--»5~szőtÖa hígítás KWNaCMel 100 μΐ ......................
χ Φ Φ Φ·
Α 15- napon (az 1 után 2 bébe!) és 28. napon (a 11. után 2 héttel) véruántái vettünk a retrooröiíális üregből,
A fenti kísérlet tm-ezéséhez (4 készítmény s 2 őőds 12 egérrel csoportonként) az erősséget eleve megbecsültük a FASS staüsztikns próbám segítségével A PÁSS {Power and Sample Size) stsEsshkos programot az NCSSaöí kaptak (329 Norfe i8ÜŐ Basi# Kaysvitle, Utalt 84037). A kétnUs varianeta analízishez a tósziiméayek között a GMT 25>sgms eltérését teli detektált» 5% aiia hibával >90% erősséggel,
Brétbtények
Sze.to.fegb
A htnneréhs válaszokat (Összes lg és feoBpwb) E14SA vizsgálattal mértük, bevonó antigénként HBsAg (BEP260) aikaknazásával és biotfe-kenjsgált anti-egér antóüsstekkel az asiXHBs antitest köfeáés kimutatására. Csak a II utáni szérumokat assatíasáituk^
A 9. táblázatban láthatók az átlagos és a OMT antí-HSs lg antitest véfeszok, amelyeket az egyes szérumokban mértünk a 11, atán 2 hétiéi.
A DENS és a klasszikus hepatitisz ö készítmények összehasonlítható antitest válaszokat indnkáhak: a ÖMT 2384 és 3976 EtEsd között változott a DENE sorozatban, az SB Bíologseals hepatitisz B monovalens vakcinára (Bugena BlM) kspoP 2882 BUóaEta viszonyítva 2 pg dózisban, és a GMT 696 és 1182 BV/snl között változott a ÖENE sorozatban, az EB Bfefegfeab hepsPhbz B monov&lena vakcinára (Bngerix B!M) kapott 627 W/tnl-rel összehasonlítva 0,4 pg dózisban.
Amint sz várható volt, világos antigén öósés - hatás összefüggést találtunk az összes készínnénynéi 2 pg és 0,4 pg óödsokhso, a GMT-k 3«6«szeros különbségével
Négy nesMaagálé egeret {bteek <50 BIEtsi) találtunk, amelyeknél. nem tapasztaltunk vüágos kapcsolatot az antigén dózisokkal vagy az fefekták sorozatokkal (!., 2., 3. és 8, csoport; egy egér csoportonként), Statisztikai analízis alapján. (Grnbbs teszt) ezeket az egereket kizártuk a további snaííxisböt
Sdlbto
Antitest válasz egérben a 28, napon (2 héttel a IX után)
Csoport Vakcina IMzis Eben BUBA liter (lg)
Átlag 6ΜΪ
i. DBNSÖÖ1A4 2 pg 11 3466 2971
·> A,» 0,4 pg Π 1263 11.82
3, DENSÖ82A4 2 pg ii 2436 2384
4. 8,4 pg 12 904 706
5. BBNW3Á4 2· W 12 4603 3976
6. 0,4 pg 12 997 696
7. BNG2953A4/Q 2 pg 8,4 pg 12 11 :W9 737 62?
*««» *φ φφφφ φφφ * btteisztikai antoh &étntaa vasútítsis. analízist végeztünk az attti-HBs fitsrekm & IX tetmassszálás teáoi adatok iog tesmtormálása ttlátz. váhztzókéot & vakcinákat (4 Mk) éa sz antigén dózisokat (2 μ§ és 0,4 gg) alktoazva. Es az attalteís megeróstaite, hogy ssatisshtes ílag szignifikáns teitesbség vsa s kél antigén dózis kőzett (p énók «$,001), és nem találtunk szignifikáns kihösbeégel az ©gyes vakcinák kiteótt (g érték - (/2674). Amint azt te» rabban ©telítettek, az ©rősségte a priori beesők© meg, és a kísérletet égy torveztete begy a ÍIMT 2^-szetm kteöóbeég© SH alte hibával detektálható tehessen a készítmények között, amelyek erőssége >90%.
izottpos prolii
A 1Ö, táblázat mslslja az izetipus megoszlást (igGX. IgC2a és lgG2b}, melyet a IX imsmnizálás után gyűjtött szérumok aasrllziséböl számítottunk ki.
Amiül az vsrbstő volt, s lenti alom sűttpá vakcinák tiszta TH2 választ indukáltak, mivel fbisg l.gG i antitesteket Sgyelíöak meg.
Nem találtunk kőlőssbaegst s DBMS vakarnák és az SB Bioiogleals hepatitisz B amaovafens vakcina között az teottpos profik tekintve,
MtűbMte
IgC tenfípnsok megttsziáss a 28. napén vett Ősszegyéjtött saárnmhnn
Csoport Vakcina Bázis ipGt teobpas <%> igC72a fgCteb
1. DEN3ÖÖXÁA 2 pg 91 4 5
2. .......Mm....... 87 3 5
:x DMSÖÖ2.A4 2 pg 9? 1
4. .......Mm....... 8? 6 7
5. DM3bö3A4 2 pg 93 1 1
á. .......Mm...... 93 4 3
2. ENG2953Á4/Q 2 pg ......Mm....... B§· -Sí 8 § 4 3
3MM
Kombinált vakcináit eióállitása
A találmány szerinti atstigá© anyag különösen alkalmas IPV'-t tartalmazó kembináít vakcina eteáiteásárs.
Sgy kombinált DTPa-ll.BAf-ÍF'V vakcina kiindulási sarasaival végzett stabilitási vizsgálatok azt mutatták, hogy az IPV komponens, ksldnósen az 1. típnsé pöliontyeliíis antigén erőssége esokkm, ha itt vitte; itmnunvizsgáiafot (Stentegést wtotn osegbetemsám EI.l$.A-vai) és Itt vivő patkány hatékonysági vizsgáktól végtebxk, Nem tapasztatok bélákettymgmeőteíejtéte a 3, típusra, A. 2, tgmsrz n Nteékottyságoeökkeoés a várt hgtosöásyoo lse© vök (nem. több, műd H>% veeztezegrév tárolás).
Vizsgátokat imteoihmk annak aseghetéroMártt, begy mi okom ezt a isatekosyságosökkeoést a tessubtsáh DTFa-HBV-lPY vakeioábsit, Abfeöi a megfigyelésből, hogy az IPV stabilitása az SS Biologioais DTFs-lW vakcmában kielégitö <««m több, mint 10% strtigésrtart&teoz vessteeégiev tárolás), arra te» vetkezettünk, hogy a HBY komponens tetelós valöszistéiog sz IPV testebibtásáért s DIAhrMBVMV ystettsáb&o.
* *
A kibxfeláss BTFa-BBVDPV készítményben alkalmazott H&V komponens a tisztított r-DNS, élesztőből zssérmaző dBsAg-i fe alkaknamk s« SS Blolöglesfe hepatitisz S monevaiens vakcina előáll liásár;; & aa 1. példában ismerfefeb: ötödén w elöállitvít,
Sbö kísérletként annak meghatérnzfeám, hogy a HSV kangxwss melyik eleme veszélyes az .IP¥«ce, a HBsAg anyagot tfensemál jeiettiétém snmlizáltak, Korábban kfemtstrák [Davisaon es rmmkalársm, J. Láb. Clta. Med. 4.2, feli) (1956)]. hagy a DTP vakcmákban konzm-válöszerként alkalmazott tlornerzál káros volt a poliorayeiítía vírasra egy DTP-1PV konjfemáeióbaa. A vaksi»» gyártói figyeierbbevették eb a megfigyelést és a homarzált egyéb konzerválóewskfceí helyeífeaífehék az íPVbsmkaá vakcinák eiöáilitásábats.. Később febói megvizsgálták a tlornerzál hatását sz 1PV erősségét» -% “C«ja. való tartós tárolás után, Khnntatíák, hogy az 1. típusú gotlovims antigén hatásé a kntsatetbetősági határ alá csökkent 44 hónap tárolás mán (Sarnyer E. A, és munkatársai, Vaeeíne 12, 851456 0444)],
Átonu&hszoípoió® xpekhosekbpis slkelnsezásávei körálbelöl 0,5 pg higany (HgiBÖ gg flBsAg koncentrációt találtunk az 1. példa szerint tisztított ani^énben.
Ez s ikganymerísyiség (mint tiomeazál és etíitógany-klorid, a tfesaerzál bomlásterméke) a kimutatási hsak eistti szintre eaökkmrlheti sz ELÍSA választ sz i. típusú D-aasjgénm egy 3? C-on 7 napon keresztül i&knhók IFV anyag keneenbétuathan.
Eljárást fejlesztettünk ki a RBsAg anyagban jelen lévő higany felszabadítására. Feltételeztük, hogy a higany a HÖsAg részecskék tselesopmtj&ihoz kötődhet, és ezért rerfekálöszerek jelenlétében felszabadítható. Más redukáíőszerekke! történő kísérletezés trtáo az Emlszseást választottuk ki a higany HBaAg részecskéből való felszabadítására al&abaaa szarkám. A KBsAg anyag 5,7 mM L-dszseiní iamhnazé sóoiáaltal szemben végzett dialízise «ián asm felállónk higanyt s vássssanamát okimban (a vizsgálati módszer kimutatási határa: 25 ng HgfeO pg BBsAg). A dfelizáit antigént az IFV kencentrémmsasl összekevsssők, ás a D«aaiígén tartalom mérésével 37 ^'Cmn 7 mgm keresztül történő inkobáláx mán meghatároztak ez 1, típusé vhas stabilitását Kontrollként nem kevert ÍPV ksateentráímnot és ciszternád nem kezelt RBsAg-vei kevert 1PV koneemrámmoí alkalmaztunk, A. referencia BUSA titert »2 VC és vá fel közötti hőmérsékleten 7 napon keresztül tárok adntákbsi kajánk. Az eredményeket a 11. táblázatban foglaljak össze, iLAiktoi
Minta B-sstlgésr tartalom <L típus)ω Veszteség
7ofe4eC TaspőVTC
iRV (nem kevert) 31,6 44,2 23%
1PV v ÉBsAg oern kezelt 51.1. 18,1 4234
IPV 1 ÖBsAg eiszfemel kezelt 51,4 270 1.2%
1PV v tmmetzál (1 pgérnl) MS llfe 7434
'l5!>-mrOgárt egységben (DB) kifejezve
A fenti laboratóriumi készfenéríy«kks.i kapott adatok világosat; bizonyítják, hogy sm 1, tiporó poltoviras stabilitása szignifikánsan javult, ha a ÖBsAgd ciszternáéi ászaitok a maradék higany eltávolítása céljából az IFV-vei való keverés elölt.
4ΦΦ-Φ ΦΦ **** * * Φ Φ
Á későit adatok azt is tnutufjkk, hogy a referencia IPV készítmény D-aotigén tartalma 23%-kal csökken 37 ’Von 7 napén kérésztől végtót tónkéin» után. Ez megerősíti az 1. típasá Mahoney polsovírus inbesaírs iteabfotáaáf, amelyet korábban leírtak (Sawyer L. A, és munkatársai, Vasé» Π, 351-856 (19§4}}<
Noha a DTPa-HS¥4PV és DTPn4IB¥4PV/Hik vakemto tnár előállítottak kmeskedéfasi mennyiségben dialízises eljárás alkalmazásával, §,? mM Ixótómnt alkalmazva a maradék higany eltávolitására és sz IPV stetbtátes&k megőrzésére, a dialízises eljárás nem alkalmas ipari mértékű termelésre, ás kiegészítő lépések sorozatára w tetkség: a tfomeraál· vagy higaaymentes HBsAg előállítására. Ezzel szemben a találmány szerinél NEsAg, amelyet tiometei ítéltei álltok elő, közvetlenül ötólmtósafó kotorják vakolna készítményekben, kólónőse» ax IPV4 ttóahmtző ilyen készítményekben.
4. Összefoglalás
Az, élesztőből származó ielblte autteu dstótóte korábban alkalmazok eljárásban varr egy gélpexmeácíós lépés, amelyben egy híganytartsto -mikröbaellenes vegyüíetet, domerzált alkalmaznak, az eláeiós pufierbea a hioterbelés kézbentartására,
A fiomezzált nem távolilják el teljesen az eljárás sttokővetkező lépéseiben, így körülbelül 1,2 pg tiomerzál marad 20 pg proteinre vonatkoztatva a tisztben antigén anyagban.
Annak érdekében, hegy teljesen ttoerzálmenfes (higany-mentes) antigén anyagot klitetó. «lő, s tistettó eljárást két lépésben megváltoztattuk,
A tismetzált elhagytuk az efoeiós pnfforből a 48 gélpermeáeiés lépési»?».
Cisateíst (2 mM v^kmtcentráciőban) adtunk az asfoneserőlő kromatográfiás lépésből származó összegyűjtőd eluátomhoz. Ez megakadásom sz antigén kicsapódását a Cte'i tóitógytófotes cenidfegálás során.
Nincsen más változtatás az előállítási eljárásban.
A módosított eljárással előállítok tetlgteasy?pxé j«!lmtóék. A ltefob4sésüfoi sézsgálaíok szí mutatják, hogy a tmmerzá&neutes antigént, tulajdonságait tekintve nem fotó megkülönböztetni a korábban alkalmazott eljárással előállított ttefoétífoi, Az sutfoénrészccskék összetétele szyasaz.
A 1-lPsAg poUpepttd identitását és Integritását nem befolyásolja a módosított eljárás, amelyet SDSPAGE íimiiizúsei, políktonáíis mrtfoKBsAg antitestek alkalmazásával végzett Western bi-texl, N-terminális szekvencia analízissel és ammtmv-^sazetétoilel matattunk ki, Elefoummíkrotósőpia és iézerfény-sxóráses analízis te muta^a, hogy « részecskék az élesztőből származó REsÁg esetén várt tipikus formával és mérettel rendelkeznek. Áz uudé-fosKfo protein szérummal való Western biot wdító tó matatja, hogy a tiometzáimentes eljárással előállított tettes hasonló mitetetaJ rendelkezik, mint a szennyező élesztő-proteinek. Azonban a 23fotei vándorló szennyező sáv mennyisége lényaneseu kisebb a módosított eljárás alkalmazásával előállított három BBsAg sarasban, todttefogifo ateiztek tó testálják, hogy a. ttoarzátoafos részecskék fokozott antigemcitással rendelkeznek, A téazeeslsék reaktívabbak Abbott ÁUSZYME kittéi (amely meaokfoaáhs antitestek «fogyót tamlrnszza), l,é - 2,25 EldSAtesfolst arányukat adva. Ez a fokozott aatigeniciíás s védő RP1 menoktonálm antitesttel is kimutatható, Kitelitek 4 - 7'szur kevesebb domerzáhsestss antigén telkséges az, foki stótoard fiaöt antigénhez való kötődésének gátlásához. A tiooserzáhneuíes és a klasszikus antigének kötődésének gátlására kapod görbék tót elkülönülő családba esnek, Bz u eltérés az M.F1 tótődés affinitást álteáöjásxtk mérésével is látható, léliileíi píaznmmzonaneia álkalmszésávsl. A tiometzáknenles prepar^umré; kötődési atiisdéssi 3 -' 4-szer nagyobbak, mint a klasszikus antigénnel kapottak.
Az asstigén anyag preparátumokat vakcinává jbrmáítak alnmlsnnm’hidrozídon való sdssöipeiásísl és konzerválószer nélkül. Az in vitro hatás Abbott AÜSZVME HISA teli és tiomctetititertaltefi SB Biologicals hepatitisz B monevalens vakcina mim Standard alkalmazásával végzett vizsgálatával magas ín vitte erösségéttékelter kapunk. A fenti teszttel meghatározott sotigérteírtelote közé kétszeres vök, mint a várt 20 pg pmlem/tnl ének
Kimutattuk a tiemerzálmentes antigénből előállított vakcina fokozott reaktivitását is, az RH taösoklouális antitest Szák antigénhez való kteteiésőpök gátlása vizsgálatával, A tiomerzábneates vakcinából kötelbsltil fele mennyiség volt szükséges ahhoz, hogy az- RF1 fixált antigénhez való kötődését 50%-kal gátolja, a korábban alkalmazott éljázással tisztított ás konzervákSszer rtélkSi feasáfc antigénhez viszonyítva,
A tiemerzáknentes vakcina fenti fokozott antigeniciiása az RF1 -et tekintve összhangban van az in vitro ssfisségj teszttel (antigénfartalem) és az RF1 antitest tesztekkel kapott eredményekkel, amelyeket az antigén pnspacátnxnokon végeztünk.
Az egér Inummogemeitási tesztet indite ás erősítő vskcináiás alkalmazásával hajtottak végre kéthetes időközzel, és 2 és 0,4 pg antigén dózisokkal, Az egetektől a 2$. napon védőnk vért, 14 n^i az erősítő vakcíoálás (hooster) alán. A szérumokat antitest literre ás izetípos összetételre analizáltuk. Tiszta ateigé® dózis ·· hatás összeföggést találtunk. « beadott kát dózisra, azonban aem volt statisztikusan szignifikáns különbség a válaszokban az antitest litereket <<3MT) tekintve a ttötnerzálmentes ás a konzervátószer mentes vakcinák között.
Nem találtunk iésyeges kőlönbaégeí az iaolfpus proföekhan.

Claims (8)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. kijárás stabil, immuogén hepatitisz ti vakcina előállítására, amely a tiometzál nyomaitól mentes, amely eljárás tartalmazza az alábbi lépéseket (aj bs^atitiaz B felületi sráigém (HBsAg) fejezitek ki refcomhitsáns protein formájában Sacehnromyces cetevisiae-bes;
    (b) az élesztő sejteket feldolgozva nyers antigén preparátumot állítunk elő;
    fej a nyers antigén preparátumot gél permeáoiós kromatografeíásoak, vetjük alá, ahol a gél peimeáeiős kzomatogmfeláshoz alkalmazott elnolós pufiér nem tartalmaz tiomerzáít;
    (d) a (e) lépésben kapott, és az soíigést tartalmazó ehiátmaot ioncserés bomatogxafálásnak vetjük alá;
    <«} a (á) lápés után kapott, és az antigént tartalmazó eltiáöuahez tesztelte adagolnak;
    (1> az (e) lépés szerinti preparátumot eézhsm-ltioridos atacentttfegálássutk vetjük alá; és (g) a tisztitett fiBsAg-t gybgjteserészetifeg alkalmazható hordozóanyaggal tattbbrálvs stabil, femnarogán hepatitisz ti vakolnál telítetek elő, ahol a kapott vakzttóhoz tiemetóŐt nora adagolunk,
  2. 2, Az 1. igénypont szerinti «.Ijétes, álról a eiszteint I és Ifi «Μ közötti végkosteóteráoiőbsm adagoljuk.
  3. 3, A 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a efezteínf mintegy 2 mM vágkoneeutttóóbsn adagoljuk.
  4. 4. Az előző Igénypontok bármelyike szerinti el járás, ahol az ioncserés kromafegratóás aníoncserés ktomatogmfetóí.
    fcfcfcfc X* fcfcfc* fcfc fc * ♦
  5. 5. Az elázó igénypontok bármelyike szerinti eljárás, shoí a vakcinát további komponensként adjovássssü kombinálok.
  6. 6, Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol sz sdjuváss egy ahmdnmm só.
  7. 7, A 6, igénypont szerinti ellátás, ahol az adjuváns aítmtímtmjJydröxid gél vagy alnminitanJbszfát.
    4. A á, igénypont szerinti eljárás, alsói az adjuvásss egy THÍ-ináafcáló adjnváns,
    $. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a ΊΉΙ-mdnkáló adjuvéns 3-I3MPI, QS21,3-DMPL és QS21 vagy egy Cp<5 oügonnkíeoiíd.
  8. 10, A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol az adjtmas 3D-MPL és egy altmrinitnn só.
HU0302951A 2000-08-10 2001-08-07 Purification of hbv antigens for use in vaccines HU228932B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) 2000-08-10 2000-08-10 Novel treatment
GB0101334A GB0101334D0 (en) 2001-01-18 2001-01-18 Novel compounds
PCT/EP2001/009100 WO2002012287A1 (en) 2000-08-10 2001-08-07 Purification of hbv antigens for use in vaccines

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0302951A2 HUP0302951A2 (hu) 2003-12-29
HUP0302951A3 HUP0302951A3 (en) 2004-10-28
HU228932B1 true HU228932B1 (en) 2013-06-28

Family

ID=26244821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0302951A HU228932B1 (en) 2000-08-10 2001-08-07 Purification of hbv antigens for use in vaccines

Country Status (36)

Country Link
US (3) US20030235590A1 (hu)
EP (2) EP1307473B1 (hu)
JP (2) JP2004505992A (hu)
KR (1) KR100804922B1 (hu)
CN (1) CN1468256B (hu)
AP (1) AP2003002734A0 (hu)
AR (1) AR030325A1 (hu)
AT (2) ATE313558T1 (hu)
AU (2) AU8207301A (hu)
BG (1) BG66038B1 (hu)
BR (1) BRPI0113155C1 (hu)
CA (2) CA2427475C (hu)
CY (2) CY1106310T1 (hu)
CZ (1) CZ303217B6 (hu)
DE (2) DE60136400D1 (hu)
DK (2) DK1307473T3 (hu)
DZ (1) DZ3470A1 (hu)
EA (1) EA006433B1 (hu)
EG (1) EG25829A (hu)
ES (2) ES2254464T3 (hu)
HK (1) HK1056884A1 (hu)
HU (1) HU228932B1 (hu)
IL (2) IL154301A0 (hu)
MX (1) MXPA03001235A (hu)
MY (1) MY128999A (hu)
NO (1) NO20030635L (hu)
NZ (1) NZ524012A (hu)
OA (1) OA12361A (hu)
PE (1) PE20020287A1 (hu)
PL (1) PL204736B1 (hu)
PT (1) PT1666487E (hu)
SI (2) SI1307473T1 (hu)
SK (2) SK288079B6 (hu)
UA (1) UA79735C2 (hu)
UY (1) UY26882A1 (hu)
WO (1) WO2002012287A1 (hu)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
GB0202901D0 (en) * 2002-02-07 2002-03-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
BRPI0613025A2 (pt) * 2005-07-11 2010-12-14 Globeimmune Inc composiÇço para reduzir a resistÊncia a um agente, mÉtodo para a preparaÇço de um veÍculo de levedura e uso da composiÇço
EA014314B1 (ru) * 2005-08-02 2010-10-29 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл Пониженная интерференция между маслосодержащими адъювантами и антигенами, содержащими поверхностно-активные вещества
GB0522765D0 (en) * 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0612142D0 (en) 2006-06-20 2006-08-02 Secr Defence Spreading modulation spectrum control
EP2066344B2 (en) 2006-09-07 2016-06-29 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Inactivated Poliovirus combination vaccine
EA201490303A1 (ru) 2007-05-02 2014-05-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина
WO2009057699A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Kyocera Corporation 弾性波装置
US8250102B2 (en) * 2008-03-14 2012-08-21 Microsoft Corporation Remote storage and management of binary object data
KR100959145B1 (ko) 2008-03-21 2010-05-25 중앙대학교 산학협력단 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법
CA2725329C (en) * 2008-05-23 2013-10-01 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
EA020617B1 (ru) * 2009-05-27 2014-12-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Конструкции casb7439
PT2705365T (pt) * 2011-01-14 2016-09-19 Hal Allergy Holding B V Imunoensaio para determinação direta do teor de antigénio de produtos compreendendo partículas de antigénio acoplado a adjuvante
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
CA3070039A1 (en) 2017-07-18 2019-01-24 Serum Institute Of India Pvt Ltd. An immunogenic composition having improved stability, enhanced immunogenicity and reduced reactogenicity and process for preparation thereof
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
CA3132601A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b immunisation regimen and compositions
AU2020403296A1 (en) * 2019-12-13 2022-07-07 Grand Theravac Life Science (Nanjing) Co., Ltd. Immunostimulatory composition and use thereof

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1030777A (en) * 1963-12-06 1966-05-25 Ciba Ltd Method of preparing a vaccine against trypanosoma cruzi infections
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4720385A (en) * 1983-03-29 1988-01-19 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
JPS6013718A (ja) 1983-07-05 1985-01-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｂ型肝炎ワクチン
KR850001534A (ko) 1983-08-22 1985-03-30 제임스 에프. 나우톤 형질전환된 효모로 부터 유도된 면역원성 HBsAg
US4683294A (en) 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
US4895800A (en) 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
EP0278940A3 (en) 1987-01-30 1988-12-07 Smithkline Biologicals S.A. Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
DE3789866T2 (de) 1987-07-17 1994-09-22 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh DNA-Moleküle, die für FMDH-Kontrollabschnitte und Strukturgene für ein Protein mit FMDH-Aktivität kodieren, sowie deren Anwendung.
EP0314240A3 (en) * 1987-10-26 1990-03-28 Merck & Co. Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
JPH085804B2 (ja) 1988-04-28 1996-01-24 財団法人化学及血清療法研究所 Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5242812A (en) * 1989-02-07 1993-09-07 Bio-Technology General Corp. Method for production and purification of hepatitis B vaccine
US5274081A (en) * 1989-09-20 1993-12-28 Immuno A.G. Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen
GB9007024D0 (en) 1990-03-29 1990-05-30 Imperial College Novel vaccine
WO1992011291A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
JP3026029B2 (ja) 1991-04-26 2000-03-27 財団法人阪大微生物病研究会 組換え水痘ウイルスとその作製法
AU657168B2 (en) 1991-09-18 1995-03-02 Amgen, Inc. Hepatitis B vaccine with bile salt adjuvant
US6620414B2 (en) * 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
HU219808B (hu) 1992-06-25 2001-08-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Adjuvánst tartalmazó vakcinakompozíció és eljárás annak előállítására
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
CA2194761C (en) 1994-07-15 2006-12-19 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
DE69535530D1 (de) * 1994-10-24 2007-08-16 Ophidian Pharm Inc Impfstoff und Antitoxine zur Behandlung und Vorbeugung von C. Difficile Krankheiten
KR960023066A (ko) * 1994-12-10 1996-07-18 성재갑 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
BR9908599A (pt) * 1998-03-09 2000-11-14 Smithkline Beecham Biolog Composições combinadas de vacina
JP4620251B2 (ja) 1998-08-10 2011-01-26 アンチジェニックス・インコーポレイテッド Ｃｐｇおよびサポニンアジュバントの組成物並びにその方法
JP2002532116A (ja) * 1998-12-23 2002-10-02 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 改良された組換えｂ型肝炎表面抗原
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах

Also Published As

Publication number Publication date
EP1666487B1 (en) 2008-10-29
AP2003002734A0 (en) 2003-03-31
BG107545A (bg) 2004-01-30
AU8207301A (en) 2002-02-18
CA2427475C (en) 2011-07-05
BRPI0113155B1 (pt) 2018-11-21
DK1307473T3 (da) 2006-05-01
DE60116107T2 (de) 2006-08-03
PL362322A1 (en) 2004-10-18
CZ2003385A3 (cs) 2003-06-18
JP2012255015A (ja) 2012-12-27
BRPI0113155B8 (pt) 2019-08-13
BRPI0113155C1 (pt) 2021-05-25
AU2001282073B2 (en) 2005-01-20
MY128999A (en) 2007-03-30
DK1666487T3 (da) 2009-01-12
DE60116107D1 (de) 2006-01-26
IL154301A0 (en) 2003-09-17
BR0113155A (pt) 2003-07-08
EP1666487A1 (en) 2006-06-07
UY26882A1 (es) 2002-03-22
PT1666487E (pt) 2008-12-26
UA79735C2 (uk) 2007-07-25
KR100804922B1 (ko) 2008-02-20
ATE412665T1 (de) 2008-11-15
EP1307473A1 (en) 2003-05-07
AR030325A1 (es) 2003-08-20
ES2254464T3 (es) 2006-06-16
ES2314555T3 (es) 2009-03-16
US20090123496A1 (en) 2009-05-14
PE20020287A1 (es) 2002-06-20
CN1468256A (zh) 2004-01-14
EA006433B1 (ru) 2005-12-29
DE60136400D1 (de) 2008-12-11
CY1108789T1 (el) 2014-04-09
US8624004B2 (en) 2014-01-07
KR20030029127A (ko) 2003-04-11
SK288069B6 (sk) 2013-05-03
SK288079B6 (sk) 2013-06-03
CZ303217B6 (cs) 2012-05-30
SI1666487T1 (sl) 2009-02-28
OA12361A (en) 2004-04-13
EA200300129A1 (ru) 2003-10-30
DZ3470A1 (fr) 2002-02-14
BG66038B1 (bg) 2010-11-30
CN1468256B (zh) 2010-10-27
SI1307473T1 (sl) 2006-04-30
NZ524012A (en) 2004-02-27
WO2002012287A1 (en) 2002-02-14
HUP0302951A3 (en) 2004-10-28
SK1692003A3 (en) 2003-08-05
EP1307473B1 (en) 2005-12-21
MXPA03001235A (es) 2004-07-16
HK1056884A1 (en) 2004-03-05
JP2004505992A (ja) 2004-02-26
US20030235590A1 (en) 2003-12-25
NO20030635D0 (no) 2003-02-07
HUP0302951A2 (hu) 2003-12-29
CA2427475A1 (en) 2002-02-11
US20060159705A1 (en) 2006-07-20
CA2740282A1 (en) 2002-02-11
EG25829A (en) 2012-09-02
IL154301A (en) 2009-11-18
PL204736B1 (pl) 2010-02-26
JP5559847B2 (ja) 2014-07-23
ATE313558T1 (de) 2006-01-15
CY1106310T1 (el) 2011-10-12
NO20030635L (no) 2003-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228932B1 (en) Purification of hbv antigens for use in vaccines
DE69333985T2 (de) Allergene proteine und peptide von hundhautanhangsgebilden und ihre verwendung
DE69838513T2 (de) Verkürztes hepatitis-c-virus protein nsb5 und methoden, um antivirale substanzen zu identifizieren
JPH09510740A (ja) クイラヤ サポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤
EP0124896B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Viren bzw. Virusantigenen und deren Anwendung in Diagnose und Therapie (Impfstoff)
US5616685A (en) snRNP-A antigen and fragments thereof
DE69325943T3 (de) Synthetische Polypeptide vom Hepatitis C-Virus, verwendbar für den Nachweis des Virus
DE69738597T2 (de) Vakzine gegen das varicella zostervirus produkt von gen 63
Bakay et al. Binding of thalidomide by macromolecules in the fetal and maternal rat
Belcourt et al. Ethylenediaminetetraacetic acid insoluble protein of adult human enamel
CA1208554A (en) Non-a, non-b hepatitis antigen
KR0141678B1 (ko) 정제 진드기 알레르겐
Ruiz-Bravo et al. Immunolocalization of the sea urchin sperm receptor in eggs and maturing ovaries
TWI653049B (zh) 合成多肽、包含該合成多肽之疫苗組合物及其用途
NO20130773L (no) Metode for fremstilling av en vaksine
Ogbuihi et al. Fatal case of propoxyphene overdose: Morphological and toxicological findings
Swango Studies on a Measles Virus Inhibitor Present in Normal Rat Brain
WO1997042318A1 (en) Vaccines
SE431215B (sv) Polypeptidfraktion isolerad ur hemolymfa fran blamussla till anvendning som anti-viralt lekemedel
EP1235591A1 (en) Vaccine adjuvants comprising ginseng plant extract and added aluminium salt

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees