EA014314B1

EA014314B1 - Пониженная интерференция между маслосодержащими адъювантами и антигенами, содержащими поверхностно-активные вещества

Info

Publication number: EA014314B1
Application number: EA200800509A
Authority: EA
Inventors: Марио КОНТОРНИ
Original assignee: Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл
Priority date: 2005-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2010-10-29
Also published as: IL189102A0; EP1909830A2; AP2745A; AU2006274647B2; CA2617362A1; AU2006274647A1; KR20080038384A; PT1909830E; EA200800509A1; WO2007015167A3; WO2007015167A2; CY1112149T1; SI1909830T1; DK1909830T3; MX2008001527A; US20090220547A1; EP1909830B1; ATE526036T1; NO20081033L; CN103690945A

Abstract

Включение алифатических адъювантов в вакцинные композиции может вызывать осложнения с некоторыми антигенными компонентами, в особенности с антигенами, которые включают поверхностно-активное вещество в качестве компонента. Способ получения иммуногенной композиции, включающей антиген и алифатический адъювант, включает очистку антигена, по существу, в отсутствие поверхностно-активного вещества. Там, где присутствия поверхностно-активных веществ избежать нельзя, комбинируются следующие: (i) антигенный компонент, который включает поверхностно-активное вещество, и (ii) алифатический адъювантный компонент с образованием композиции, в которой весовое отношение указанного алифатического адъюванта к указанному поверхностно-активному веществу составляет менее 1000:1.

Description

Все цитированные здесь документы включены ссылкой во всей их полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области производства вакцин с адъювантами. В частности, оно касается применения алифатических адъювантов в производстве вакцин, основанных на антигенах, содержащих поверхностно-активные вещества.

Уровень техники

Применение адъювантов для усиления иммунных ответов на вакцинные антигены хорошо известно (например, см. ссылки 1 и 2). В течение многих лет адъювантами, утвержденными к использованию для людей, были только соли алюминия, но вакцины, содержащие адъювант МР59 и адъювант К.С-529, были утверждены в различных странах, включая Италию (в продукте РТИЛО™ фирмы СЫгои) и Аргентину (в продукте ЗИРЕВУАХ™ фирмы Вета Вю1еей). Прочие адъюванты, находящиеся на последней стадии экспериментальных испытаний на людях, включают смеси холестерина и сапонинов, Р5СОМ, МРЬ™, А804, виросомы, 8ВА4 и т.д.

Общим признаком некоторых альтернатив солям алюминия является наличие алифатического компонента. Например, адъювант МР59 включает сквален (масло), и МРЬ содержит деацилированную форму монофосфориллипида А, имеющую множественные цепи алифатических кислот, присоединенные к диглюкозаминному каркасу.

Настоящее изобретение касается предотвращения интерференции, которая может возникать между этими алифатическими адъювантами и антигенами, которые включают поверхностно-активное вещество в качестве компонента.

Сущность изобретения

Автор обнаружил, что алифатические адъюванты в вакцинных композициях могут быть несовместимыми с антигенами, которые включают поверхностно-активное вещество в качестве компонента.

Во многих случаях, однако, остается желательным сочетание алифатического адъюванта и смеси антигена с поверхностно-активным веществом, и целью настоящего изобретения является выявление путей предотвращения трудностей, которые могут возникать при выполнении этого. Другая цель состоит в обеспечении способов комбинирования адъювантов и антигенов, в которых несовместимость предотвращается.

Чтобы предотвратить эти проблемы несовместимости при использовании антигенов, которые обычно очищаются с использованием поверхностно-активных веществ, первый аспект изобретения представляет способ получения иммуногенной композиции, в котором: (а) композиция включает антиген и алифатический адъювант; и (Ь) антиген очищается в основном в отсутствие поверхностно-активного вещества. С помощью очистки антигена альтернативным путем, в котором не используется поверхностно-активное вещество, может быть преодолена любая несовместимость с алифатическими адъювантами.

Однако, по клиническим, историческим причинам или вопросам правового регулирования может оказаться невозможным очистить антиген без использования поверхностно-активных веществ, или же полностью устранить поверхностно-активные вещества из вакцин. В этом случае изобретение предотвращает интерференцию путем уменьшения отношения масла к поверхностно-активному веществу в композиции. Типичная вакцина МР59/НВ§Ад содержит огромный избыток масла относительно поверхностно-активного вещества, с соотношением масло :поверхностно-активное вещество более 4000:1 (по весу). Настоящее изобретение имеет целью минимизировать количество алифатического адъюванта в композиции и, во втором аспекте, изобретение использует самое большее 1000-кратный избыток масла по весу. Таким образом, изобретение обеспечивает способ получения иммуногенной композиции, включающий стадии комбинирования (ί) антигенного компонента, который включает поверхностно-активное вещество, и (ίί) алифатического адъювантного компонента, с образованием композиции, в которой весовое отношение алифатического адъюванта к поверхностно-активному веществу составляет менее чем 1000:1. Подобным образом, изобретение представляет иммуногенную композицию, в которой: (а) композиция включает антигенный компонент и алифатический адъювантный компонент; (Ь) антигенный компонент включает поверхностно-активное вещество и (с) весовое отношение алифатического адъюванта к поверхностно-активному веществу составляет менее чем 1000:1.

Алифатический адъювант

Как первый, так и второй аспекты изобретения используют алифатический адъювант, то есть адъювантный компонент, который включает алифатическую молекулу. Типичные алифатические адъюванты включают масло, преобразуемое в ходе обмена веществ, алифатическую кислоту и/или молекулу, включающую фрагмент алифатической кислоты.

Два предпочтительных алифатических адъюванта представляют собой адъюванты, известные как МР59 и МРЬ. МР59 представляет собой алифатический адъювант, поскольку он содержит сквален, который является маслом, преобразуемым в ходе обмена веществ. МРЬ представляет собой алифатический адъювант, поскольку он содержит дисахарид, замещенный многочисленными цепями алифатических кислот. Наряду с МР59, могут быть также использованы другие адъюванты в форме эмульсий типа масло в воде.

- 1 014314

Таким образом, предпочтительные композиции согласно изобретению включают: (а) эмульсию типа масло в воде, такую как субмикронная эмульсия типа масло в воде, включающая сквален и полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (и, необязательно, сорбитантриолеат); и/или (Ь) 3-О-деацилированный монофосфориллипид А. Полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат также известен как полисорбат 80.

В дополнение к МР59 и МРЬ, другие алифатические адъюванты, которые могут быть использованы согласно изобретению, включают, но не ограничиваются таковыми: производные глюкозаминидфосфата; Ν-ацилпсевдодипептиды;

растворимый адъювант, производный от липида А Е5с11сг1с111а. сой, известный как ОМ-174; соединения, содержащие липиды, связанные с фосфатсодержащим ациклическим остовом; и ациклические синтетические аналоги липида А.

Когда используется эмульсия адъюванта типа масло в воде, такого как МР59, то, как правило, она добавляется к равному объему водной антигенной композиции так, что эмульсия составляет 50 об.% от всей композиции. Когда используется адъювант 3Э-МРЕ. типичная доза составляет 25 мкг/мл 200 мкг/мл, например в диапазоне 50-150 мкг/мл, 75-125 мкг/мл, 90-110 мкг/мл или примерно 100 мкг/мл. Является обычным введение 25-75 мкг 30-МРБ на дозу, например, 45-55 мкг или примерно 50 мкг 3ΌМРЬ на дозу. Эмульсионный адъювант, такой как МР59, типично поставляется в контейнере отдельно от антигена для немедленного смешения в момент использования, или же он может быть поставлен уже смешанным с антигеном. Адъювант 3Э-МРЕ. как правило, является уже смешанным с антигеном перед поставкой конечным пользователям.

МР59

Адъювант МР59 представляет собой эмульсию типа масло в воде, образованную из сквалена, Твина 80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата) и Спана 85 (сорбитантриолеата). Эмульсия подвергается микрофлюидизированию для формирования эмульсии микрокапелек субмикронного размера. Получение МР59 было первоначально описано в ссылке 3, и продукт изготавливался и продавался фирмой СЫтои Сотрогайои. Дальнейшие подробности могут быть найдены в главе 10 ссылки 2, главе 12 ссылки 1 и в ссылках 4-6. Состав МР59 по объему представляет собой 5% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,5% Спана 85. В весовых единицах эти соотношения составляют 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Спана 85. Собственное содержание поверхностно-активного вещества в МР59 не принимается в расчет, когда соотношение масло:поверхностно-активное вещество рассчитывается во втором аспекте изобретения, так как соотношение основывается на содержании поверхностно-активного вещества в антигене.

Эмульсия МР59 преимущественно включает цитрат-ионы, например буфер цитрата натрия с концентрацией 10 мМ.

Другие эмульсии типа масло в воде

В качестве альтернативы адъюванту МР59 могут быть использованы другие эмульсии типа масло в воде. Адъювантные эмульсии типично включают по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, при том, что масло(масла) и поверхностно-активное(-ые) вещество(-а) являются биоразлогаемыми (преобразуемыми в ходе обмена веществ) и биосовместимыми. Микрокапельки масла в эмульсии имеют в общем менее чем 5 мкм в диаметре, обычно с субмикронным диаметром. Малые размеры микрокапелек могут быть достигнуты с помощью микроэмульгатора для создания стабильных эмульсий.

Микрокапельки с размером менее чем 220 нм предпочтительны, так как они могут быть подвергнуты стерилизации фильтрованием.

Эмульсии могут включать масла, такие как таковые из животных (таких как рыба) или растительных источников, а не минеральные масла. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло являются наиболее общедоступными и представляют собой примеры ореховых масел. Может быть использовано масло жожоба, например, полученное из бобов жожоба. Растительные масла из семян включают сафлоровое масло, масло из семян хлопка, масло из семян подсолнечника, масло из семян кунжута и тому подобные. В зерновой группе кукурузное масло является наиболее легкодоступным, но может быть также использовано масло других злаковых зерен, таких как пшеница, овес, рожь, рис, метличка абиссинская, тритикале и тому подобные. Сложные эфиры алифатических кислот, содержащих 6-10 атомов углерода, с глицерином и 1,2пропандиолом, если они природно не присутствуют в маслах из семян, могут быть получены путем гидролиза, отделения и этерификации подходящих материалов, начиная с ореховых и зерновых масел. Жиры и масла из молока млекопитающих являются преобразуемыми в ходе обмена веществ и поэтому могут быть использованы в практике настоящего изобретения. Методы отделения, очистки, омыления и другие средства, необходимые для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в данной области. Большинство рыб содержит преобразуемые в ходе обмена веществ масла, которые могут быть легко извлечены. Например, рыбий жир, жир акульей печени и китовый жир, такой как спермацет, представляют собой примеры нескольких масел рыбьего происхождения, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Некоторые масла с разветвленными цепями биохимическим путем преобразуются в пятиуглеродные изопреновые блоки, которые обычно называются терпеноидами. Масло акульей печени содержит разветвленные ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален,

- 2 014314

2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который в особенности предпочтителен здесь. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также является предпочтительным маслом. Рыбьи масла, включая сквален и сквалан, являются легкодоступными из коммерческих источников или могут быть получены известными в данной области способами. Другими предпочтительными маслами являются токоферолы (см. ниже). Могут быть использованы смеси масел.

Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по их гидрофильнолипофильному балансу (НЬВ). Предпочтительные поверхностно-активные вещества согласно изобретению имеют НЬВ, равный по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, и более предпочтительно по меньшей мере 16. Изобретение может быть использовано с поверхностно-активными веществами, включающими, но не ограничивающимися таковыми:

полиоксиэтиленсорбитановые сложноэфирные поверхностно-активные вещества (обычно называемые как Твины), в особенности полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропиленоксида (РО), и/или бутиленоксида (ВО), которые продаются под торговым наименованием ΟΘΧνΡΛΧ™. такие как линейные ЕО/РО-блок-сополимеры; октоксинолы, которые могут варьировать по числу повторяющихся этоксигрупп (окси-1,2-этандиильных фрагментов), из которых октоксинол-9 (Тритон Χ-100, или ΐ-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особенный интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (ЮЕРАЬ 0Ά-630/ΝΡ-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин);

полиоксиэтиленовые алифатические простые эфиры, производные лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Вгу), такие как монолауриловый простой эфир триэтиленгликоля (Вгу 30); и сорбитановые сложные эфиры (общеизвестные как Спаны), такие как сорбитантриолеат (Спан 85) и сорбитанмонолаурат.

Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются Твин 80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат), Спан 85 (сорбитантриолеат), лецитин и Тритон Х-100. Могут быть использованы смеси поверхностно-активных веществ, например смеси Твин 80/Спан 85, или смеси Твин 80/Тритон Х-100.

Эмульсионные адъюванты типа масло в воде, пригодные для изобретения, включают, но не ограничиваются таковыми.

Эмульсия сквалена, токоферола и Твина 80. Эмульсия может включать фосфатно-солевой буферный раствор. Она может также включать Спан 85 (например, на уровне 1%) и/или лецитин. Эти эмульсии могут содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% Твина 80, и весовое отношение сквален:токоферол составляет предпочтительно <1, так как это обеспечивает более стабильную эмульсию. Одна такая эмульсия может быть получена путем растворения Твина 80 в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8) с образованием 2%-ного раствора, затем смешивания 90 мл этого раствора со смесью (5 г ΌΌ-α-токоферола и 5 мл сквалена), затем микрофлюидизирования смеси. Полученная эмульсия может иметь субмикронные масляные микрокапельки, например, со средним диаметром 100-250 нм, предпочтительно примерно 180 нм.

Эмульсия сквалена, токоферола и Тритона как детергента (например, Тритона Х-100).

Эмульсия сквалана, полисорбата 80 и Полоксамера 401 (Р1игошс Ь121). Эмульсия может быть приготовлена в составе с фосфатно-солевым буферным раствором, с рН 7,4. Эта эмульсия представляет собой полезный носитель доставки для мурамилдипептидов и была использована с треонил-ΜΌΡ (треонил-мурамилдипептид, ТЬг-ΜΌΡ) в адъюванте 8ΆΕ-1 [ссылка 7] (0,05-1% ТЬг-ΜΌΡ, 5% сквалана, 2,5% Р1игошс Ь121 и 0,2% полисорбата 80). Она может быть также использована без ТЬг-ΜΌΡ, как в адъюванте АЕ [ссылка 8] (5% сквалана, 1,25% Р1игошс Ь121 и 0,2% полисорбата 80). Предпочтительно микрофлюидизирование.

Эмульсия, содержащая от 0,5 до 50% масла, 0,1-10% фосфолипида и 0,05-5% неионного поверхностно-активного вещества. Как описано в ссылке 9, предпочтительными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Предпочтительны микрокапельки субмикронного размера.

Субмикронная эмульсия типа масло в воде масла, непреобразуемого в ходе обмена веществ (такого как легкое минеральное масло), и по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества (такого как лецитин, Твин 80 или Спан 80). Могут быть включены добавки, такие как сапонин ОпПА, холестерин, сапонин-липофильный конъюгат (такой как 0ΡΙ-0100, описанный в ссылке 10, получаемый присоединением алифатического амина к деацилированному сапонину по карбоксильной группе глюкуроновой кислоты), бромид диметилдиоктадециламмония и/или ^№диоктадецил-^№бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин.

Эмульсия, в которой сапонин (например, ΟιιίΙΆ или 0821) и стерин (например, холестерин) ассоциированы в виде спиральных мицелл [ссылка 11].

Эмульсии предпочтительно смешиваются с антигеном непосредственно перед использованием в момент поставки. Таким образом, адъювант и антиген обычно хранятся по отдельности в упакованной или распределенной вакцине, готовой для конечного составления в момент использования. Антиген

- 3 014314 обычно находится в водной форме, так что вакцина в конце концов готовится смешиванием двух жидкостей. Объемное соотношение двух жидкостей для смешивания может варьировать (например, 5:1 - 1:5), но обычно оно составляет примерно 1:1.

Когда композиция включает токоферол, может быть использован любой из -α, β-, γ-, δ-,ε- или ξтокоферолов, но предпочтительны-токоферолы. Токоферол может быть взят в нескольких формах, например, различных солей и/или изомеров. Соли включают органические соли, такие как сукцинаты, ацетаты, никотинаты и т.д. Ό-α-токоферол и НБ-а-токоферол могут быть использованы оба. Предпочтительным -токоферолом является ΌΤ-α-токоферол, и предпочтительной солью этого токоферола является сукцинат.

3Б-МРЬ

3-О-деацилированный монофосфориллипид Α (3Ό-ΜΡΌ; также называемый как 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А или 3-О-дезацил-4'-монофосфориллипид А) является известным адъювантом. Наименование показывает, что положение 3 на восстанавливающем конце глюкозамина в монофосфориллипиде А является деацилированным. 3Ό-ΜΡΤ был получен из не содержащего гептозы мутанта 8а1топе11а ттпсюЮ. и химически он подобен липиду А, но лишен кислото-лабильной фосфорильной группы и основно-лабильной ацильной группы. Он активирует клетки моноцит/макрофаговой линии дифференцировки и стимулирует выделение некоторых цитокинов, включая 1Ь-1, 1Ь-12, ΤΝΤ-α и ΟΜС8Р. Приготовление 3Ό-ΜΡΤ было первоначально описано в ссылке 12, и продукт производится и продается фирмой Сопха Сотротайои под торговым наименованием МРЬ. Дальнейшие подробности могут быть найдены в ссылках 13-16.

3Ό-ΜΡΤ может принимать форму смеси родственных молекул, с вариацией степени их ацилирования (например, имеющих 3, 4, 5 или 6 ацильных цепей, которые могут иметь различную длину). Два глюкозаминных (также известных как 2-дезокси-2-аминоглюкоза) моносахаридных фрагмента являются Ν-ацилированными по их углеродам в положениях 2 (то есть по положениям 2 и 2'), и имеет место также О-ацилирование по кислороду в положении 3'. Группа, присоединенная к углероду в положении 2, имеет формулу -Ж-СО-СЩ-СВ'В¹'. Группа, присоединенная к углероду в положении 2' , имеет формулу -ΝΗСО-СН2-СВ²В²'. Группа, присоединенная к углероду в положении 3', имеет формулу -О-СО-СН2-СВ³В³'. Иллюстративная структура такова:

Каждая из групп В¹, В² и В³ независимо представляет собой -(СН₂)_П-СН₃. Значение η предпочтительно составляет от 8 до 16, более предпочтительно от 9 до 12, и наиболее предпочтительно равно 10.

Каждая из групп В¹', В²' и В³' независимо может быть: (а) -Н; (Ь) -ОН; или (с) -О-СО-В⁴, где В⁴представляет собой либо -Н, либо - (СН2)т-СН3, где значение т составляет предпочтительно от 8 до 16, и более предпочтительно оно равно 10, 12 или 14. В положении 2 т предпочтительно равно 14. В положении 2' т предпочтительно равно 10. В положении 3' т предпочтительно равно 12. Группы В¹', В²' и В³' тем самым представляют собой предпочтительно -О-ацильные группы из лауриновой кислоты, миристиновой кислоты или пальмитиновой кислоты.

Когда все из групп В¹', В²' и В³' являются -Н, тогда 3Ό-ΜΡΤ имеет только 3 ацильных цепи (каждая из которых в положениях 2, 2' и 3') . Когда только две из групп В¹', В²' и В³' являются -Н, тогда 3Ό-ΜΡΤ может иметь 4 ацильных цепи. Когда только одна из групп В¹', В²' и В³' является -Н, тогда 3Ό-ΜΡΤ может иметь 5 ацильных цепей. Когда же ни одна из групп В¹', В²' и В³' не является -Н, тогда 3Ό-ΜΡΤ может иметь 6 ацильных цепей. Адъювант 3Ό-ΜΡΤ, используемый согласно изобретению, может быть смесью этих форм, содержащих от 3 до 6 ацильных цепей, но предпочтительно включать в смесь 3Ό-ΜΡΤ с 6 ацильными цепями, и в особенности для обеспечения того, что форма с шестью ацильными цепями составляет по меньшей мере 10% по весу от общего 3Ό-ΜΡΤ, например >20%, >30%, >40%, >50% или более. Было показано, что 3Ό-ΜΡΤ с 6 ацильными цепями является наиболее активной формой адъюванта.

Таким образом, наиболее предпочтительной формой 3Ό-ΜΡΤ для включения в композицию согласно изобретению является:

- 4 014314

Там, где ЗИ-МРЬ используется в форме смеси, указания о количествах или концентрациях ЗИ-МРЬ в композициях согласно изобретению касаются комбинированных частиц ЗИ-МРЬ в смеси.

В водных условиях ЗИ-МРЬ может образовывать мицеллярные агрегаты или частицы с различными размерами, например, с диаметром <150 нм или >500 нм. Каждая из них или обе могут быть использованы согласно изобретению, и лучшие частицы могут быть отобраны общепринятым анализом. Наименьшие частицы (например, в достаточной степени маленькие, чтобы образовать прозрачные водные суспензии ЗИ-МРЬ) предпочтительны для использования согласно изобретению благодаря их превосходной активности [ссылка 17]. Предпочтительные частицы имеют средний диаметр менее чем 220 нм, более предпочтительно менее чем 200 нм или менее чем 150 нм или менее чем 120 нм, и могут даже иметь средний диаметр менее чем 100 нм. Однако во многих случаях средний диаметр не составляет меньше чем 50 нм. Эти частицы малы в достаточной степени, чтобы быть пригодными для стерилизации фильтрованием. Диаметр частиц может быть оценен с помощью общепринятого метода динамического рассеяния света, которым определяется средний диаметр частиц. Там, где частица называется имеющей диаметр х нм, на самом деле имеет место распределение частиц примерно этого среднего значения, но по меньшей мере 50% числа (например, >60, >70, >80, >90 или более) частиц будут иметь диаметр в пределах диапазона х ± 25%.

ЗП-МРЬ может быть использован в качестве адъюванта и сам по себе, или в сочетании с одним или несколькими дополнительными адъювантными соединениями. Например, известно применение ЗП-МРЬ в комбинации с сапонином 0821 [ссылка 18], с 0821 и эмульсией типа масло в воде [ссылка 19], с фосфатом алюминия [ссылка 20], с гидроксидом алюминия [ссылка 21], или с сапонинами и интерлейкином-12 [ссылка 22].

Предпочтительная смесь адъювантов, в частности, для использования с НВзАд включает смесь ЗЭМРЬ и соли алюминия, преимущественно фосфата алюминия. Преимущественно ЗЭ-МРЬ адсорбируется на соли алюминия. Предпочтительно адсорбируются по меньшей мере 50% (по весу) ЗП-МРЬ, например >60, >70, >80, >90, >95, >98 или более.

Алюминиевые адъюванты, используемые в настоящее время, типично обозначаются либо как адъюванты из гидроксида алюминия, либо как адъюванты из фосфата алюминия. Однако эти наименования приняты для удобства, поскольку нет ни одного точного описания реального химического соединения, которое наличествует (например, см. главу 9 ссылки 2). Для комбинации с алифатическим адъювантом, таким как ЗП-МРЬ, изобретение может использовать любую из гидроксидной или фосфатной солей, которые в общем используются как адъюванты.

Адъюванты, известные как гидроксид алюминия, на самом деле представляют собой соли оксигидроксида алюминия, которые обычно, по меньшей мере частично, являются кристаллическими. Оксигидроксид алюминия, который может быть представлен формулой А1О(ОН), можно отличить от прочих соединений алюминия, таких как гидроксид алюминия А1(ОН)_З, с помощью инфракрасной (ИК) спектроскопии, в частности по присутствию полосы поглощения при 1070 см^-1 и сильному плечу при З090-З100 см^-1 (глава 9 в ссылке 2).

Адъюванты, известные как фосфат алюминия, обычно представляют собой гидроксифосфаты алюминия, часто содержащие также небольшое количество сульфата. Они могут быть получены осаждением, и реакционные условия и концентрации в способе осаждения влияют на степень замещения фос

- 5 014314 фата на гидроксил в соли. Гидроксифосфаты в общем имеют молярное соотношение ΡΟ4/ΑΙ 0,3-0,99. Гидроксифосфаты можно отличить от чистого А1РО₄ по присутствию гидроксильных групп. Например, полоса в ИК-спектре при 3164 см^-1 (например, при нагревании до 200°С) показывает присутствие структурных гидроксилов (глава 9 в ссылке 2).

Молярное отношение РО₄/А1³⁺ в алюминийфосфатном адъюванте обычно составляет 0,3-1,2, предпочтительно 0,8-1,2 и более предпочтительно 0,95±0,1. Фосфат алюминия обычно является аморфным, в особенности в случае гидроксифосфатных солей. Типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением РО₄/А1 0,84-0,92, включаемый на уровне 0,6 мг А1³⁺/мл. Фосфат алюминия обычно является дисперсным. Типичные диаметры частиц колеблются в интервале 0,5-20 мкм (например, примерно 5-10 мкм) после адсорбции любого антигена.

Точка нулевого заряда (ΡΖΟ) фосфата алюминия обратно пропорционально соотносится со степенью замещения фосфата на гидроксил, и эта степень замещения может варьировать в зависимости от реакционных условий и концентрации реактантов, использованных для получения соли путем осаждения. Точка нулевого заряда (ΡΖΟ) также сдвигается при изменении концентрации свободных фосфатных ионов в растворе (больше фосфата = более кислая ΡΖΟ) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (делает ΡΖΟ более щелочной). Фосфаты алюминия, использованные согласно изобретению, обычно имеют точку нулевого заряда (ΡΖΟ) 4,0-7,0, более предпочтительно 5,0-6,5, например, примерно 5,7.

Раствор фосфата алюминия, использованный для получения композиции согласно изобретению, может содержать буфер (например, фосфатный или гистидиновый или Трис-буфер), но это не всегда является необходимым. Раствор фосфата алюминия преимущественно стерильный и апирогенный. Раствор фосфата алюминия может включать свободные гидратированные фосфатные ионы, например, присутствующие в концентрации 1,0-20 мМ, предпочтительно 5-15 мМ, и более предпочтительно примерно 10 мМ. Раствор фосфата алюминия может также включать хлорид натрия. Концентрация хлорида натрия предпочтительно колеблется в диапазоне от 0,1 до 100 мг/мл (например, 0,5-50 мг/мл, 1-20 мг/мл, 2-10 мг/мл), и более предпочтительно составляет примерно 3±1 мг/мл. Присутствие ЫаС1 облегчает правильное измерение величины рН перед адсорбцией антигенов.

Фосфат алюминия предпочтительно используется в форме водного раствора, к которому добавляется 3Ό-ΜΡΤ (и, необязательно, антиген) (Примечание: является стандартным называть водный фосфат алюминия как раствор, хотя, строго говоря с физико-химической точки зрения, соль нерастворима и образует суспензию). Является предпочтительным разбавлять фосфат алюминия до требуемой концентрации и обеспечивать однородность раствора перед добавлением 3Ό-ΜΡΤ и/или антигена.

Ν-Ацилпсевдодипептиды

Ν-Ацилпсевдодипептидный адъювант предпочтительно включает гидроксильную группу, которая этерифицирована кислотным фрагментом в нейтральной или заряженной форме. Ацильные группы придают псевдодипептидам алифатический характер. Адъювант предпочтительно имеет формулу (I):

Х-А-(СН ^-СЩСНЛ -СО-МН-(СН₂)_р-СН-(СН₂ )_η-β-Υ

I I ®

ΝΗΚ, МНК_г где

Κι представляет собой ацильную группу, происходящую из насыщенной или ненасыщенной, линейной или разветвленной карбоновой кислоты, имеющей от 2 до 24 атомов углерода, и карбоновая кислота является незамещенной или замещенной одним или более заместителями, выбираемыми из группы, состоящей из гидроксильной, алкильной, алкоксильной, ацилоксильной, аминной, ациламинной, ацилтиогруппой и ( (С1_-24)алкил)тиогрупп;

Κ₂ представляет собой ацильную группу, происходящую из насыщенной или ненасыщенной, линейной или разветвленной карбоновой кислоты, имеющей от 2 до 24 атомов углерода, и карбоновая кислота является незамещенной или замещенной одним или более заместителями, выбираемыми из группы, состоящей из гидроксильной, алкильной, алкоксильной, ацилоксильной, аминной, ациламинной, ацилтиогруппой и ( (С1_-24)алкил)тиогрупп;

X представляет собой атом водорода или кислотную группу, либо в нейтральной, либо в заряженной форме;

Υ представляет собой атом водорода или кислотную группу, либо в нейтральной, либо в заряженной форме;

А представляет собой атом кислорода, атом серы или иминогруппу -ΝΗ-;

В представляет собой атом кислорода, атом серы или иминогруппу -ΝΗ-;

т равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

η равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

р равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10; и

с.| равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10,

- 6 014314 при условии, что по меньшей мере один из заместителей X или Υ обозначает кислотную группу в нейтральной или ионной форме.

Адъювант может быть использован либо в кислотной, либо в солевой форме, с органическим или минеральным основанием.

Солеобразующие основания, предназначенные для терапевтического использования, по большей части включают основания щелочных металлов, такие как гидроксиды натрия, калия или лития, соли аммония; основания щелочно-земельных металлов, такие как гидроксиды кальция или стронция и соли магния; соли железа и подобные; органические основания, такие как таковые, производные из первичных, вторичных, третичных аминов, таких как метиламин, диэтиламин, моноэтаноламин, диэтаноламин, бензиламин, Ν-метилбензиламин, вератриламин, триметоксибензиламин; основные аминокислоты, такие как лизин и орнитин или аминосахара. Примерами оснований, не предназначенных для терапевтического использования, являются бруцин, стрихнин, агматин, гомарин, глюкозамин, Ν-метилглюкозамин или Νметилморфолин.

Предпочтительные заместители X и Υ выбирают из карбокси [(С1_-5)алкильных];

СН-[(СН₂)_гСООН][(СН₂)₈СООН], где г равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; 8 равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; фосфоно [(С_1-5)алкильных];

дигидроксифосфорилокси [(С_1-5)алкильных];

диметоксифосфорильных;

фосфоновых;

гидроксисульфонильных; гидроксисульфонил [(С_1-5)алкильных];

гидроксисульфонилокси[(С_1-5)алкильных]групп.

Там, где заместители X и/или Υ обозначают кислотную группу в нейтральной форме, речь идет о свободной карбоновой, сульфоновой или фосфорной форме. Там, где кислотная группа находится в заряженной форме, речь идет о карбоновой, сульфоновой или фосфорной солевой форме, а именно путем добавления органического или минерального основания, предпочтительно такого, какое предназначается для терапевтического использования. Подобные рассуждения применимы, где X и/или Υ обозначают карбоксиалкильную, алкенилбискарбоксильную, гидроксисульфонильную, гидроксисульфонилалкильную, гидроксисульфонилоксиалкильную, фосфоноалкильную или фосфорилоксиалкильную группу.

Там, где т=1 и п=0, адъювант происходит из серина. Там, где т=2 и п=0, адъювант происходит из гомосерина. Если т=3 и п=0, речь идет о пентагомосериновом соединении. Если т=4 и п=0, речь идет о гексагомосериновом соединении.

Там, где р=3 и ц=1, обсуждаемый продукт может быть цитруллиновым, орнитиновым или аргининовым соединением. Там, где р=4 и ц=1, речь идет о гомоаргининовом или лизиновом соединении.

К₁ и К₂ включают насыщенные или ненасыщенные, разветвленные или линейные, ацильные производные, имеющие цепи переменного размера, различающейся или идентичной природы, которые могут иметь один или более заместителей, выбираемых из группы, состоящей из алкильной, аминной, ациламинной, гидроксильной, алкоксильной, ацилоксильной групп, ацилтиогрупп и алкилтиогрупп.

Примерами таких ацилированных, замещенных производных являются рицинолеильный, 1,2гидроксистеароильный, 2-гидрокси-3-метилбутироильный, 3-гидрокси-2-аминопентаноильный, пальмитоильный, элаидильный, элеостеароильный, арахидоильный, арахидонильный, гадолеильный, бегениловый, эруциловый, 8-метилдеканоильный, 9-метилдеканоильный, докозогексаноильный или эйкозапентаноильный радикалы.

Предпочтительные адъюванты имеют формулу (1а), где оба А и В представляют собой атомы кислорода:

Х-О-ВДпгСНЧСНА -СО-МН-(СН₂)_р-СН-(СН_г )_Ч-О-У

I I (1а)

ΝΗΕ^ МНВ_г

В формуле (1а), X и Υ предпочтительно представляют собой либо атом водорода, либо фосфоновую группу.

Пригодные адъюванты формулы (1а) включают 3-(3-додеканоилокситетрадеканоиламино)-9-(3-гидрокситетрадеканоиламино)-4-оксо-5-азадекан-

1.10- диол-1 и/или 10-дигидрофосфат и его аддитивные соли, полученные добавлением органического или минерального основания,

3-(3-додеканоилокситетрадеканоиламино)-9-(3-гидрокситетрадеканоиламино)-4-оксо-5-азадекан-

1.10- диол-1,10-бис(дигидрофосфат) и его аддитивные соли, полученные добавлением органического или минерального основания,

3-(3-гидрокситетрадеканоиламино)-9-(3-додеканоилокситетрадеканоиламино)-4-оксо-5-азадекан-

1,10-диол-1,10-бис(дигидрофосфат) и его аддитивные соли, полученные добавлением органического или минерального основания,

- 7 014314

1,10-диол-1-дигидрофосфат и его аддитивные соли, полученные добавлением органического или минерального основания,

1.10- диол-1-дигидрофосфат и его аддитивные соли, полученные добавлением органического или минерального основания,

1.10- диол-10-дигидрофосфат и его аддитивные соли, полученные добавлением органического или минерального основания.

Способы синтеза адъювантов формулы (I) подробно раскрыты в ссылке 23 и включают способы, включающие стадии: защита аминных функциональных групп в положениях (д+1) и ω диаминокислоты с помощью блокирующих реагентов, легко подвергаемых ацидолизу и гидрогенолизу, соответственно; реакция свободной карбоксильной функциональной группы с восстанавливающим реагентом с образованием соответствующего спирта; снятие защитной группы с аминной функциональной группы в положении (д+1) и затем ацилирование с помощью функционального производного карбоновой кислоты формулы К₂ОН, и затем освобождение концевой аминной функциональной группы путем гидрогенолиза с образованием диаминоспирта общей формулы II (И) каковой аминоспирт конденсируется в присутствии пептидного конденсирующего реагента в инертном растворителе вместе с ω-гидрокси-, ω-амино- или ω-тиоаминокислотным соединением общей формулы III

ХАЦСН^-СЩСН^-СООН с образованием дипептидного соединения формулы (IV)

концевая свободная спиртовая функциональная группа которого, если необходимо, может быть защищена (например, алкильной или ацильной группой, или любой другой подходящей защитной группой) или, в противном случае, замещена, если необходимо, в присутствии, сшивающего реагента. Защищенный спирт может быть подвергнут каталитическому гидрированию или другой обработке для снятия защиты, чтобы получить производное общей формулы I.

Способы синтеза адъювантов формулы (II) также подробно раскрыты в ссылке 23 и включают способы, включающие стадии: защита аминных функциональных групп в положениях (д+1) и ω диаминокислоты формулы Η₂Ν (СН₂)_рСНИН₂(СН₂)_ч+1СООН с помощью создающих защиту реагентов, которые легко подвергаются ацидолизу и гидрогенолизу, соответственно; реакция свободных карбоксильных функциональных групп с восстанавливающим реагентом с образованием соответствующего спирта, снятие защитной группы с аминной функциональной группы в положении (д+1) и затем ацилирование с помощью функционального производного карбоновой кислоты формулы К₂ОН, и затем снятие защитной группы с концевой аминной функциональной группы путем гидрогенолиза с образованием аминоспирта общей формулы II; каковой аминоспирт конденсируется в присутствии пептидного конденсирующего реагента в инертном растворителе вместе с функциональным производным ω-гидроксиаминокислоты общей формулы Ша:

Х<МСН_г)«-^сНЧСНа>»-^С00Н (Ша) где X представляет собой диалкилокси- или диарилоксифосфорильный радикал формулы (КО)₂Р-О с образованием пептидоподобного соединения формулы Ща:

(ГУа)

- 8 014314 где Я представляет собой радикал, который легко подвергается гидрогенолизу, другая спиртовая функциональная группа которого, если желательно, может быть фосфорилирована с помощью фосфорилирующего реагента в присутствии сшивающего реагента, если нужно. Защищенный спирт может быть подвергнут каталитическому гидрированию, с одной стороны, чтобы снять защиту со спиртовой функциональной группы, необязательно присутствующей в ацильной группе Я₂, и с другой стороны, чтобы освободить фосфатную функциональную группу и затем снять защиту путем гидрогенолиза со второй, необязательно присутствующей фосфатной функциональной группы, чтобы получить производное общей формулы V:

(V) и, необязательно, выполнить дальнейшую стадию образования соли с помощью органического или минерального основания.

Стереохимия хиральных центров ациламиногрупп определяется конфигурацией первоначально используемой аминокислоты, тогда как стереохимия ациламиногрупп зависит от конфигурации первоначально использованной алифатической кислоты. Здесь можно исходить из диаминокислот, имеющих Ьили Ό-конфигурацию, или же имеющих рацемическую природу. Можно исходить из гидроксилированной аминокислоты с ЬЦ-конфигурацией или из рацемической смеси. Все такие стереоизомеры или диастереоизомеры включены в рамки изобретения.

В особенности предпочтительные адъюванты, и заслуживающие внимания моно- и бисфосфорилированные соединения, являются таковыми, которые известны как ОМ-294-МР (формула VI) и ΟΜ-294-ΌΡ (формула VII) [ссылка 23]:

ОМ-174

ОМ-174 может быть получен химическим синтезом и содержит триацилированный фрагмент липида А. Это более подробно описано в ссылках 24-26. Ссылка 26 приводит формулу ОМ-174 как:

Таким образом, ОМ-174 имеет 1,4'-бис-фосфорилированный β (1^6)-связанный диглюкозаминный каркас, как найдено в природном липиде А. ОМ-174 может быть представлен в форме агрегатов с мицеллярной Н_гструктурой. то есть в которой липидные молекулы упакованы со своим каркасом в виде ци

- 9 014314 линдрической поверхности, с ацильными цепями, направленными внутрь, и с самими цилиндрами, упа кованными гексагонально.

Кубическая фаза может отсутствовать. Может также отсутствовать Н_п-фаза.

Глюкозаминидфосфатные производные

Аминоалкильные глюкозаминидфосфатные (АСР) производные (например, ВС-529 [ссылки 27, 28]) являются алифатическими адъювантами благодаря их ацильным цепям. В общем эти производные могут иметь следующую формулу [ссылка 29]:

в которой

X представляет атом кислорода или серы, либо в аксиальном, либо в экваториальном положении;

Υ представляет атом кислорода или ИН-группу;

''п, т, р и с.| являются одинаковыми или различными и являются целыми числами от 0 до 6;

В_ь В₂ и В_З, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют собой остатки алифатических кислот, имеющих от 1 до примерно 20 атомов углерода, и где один из В_ь В₂ или В_З представляет собой необязательно водород;

В₄ и В₅ являются одинаковыми или различными и представляют собой водород или метильную группу;

В₆ и В₇ являются одинаковыми или различными и представляют собой водород, гидроксильную, алкоксильную, фосфоновую, фосфонооксильную, сульфоновую, сульфоксильную, аминную группу, меркаптогруппу, цианогруппу, нитрогруппу, формильную или карбоксильную группу и их сложные эфиры и амиды;

В8 и В9 являются одинаковыми или различными и представляют собой фосфоновую группу или водород, с предпочтением, что по меньшей мере один из В₈ и/или В₉ представляет собой фосфоновую группу.

Конфигурация З'-стереогенных центров, к которым присоединены нормальные алифатические ацильные остатки, это В или 8, но предпочтительно В-конфигурация. Стереохимия атомов углерода, к которым присоединены В₄ или В₅, может быть В- или 8-конфигурацией. Все стереоизомеры, как энантиомеры, так и диастереомеры, и их смеси рассматриваются как входящие в рамки предмета изобретения. Пригодные адъюванты включают соли этих соединений.

Предпочтительное аминоалкильное глюкозаминидфосфатное (АСР) соединение представляет собой ВС-529, которое может быть приготовлено, как описано в ссылке З0:

- 10 014314

Ациклические синтетические аналоги липида А

Аналог липида А, который может быть использован в качестве адъюванта в композициях согласно изобретению, представляет собой ЕЯ-112022 [ссылка 31] , фосфолипидный димер, присоединенный через ациклический каркас:

Каждая мономерная единица ЕЯ-112022 содержит 3 уникальных алифатических группы, которые присоединены опосредованно к фосфатному сложному диэфиру. Алифатические группы включают 10углеродную цепь простого эфира, ненасыщенную 12-углеродную ацилоксильную цепь, связанную с эфирной цепью, и 14-углеродную, Ь-оксоамидную цепь, присоединенную более близко к сложному фосфодиэфиру. Таким образом, соединение имеет 3 уникальных признака, сравнимых с природным липидом А из Е.еой: (ί) ЕЯ-112022 не имеет циклического углеводного каркаса; (ίί) во-вторых, фосфаты представляют собой сложные фосфодиэфиры, внедренные в пределы структурного остова, отличного от сложных фосфоэфиров липида Α Ε.οοίί; и (ίίί) структура является симметричной (шесть симметрично расположенных алифатических кислот на неуглеводном каркасе).

Подобные употребимые соединения включают таковые с формулой XIV, XV или XVI, или их соли:

ссылке 32, такие как ЕЯ 803058,ЕЯ 803732, ЕЯ 804053, ЕЯ 804058, ЕЯ в

как определено

804059, ЕЯ 804442, ЕЯ 804680, ЕЯ 804764, ЕЯ 803022 или ЕЯ 804057, например:

- 11 014314

Соединения, содержащие липиды, присоединенные к фосфатсодержащему ациклическому каркасу, могут быть также использованы в качестве адъювантов, таких как ТЬК4 антагонист Е5564 [ссылки 33, 34]:

Поверхностно-активное вещество

Первый аспект изобретения в значительной степени избегает использования поверхностноактивного вещества в ходе очистки антигена так, что поверхностно-активное вещество не находится внутри антигенного компонента, использованного в изобретении. Однако во втором аспекте поверхностно-активное вещество используется, но на контролируемом уровне относительно алифатического адъюванта.

Поверхностно-активное вещество обычно представляет собой неионное поверхностно-активное вещество, в особенности такое, которое уже находятся в вакцинных составах. Предпочтительны органические поверхностно-активные вещества. Обычно они представляют собой продукты реакций алкиленоксида (например, этиленоксида) с алифатическим спиртом, алифатической кислотой, алкилфенолом, алкиламином или другим подходящим соединением, имеющим по меньшей мере один активный атом водорода. Для большинства поверхностно-активных веществ наиболее распространенные спирты, амины и кислоты имеют углеродную цепь с длиной в пределах С₈-С₁₈. Наиболее распространенные алкилфенолы представляют собой нонилфенол и октилфенол. Поверхностно-активные вещества, содержащие полиоксиэтиленовые остатки, являются в особенности предпочтительными.

Например, изобретение может быть использовано с поверхностно-активными веществами, включающими, но не ограничивающимися таковыми: сложноэфирные полиоксиэтиленсорбитановые поверхностно-активные вещества (обычно называемые как Твины), в особенности полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропиленоксида (РО), и/или бутиленоксида (ВО), которые продаются под торговым наименованием ΌΟ^ΕΑΧ™, такие как линейные ЕО/РО-блок-сополимеры; октоксинолы, которые могут варьировать по числу повторяющихся этоксигрупп (окси-1,2-этандиильных фрагментов), из которых октоксинол-9 (Тритон Х-100, или ΐ-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особенный интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (ЮЕРЛЬ СЛ-630/ХР-40); полиоксиэтиленовые алифатические простые эфиры, производные лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Вту), такие как монолауриловый простой эфир триэтиленгликоля (Вту 30); и сорбитановые сложные эфиры (общеизвестные как Спаны), такие как сорбитантриолеат (Спан 85) и сорбитанмонолаурат.

Два конкретных особенно интересных поверхностно-активных вещества представляют Тритон Х100 и полисорбат 20. Таким образом, предпочтительные варианты осуществления первого аспекта изобретения избегают использования этих двух неионных поверхностно-активных веществ в частности, и предпочтительно в основном избегают использования любого неионного поверхностно-активного вещества. Подобным образом, предпочтительные варианты осуществления второго аспекта изобретения используют антигенный компонент, который включает одно из этих двух неионных поверхностноактивных веществ.

Изобретение в особенности пригодно для применения с полисорбатом 20. Это поверхностноактивное вещество имеет установленный профиль безопасности для введения людям, в том числе в составе вакцин.

Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по их гидрофильнолипофильному балансу (НЬВ). Предпочтительные поверхностно-активные вещества согласно изобретению имеют НЬВ, равный по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, и более предпочтительно по меньшей мере 16.

Чтобы избежать введения больших доз поверхностно-активного вещества пациенту во втором аспекте изобретения, предпочтительно, чтобы концентрация поверхностно-активного вещества в композиции была не более чем 50 мкг/мл, например 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 и т.д. Предпочтительна концентрация 20 мкг/мл.

Антиген

Изобретение включает применение антигена. Изобретение в особенности пригодно для применения

- 12 014314 с антигенами, которые обычно очищаются с использованием поверхностно-активных веществ. Эти антигены обычно являются липофильными. Они обычно включают по меньшей мере одну трансмембранную область, которая функционирует ίη νίνο для локализации антигена внутри липидного бислоя, например на поверхности болезнетворного микроорганизма. Изобретение в особенности применимо для использования с поверхностными антигенами вирусов.

Во втором аспекте изобретения антигенный компонент включает поверхностно-активное вещество. Является скорее предпочтительным, чтобы антиген и поверхностно-активное вещество были в форме комплекса, нежели составляли бы простую смесь антигена и поверхностно-активного вещества. Комплексы антиген/поверхностно-активное вещество включают стабилизированные поверхностноактивным веществом липосомы, содержащие антиген, и ниосомы, которые являются носителями, сформированными из синтетических неионных амфифильных соединений. Предпочтительным комплексом антиген/поверхностно-активное вещество является корпускулярный поверхностный антиген гепатита В, очищаемый в присутствии поверхностно-активного вещества. Ссылка 35 описывает, как рекомбинантные частицы НВкАд могут удерживать Твин 20, который был использован во время их очистки (до 25 мкг Твина 20 на 100 мкг НВкЛд).

Таким образом, наиболее предпочтительным антигеном для применения во втором аспекте изобретения является поверхностный антиген вируса гепатита В (НВУ) в форме, по существу, сферических частиц (средний диаметр примерно 20 нм), включающих липидную матрицу, включающую как фосфолипиды, так и неионное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 20. Неионное поверхностно-активное вещество может быть внедрено в частицу в процессе очистки.

Однако для первого аспекта изобретения предпочтительной формой НВкАд является такая, в которой НВкАд очищается без использования неионных поверхностно-активных веществ, так что частицы НВкАд не включают никакого поверхностно-активного вещества, тем самым избегая интерференции с алифатическим адъювантом.

Вирус гепатита В (НВУ) является одним из известных агентов, который вызывает вирусный гепатит. Вирион НВУ состоит из внутреннего кора, окруженного внешней белковой оболочкой, или капсидом, и вирусный кор содержит вирусный ДНК геном. Главный компонент капсида представляет собой белок, известный как НВУ-поверхностный антиген, или, как более принято, НВкАд, который типично представляет собой полипептид из 226 аминокислот, имеющий молекулярную массу примерно 24 килодальтонов (кДа). Все существующие вакцины гепатита В содержат НВкАд, и когда этот антиген вводится при нормальной вакцинации, он стимулирует продуцирование анти-НВкАд антител, которые защищают организм от инфицирования НВУ.

Для производства вакцины НВкАд может быть приготовлен двумя путями. Первый способ включает очистку антигена в корпускулярной форме от плазмы хронических носителей гепатита В, так как большие количества НВкАд синтезируются в печени и выбрасываются в кровоток во время инфицирования НВУ. Второй путь включает экспрессирование белка методом рекомбинантных ДНК. НВкАд для применения в способе согласно изобретению является рекомбинантно экспрессированным в дрожжевых клетках. Пригодные дрожжи включают Зассйагошусек (такие как §.еегеу181ае), ΡίοΗία (такие как Р.ра51ог15) или Напеп8и1а (такие как Н.ро1ушогрйа) в качестве клетки-хозяина. В качестве альтернативы, антиген может быть экспрессирован в клетках рекомбинантного млекопитающего (например, в яичнике китайского хомячка (СНО), СО8-клетках, Ви3-клетках, и т.д.), насекомого (например, с использованием бакуловирусных векторов), или растительных клетках. В общем, однако, используется дрожжевая экспрессия.

Экспрессированный в дрожжах НВкАд предпочтительно является негликозилированным. В отличие от нативного НВкАд (то есть, как в очищенном из плазмы продукте), экспрессированный в дрожжах НВкАд в общем является негликозилированным, и он представляет собой наиболее предпочтительную форму НВкАд для использования согласно изобретению, поскольку он является высокоиммуногенным и может быть приготовлен без риска загрязнения продуктами крови. Частицы экспрессированного в дрожжах НВкАд могут включать фосфатидилинозит, который не находится в натуральных НВУ-вирионах. Частицы могут также включать нетоксичное количество липополисахаридного (ЬР8) эндотоксина, чтобы стимулировать иммунную систему [ссылка 36].

В данной области известны многие способы очистки НВкАд (например, см. ссылки 37-62). Из этих разнообразных способов первый аспект изобретения использует один, в котором не применяется неионное поверхностно-активное вещество. Напротив, второй аспект изобретения использует неионное поверхностно-активное вещество во время очистки, так что поверхностно-активное вещество становится внедренным в конечный корпускулярный НВкАд продукт. Применение полисорбата 20 в способе разрушения рекомбинантных дрожжевых клеток в начале очистки является предпочтительным путем для внедрения поверхностно-активного вещества в частицы НВкАд.

Предпочтительный способ очистки НВкАд включает, после разрушения клеток: ультрафильтрацию; гель-проникающую хроматографию; анионообменную хроматографию; ультрацентрифугирование; обессоливание и стерилизацию фильтрованием. Лизаты могут быть осаждены после разрушения клеток (например, с использованием полиэтиленгликоля), оставляя НВкАд в растворе, готовом для ультрафильтра

- 13 014314 ции. До или после стерилизации фильтрованием возможна стабилизация частиц НВкАд путем обработки формальдегидом. Избыток формальдегида может быть затем удален ультрафильтрацией или с помощью хроматографии. Может быть применена последующая стерилизация фильтрованием.

НВкАд предпочтительно относится к НВУ-субтипу аб\\'2.

В дополнение к ^''-последовательности, поверхностный антиген может включать все или часть пре-8-последовательности, такие как все или часть пре-81- и/или пре-82-последовательности.

Другие вирусные поверхностные антигены, которые могут быть использованы согласно изобретению, в общем представляют собой капсульные гликопротеины из капсульных вирусов. Вирусные поверхностные антигены для применения согласно изобретению могут включать, но не ограничиваться таковыми.

Ретровирусный белок. Семейство Яейоушбае включает лентивирусы и спумавирусы. Представляющие интерес вирусы включают НТЬУ-Ι, НТЬУ-П, вирус кошачьего иммунодефицита (Е1У), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, Н1У, включая Н1У-1 и Н1У-2), вирус иммунодефицита обезьяны (81У), пенистый вирус обезьяны (шимпанзе) и человеческий спумавирус.

Парамиксовирусный белок, такой как Е-белок. Семейство Рататухоушбае включает (а) подсемейство Рататухоушпае, которое включает парамиксовирусы, рубулавирусы и морбилливирусы, и (Ь) подсемейство Рпеитоушпае, которое включает пневмовирусы. Представляющие интерес вирусы включают вирус параинфлюенцы (Р1У), человеческий парамиксовирус, ЯюбегреЧ вирус, РеЧе Эе5 РеШ Яитшап! вирус, Меа§1е8 вирус кори, Митрк вирус, респираторный синцитальный вирус (Я8У), Нипах вирус, вирус Хендра, Едите МотЫШуйик (ЕМУ), лисса-вирус и Мепапд1е вирус.

Филовирусный белок. Семейство Ейоушбае включает вирусы МатЬитд и ЕЬо1а.

Гликопротеины оболочечного шипа коронавирусов. Семейство Сотопаушбае включает коронавирусы и торовирусы. Вирусы, представляющие интерес, включают человеческие коронавирусы (в том числе 8АК8-коронавирусы), Ау1ап вирус инфекционного бронхита, Рейпе вирус инфекционного перитонита, Мштпе вирус гепатита, Рогсте вирус эпидемической диареи, Рогсте вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита, Рогсте вирус трансмиссионного гастроэнтерита и Вете вирус.

Рабдовирусный белок, такой как С-белок. Семейство РйаЬбоушбае включает рабдовирусы, везикуловирусы, лиссавирусы, эфемеровирусы, циторабдовирусы и нуклеорабдовирусы. Представляющие интерес вирусы включают вирус везикулярного стоматита, вирус бешенства, вирус Мокола, коровий рабдовирус (Ьоуте еркетега1 Геуег).

Тогавирусный белок. Семейство Тодаушбае включает альфавирусы и рубивирусы. Представляющие интерес вирусы включают 8тбЬ1§ вирус, вирусы восточного и западного энцефалита, 8етйк1 ЕогеЧ вирус, вирус краснухи, Аига вирус, ВаЬапк1 вирус, Вагтак ЕогеЧ вирус ауй-А. вирус Бебару, Видду Сгеек вирус, вирус тропической лихорадки чикунгунья, Еуегд1абе§ вирус, Рой Могдап вирус, вирус Гета, Н|дк1апб5 I вирус, Куху1адаск вирус, Мауаго вирус, М1ббе1Ьшд вирус, МисатЬо вирус, Шити вирус, Оске1Ьо вирус, вирус лихорадки о'ньонг-ньонг, Р1хипа вирус, Яо55 Ктуег вирус, 8ад1уата вирус, Ипа вирус, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита и \Ука1агоа вирус.

Капсульный (Е) гликопротеин флавивируса. Семейство Е1ау1ушбае включает флавивирусы, пестивирусы и гепацивирусы. Представляющие интерес вирусы включают вирус лихорадки денге, вирус гепатита С, вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, вирус энцефалита Сент-Луис, вирус бычьей диареи и вирус клещевого энцефалита (ТВЕ).

Буньявирусный белок. Семейство Випуаушбае включает буньявирусы, наировирусы, флебовирусы, хантавирусы и тосповирусы. Представляющие интерес вирусы включают буньявирус, вирус Випуатетета, вирус калифорнийского энцефалита, Ьа Сгокк вирус, НаПаап вирус, δίπ №тЬге вирус, вирус Крым-Конго геморрагической лихорадки, вирус лихорадки 8апбГ1у Геуег 8юШап и вирус лихорадки долины Рифт.

Аренавирусный белок. Семейство Агепаушбае включает вирус лимфоцитарного хориоменингита, вирус Иппи и вирус Ласса.

Гепаднавирусный белок (в том числе НВкАд). Семейство Нерабпаушбае включает ортогепаднавирусы и авигепаднавирусы. Наряду с вирусом человеческого гепатита В, это семейство вирусов включает вирус гепатита В сусликов, вирус гепатита В лесного сурка, вирус гепатита В шерстистой обезьяны, вирус гепатита арктической белки, вирус гепатита В уток, вирус гепатита В цапли и вирус гепатита В гусей Росс.

Белок вируса герпеса. Семейство Нетрекушбае включает симплексвирусы, варицелловирусы, розеоловирусы, цитомегаловирусы, муромегаловирусы, лимфокриптовирусы и радиновирусы. Представляющие интерес вирусы включают вирусы человеческого герпеса, в том числе вирусы простого герпеса (Н8У), Уапсе11а-/оЧег вирус (У2У), вирус Эпштейна-Барра (ЕВУ), цитомегаловирус (СМУ), вирус герпеса 6 человека (ННУ6), вирус герпеса 7 человека (ННУ7) и вирус герпеса 8 человека (ННУ8) и т.д. Пригодные антигены могут быть избраны из гликопротеинов дВ, дС, дО и дН (например, в Н8У). В особенности предпочтителен Н8У дЭ2.

Ортомиксовирусный белок. Семейство Оййотухоушбае включает вирус гриппа и вирусы 1кодоЮ. Антигены из вирусов гриппа являются предпочтительными (вирус гриппа А, В или С), включая поверх

- 14 014314 ностные антигены гемагглютинин (НА) и/или нейраминидазу (ΝΑ).

Эти вирусные поверхностные антигены обычно очищают с использованием поверхностноактивных веществ, и тем самым антигенный компонент может включать поверхностно-активное вещество, в особенности если он находится в корпускулярной форме, включая липиды.

Изобретение также применимо с корпускулярными антигенами, основанными на гибридных или составных белках, которые включают вирусный поверхностный антиген и гетерологичный антиген. Например, известно присоединение НВ 5Ад последовательности к гетерологичным антигенам, чтобы использовать способность НВкАд собираться в частицы.

Например, работа в ссылке 63 сообщает об интеграции Ηΐν-1 др120 с НВкАд с образованием белка, который самопроизвольно собирается в частицы, которые похожи на частицы нативного НВкАд по размеру и плотности, совпадающие по липидному составу примерно на 25% и с содержанием др 120 примерно 100 на частицу. Белок др120 был способен сворачиваться в свою нативную конформацию при сшивании и сохранял свою биологическую активность. Подобным образом, НА др41 эпитопы были улучшены выполнением внутренних сшивок с НВ 5Ад, и составной белок включался в самосборку в дрожжах с образованием липопротеиновых частиц размером 22 нм [ссылка 64].

Этот подход был также использован для малярийных вакцин. Работа в ссылке 65 сообщает, что эпитопы до 61 аминокилоты (аа) из малярийного др190 антигена были введены в последовательность НВкАд и что экспрессированные гибридные частицы могли вызывать анти-др190 иммунный ответ у животных. Работа в ссылке 66 сообщает о белке, имеющем 16 повторений 4-мерной последовательности циркумспорозоитного (С1гсит5рогохо11с) белка, экспрессированного как составной белок с НВкАд. Работа в ссылке 67 сообщает о продуцировании в дрожжах вирусоподобных частиц, состоящих из РГ516, конъюгированного с НВкАд. Работа в ссылке 68 представляет гибридный антиген, в котором циркумспорозоитный (С1гсит5рогохо11с) белок конъюгирован с НВкАд. Работа в ссылке 69 представляет конъюгацию С-концевой области мерозоитного (шегохойе) поверхностного белка 1 из Ρ.νίναχ, который образует иммуногенные частицы размером 20-45 нм. Применение НВкАд для представленных малярийных антигенов в самособираемой корпускулярной форме поэтому хорошо известно в данной области.

Таким образом, изобретение может быть использовано с гибридными антигенами, которые включают вирусный поверхностный антиген и гетерологичный антиген. Гетерологичный антиген может быть внедрен в последовательность вирусного поверхностного антигена, или может быть конъюгирован с Νконцевым или С-концевым фрагментом последовательности вирусного поверхностного антигена. Если нативный вирусный поверхностный антиген может собираться в частицы (например, НВкАд), то внедрение или конъюгирование не будет препятствовать этой сборке.

В этих гибридных белках гетерологичный антиген может быть из бактерии, из грибка, из паразита, из вируса (но, по определению, гетерологичный антиген не является НВкАд) и т.д. Возможно включение полного гетерологичного антигена в гибридный белок, но более обычным является включение антигенного фрагмента из антигена.

В особенности там, где вирусный поверхностный антиген представляет собой НВкАд, гетерологичный антиген может быть из НА, Р1а§тобшт Га1с1рагит, Р1а§тобшт νίνηχ, Р1а§тобшт та1апае или Р1а§тобшт оνа1е. Подходящие НА антигены для приготовления НВкАд-гибридов включают капсульный гликопротеин др120 или его антигенные фрагменты [ссылка 63]. Пригодные Р.ГаШрагиш антигены для приготовления НВ 5 Ад-гибридов могут быть основаны на субъединице циркумспорозоитного (с1гсипърогохойе) поверхностного антигена (С8Р), например они могут включать от 3 до 20 повторов их NΑNΡ-фрагмента (идентификатор последовательности 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 2), и/или они могут включать Сконцевую область С8Р (но типично не включая концевые 12 аминокислот из С-конца). Например, изобретение может использовать антиген, известный как ЯТ8, который содержит большую часть С-конца С8Р из ΝΕ54 или 768, выделенных из Р.ГаЮрагит (аминокислоты от 210 до 398, которые включают 19 NΑNΡ-повторов, и область эпитопа Т-клетки с аминокислотами от 367 до 390), сшитый с Ν-концом НВ5Ад четырьмя аминокислотами из рге32 части НВ5Ад. Будучи экспрессированным в дрожжах, ЯТ8 формирует частицы, которые включают липиды (первоначально фосфолипид) в дополнение к белку. Последовательность ЯТ8 тем самым может содержать: (ί) Ν-концевой метиониновый остаток; (ίί) Ме1-А1аРго; (ш) 189 аминокислот, соответствующих либо аминокислотам 210-398 С8-белка из Р.ГаЮрагит 768, либо аминокислотам 207-395 С8-белка из Р.Га1арагит ΝΕ54; (ίν) Агд или 61у; (ν) Рго^а1-ТБг-А5п из рге82 белка гепатита В и (νί) НВ5Ад. Выделенный из 768 полный ЯТ8 имеет последовательность, приведенную как 8Е6 ΙΌ ΝΟ:1 в ссылке 70 (см. также фиг. 5 в ссылке 71):

ΜΜΑΡΟΡΗΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΗΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΜΑΜΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑ ΝΡΝΑΝΡΝΚΝΝΟΟΝΟΟΟΗΝΜΡΝΟΡΝΚΜνΟΕΝΝΑΝΜΑνΚΝΝΝΝΕΕΡεοΚΗΙΕΟΥΕΚΚΙΚΝΒΙδΤΕΜδΡΟδνΤΟΟΝαίΟ νΚΙΚΡ65ΑΝΚΡΚϋΕΕ0ΥΕΝ0ΙΕΚΚΙΕΚΜΕΚ055νΕΝνν№ΚΡνΤΝΜΕΝΓΓ$0ΓΓ6ΡΙ [АД-ОАСРРШТЯГ 1_Т1 Р05 ΕΟ5νηιΠ·5ΕΝΡΕΟ05ΡνθΕ00Η5(15ΡΤ5ΝΗ5ΡΤ5ΟΡΡΐερθΥΚ«ΜΟΕΚΚΡΙΙΡΕΓΙΓΕΕΟΕΙΡΓίνΕΕΟΥ00ΜΕΡν€ РЬ1РС5ТТТМТСРСКТСТТРА0СМ5МРР5СССТКРТ0СМСТС1ΡΙ РЗЗИАРАКУШЕМАЗУкРЗИиЗГЬУР ΡΥΟΜΡ УСБ5РТ\М1_5А1№4М1лМл/<ЗР51-У51\/5РР1Р1.1_Р1РРС1-1лЛ/У1 (5Е(] Ю N0:1)

Гибридный белок может быть экспрессирован в дрожжах, с использованием последовательности,

- 15 014314 кодирующей 8ЕО ΙΌ NΟ:1. Предпочтительно соэкспрессировать гибридный белок в дрожжах с нормальным НВ 8Ад. Этот подход был ранее использован с ВТ8, и продукт соэкспрессии обозначается как ВТ8,8. Применимо соотношение ВТ8:8 примерно 1:4. Предпочтительна экспрессия в дрожжах 8. сегеУ181ае с использованием плазмиды, имеющей последовательность, кодирующую гибридный белок, и включающей: (1) вышерасположенный промотор из гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, для контролируемой экспрессии кодирующей последовательности; и (2) АВС3 транскрипционный терминатор, расположенный ниже кодирующей последовательности. Эти плазмиды обычно также включают: (3) ЬЕи2 маркер селекции; (4) 2μ плазмидную последовательность и (5) точку инициации репликации, действующей в Е8с11епс1иа со11.

ВТ8,8 может быть комбинирован с другими малярийными антигенами, такими как родственный тромбоспондину анонимный белок (ΤΒΑΡ). Предпочтительный алифатический адъювант для использования с ВТ8,8 включает эмульсию типа масло в воде, 3Ό-ΜΡΕ и 08-21 сапонин.

Соотношение алифатического адъюванта и поверхностно-активного вещества

Во втором аспекте изобретения весовое отношение в композиции алифатического адъюванта к поверхностно-активному веществу антигена составляет менее чем 1000:1.

Для адъюванта ΜΡ59 весовое соотношение основывается на количестве сквалена. Для композиции, содержащей 0,1 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, концентрация сквалена составляет менее чем 100 мкг/мл. Для композиции, содержащей 1 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, концентрация сквалена составляет менее чем 1 мг/мл. Для композиции, содержащей 10 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, концентрация сквалена составляет менее чем 10 мг/мл, тогда как концентрация сквалена в типичной композиции с ΜΡ59 как адъювантом должна быть 43 мг/мл (то есть 4300:1).

Для адъюванта 3Ό-ΜΡΕ весовое соотношение основывается на общем количествое 3Ό-ΜΡΕ, то есть включая все из различных ацильных форм, которые могут присутствовать. Для композиции, содержащей 0,1 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, общая концентрация 3Ό-ΜΡΕ составляет менее чем 100 мкг/мл. Для композиции, содержащей 1 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, общая концентрация 3Ό-ΜΡΕ составляет менее чем 1 мг/мл.

Соотношение 1000:1 является максимальным. Для дальнейшего сокращения возможностей интерференции между маслом в адъюванте и поверхностно-активным веществом в антигене соотношение может быть уменьшено. Так, соотношение может быть 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1 или даже 25:1. При соотношении 100:1 композиция, содержащая 10 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, должна иметь содержание масла (например, содержание сквалена или 3Ό-ΜΡΕ) 1 мг/мл. При соотношении 25:1 композиция, содержащая 10 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, должна иметь содержание масла (например, содержание сквалена или 3Ό-ΜΡΕ) 250 мкг/мл; и наоборот, композиция, включающая 100 мкг/мл 3Ό-ΜΡΕ, должна иметь не менее чем 4 мкг/мл поверхностно-активного вещества как части антигена.

Предпочтительно соотношение выше чем 1,5:1, например >2:1, >2,5:1, >3:1, >4:1, >5:1 или более.

Для 3Ό-ΜΡΕ соотношение 2,5:1-25:1 является предпочтительным, более предпочтительно 2,5:1 10:1, и еще более предпочтительно между 2,5:1-5:1. Так, композиция, содержащая 10 мкг/мл поверхностно-активного вещества в антигенном компоненте, должна иметь содержание 3Ό-ΜΡΕ 25-250 мкг/мл, предпочтительно 25-100 мкг/мл и еще более предпочтительно 25-50 мкг/мл; и наоборот, композиция, включающая 100 мкг/мл 3Ό-ΜΡΕ, должна включать антиген, имеющий содержание поверхностноактивного вещества 4 мкг/мл - 40 мкг/мл, предпочтительно 10-40 мкг/мл и еще более предпочтительно 20 - 40 мкг/мл.

Иммуногенная композиция

Наряду с содержанием антигена и алифатического адъюванта (и, во втором аспекте, низкого уровня поверхностно-активного вещества), композиции согласно изобретению могут включать носители, адъюванты, наполнители, буферы и т.д., как более подробно описано ниже. Эти неантигенные компоненты могут иметь различные источники. Например, они могут присутствовать в одном из материалов антигенов или адъювантов, которые используются во время получения, или могут быть добавлены отдельно от этих компонентов.

Предпочтительные композиции согласно изобретению включают один или несколько фармацевтических носителя(-ей) и/или наполнителя(-ей).

Для регулирования тоничности предпочтительно включение физиологической соли, такой как натриевая соль. Предпочтителен хлорид натрия ЩаС1), который может присутствовать в количестве 1-20 мг/мл.

Композиции в общем имеют осмотическую концентрацию между 200 и 400 мОсм/кг, предпочтительно между 240 и 360 мОсм/кг, более предпочтительно в пределах интервала 280-320 мОсм/кг. Осмоляльность была ранее описана как не оказывающая влияния на боль, вызываемую вакцинацией [ссылка 72], но тем не менее предпочтительно удерживать осмоляльность в этом интервале.

Композиции согласно изобретению могут включать один или несколько буферов. Типичные буфе

- 16 014314 ры включают: фосфатный буфер; Трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер или цитратный буфер. Буферы типично включаются в диапазоне концентраций 5-50 мМ и предпочтительно в диапазоне 5-20 мМ.

Величина рН композиции согласно изобретению в общем составляет 5,0-7,5, и более типично 5,06,0 для оптимальной стабильности, или 6,0-7,0. Способ согласно изобретению поэтому может включать стадию регулирования величины рН в полном объеме вакцины перед ее упаковкой в контейнерыдозаторы. Вакцина, содержащая дифтерийный и столбнячный анатоксины, предпочтительно имеет величину рН >6, во избежание риска возврата токсичности анатоксинов (в особенности в дифтерийном анатоксине), и тем самым вакцина, содержащая анатоксины и НВзАд антигены, предпочтительно имеет величину рН 6,0-7,0. Для других вакцин, включая моновалентные НВзАд вакцины, величина рН <6 может быть приемлемой.

Композиции согласно изобретению предпочтительно являются стерильными.

Композиции согласно изобретению предпочтительно являются апирогенными, например, содержащими <1 ЕЙ (единиц эндотоксина, стандартная мера) на дозу, и предпочтительно <0,1 ЕЙ на дозу.

Композиции согласно изобретению предпочтительно не содержат глютена.

Если НВзАд применяется адсорбированным, конечный вакцинный продукт может быть суспензией с мутным внешним видом. Этот внешний вид означает, что микробиальное загрязнение не является легкоразличимым визуально и что вакцина преимущественно содержит антимикробное средство. Это в особенности важно, когда вакцина упаковывается в контейнеры для многократного приема. Предпочтительные консерванты для включения представляют собой 2-феноксиэтанол и/или тимеросал (ТЫтегоза1). Однако рекомендуется не применять ртутные консерванты в способе согласно изобретению, даже если тимеросал находится во многих существующих вакцинах. Однако для надежности предпочтительно, что конечная композиция содержит менее чем примерно 25 нг/мл ртути. Более предпочтительно, что конечный вакцинный продукт не содержит определяемого количества тимеросала. В общем это достигается удалением ртутного консерванта при приготовлении антигена до его добавления в способе согласно изобретению, или без применения тимеросала во время получения компонентов, используемых для составления композиции. НВзАд может быть подвергнут диализу (например, с цистеином) для удаления любых ртутных консервантов, таких как тимеросал, который мог быть использован в ходе получения НВзАд [ссылки 7З, 74].

В ходе получения разбавление компонентов с образованием желаемых конечных концентраций обычно выполняется с использованием воды для инъекций (АП).

Концентрация любого фосфата алюминия в композиции согласно изобретению, выраженная в расчете на А1^З+, составляет предпочтительно менее чем 5 мг/мл, например 4, З, 2, 1 мг/мл и т.д.

Концентрация НВзАд в композиции согласно изобретению предпочтительно составляет менее чем 100 мкг/мл, например 90, 80, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 мкг/мл и т.д. Типична концентрация примерно 40 мкг/мл или примерно 20 мкг/мл.

Композиции согласно изобретению предпочтительно вводятся пациентам в дозах по 0,5 мл. Обозначение доз как 0,5 мл понимается как включающее нормальное отклонение, например 0,5 мл ± 0,05 мл.

Изобретение может представлять нефасованный материал, который пригоден для упаковывания на индивидуальные дозы, которые могут быть затем распределены для введения пациентам. Концентрации, упомянутые выше, типично являются концентрациями в конечной упакованной дозе, и тем самым концентрации в полной вакцине могут быть выше (например, могут быть понижены до конечной концентрации путем разбавления).

Композиции согласно изобретению в общем представлены в водной форме.

Упаковывание композиций согласно изобретению

После комбинирования антигена и адъюванта, способы согласно изобретению могут включать стадию выборки и упаковывания 0,5-миллилитрового образца смеси в контейнер. Для случаев многоразового употребления количества многоразовых доз выбираются и упаковываются вместе в один контейнер. Как упомянуто выше, в альтернативной компоновке антиген и адъювант упаковываются по отдельности, для смешивания непосредственно перед моментом использования.

Способы согласно изобретению могут включать дополнительную стадию упаковки вакцины в контейнеры для использования. Пригодные контейнеры включают микропробирки (виалки) и одноразовые шприцы (предпочтительно стерильные шприцы).

Когда композиция согласно изобретению упаковывается в микропробирки, они предпочтительно изготавливаются из стекла или пластического материала. Микропробирка предпочтительно стерилизуется перед внесением в нее композиции. Во избежание проблем с пациентами, чувствительными к латексу, микропробирки предпочтительно закупориваются пробкой, не содержащей латекса. Микропробирка может включать однократную дозу вакцины, или она может включать более чем одну дозу (мультидозовая микропробирка), например 10 доз. Когда используется мультидозовая микропробирка, каждая доза должна извлекаться стерильными иглой и шприцем при строго асептических условиях, соблюдая предосторожности во избежание загрязнения содержимого микропробирки. Предпочтительные микропро

- 17 014314 бирки изготавливаются из бесцветного стекла.

Микропробирка может иметь крышку (например, наконечник Люэра), приспособленную так, что предварительно наполненный шприц может быть введен в крышку, содержимое шприца может быть вытеснено в микропробирку, и содержимое микропробирки может быть удалено обратно в шприц. После удаления шприца из микропробирки затем может быть присоединена игла, и композиция может быть введена пациенту. Крышка предпочтительно располагается внутри уплотнения или колпачка так, что уплотнение или колпачок должны быть удалены, прежде чем может быть открыт доступ к крышке.

Там, где композиция упаковывается в шприц, который предпочтителен, шприц, как правило, не имеет присоединенной к нему иглы, хотя игла отдельно может быть поставлена со шприцем для сборки и употребления. Предпочтительны безопасные иглы. Типичны 1-дюймовые иглы 23-его размера, 1дюймовые иглы 25-ого размера и 5/8-дюймовые иглы 25 размера. Шприцы могут быть поставлены с отрывными этикетками, на которых могут быть напечатаны номер партии и дата истечения срока годности содержимого, для облегчения ведения учета. Поршень в шприце предпочтительно имеет ограничитель для предотвращения случайного извлечения во время отсасывания. Предпочтителен ограничитель поршня из бутилкаучука. Шприцы могут иметь крышку и/или поршень из латексного каучука. Одноразовые шприцы содержат однократную дозу вакцины. Шприц в общем имеет крышку на наконечнике, чтобы закрывать наконечник до подсоединения иглы, и крышка на наконечнике предпочтительно сделана из бутилкаучука. Если шприц и игла упаковываются отдельно, то игла предпочтительно снабжается защитным щитком из бутилкаучука. Предпочтителен серый бутилкаучук. Предпочтительны такие шприцы, которые продаются под торговым наименованием Τίρ-Ьок.

Если используется стеклянный контейнер (например, шприц или микропробирка), то является предпочтительным применение контейнера, изготовленного из боросиликатного стекла, нежели из натриево-кальциевого стекла.

После того как композиция упаковывается в контейнер, контейнер может быть затем помещен в коробку для распределения, например внутрь картонной коробки, и коробка маркируется с подробностями о вакцине, например ее торговое наименование, список антигенов в вакцине (например, гепатит В рекомбинант, и т.д.), информация о контейнере (например, Одноразовые предварительно заполненные шприцы Τίρ-Ьок или Микропробирки с однократными дозами 10x0,5 мл), его доза (например, каждая содержит одну дозу 0,5 мл), предостережения (например, Только для применения взрослыми или Только для педиатрического употребления), дата истечения срока годности, показания (например, активная иммунизация против инфицирования вирусом гепатита В (НВУ), вызываемого всеми известными субтипами для пациентов с почечной недостаточностью (включая пре-гемодиализ и гемодиализ), для пациентов старше 15 лет, и т.д.), номер патента, и т.д. Каждая коробка может содержать более чем одну упакованную вакцину, например пять или десять упакованных вакцин (в особенности для микропробирок). Если вакцина содержится в шприце, то на коробке может быть картинка с изображением шприца.

Вакцина может быть распределена совместно (например, в одной и той же коробке) с брошюрой, включающей подробности о вакцине, например инструкции по употреблению, подробности об антигенах в вакцине и т. д. Инструкции могут также содержать предостережения, например, о том, чтобы держать раствор адреналина в легкодоступном месте в случае анафилактической реакции после вакцинации, и т.д.

Упакованная вакцина предпочтительно хранится при температуре 2°С - 8°С. Ее не следует замораживать.

Способы лечения и введения вакцины

Композиции согласно изобретению пригодны для введения пациентам, и изобретение представляет способ повышения иммунного ответа у пациента, включающий стадию введения композиции согласно изобретению пациенту.

Изобретение также представляет композицию согласно изобретению для применения в медицине.

Изобретение также представляет применение (ί) антигена, очищенного по существу в отсутствие поверхностно-активного вещества, и (ίί) алифатического адъюванта в производстве лекарственного средства для введения пациенту.

Изобретение также представляет применение (ί) антигенного компонента, который включает поверхностно-активное вещество, и (ίί) алифатического адъюванта в производстве лекарственного средства для введения пациенту, в котором весовое отношение алифатического адъюванта в (ίί) к поверхностноактивному веществу в (ί) составляет менее чем 1000:1.

Иммуногенные композиции согласно изобретению предпочтительно представляют собой вакцины, например, для использования в профилактике и/или лечении вирусной инфекции гепатита В. Пациенты, которые получили композиции согласно изобретению, предпочтительно имеют геометрическое значение (ΟΜ) титра анти-НВкАд сыворотки >500 мМЕ/мл (т1Е/т1, милли-международных единиц на мл), измеренное через 6 недель после первой иммунизации. Более предпочтительно титр составляет >500 мМЕ/мл, когда измерение проводится через 12 месяцев.

Композиции в особенности применимы для защиты против и/или лечения вирусных инфекций ге

- 18 014314 патита В у пациентов, для которых существующие адъювантные вакцины (такие как продукт ЕЫСЕЯ1Х В™) неэффективны. Субгруппы пациентов, для которых композиции в особенности пригодны, включают: пациенты с иммунной недостаточностью; пациенты, находящиеся на гемодиализе; пациенты перед гемодиализом; пациенты с почечной недостаточностью; пациенты с отказом почек; пациенты с отказом почек на ранней стадии перед тем, как им потребуется гемодиализ; пациенты в ожидании трансплантации печени, например, находящиеся в листе ожидания; пациенты на конечной стадии почечной недостаточности; пациенты, которые получили орган-трансплантат (в особенности трансплантат печени), например, в шестимесячный период, предшествующий первой дозе вакцины согласно изобретению; пациенты, которые получают (или получали, например, в шестимесячный период, предшествующий первой дозе вакцины согласно изобретению) лечение иммуноглобулином (НВ1д) гепатита В; пациенты с гаплотипом НЬА Ό03 [ссылка 75]; пациенты с гаплотипом НЬА ΌΒ3 [ссылка 75]; пациенты с гаплотипом НЬА ΌΒ7 [ссылка 75]; пациенты с НЬА-аллелем ЭОВ1*0202 [ссылка 76]; пациенты, инфицированные ВИЧ; хронические носители вируса гепатита В (НВУ); пациенты, которые недавно перенесли переливание крови; пациенты, получающие иммунодепрессивные препараты; пациенты, страдающие СПИДом; пациенты с асцитом; пациенты с циррозом печени; пациенты с энцефалопатией; пациенты, получающие лечение интерфероном, и в особенности ίπί-α; пациенты, которые курят сигареты; пациенты, которые курят сигары; пациенты с индексом массы тела >30 кг/м²; и пациенты, которые получали НВкАдвакцину, но не достигшие сероконверсии (например, они имеют титр анти-НВкАд сыворотки <10 мМЕ/мл после стандартного курса первичной дозировки, такого как 3 дозы ЕИСЕЯ1Х В™).

Эти пациенты могут иметь скорость клиренса креатинина менее чем 30 мл/мин (нормальный здоровый диапазон составляет ~100-140 мл/мин для мужчин и 90-130 мл/мин для женщин). Пациенты предпочтительно имеют возраст по меньшей мере 15 лет, например, между 15-40 годами, между 15-60 годами, между 40-60 годами, или даже свыше 60 лет. Пациенты старше 55 лет могут получать эффективное лечение независимо от любых испытываемых болезней.

Композиции согласно изобретению могут быть введены внутримышечно, например в дельтовидную мышцу.

Если композиции согласно изобретению включают адъювант на основе алюминия, во время хранения может происходить расслоение компонентов. Поэтому композицию следует встряхивать перед введением пациенту. Взболтанная композиция имеет вид мутной белой суспензии.

Предпочтительные способы и вакцины согласно изобретению

Предпочтительный способ получения иммуногенной композиции включает стадии комбинирования (ί) НВкАд-компонента, который включает полисорбат 20, и (ίί) адъювантного компонента, включающего 3Ό-ΜΡΕ, адсорбированный на фосфате алюминия, с образованием композиции, в которой весовое отношение 3Ό-ΜΡΕ к полисорбату 20 составляет менее чем 1000:1.

Предпочтительная иммуногенная композиция представляет собой таковую, в которой: (а) композиция включает НВкАд, полисорбат 20, 3Ό-ΜΡΕ и алюминийфосфатный адъювант; и (Ь) весовое отношение 3Ό-ΜΡΕ к полисорбату 20 составляет менее чем 1000:1. 3Ό-ΜΡΕ и НВкАд предпочтительно адсорбированы на фосфате алюминия. Концентрация НВкАд составляет примерно 40 мкг/мл. Концентрация 3Ό-ΜΡΕ составляет примерно 100 мкг/мл. Концентрация ионов А1³⁺ составляет примерно 1 мг/мл.

Еще одна предпочтительная композиция согласно изобретению включает (ί) НВкАд, очищенный из 8.сетеу1ыае, и (ίί) адъювант, включающий смесь фосфата алюминия и 3Ό-ΜΡΕ. Концентраци НВкАд составляет примерно 40 мкг/мл. Концентрация 3Ό-ΜΡΕ составляет примерно 100 мкг/мл. Концентрация ионов А1³⁺ составляет примерно 1 мг/мл. НВкАд включает полисорбат 20, и весовое соотношение масло:поверхностно-активное вещество (то есть весовое соотношение 3^-ΜΡ^:полисорбат 20) составляет 2,5:1-100:1, то есть, полисорбат 20 присутствует на уровне 1-40 мкг/мл (то есть, 2,5-100 мкг полисорбата 20 на 100 мкг НВкАд). Соотношение предпочтительно составляет 2,5:1-25:1, то есть, полисорбат 20 присутствует на уровне 4-40 мкг/мл. Оба компонента 3Ό-ΜΡΕ и НВкАд адсорбированы на фосфате алюминия.

Обобщение

Термин включающий охватывает понятие заключающий в себе, а также состоящий, например, композиция, включающая X, может состоять исключительно из X, или может включать что-нибудь дополнительное, например, X + Υ.

Слова главным образом не исключают понятия полностью, например, композиция, которая главным образом не содержит Υ, может вообще не содержать Υ. Если необходимо, слова главным образом могут быть изъяты из определения изобретения.

Термин примерно в отношении цифрового значения х означает, например, х ± 10%.

Если иное не оговорено конкретно, способ, включающий стадию смешивания двух или более компонентов, не требует какого-либо определенного порядка смешивания. Таким образом, компоненты могут быть смешаны в любом порядке. Там, где наличествуют три компонента, два компонента могут быть смешаны друг с другом, и затем комбинация может быть соединена с третьим компонентом и т. д. Как описано выше, компоненты могут быть смешаны в ходе производства, или же непосредственно перед

- 19 014314 моментом употребления.

Если антиген описывается как адсорбированный на адъюванте, то предпочтительно, что по меньшей мере 50% (по весу) этого антигена являются адсорбированными, например 50, 60, 70, 80, 90%, 95 98% или более. Предпочтительно, что НВкАд является полностью адсорбированным, то есть никакое его количество не определяется в надосадочной жидкости.

Там, где животные (и, в частности, бычьи) материалы используются в культуре клеток, они должны быть получены из источников, которые свободны от инфекционных губчатых энцефалопатий (Т8Е), и в особенности свободны от бычьей губчатой энцефалопатии (В8Е).

Бутилкаучуки включают хлорбутил- и бромбутилкаучуки.

Будет принято во внимание, что ионизируемые группы могут существовать в нейтральной форме, показанной здесь в формулах, или могут существовать в заряженной форме, например, в зависимости от величины рН. Таким образом, фосфатная группа может быть показана как -Р-О-(ОН)₂, эта формула типична только для нейтральной фосфатной группы, и другие заряженные формы охватываются изобретением. Подобным образом углеводные циклы могут существовать в открытой и замкнутой форме, и, в то время как замкнутые формы показаны здесь в структурных формулах, открытые формы также охватываются изобретением.

Способы осуществления изобретения

Были изучены три различных варианта получения НЬкАд.

НВкАд, экспрессированный в клетках 8.сегеу151ае, очищенный с использованием неионного поверхностно-активного вещества.

НВкАд, экспрессированный в дрожжевых клетках Напеп8и1а, очищенный с использованием неионного поверхностно-активного вещества.

НВкАд, экспрессированный в клетках яичника китайского хомячка (СНО), с рге82 последовательностью, очищенный без использования поверхностно-активных веществ.

Были изучены два различных адъюванта:

гидроксид алюминия (1 мг/мл);

ΜΕ5.9 в цитратном буфере (13 мМ).

Были приготовлены шесть составов, каждый с 20 мкг/мл НВкАд, 0,15 мМ №1С1 и 0,01% мертиолата:

	А	в	С	и	Е	Е
НВзАз	СНО	сно	Напепхи1а	Напеп5и1а	8,сегеушае	З.сегем&ае
Адъювант	Гидроксид алюминия	ΜΓ59	Гидроксид алюминия	ΜΈ59	Гидроксид алюминия	МГ59
Νβ€Ι	0,15М	0,15М	0,15М	0,15М	0,15М	0,15М
Метиолат	0,01%	0,01%	0,01%	0,01%	0,01%	0,01%
Поверхностно- активное вещество	-	-	+	+	+	+

ΜΕ59 был описан как усиливающий гуморальный иммунный ответ у приматов на рекомбинантный НВкАд [ссылка 77]. Составы от А до Ό были использованы для иммунизации африканских зеленых мартышек. Группы из 6 мартышек были иммунизированы внутримышечно на день 0 и день 28. Кровоизвлечения были сделаны на момент 0 и затем каждые 2 недели до недели 8, и титры анти-НВкАд (геометрические значения титров, ΟΜΤ) были измерены с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ЕБ18А). Титры были нормализованы к 1,0, данное значение было на 14 день в каждой группе, и нормализованные результаты были следующими:

	А	В	С	ϋ
Хозяин	СНО	СНО	Дрожжи	Дрожжи
Адъювант	Гидроксид алюминия	МР59	Гидроксид алюминия	МР59
Поверхностноактивное вещество	-	-	+	4-
День 14	1,0	1,0	1,0	1,0
День 28	0,9	0,8	1,3	0,4
День 42	19,2	159,8	108,8	85,2
День 56	10,8	32,6	61,3	24,5

При рассмотрении титров дня 42 и дня 56, эти данные показывают, что адъювант ΜΕ59 повышал

- 20 014314 титры гораздо более заметно, чем алюминиевый адъювант для СНО-экспрессированного антигена (160кратное повышение против 20-кратного повышения на 42 день), но ситуация была обратной для Напеп8и1а-экспрессированного антигена (85-кратное повышение против 110-кратного на 42 день).

Подобные эксперименты были выполнены на бабуинах с использованием составов В, Е и Р. Значения СМТ были измерены через 14 дней после первой инъекции и относительно значения группы Р были следующими:

	А	в	Е	Е
Поверхностноактивное вещество	-	-	4-	+
Адъювант	Гидроксид алюминия	МР59	Гидроксид алюминия	МР59
День 14	-	13,5	4,5	1,0

Здесь использование МР59 вместо алюминиевого адъюванта ведет к более низкому СМТ ответу (сравнивая группы Е и Р) , тогда как следовало ожидать повышения (группа В и ссылка 77).

Анти-НВкАд ответы на 28 день после первой инъекции с использованием составов Е и Р были также сравнены на макаках-резус, африканских зеленых мартышках и мышах линии С3Н (примечание: мыши получали 60% дозы НВкАд). Как и измеренные значения СМТ, было также измерено число респондеров, то есть животных, показавших титр >10 мМЕ/мл. Результаты, нормализованные по группе Р, были следующими:

	СМТ	Респондеры
	Е	Е	Е	Г
Адъювант	Гидроксид алюминия	МР59	Гидроксид алюминия	МГ39
Макак-резус	4,2	1.0	60%	20%
Африканские зеленые мартышки (АСМ)	110.0	1.0	100%	50%
Мыши	0.1	1.0	94%	100%

В отличие от мышей, поэтому, применение МР59 в качестве адъюванта для приматов проявилось в существенном снижении как значений СМТ, так и числа респондеров для §.сегеу181аеэкспрессированного НВкАд.

Наконец, повышение СМТ, происходящее от бустерной вакцинации составами Е и Р, было измерено на серопозитивных африканских зеленых мартышках. Титры были измерены перед бустерной дозой и затем вновь через 28 дней, и повышение титров было следующим:

Группа	Адъювант	Повышение (х)
Е	Гидроксид алюминия	91,5 х
Г	МР59	19,1 х

Так же, как давая более низкий показатель повышения, чем для алюминийгидроксидного адъюванта, МР59 дал более низкое значение СМТ на 28 день после бустерной дозы.

Поэтому в целом МР59 представляется более худшим адъювантом, чем гидроксид алюминия, для экспрессированного в дрожжах НВкАд приматов, но лучшим адъювантом для СНО-экспрессированного НВкАд. Эти результаты могут быть объяснены взаимодействием между (а) остаточным поверхностноактивным веществом в НВкАд, очищенном из дрожжей, и (Ь) избытком скваленового масла в адъюванте МР59. В качестве масла сквален подвергается воздействию поверхностно-активных веществ в водных условиях, и наоборот, предполагается, что поверхностно-активное вещество в антигене является несовместимым с маслом в адъюванте. С этой несовместимостью можно справиться либо очисткой НВкАд без использования детергентов (например, как в СНО-экспрессированном материале), либо обеспечением того, чтобы масло не присутствовало как таковое в избытке, который взаимодействует с поверхност но-активным веществом в антигене.

В НВкАд-композициях с МР59 в качестве адъюванта один объем МР59 смешивается с одним объемом раствора антигена. В 100-миллилитровом объеме тем самым будут 50 мл МР59 и 50 мл раствора НВкАд. Эти 100 мл содержат 2,15 г сквалена из МР59 и, при концентрации НВкАд в 40 мкг/мл, они содержат 2 мг НВкАд. При концентрации полисорбата 20 в 25 мкг на 100 мкг НВкАд [ссылка 35], 100 мл содержат 0,5 мг полисорбата 20. Соотношение масло :поверхностно-активное вещество в типичной вакцине с МР59-адъювантом тем самым составляет 4300:1. Путем снижения избытка масла до менее чем 1000:1 взаимодействие между маслом в адъюванте и поверхностно-активным веществом в антигене мо

- 21 014314 жет быть существенно уменьшено, тем самым снижая интерференцию.

Понятно, что изобретение было описано только с помощью примеров, и модификации могут быть сделаны в такой степени, пока будут оставаться в рамках и в смысле изобретения.

Список цитированной литературы (содержание которой включается ссылками) [1] Рассте А<Ет>апВ: РгерагаИоп Ме1коАч αηά Кеяеагск Ρι-οΐοηοΙχ (Уо1итс 42 οί МеНюек ίη Мо1еси1аг Ме&сте зепез). Ι8ΒΝ: 1-59259-083-7. Еб. О’Надап.

[2] \'ассте Оез1$п: Тке ЗидипИ αηά ΑΑ}ΐιναηί Αρρι-οαοΐι (ебз. Ροτνβΐΐ & Пеуитап) Р1епит Ргезз 1995 (Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х).

[3] №090/14837.

[4] Робба & ϋβΐ Сйибгсе (2003) Ехрег1Ксу Расстез 2:197-203.

[5] ϋδ ра1еп1 б Д99,884.

[6] ϋδ ра1еп16,451,325.

[7] Α11Ϊ3ΟΠ & Вуагз (1992) Кез 1ттто1143:519-25.

[8] НапЬагап е1а!. (1995) СапсегКез 55:3486-9.

[9] №095/11700.

[10] ϋδ ра!еп1 6,080,725.

[11] №02005/097181.

[12] ЦК ра1сп1 аррНсабоп ОВ-А-2220211.

[13] Муегз еТ. а1 (1990) радея 145-156 о£ СеИгйаг αηά то1еси1аг азрес1з о/ епскйохт геаспопз.

[14] икгсЬ (2000) Сйар1ег 16 (радез 273-282) οί геГегепсе 1.

[15] 1о11пзоп е1 а!. (1999) ЛИй? САгет 42:4640-9.

[16] ВаЮпск е/ «/. (2002) Ке$и!а1огу ΤοχκοΙ Ркагтасо! 35:398-413.

[17] №0 94/21292.

[18] №094/00153.

- 22 014314 [19] \νθ97/0Ι640/ [20] ^096/26741.

[21] 7/093/19780.

[22] из ра!еп16,375,945.

[23] ν/ΟΟΟ/00462.

[24] Мега1с11 ек ак (2003) Уассте 21:2485-2401.

[25] Ра)ак ек ак (2003) Уасскпе 21:836-842.

[26] Вгап(1епЬиг§ ек ак (2000) Енг АВгоскет 267:3370-7.

[27] 1оЬпеоп ек ак (1999) ΒϊοοκβΜεά Скет ЕеИ 9:2273-2278.

[28] Еуапз ек ак (2003) Ехрегк Καν Уасекгех 2:219-229.

[29] иЗ ра!еп16,764,840.

[30] из ρβίβηΐ аррПсабоп 2005/0107600.

[31] Εΐβηβία/. (2001)7.ΒΐοΙ Скет276:1873-80.

[32] Ψ003/011223.

[33] \Уопд ек а1. (2003) 7 С1т Ркагтасо! 43(7):735-42.

[34] 082005/0215517.

[35] Соз1а ек ак (1997) Ββν. ΙιιζΙ. Мей кгор. 8. Раи1о ν.39 п.1 Вао Раи1о Ене.

[36] Уап1ап<]зскоо1 е/а/. (2005) йСеп Ига/86:323-31.

[37] НШетап (1993) радез 17-40 οίΗβραϋΙϊχ В уасстез ίη скпгса!ргасИсе Ι8ΒΝ 0-8247-8780-3.

[38] (Зепп ек ак (1969) 7 Ига/4:763.

[39] Сепп ек а1. (1969) 7 Ига/ 7:569.

[40] 81еЬке ек ак (1972) АскаРаЛо!МюгоЫо!8сап еескВ 80:935.

[41] ΡίΙΙοί βί ак (1976)7СНпМкгоЫо!4:205.

[42] Ώιώηβΐ & Кгупеп (1972) Уох 8αηξ 2В:249.

[43] ИеигаЙ1 екак (1974) ΡΝΑ8 Ц8А 71:2663.

[44] СЬагт & ν/οπβ (1975) Вю1ескпо1 Вюеп§ 16:593.

[45] 178 ра!еп( 4,857,317.

[46] Ш ра1еп14,683,294.

[47] Ηοιπνβη екак (1975) Лттмпо!Мейгойз 8:185.

[48] 8йгт βί ак (1993) радев 83-101 οί НераИИз В уасстез т сВтса!ргасИсе Ι8ΒΝ 0-8247-8780-3 [49] АУатр1ег ак (1985) ΡΝΑ8 Ц8А 82:6830-4.

[50] СЫ екак (1994)^2^7^07.^721:365-73.

[511 Адгах екак (1994) й Скготако^г А 672:25-33.

[52] Мазон ек а1. (1992) ΡΝΑ8 СВАЮ:! 1745-9.

[53] ϋβηιΐ ек ак (1999) 7 Иго/ Меккойи 79:205-17.

[54] 1Ьагга ек ак (1999)7Скготакоду В Вкотей 8с1 Арр1735:271-7.

[55] \У090/Ю058.

[56] /арапезе ра!сп1 аррПсаГюп ΙΡ63239234.

[57] и8 ра1еп( 4,694,074.

[58] ЕР-0341733.

[59] из ра1еп1 5,242,812.

[60] В.изз1ап ра(еа! аррНсабоп 1Ш-2128707.

[61] Нагйу ек ак. (2000) йВюкескпо!77:157-67.

[62] Оодапе^а/. (2000) Вюкескпо!Рго% 16:435-41.

[63] Вегкоугег βί а/. (2004) Иго/оду 321(1):75-86.

[64] ЕскКаПеГ ей. (1996) 7Оеп Р1го177:2001-8.

[65] νοη Впит екак (1991) Уасскге 9(7):477-84.

[66] Угебеп βία/. (1991) Ат й Тгор Мей Ну$ 45(5):533-8.

[67] Моектз ег ак (1995) Μοί Вюскет РагазИо! 72(1-2):179-92.

[68] ЗЮЫееГо/. (1997) N Еп^й Мей 336(2):86-91.

[69] МОтбегПсЬ & бе1 РогйПо (2000) Мок Мей 6(3):238-45.

[70] из ра!еп( 5,928,902 [71] УУО93/Ю152.

[72] Попу ек ак. (2001) Уассте 27:3645-51.

[73] 77002/12287.

[74] У/003/066094.

[75] ПезотЬеге ек ак (1998) Тйзие Апкдемз 51:593-604.

[76] МсДегтой ек ак (1997) Тшие АпИдепх. 50:8-14.

[77] Тгадишае/о/. (1996) Лп/еск Ώά 174:1168-75.

- 23 014314

Claims

ФОРМУЛА изобретения

1. Способ получения иммуногенной композиции, включающий стадии комбинирования (ί) антигенного компонента, который включает поверхностно-активное вещество, и (ίί) алифатического адъювантного компонента, причем весовое отношение алифатического адъюванта к поверхностно-активному веществу в композиции составляет менее чем 1000:1.
2. Иммуногенная композиция, содержащая антигенный компонент, включающий поверхностноактивное вещество и алифатический адъювантный компонент, причем весовое отношение алифатического адъюванта к поверхностно-активному веществу в композиции составляет менее чем 1000:1.
3. Способ или композиция по п.1 или 2, в которых алифатический адъювант включает масло, преобразуемое в ходе обмена веществ.
4. Способ или композиция по п.3, в которых алифатический адъювант включает субмикронную эмульсию типа масло в воде сквалена и полисорбата 80.
5. Способ или композиция по п.1 или 2, в которых алифатический адъювант включает молекулу, включающую фрагмент алифатической кислоты.
6. Способ или композиция по п.5, в которых алифатический адъювант представляет собой 3дезоксиацилированный монофосфориллипид Α (3Ό-ΜΡΕ).
7. Способ или композиция по п.6, в которых 3Ό-ΜΡΕ представляет собой смесь молекул, различающихся по их ацилированию.
8. Способ или композиция по п.6 или 7, в которых алифатический адъювант включает
9. Способ или композиция по любому из пп.6-8, в которых 3Ό-ΜΡΕ находится в форме частиц.
10. Способ или композиция по п.9, в которых частицы могут быть стерилизованы фильтрованием.
11. Способ или композиция по любому из пп.6-10, в которых 3Ό-ΜΡΕ находится в комбинации с солью алюминия.
12. Способ или композиция по п.11, в которых соль алюминия представляет собой фосфат алюминия.
13. Способ или композиция по п.12, в которых 3Ό-ΜΡΕ адсорбирован на соли алюминия.
14. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых поверхностноактивное вещество представляет собой полиоксиэтиленсорбитановый сложный эфир.
15. Способ или композиция по п.14, в которых сложный эфир представляет собой полисорбат 20.
16. Способ или композиция по п.14 или 15, в которых концентрация поверхностно-активного вещества не более чем 50 мкг/мл.
17. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых антиген представляет собой вирусный поверхностный антиген.
18. Способ или композиция по п.17, в которых антиген представляет собой корпускулярный поверхностный антиген гепатита В (НВкАд), очищенный в присутствии поверхностно-активного вещества.
19. Способ или композиция по п.18, в которых НВкАд экспрессирован в дрожжевой клетке.
20. Способ или композиция по п.19, в которых дрожжи представляют собой Заес11аготуес5 сегеуыас.
21. Способ или композиция по любому из пп.18-20, в которых НВкАд является негликозилирован

- 24 014314 ным и/или включает фосфатидилинозит.
22. Способ или композиция по любому из пп.18-21, в которых НВкАд происходит из субтипа ;·ιά\ν2 вируса гепатита В.
23. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых антиген представляет собой гибридный белок, включающий вирусный поверхностный антиген и гетерологичный антиген.
24. Способ или композиция по п.23, в которых вирусный поверхностный антиген представляет собой НВкАд, и гетерологичный антиген представляет собой малярийный антиген.
25. Способ или композиция по п.24, в которых гибридный белок включает НВкАд и фрагмент циркумспорозоитного белка Р1акто4шт Га1арагит.
26. Способ или композиция по п.25, в которых гибридный белок включает С-концевую часть Р.Га1е1рашт циркумспорозоитного белка Р1акто4шт Га1с1ратит, четыре или более тандемных повтора иммунодоминантной области циркумспорозоитного белка и НВкАд.
27. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых весовое отношение алифатического адъюванта к поверхностно-активному веществу составляет менее чем 500:1.
28. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых весовое отношение алифатического адъюванта к поверхностно-активному веществу составляет менее чем 50:1.
29. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых алифатический адъювант представляет собой 3О-МРС и весовое отношение алифатического адъюванта к поверхностноактивному веществу составляет 2,5:1-25:1.
30. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых композиция имеет осмоляльность 200-400 мОсм/кг.
31. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых композиция включает фосфатный буфер.
32. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, в которых композиция имеет величину рН 6,0-7,0.
33. Применение (ί) антигенного компонента, который включает поверхностно-активное вещество, и (ίί) алифатического адъюванта в производстве лекарственного средства для введения пациенту, в котором весовое отношение алифатического адъюванта в (ίί) к поверхностно-активному веществу в (ί) составляет менее чем 1000:1.
34. Способ получения иммуногенной композиции, включающий стадии комбинирования (ί) НВкАд компонента, который включает полисорбат 20, и (ίί) адъювантного компонента, включающего 3Ό-ΜΡΕ, адсорбированный на фосфате алюминия, причем весовое отношение 3Ό-ΜΡΕ к полисорбату 20 в композиции составляет менее чем 1000:1.
35. Иммуногенная композиция, содержащая НВкАд, полисорбат 20, 3Ό-ΜΡΕ и фосфат алюминия как адъювант, причем весовое отношение 3Ό-ΜΡΕ к полисорбату 20 в композиции составляет менее чем 1000:1.
36. Способ получения иммуногенной композиции, включающий стадии комбинирования (а) антигена и алифатического адъюванта; и (Ь) антигена, который был очищен в отсутствие поверхностноактивного вещества.