PT1909830E - Redução de interferência entre adjuvantes contendo óleo e antigénios contendo tensioactivos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "REDUÇÃO DE INTERFERÊNCIA ENTRE ADJUVANTES CONTENDO ÓLEO E ANTIGÉNIOS CONTENDO TENSIOACTIVOS"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção insere-se no campo de fabrico de vacinas com adjuvantes. Em particular, diz respeito à utilização de adjuvantes gordos durante o fabrico de vacinas à base de antigénios que contêm tensioactivos.

TÉCNICA ANTERIOR A utilização de adjuvantes para melhorar as respostas imunes contra antigénios de vacina é bem conhecida (por exemplo, veja-se, as referências 1 e 2). Por vários anos os únicos adjuvantes aprovados para utilização em seres humanos eram 3 sais de alumínio, mas vacinas que contêm o adjuvante MF59 e o adjuvante RC-52 9 foram aprovadas em vários países, que incluem Itália (no produto FLUAD™ de Chiron) e Argentina (no produto SUPERVAX™ de Berna Biotech). Os adjuvantes adicionais na última fase de utilização experimental em seres humanos incluem misturas de colesterol e saponinas, ISCOMs, MPL™, AS04, virossomas, SBA4 etc. MPL™ ou monofosforil lípido A 3-0-desoxiacilado tem sido utilizado com HBsAg, por exemplo, veja-se o documento WO 98/43670.

Uma característica comum de algumas alternativas aos sais de alumínio é a presença de um componente gordo. Por exemplo, o adjuvante MF59 inclui esqualeno (um óleo), e MPL™ contém uma forma desacilada de monofosforil lípido A que tem múltiplas cadeias de ácidos gordos unidas a uma estrutura de di-glicosamina. A invenção visa evitar a interferência que pode ocorrer entre estes adjuvantes gordos e antigénios que incluem um componente tensioactivo. 2

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 inventor descobriu que adjuvantes gordos em composições de vacina podem ser incompatíveis com antigénios que incluem um componente tensioactivo. Em várias situações, no entanto, permanece desejável combinar um adjuvante gordo e uma mistura antigénio/tensioactivo, e é um objecto da invenção fornecer vias de evitar as dificuldades que possam surgir ao fazê-lo. É também um objecto fornecer processos para combinar adjuvantes e antigénios, em que a incompatibilidade é evitada.

Para evitar estes problemas de incompatibilidade quando se utiliza antigénios que são tipicamente purificados pela utilização de tensioactivos, uma abordagem seria utilizar um processo para a preparação de uma composição imunogénica, em que: (a) a composição compreende um antigénio e um adjuvante gordo; e (b) o antigénio é purificado substancialmente na ausência de tensioactivo. Ao purificar o antigénio por uma via alternativa que evita a utilização de tensioactivo, qualquer incompatibilidade com adjuvantes gordos pode ser superada.

Por razões clínicas, históricas ou reguladoras, no entanto, pode não ser possível purificar um antigénio sem a utilização de tensioactivos, ou remover totalmente tensioactivos das vacinas. Nesta situação, a invenção evita interferência por redução da razão de óleo para o tensioactivo na composição. Uma vacina de MF59/HBsAg típica contém um grande excesso de óleo em relação ao tensioactivo, com uma razão de óleo:tensioactivo de mais que 4.000:1 (em peso). A invenção deseja minimizar a quantidade de adjuvante gordo na composição e utiliza no máximo um excesso de peso de óleo de 1.000 vezes. Portanto, a invenção fornece um processo para a preparação de uma composição imunogénica, que compreende as etapas de combinação de (i) um componente antigénio de superfície virai que inclui um tensioactivo e (ii) um componente 3 adjuvante gordo, para dar uma composição em que a razao de peso do adjuvante gordo para o tensioactivo é menor que 1.000 :1.

Adjuvante gordo A invenção utiliza um adjuvante gordo, isto é, um componente adjuvante que inclui uma molécula gorda. Os adjuvantes gordos tipicos compreendem um óleo metabolizável, um ácido gordo e/ou uma molécula que compreende um grupo de ácido gordo.

Dois adjuvantes gordos preferidos são os adjuvantes conhecidos como "MF59" e "MPL". "MF59" é um adjuvante gordo porque ele contém esqualeno, que é um óleo metabolizável. "MPL" é um adjuvante gordo porque ele contém um dissacarideo substituído com múltiplas cadeias de ácido gordo. Assim como MF59, outros adjuvantes de emulsão óleo em água também podem ser utilizados.

Portanto, as composições preferidas da invenção incluem: (a) uma emulsão óleo em água, como uma emulsão óleo em água submicrométrica que compreende esqualeno e monooleato de polioxietileno sorbitano (e, opcionalmente, trioleato de sorbitano); e/ou (b) um monofosforil lípido A 3-O-desacilado. Monooleato de polioxietileno sorbitano é também conhecido como polisorbato 80.

Além de "MF59" e "MPL", outros adjuvantes gordos que podem ser utilizados com a invenção incluem, mas não são limitados a: derivados de fosfato de glicosaminídeo; N-acil-pseudodipéptidos; o adjuvante solúvel derivado do

lípido A de Escherichia coli conhecido como "OM-174"; compostos que contêm lípidos ligados a uma estrutura acíclica que contém fosfato; e análogos de lípido A sintético acíclico.

Quando um adjuvante de emulsão óleo em água como MF59 é utilizado, ele é tipicamente adicionado a um volume igual de uma composição aquosa de antigénio, de modo que a emulsão é 50 % em volume da composição total. Quando um 4 adjuvante 3D- MPL é utilizado, uma dose típica está entre 25 pg/ml e 200 pg/ml, por exemplo, no intervalo de 50-150 pg/ml, 75-125 pg/ml, 90-110 pg/ml, ou aproximadamente 100 pg/ml. É comum administrar entre 25-75 pg de 3D-MPL por dose por exemplo entre 45-55 pg, ou aproximadamente 50 pg de 3D-MPL por dose. Um adjuvante de emulsão como MF59 será tipicamente fornecido num contentor separado do antigénio, para mistura extemporânea no momento da utilização, ou ele pode ser fornecido já misturado com o antigénio. Um adjuvante de 3D-MPL será tipicamente já misturado com o antigénio antes da distribuição aos utilizadores finais. MF59 O adjuvante "MF59" é uma emulsão óleo em água formada a partir de esqualeno, Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano) e Span 85 (trioleato de sorbitano). A emulsão é microfluidifiçada para dar uma emulsão com um tamanho de gotícula submicrométrica. A preparação de MF59 foi originalmente descrita na referência 3, e o produto foi fabricado e vendido pela "Chiron Corporation". Detalhes adicionais podem ser encontrados no capítulo 10 da ref. 2, capítulo 12 da ref. 1 e nas referências 4 a 6. A composição de MF59 em volume é 5 % de esqualeno, 0,5 % de polisorbato 80 e 0,5 % de Span 85. Em termos de peso, essas razões tornam-se 4,3 % de esqualeno, 0,5 % de polisorbato 80 e 0,48 % de Span 85. O conteúdo de tensioactivo próprio de MF59 não é levado em consideração quando se calcula a razão óleo:tensioactivo, uma vez que a razão baseia-se no conteúdo de tensioactivo do antigénio. A emulsão de MF59 inclui vantajosamente iões de citrato, por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio. Outras emulsões óleo em água

Como uma alternativa ao adjuvante MF59, outras emulsões óleo em água podem ser utilizadas. Emulsões de adjuvante tipicamente incluem pelo menos um óleo e pelo menos um tensioactivo, com o(s) óleo(s) e tensioactivo(s) 5 sendo biodegradáveis (metabolizáveis) e biocompativeis. As goticulas de óleo na emulsão são têm geralmente menos gue 5 μπι de diâmetro, tipicamente com um diâmetro submicrométrico. Tamanhos de goticulas pequenos podem ser atingidos com um microfluidificador para fornecer emulsões estáveis. Goticulas com um tamanho menor que 220 nm são preferidas uma vez que elas podem ser submetidas a esterilização por filtragem.

As emulsões podem incluir óleos como aqueles de uma fonte animal (tal como peixe) ou vegetal, em vez de óleos minerais. Fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco e óleo de oliva, os mais comumente disponíveis, exemplificam os óleos de nozes. Óleo de jojoba pode ser utilizado, por exemplo, obtido do grão da jojoba. Óleos de sementes incluem óleo de açafrão, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de gergelim e outros. No grupo de grãos, o óleo de milho é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãos cereais tais como trigo, aveias, centeio, arroz, teff, triticale e outros também podem ser utilizados. Ésteres de ácido gordo de 6-10 carbonos de glicerol e 1,2-propanodiol, embora não ocorram naturalmente em óleos de semente, podem ser preparados por meio de hidrólise, separação e esterificação dos materiais adequados iniciando a partir dos óleos de nozes e sementes. Gorduras e óleos de leite de mamífero são metabolizáveis e podem, portanto, ser utilizados na prática dessa invenção. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obter óleos puros de fontes animais são bem conhecidos na técnica. A maioria dos peixes contém óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo de baleia como espermacete exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser utilizados aqui. Um número de óleos de 6 cadeia ramificada é sintetizado bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são geralmente referidos como terpenóides. Óleos de figado de tubarão contêm terpenóides ramificados, insaturados conhecidos como esqualeno, 2,6,10,15, 19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22 tetracosahexaeno, que é particularmente preferido no presente documento. Esqualano o análogo saturado ao esqualeno, é também um óleo preferido. Óleos de peixe, que incluem esqualeno e esqualano, são facilmente disponíveis de fontes comerciais ou podem ser obtidos por meio de métodos conhecidos na técnica. Outros óleos preferidos são os tocoferóis (veja-se a seguir). Misturas de óleos podem ser utilizadas.

Tensioactivos podem ser classificados por seu "HLB" (equilíbrio hidrofilia/lipofilia) . Tensioactivos preferidos da invenção têm um HLB de pelo menos 10, preferentemente pelo menos 15, e mais preferentemente pelo menos 16. A invenção pode ser utilizada com tensioactivos que incluem, sem limitação: os tensioactivos de ésteres de polioxietileno sorbitano (comummente referidos como os Tweens), especialmente polisorbato 20 e polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), e/ou óxido de butileno (BO) , vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, como copolímeros em bloco lineares EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de grupos de repetição de etoxi(oxi-1,2-etanodiilo), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos como fosfatidilcolina (lecitina); éteres gordos de polioxietileno derivados de álcoois laurilicos, cetilicos, estearilicos e oleilicos (conhecidos como tensioactivos Brij), tais como trietilenoglicol monolauril éter (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comummente conhecidos como SPANs), como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de 7 sorbitano. Tensioactivos preferidos para inclusão numa emulsão são Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano) , Span 85 (trioleato de sorbitano) , lecitina e Triton X—100· Misturas de tensioactivos podem ser utilizadas, por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85, ou misturas de Tween80/Triton-X100.

Adjuvantes de emulsão óleo em água úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a: uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato. Também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1 %) e/ou lecitina. Essas emulsões podem ter desde 2 até 10 % de esqualeno, desde 2 até 10 % de tocoferol e desde 0,3 até 3 % de Tween 80, e a razão de peso de esqualeno: tocoferol é preferentemente <1 uma vez que essa fornece uma emulsão mais estável. Uma tal emulsão pode ser feita por dissolução de Tween 80 em PBS para dar uma solução a 2 %, seguida de mistura de 90 ml dessa solução com a mistura de (5 g de DL-α-tocoferol e 5 ml de esqualeno) e, depois, microfluidificação da mistura. A emulsão resultante pode ter goticulas de óleo submicrométricas, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferentemente aproximadamente 180 nm. - uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente de Triton (por exemplo, Triton X-100). uma emulsão de esqualano, polisorbato 80 e poloxamer 401 ("Pluronic™ L121"). A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Essa emulsão é um veiculo de distribuição útil para dipéptidos de muramil, e tem sido utilizada com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1" [7] (0,05-1 % de Thr-MDP, 5 % de esqualano, 2,5 % de Pluronic L121 e 0,2 % de polisorbato 80) . Ela também pode ser utilizada sem o Thr-MDP, como no adjuvante "AF" [8] (5 % de esqualano, 1,25 % de Pluronic 8 L121 e 0,2 % de polisorbato 80). Microfluidificação é preferida. uma emulsão que tem de 0,5-50 % de um óleo, 0, Ι-ΙΟ % de um fosfolipido, e 0,05-5 % de um tensioactivo não iónico. Como descrito na referência 9, componentes preferidos de fosfolipido são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatidico, esfingomielina e cardiolipina. Tamanho de goticulas submicrométricas são vantajosos. uma emulsão óleo em água submicrométrica de um óleo não metabolizável (como óleo mineral leve) e pelo menos um tensioactivo (como lecitina, Tween 80 ou Span 80) . Aditivos podem ser incluídos, tais como a saponina QuilA, colesterol, um conjugado saponina-lipofílico (como GPI-0100, descrito na referência 10, produzido por adição de amina alifática a desacilsaponina via grupo carboxil de ácido glicurínico), brometo de dimetildioctadecilamónio e/ou N,N-dioctadecil- N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina. uma emulsão em que uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) são associados como micelas em hélice [11].

As emulsões são preferentemente misturadas com antigénio extemporaneamente, no momento da administração. Portanto, o adjuvante e antigénio são tipicamente mantidos separadamente numa vacina empacotada ou distribuída, pronta para formulação final no momento da utilização. O antigénio estará geralmente numa forma aquosa, de modo que a vacina é finalmente preparada por mistura de dois líquidos. A razão de volume dos dois líquidos para mistura pode variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5) mas é geralmente de aproximadamente 1:1.

Quando a composição inclui um tocoferol, qualquer um de α, β, γ, δ, ε, ο^ tocoferóis pode ser utilizado, mas a-tocoferóis são preferidos. O tocoferol pode ter várias 9 formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isómeros. Sais incluem sais orgânicos, como succinato, acetato, nicotinato etc. D-oí-tocof erol e DL-a-tocof erol podem ser utilizados. Um α-tocoferol preferido é DL-a-tocoferol, e o sal preferido desse tocoferol é o succinato.

3D-MPL

Monofosforil lipido A 3-0-desacilado (3D-MPL; também referido como monofosforil lipido A 3 de-O-acilado ou 3-0-desacil-4'-monofosforil lipido A) é um adjuvante conhecido. O nome indica que a posição 3 da glicosamina de extremidade redutora no monofosforil lipido A é desacilada. 3D-MPL foi preparado a partir de um mutante sem heptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente similar ao lipido A mas é desprovido de um grupo fosforil estável em ácido e um grupo acil estável em base. Ele activa células da linhagem de monócitos/macrófagos e estimula a libertação de várias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-α e GM-CSF. A preparação de 3D-MPL foi originalmente descrita na referência 12, e o produto tem sido fabricado e vendido por Corixa Corporation sob o nome comercial "MPL". Detalhes adicionais podem ser encontrados nas referências 13 a 16. 3D-MPL pode ter a forma de uma mistura de moléculas relacionadas, que variam por sua acilação (por exemplo, tendo 3, 4, 5 ou 6 cadeias de acilo, que podem ser de comprimento diferentes). Os dois monossacarideos de glicosamina (também conhecidas como 2-desoxi-2-amino-glicose) são N-acilados em seus carbonos de posição 2 (ou seja, nas posições 2 e 2'), e há também 0-acilação na posição 3 ' . 0 grupo unido ao carbono 2 tem a fórmula -NH-CO-CH2-CR1R1' . O grupo unido ao carbono 2' tem a fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2' . 0 grupo unido ao carbono 3' tem a fórmula — 0—C0—CH2—CR3R3 '. Uma estrutura representativa é: 10

10 QIC

(XII) κ

Grupos R1, R2 e R3 são cada um independentemente -(CH2) n—CH3. O valor de n é preferentemente entre 8 e 16, mais preferentemente entre 9 e 12, e é mais preferentemente 10.

Grupos R1' , R2' e R3' podem ser independentemente: (a) -H; (b) -OH; ou (c) -O-CO-R4, em que R4 é -H ou -(CH2)m-CH3, em que o valor de m é preferentemente entre 8 e 16, e é mais preferentemente 10, 12 ou 14. Na posição 2, m é preferentemente 14. Na posição 2', m é preferentemente 10. Na posição 3', m é preferentemente 12. Grupos R ', R ' e R ' são assim preferentemente grupos -O-acilo de ácido dodecanóico, tetradecanóico ou hexadecanóico.

Quando todos de R1' , R2' e R3' são -H então o 3D-MPL em apenas 3 cadeias acilo (uma em cada das posições 2, 2' e 3')· Quando somente dois de R1', R2' e R3' são —H então o 3D- MPL pode ter 4 cadeias acilo. Quando apenas um de R1' , R2' e R3' é —H então o 3D-MPL pode ter 5 cadeias acilo. Quando nenhum de R1', R2' e R3' é -H então o 3D-MPL pode ter 6 cadeias acilo. 0 adjuvante 3D-MPL utilizado de acordo com a invenção pode ser uma mistura dessas formas, com de 3 a 6 cadeias acilo, mas é preferível incluir 3D-MPL com 6 cadeias acil na mistura, e em particular para assegurar que a forma de cadeia de hexaacilo faça pelo menos 10 % em peso do 3D-MPL total, por exemplo >20 %, >30 %, >40 %, >50 % ou mais. 3D-MPL com 6 cadeias acilo é a forma mais activa de adjuvante.

Portanto, a forma mais preferida de 3D-MPL para inclusão nas composições da invenção é: 11

então referências a quantidades ou concentrações de 3D-MPL nas composições da invenção referem-se às espécies combinadas de 3D-MPL na mistura.

Em condições aquosas, 3D-MPL pode formar agregados micelares ou partículas com diferentes tamanhos, por exemplo, com um diâmetro <150 nm ou >500 nm. Cada um desses ou ambos podem ser utilizados com a invenção, e as melhores partículas podem ser seleccionadas por ensaio de rotina. Partículas menores (por exemplo, pequenas o suficiente para dar uma suspensão aquosa transparente de 3D-MPL) são preferidas para utilização de acordo com a invenção por causa de sua actividade superior [17] . Partículas preferidas têm um diâmetro médio menor que 220 nm, mais preferentemente menos que 200 nm ou menos que 150 nm ou 12 menos que 120 nm, e podem até ter um diâmetro médio menor que 100 nm. Na maioria dos casos, no entanto, o diâmetro médio não será menor que 50 nm. Essas partículas são pequenas o suficiente para serem adequadas para esterilização por filtragem. 0 diâmetro da partícula pode ser avaliado por técnica de rotina de espalhamento de luz dinâmica, que revela um diâmetro médio de partícula. Quando uma partícula é dita como tendo um diâmetro de x nm, haverá geralmente uma distribuição de partículas por volta dessa média, mas pelo menos 50 % em número (por exemplo, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, ou mais) das partículas terão um diâmetro no intervalo de x ± 25 %. O 3D-MPL pode ser utilizado por si ou como um adjuvante, ou em combinação com um ou mais de outros compostos adjuvantes. Por exemplo, é conhecido a utilização de 3D-MPL em combinação com a saponina QS21 [18], com QS21 e uma emulsão óleo em água [19], com um fosfato de alumínio [20], com hidróxido de alumínio [21], ou com saponinas & interleucina-12 [22].

Uma mistura preferida de adjuvante, particularmente para utilização com HBsAg, compreende uma mistura de 3D-MPL e um sal de alumínio, preferentemente fosfato de alumínio.

Vantajosamente, o 3D-MPL é adsorvido no sal de alumínio. Preferentemente pelo menos 50 % (em peso) do 3D-MPL é adsorvido por exemplo >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, >98 % ou mais.

Adjuvantes de alumínio actualmente em utilização são tipicamente referidos como adjuvantes de "hidróxido de alumínio" ou como "fosfato de alumínio". Esses são nomes de conveniência, no entanto, como nenhum é uma descrição precisa do real composto químico que está presente (por exemplo, veja-se o capítulo 9 da referência 2). Para combinação com um adjuvante gordo como 3D-MPL, a invenção pode usar qualquer um dos "hidróxido" ou sais de "fosfato" que estão em utilização geral como adjuvantes. 13

Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio" são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que são comummente, pelo menos parcialmente, cristalinos. Oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pela fórmula AIO(OH), pode ser distinto de outros compostos de alumínio, como hidróxido de alumínio A1(0H)3, por meio de espectroscopia de infravermelho (IR), em particular pela presença de uma banda de absorção a 1070 cm 1 e uma ramificação forte a 3090 - 3100 crrf1 (capitulo 9 da ref. 2) .

Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio" são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, frequentemente também contendo uma pequena quantidade de sulfato. Podem ser obtidos por precipitação, e as condições de reacção e as concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato por hidroxil no sal. Hidroxifosfatos geralmente têm uma razão molar de P04/A1 entre 0,3 e 0,99. Hidroxifosfatos podem ser distinguidos de A1P04 pela presença de grupos hidroxil. Por exemplo, uma banda de espectro de IR a 3.164 cm-1 (por exemplo, quando é aquecido até 200°C) indica a presença de grupos hidroxil estruturais (capítulo 9 da ref. 2). A razão molar de P04/A13+ de um adjuvante de fosfato de alumínio estará geralmente entre 0,3 e 1,2, preferentemente entre 0,8 e 1,2, e mais preferentemente 0,95 ± 0,1. O fosfato de alumínio será geralmente amorfo, particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com razão molar de P04/A1 entre 0,84 e 0,92, incluída a 0,6 mg de Al3+ /ml. O fosfato de alumínio geralmente será particulado. Diâmetros típicos das partículas estão no intervalo de 0,5-20 pm (por exemplo, aproximadamente 5-10 pm) depois de qualquer adsorção de antigénio. O PZC de fosfato de alumínio é inversamente relacionado ao grau de substituição de fosfato por 14 hidroxil, e esse grau de substituição pode variar dependendo das condições de reacção e concentração de reagentes utilizados para a preparação do sal por meio de precipitação. PZC é também alterado por troca da concentração de iões fosfato livres em solução (mais fosfato = PZC mais ácido) ou por adição de um tampão tal como um tampão de histidina (torna PZC mais básico) . Os fosfatos de alumínio utilizados de acordo com a invenção geralmente terão um PZC entre 4,0 e 7,0, mais preferentemente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, aproximadamente 5,7.

Uma solução de fosfato de alumínio utilizada para preparar a composição da invenção pode conter um tampão (por exemplo, um tampão de fosfato ou histidina ou Tris), mas isso não é sempre necessário. A solução de fosfato de alumínio é preferentemente estéril e livre de pirogénio. A solução de fosfato de alumínio pode incluir iões de fosfato aquoso livres, por exemplo, presentes numa concentração entre 1,0 e 20 mM, preferentemente entre 5 e 15 mM, e mais preferentemente aproximadamente 10 mM. A solução de fosfato de alumínio também pode compreender cloreto de sódio. A concentração de cloreto de sódio está preferentemente no intervalo de 0,1 a 100 mg/ml (por exemplo, 0,5-50 mg/ml, 1-20 mg/ml, 2-10 mg/ml) e é mais preferentemente aproximadamente 3±1 mg/ml. A presença de NaCl facilita a medição correcta do pH antes da adsorção de antigénios. 0 fosfato de alumínio é preferentemente utilizado na forma de uma solução aquosa à qual 3D-MPL (e, opcionalmente, um antigénio) é adicionado (NB: é padrão referir-se a fosfato de alumínio aquoso como uma "solução" embora, num ponto de vista físico-químico estrito, o sal é insolúvel e forma uma suspensão). É preferível diluir o fosfato de alumínio na concentração necessária e assegurar uma solução homogénea antes da adição de 3D-MPL e/ou do antigénio. 15 N-acil-pseudodipéptidos

Um adjuvante de N-acil-pseudodipéptido preferentemente inclui um grupo hidroxil que é esterificado por um grupo ácido na forma neutra ou carregada. Os grupos acil dão aos pseudodipéptidos um carácter gordo. 0 adjuvante preferentemente tem a fórmula (I): 1 [ a> NHRj NHR* em que: R1 é um grupo acil derivado de um ácido carboxilico de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado que tem desde 2 até 24 átomos de carbono, o ácido carboxilico sendo não substituído ou substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo que consiste em hidroxil, 5 alquil, alcoxi, aciloxi, amino, acilamino, aciltio e (grupos (Cl-24) alquil) tio; R2 é um grupo acil derivado de um ácido carboxilico de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado que tem desde 2 até 24 átomos de carbono, o ácido carboxilico sendo não substituído ou substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo que consiste em hidroxil, alquil, alcoxi, aciloxi, amino, acilamino, aciltio e (grupos (Cl-24) alquil) tio; X é um átomo de hidrogénio ou um grupo ácido em forma neutra ou carregada; Y é um átomo de hidrogénio ou um grupo ácido em forma neutra ou carregada; A é um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou um grupo imino -NH-; - B é um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou um grupo imino -NH-; mél, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; néO, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; 16 pél, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; qél, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; desde que pelo menos um dos substituintes X ou Y designe um grupo ácido em forma neutra ou iónica. O adjuvante pode ser utilizado em forma de ácido ou sal, com uma base orgânica ou mineral.

As bases que formam sais para utilização terapêutica incluem principalmente bases de metal alcalino como hidróxidos de sódio, potássio ou litio, sais de amónio; bases de metal alcalino terroso como hidróxido de cálcio ou estrôncio e sais de magnésio; sais de metal ferroso e outros; bases orgânicas como aquelas derivadas de aminas primárias, secundárias, terciárias como metilamina, dietilamina, monoetanolamina, dietanolamina, benzilamina, N-metilbenzilamina, veratrilamina, trimetoxibenzilamina; aminoácidos básicos como lisina e ornitina ou açúcares de amino. Exemplos de bases que não são destinadas para utilização terapêutica são brucina, estriquinina, agmatina, homarina, glicosamina, N-metilglicosamina ou N-metilmorfolina.

Substituintes preferidos X e Y são seleccionados de: carboxi [ (Ci_5) alquil] CH- [ (CH2) rCOOH] [ (CH2) sCOOH] , em que : r é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; séO, 1, 2, 3, 4 ou 5 fosfono [ (Ci_5) alquil] dihidroxif osf oriloxi [ (Ci_5) alquil] dimetoxifosforilo fosfono hidroxissulfonilo hidroxissulf onilo [ (Ci_5) alquil] hidroxissulf oniloxi [ (Ci_5) alquil]

Quando os substituintes X e/ou Y designam um grupo ácido em forma neutra, é feita referência à forma carboxílica, sulfónica ou fosfórica livre. Quando o grupo ácido está na forma com carga, é feita referência à forma 17 de sal carboxilico, sulfónico ou fosfórico, concretamente por adição de uma base orgânica ou mineral, preferentemente uma destinada para utilização terapêutica. Considerações similares se aplicam em que X e/ou Y designam um grupo carboxilalquilo, alquenilbiscarboxílico, hidroxissulfonil, hidroxissulfonilalquilo, hidroxissulfonil-oxialquilo, fosfonoalquilo ou fosforiloxialquilo.

Quando m=len=0, o adjuvante deriva de serina. Quando m=2en=0, o adjuvante deriva de homosserina. Se m=3en=0, é feita referência a um composto pentahomosserina. Sem=4en=0, é feita referência a um composto hexahomosserina.

Quando p = 3 e que = 1, o produto de interesse pode ser um composto de citrulina, ornitina ou arginina. Quando p = 4 e que = 1, é feita referência a um composto de homoarginina ou lisina. R1 e R2 incluem derivados de acil de cadeia linear ou ramificada, saturados ou insaturados que têm vários tamanhos de cadeia, de natureza distinta ou idêntica, que pode ter um ou mais substituintes seleccionados do grupo que consiste em grupos alquilo, amino, acilamino, hidroxilo, alcoxi, aciloxi, aciltio e alquiltio.

Os exemplos de tais derivados acilados, substituídos são radicais ricinoleilo, 1,2-hidroxiestearoilo, 2-hidroxi-3- metil butiroilo, 3-hidroxi-2-aminopentanoilo, palmitoilo, elaidilo, eleostearoilo, araquidoilo, araquidonilo, gadoleilo, behenilo, erucilo, 8- metildecanoilo, 9-metildecanoilo, docosohexaenoilo ou eicosapentaneoilo.

Os adjuvantes preferidos têm a fórmula (Ia), em que A e B são átomos de oxigénio:

X-0-(CHs) ,η-Ο hHGHa )j, ΌΟ-ΝΙΉΟΚρ }q-0-Y I I (la) WHR, NKRj 18

Na fórmula (Ia), X e Y são preferentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo fosfono.

Os adjuvantes adequados de fórmula (Ia) incluem: - 3 -(3-dodecanoiloxitetradecanoilamino) 9 —(3 — hidroxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecan-l,10-diol 1 e/ou 10-dihidrogéniofosfato e seus sais de adição formados com uma base orgânica ou mineral, - 3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoilamino) 9—(3— hidroxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecan-l,10-diol 1,10- bis(dihidrogéniofosfato) e seus sais de adição formados com uma base orgânica ou mineral, - 3-(3-hidroxitetradecanoilamino) 9 — (3 — dodecanoiloxitetradecanoilamino) 4-oxo-5- azadecan-1,10 - diol 1,10- bis(dihidrogéniofosfato) e seus sais de adição formados com uma base orgânica ou mineral, - 3 -(3-dodecanoiloxitetradecanoilamino) 9-(3-hidroxitetradecanoilamino) 4-oxo-5-azadecan-l,10-diol 1- dihidrogéniofosfato e seus sais de adição formados com uma base orgânica ou mineral, - 3-(3-hidroxitetradecanoilamino) 9 — (3 — dodecanoiloxitetradecanoilamino) 4-oxo-5- azadecan-1,10-diol 1-dihidrogéniofosfato e seus sais de adição formados com uma base orgânica ou mineral - 3-(3-hidroxitetradecanoilamino) 9-(3- dodecanoiloxitetradecanoilamino) 4-oxo-5- azadecano-1,10- diol 10-dihidrogéniofosfato e seus sais de adição formados com uma base orgânica ou mineral.

Os métodos para síntese de um adjuvante de fórmula (I) são revelados em detalhes na referência 23, e incluem métodos que compreendem as etapas de: protecção dos grupos funcionais de amina nas posições (q+1) e ω de um ácido 19 diamino por bloqueio dos reagentes que passam prontamente por acidólise e hidrogenólise, respectivamente; reacção do grupo funcional carboxilico livre com um agente redutor para dar um álcool correspondente; desprotecção do grupo funcional de amina (q+1) e então acilação por meio de um derivado funcional de ácido carboxilico de fórmula R2OH, e subsequentemente liberação do grupo funcional de amina terminal por hidrogenólise para dar um álcool diamino de fórmula geral II:

NHR* cujo álcool amino é condensado na presença de um agente de condensação de péptido num solvente inerte, juntamente com um composto de aminoácido 00-hidroxi, (O-amino ou ω-tio de fórmula geral III:

XMCHj«-CHW„-COOH (UI) NHR, para fornecer um composto de dipéptido de fórmula (IV):

XA-{CH - CONHCCMj)^CM:(CHâÍ^OH NHR, o grupo funcional de álcool livre terminal do qual podem ser, se for necessário, protegido (por exemplo, por um grupo alquil ou acil, ou qualquer outro grupo de protecção adequado) ou substituído, se for necessário, na presença de um agente de ligação. 0 álcool protegido pode ser submetido a uma hidrogenação catalítica ou outro tratamento de desprotecção para obter o derivado de fórmula geral I.

Os métodos para síntese de adjuvantes de fórmula (II) são também revelados em detalhe na referência 23, e incluem os métodos que compreendem as etapas de: protecção de grupos funcionais de amina nas posições (q+1) e ω de um 20 ácido diamino de fórmula H2N (CH2) pCHNH2 (CH2) q+iCOOH por protecção de reagentes que passam prontamente por acidólise e hidrogenólise, respectivamente; reacção do grupo funcional carboxilico livre com um agente redutor para dar um álcool correspondente; desprotecção do grupo funcional de amina na posição (q+1) e então acilação por meio de um derivado funcional de ácido carboxilico de fórmula R20H, então desprotecção do grupo funcional de amina terminal por hidrogenólise para obter um álcool amino de fórmula geral II; cujo álcool amino é condensado na presença de um agente de condensação de péptido num solvente inerte, juntamente com um derivado funcional de aminoácido ω-hidroxi, de fórmula geral Illa:

XCKC Hs) -COOH NHRj em que X é radical dialquiloxi ou diariloxi-fosforilo de fórmula (R0)2P-0 para dar um composto semelhante a péptido de fórmula IVa:

(ROhPO -(CHz)m-CH-{CH2)o-C0NH-(CH2)-CH-(GHí)q-0H

O NHR, 34HRj (IVa) em que R é um radical que passa prontamente por hidrogenólise, o outro grupo funcional de álcool do qual pode ser, se for desejado, fosforilado por um agente de fosforilação na presença de um agente de ligação, se for necessário. O álcool protegido pode ser submetido a uma hidrogenação catalítica por um lado com a finalidade de desproteger o grupo funcional de álcool opcionalmente presente no R2 de grupo acil e por outro lado, libertar o grupo funcional de fosfato e então desproteger através de hidrogenólise o segundo grupo funcional de fosfato opcionalmente presente, para obter o derivado de fórmula geral V: (V) 21

(1-1(¾ PO -(CHJ)pl-CÍ-MCHi)It- CONH-íCH^CmCH* Í^O-Y

O

MH

R e opcionalmente realizar a etapa adicional de formação de sal por meio de uma base orgânica ou mineral. A estereoquimica de centros quirais dos grupos acilamino é determinada pela configuração de aminoácido inicialmente utilizada enquanto a estereoquimica de grupos acilamino depende da configuração de ácido gordo inicialmente utilizada. Um pode iniciar a partir de um ácido diamino tendo configuração L ou D de uma natureza racémica. Um pode iniciar a partir de um aminoácido hidroxilado de configuração L ou D de uma mistura racémica. Todos esses estereoisómeros ou diastereoisómeros são incluídos no âmbito da invenção.

Os adjuvantes particularmente preferidos, e compostos mono- e bis-fosforilados notáveis, são aqueles que são conhecidos como "OM-294-MP" (fórmula VI) e "OM-294-DP" (fórmula VII) [23]:

(VI) - OM-294-MP

22 ΟΜ-174 ΟΜ-174 pode ser obtido através de síntese química, e retém um motivo de triacilo de lípido A. É descrito em maiores detalhes nas referências 24-26. A referência 26 dá a fórmula de OM-174 como:

(VIII)

Portanto, OM-174 tem uma estrutura principal de diglicosamina β (l->6)-ligada 1, 4 '-bif osf orilada, como é encontrado no lípido natural A. OM-174 pode estar presente na forma de agregados com uma estrutura Eh micelar, isto é, em que as moléculas de lípido são empacotadas com sua estrutura principal numa superfície cilíndrica com as cadeias acil direccionadas para o interior, com os cilindros em si sendo empacotados de modo hexagonal. Uma fase cúbica pode estar ausente. Uma fase Hn pode estar ausente também.

Derivados de fosfato de glicosaminídeo

Os derivados de fosfato de aminoalquil glicosaminídeo (AGP) (por exemplo, RC-529 [27,28]) são adjuvantes gordos por causa das cadeias acil. Em geral, esses derivados podem ter a seguinte fórmula [29]: 23

em que: - X representa um átomo de oxigénio ou enxofre na posição axial ou equatorial; - Y representa um átomo de oxigénio ou grupo NH; - "n", "m", "p" e "q" são o mesmo ou diferentes e são números inteiros de 0 a 6; - Ri, R2, e R3, que podem ser o mesmo ou diferentes, são resíduos de acil gordo que têm de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono e em que um de Ri, R2 ou R3 é opcionalmente hidrogénio; - R4 e R5 são o mesmo ou diferentes e são hidrogénio ou metil; R6 e Rv sao 0 mesmo ou diferentes e são hidrogénio, hidroxi, alcoxi, fosfono, fosfonooxi, sulfo , sulfooxi, amino, mercapto. , ciano, nitro, formilo ou carboxi e ésteres e amidas R8 e R9 são 0 desses; mesmo ou diferentes e são fosfono ou hidrogénio, com preferentemente pelo menos um de R8 e/ou R9 sendo fosfono. 24 A configuração dos centros estereogénicos 3' aos quais os residuos de acil gordo normais são unidos é R ou S, mas preferentemente R. A estereoquimica dos átomos de carbono aos quais R4 ou R5 são unidos pode ser R ou S. Todos os estereoisómeros, enantiómeros e diastereómeros, e misturas dos mesmos, são considerados como dentro do âmbito da actual invenção. Os adjuvantes adequados incluem sais desses compostos.

Um composto AGP preferido é "RC-529", que pode ser preparado como descrito na ref. 30:

Ofl

(X)

Análogos de lípido A sintético acíclico

Um análogo de lípido A que pode ser utilizado como um adjuvante nas composições da invenção é ER-112022 [31], um dímero de fosfolípido ligado via uma estrutura acíclica: 25

Cada unidade monomérica de ER-112022 contém 3 grupos gordos únicos que são ligados indirectamente a um diéster de fosfato. Os grupos gordurosos incluem uma cadeia de éter de 10-carbonos, uma cadeia de aciloxi insaturado de 12-carbonos ligada à cadeia de éter, e uma cadeia de b-oxo-amida de 14-carbonos, ligadas próximo ao fosfodiéster. Portanto, o composto tem 3 caracteristicas únicas em comparação com o lípido A de ocorrência natural de E. coli: (i) ER- 112022 é desprovido de uma estrutura principal de carboidrato ciclico; (ii) segundo, os fosfatos são fosfodiésteres incorporados nos limites do esqueleto estrutural, diferente dos fosfoésteres no lipido A de E. coli', e (iii) a estrutura é simétrica (seis ácidos gordos simetricamente organizados numa estrutura principal não-carboidrato) .

Compostos úteis similares incluem aqueles com a fórmula XIV, XV ou XVI, ou sais dos mesmos: 26

XIV 26f { ! · QíSP—QH: d V ê V f é ' » qW k» XV XVI νΛ w j&feíi /“Λ w* («tilj vi L· >-x s {»&.· |^| ·ι^* ' / \ w; m\s v / <C«A H m* j V & é # !<?·&- }-% & V V > «P* /Λ

Como definido na referência 32, como "ER 803 058", "ER 803732", "ER 804053", ER 804058", "ER 804059", "ER 804442", "ER 804680", "ER 804764", ER 803022 ou "ER 804057" por exemplo:

O N* ER804057 (XVII)

UilC

Compostos que contêm lipidos ligados a um esqueleto aciclico que contém fosfato também podem ser utilizados como adjuvantes, como o antagonista de TLR4 E5564 [33, 34] : 27

^OPOJOÍÍ); 0 ο JJv (cnibCHj

(XDQ O tensioactivo 0 primeiro aspecto da invenção utiliza tensioactivo durante a purificação de antigénio mas em niveis controlados em relação ao adjuvante gordo. 0 tensioactivo será tipicamente um tensioactivo não iónico, particularmente aqueles que são já encontrados em formulações de vacina. Tensioactivos orgânicos são preferidos. Esses são tipicamente o produto da reacção de um óxido de alquileno (por exemplo, óxido de etileno) com um álcool gordo, ácido gordo, alquilfenol, alquilamina ou outro composto adequado que tem pelo menos um átomo de hidrogénio activo. Para a maioria dos tensioactivos os álcoois mais comuns, aminas e ácidos têm um comprimento de cadeia de carbono no intervalo de Cs-Cis. Os alquilfenóis mais comuns são nonilfenol e octilfenol. Tensioactivos contendo resíduos de poli(oxieteno) são particularmente preferidos.

Por exemplo, a invenção pode ser utilizada com tensioactivos que incluem, sem limitação: os tensioactivos de ésteres de polioxietileno sorbitano (comummente referidos como os Tweens), especialmente polisorbato 20 e polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) , e/ou óxido de butileno (BO) , vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, como copolímeros em bloco lineares EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de grupos de repetição etoxi (oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) 28 sendo de particular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-63O/NP-40); éteres gordos de polioxietileno derivados de lauril, cetil, estearil e oleil álcoois (conhecidos como tensioactivos Brij), como trietileneglicol monolauril éter (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comummente referidos como os SPANs), como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano.

Dois tensioactivos específicos de interesse são Triton X-100 e polisorbato 20. Assim, formas de realização preferidas do primeiro aspecto da invenção usam um componente antigénio que compreende um desses dois tensioactivos não iónicos. A invenção é particularmente adequada para utilização com polisorbato 20. Esse tensioactivo tem um perfil de segurança estabelecido para administração a seres humanos, incluindo em vacinas.

Os tensioactivos podem ser classificados por seu "HLB" (equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Tensioactivos preferidos da invenção têm um HLB de pelo menos 10, preferentemente pelo menos 15, e mais preferentemente pelo menos 16.

Para evitar a administração de grandes doses do tensioactivo a um paciente, é preferível que a concentração do tensioactivo na composição não seja de mais que 50 pg/ml, por exemplo, < 40 pg/ml, < 35 pg/ml, <30 pg/rnl, <25 pg/ml, <20 pg/ml, <15 pg/ml, <10 pg/ml, <5 pg/ml etc. A concentração de <2 0 pg/ml é preferida. O antigénio A invenção envolve a utilização de um antigénio de superfície virai. A invenção é particularmente adequada para utilização com antigénios que são tipicamente purificados pela utilização de tensioactivos. Esses antigénios são tipicamente lipofílicos. Eles incluirão comummente pelo menos uma região de transmembrana, que funciona in vivo para localizar o antigénio numa bicamada lipídica, por exemplo, na superfície de um patogénio. 29 0 componente antigénio inclui um tensioactivo. Em vez de ser uma simples mistura de antigénio e tensioactivo, é preferível que o antigénio e tensioactivo devam estar na forma de um complexo. Complexos de antigénio/tensioactivo incluem lipossomas estabilizados por tensioactivo que contêm antigénio, e niossomas, que são vesículas formadas a partir de compostos anfifílicos não iónicos sintéticos. Um complexo antigénio/tensioactivo preferido é um antigénio de superfície de hepatite B particulado, purificado na presença de tensioactivo. A Referência 35 descreve como partículas de HBsAg recombinante podem reter Tween 20 que foi utilizado durante a sua purificação (até 25 pg de Tween 20 por 100 pg de HBsAg) . 0 antigénio mais preferido para utilização com a invenção é assim o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBV), na forma de partículas substancialmente esféricas (diâmetro médio de aproximadamente 20 nm) , incluindo uma matriz de lípido que compreende ambos fosfolípidos e um tensioactivo não iónico, como polisorbato 20. O tensioactivo não iónico pode ser incorporado na partícula durante a purificação. O vírus da hepatite B (HBV) é um dos agentes conhecidos que causa a hepatite virai. O virião do HBV consiste num núcleo interno circundado por um revestimento proteico ou capsídeo externo, e o núcleo virai contém o genoma do ADN virai. O principal componente do capsídeo é uma proteína conhecida como antigénio de superfície de HBV ou, mas comummente, "HBsAg", que é tipicamente um polipéptido de 226 aminoácidos com um peso molecular de -24 kDa. Todas as vacinas existentes de hepatite B contêm HBsAg, e quando esse antigénio é administrado a uma pessoa normal ele estimula a produção de anticorpos anti-HBsAg que protegem contra infecção por HBV.

Para fabrico de vacina, o HBsAg pode ser feito de duas maneiras. O primeiro método envolve a purificação do 30 antigénio em forma de partículas a partir do plasma de portadores de hepatite B crónica, uma vez que grandes quantidades de HBsAg são sintetizadas no fígado e libertadas na corrente sanguínea durante uma infecção por HBV. A segunda maneira envolve a expressão da proteína por métodos de ADN recombinante. 0 HBsAg para utilização com o método da invenção é expresso de forma recombinante em células de levedura. As leveduras adequadas incluem hospedeiros de Saccharomyces (como S. cerevísíae), Pichia (como P. pastoris) ou Hanensula (como H. polimorpha). Como uma alternativa, o antigénio pode ser expresso em células de mamíferos recombinantes (por exemplo, em ovário de hamster da China (CHO), células COS, células Bu3, etc.), inseto (por exemplo, utilização de vectores de baculovírus), ou células vegetais. Em geral, no entanto, a expressão em levedura é utilizada. O HBsAg expresso em levedura é preferentemente não glicosilado. Diferentemente de HBsAg nativo (ou seja, como no produto purificado de plasma) , o HBsAg expresso em levedura é geralmente não glicosilado, e essa é a forma mais preferida de HBsAg para utilização com a invenção, porque ele é altamente imunogénico e pode ser preparado sem o risco de contaminação de produto do sangue. Partículas de HBsAg expressas em levedura podem incluir fosfatidilinositol, que não é encontrado em viriões de HBV naturais. As partículas também podem incluir uma quantidade não tóxica de LPS para estimular o sistema imune [36]. Vários métodos para purificar HBsAg são conhecidos na técnica (por exemplo, veja-se as refs 37-62). Desses vários processos, o primeiro aspecto da invenção usa um tensioactivo não iónico durante a purificação, de modo que o tensioactivo torna-se incorporado no produto final particulado de HBsAg. A utilização de polisorbato durante o rompimento de células de levedura recombinante no início da 31 purificação é um modo preferido de introduzir o tensioactivo nas partículas de HBsAg.

Um método preferido para purificação de HBsAg envolve, após o rompimento da célula: ultrafiltração; cromatografia de exclusão por tamanho; cromatografia de permuta aniónica; ultracentrifugação; dessalinização; e filtração estéril. Os lisados podem ser precipitados após o rompimento da célula (por exemplo, com a utilização de polietileno glicol), deixando HBsAg em solução, pronto para ultrafiltração. Antes ou depois da filtração estéril, é possivel estabilizar as partículas de HBsAg por tratamento com formaldeido. 0 excesso de formaldeido pode ser então removido por ultrafiltração ou por cromatografia. Filtração estéril adicional pode ser utilizada. 0 HBsAg é preferentemente de HBV subtipo adw2.

Além da sequência "S", um antigénio de superfície pode incluir toda ou parte de uma pré-sequência S, como toda ou parte de uma pré-sequência SI e/ou pré-sequência S2.

Outros antigénios de superfície virai que podem ser utilizados com a invenção serão geralmente glicoproteínas de envelope de um vírus envelopado. Os antigénios de superfície virai para utilização com a invenção podem incluir, mas não são limitados a: uma proteína de retroviridae. Retroviridae incluem lentivírus e espumavírus. Vírus de interesse incluem HTLV- I, HTLV-II, vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da imunodeficiência humana (HIV, incluindo HIV-1 e HIV-2), vírus da imunodeficiência de simios (SIV), vírus espumoso de chimpanzé e espumavírus humano. uma proteína de paramyxoviridae, como a proteína F. Paramyxoviridae incluem (a) Paramyxovirinae, que incluem Paramixovírus, Rubulavirus e Morbillivirus e (b) Pneumovirinae, que incluem os Pneumovirus. Vírus de interesse incluem vírus parainfluenza (PIV), paramixovírus humano, vírus da peste bovina (Rinderpest) , vírus da peste 32 dos pequenos Ruminantes, vírus do sarampo, vírus da parotidite, vírus sincicial respiratório (RSV), Vírus Nipah, Vírus Hendra, Morbilivírus Equino (EMV), Lissavírus e vírus Menangle. uma proteína de Filoviridae. Filoviridae inclui os vírus de Marburg e Ebola. uma glicoproteína spike de coronaviridae. Coronaviridae incluem coronavírus e torovírus. Vírus de interesse incluem o coronavírus humano (incluindo o coronavírus da SARS), vírus da bronquite infecciosa aviária, vírus da peritonite infecciosa felina, vírus da hepatite de murino, vírus da diarreia epidémica suína, vírus da encefalomielite de hemaglutinação suína, vírus da gastroenterite transmissível suína e vírus do Berne. uma proteína de rhabdoviridae, como a proteína G. Rhabdoviridae inclui os Rhabdovírus, Vesiculovírus, Lissavirus, Efemerovirus, Citorrabdovirus e Nucleorrabdovírus. Vírus de interesse incluem vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva, vírus mokola, vírus da febre efémera bovina. uma proteína de togaviridae. Togaviridae incluem os Alfavírus e Rubivírus. Vírus de interesse incluem vírus Sindbis, vírus da encefalite ocidental e oriental, vírus da floresta de Semliki, vírus da rubéola, vírus Aura, vírus Babanki, vírus avis-A da floresta de Barmah, vírus bebaru, vírus Buggy Creek, vírus chikungunya, vírus dos Everglades, vírus de Fort Morgan, vírus getah, vírus de Highlands J, virus Kyzylagach, vírus Mayaro, virus Middelburg, vírus Mucambo, vírus Ndumu, vírus Ockelbo, vírus o'nyong-nyong, vírus Pixuna, vírus Ross River, vírus Sagiyama, Una vírus, vírus da encefalite equina da Venezuela e virus Whataroa. uma glicoproteína de envelope ("E' ) de um flaviviridae. Flaviviridae inclui Flavivírus, Pestivírus e Hepacivírus. Vírus de interesse incluem vírus da dengue, vírus da hepatite C, vírus da febre amarela, vírus da 33 encefalite japonesa, vírus do oeste do Nilo, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da diarreia bovina e vírus da encefalite de origem em carrapato (TBE) . uma proteína de bunyaviridae. Bunyaviridae inclui os Buniavírus, Nairovírus, Flebovírus, Hantavírus, e Tospovírus. Vírus de interesse incluem buniavírus, vírus Bunyamwera, vírus da encefalite da Califórnia, vírus de La Cross, vírus Hantaan, vírus Sin Nombre, vírus da febre hemorrágica da Criméia-Congo, vírus da febre Sandfly Sicilian e vírus da febre de Rift valley. uma proteína de arenaviridae. Arenaviridae inclui vírus da coriomeningite linfocítica, vírus ippy e lassa vírus. uma proteína de hepadnaviridae (incluindo HBsAg). Hepadnaviridae inclui ortohepadnavírus e avihepadnavírus. Bem como vírus da hepatite B humana, essa família virai inclui vírus da hepatite B de esquilo da terra, virus da hepatite B da marmota, vírus da hepatite B de woolly monkey, vírus da hepatite B esquilo do árctico, vírus da hepatite B de pato, virus da hepatite B de garça, e virus da hepatite B de ganso Ross. uma proteína de herpesviridae. Herpesviridae inclui os Simplexvírus, Varicellovírus, Roseolovírus, Citomegalovírus, Muromegalovírus, Linfocriptovírus e Radinovírus. Virus de interesse incluem o vírus da herpes humana, incluindo Vírus do Herpes Simples (HSV), vírus Varicela-zoster (VZV), vírus de Epstein-Barr (EBV), Citomegalovírus (CMV), Herpesvirus Humano 6 (HHV6), Herpesvírus Humano 7 (HHV7), e Herpesvirus Humano 8 (HHV8) etc. Os antigénios adequados podem ser seleccionados de glicoproteinas gB, gC, gD e gH (por exemplo, em HSV) . HSV gD2 é particularmente preferido. - uma proteína de Orthomyxoviridae. Orthomyxoviridae inclui vírus influenza e vírus thogoto. Antigénios de vírus influenza são preferidos (vírus influenza A, B ou C), 34 incluindo hemaglutinina de antigénios de superfície (HA) e/ou neuraminidase (NA).

Esses antigénios de superfície virai são tipicamente purificados pela utilização de tensioactivos, e assim o componente antigénio pode incluir um tensioactivo, particularmente de presente numa forma particulada que inclui lípidos. A invenção é também útil com antigénios particulados a base de proteínas híbridas ou de fusão que compreendem um antigénio de superfície virai e um antigénio heterólogo. Por exemplo, sabe-se como fundir a sequência de HBsAg aos antigénios heterólogos para explorar a capacidade do HBsAg de montar partículas.

Por exemplo, a referência 63 relata fusões de HIV-1 gp 120 a HBsAg para dar uma proteína que se montou espontaneamente em partículas que se assemelham a partículas nativas de HBsAg em tamanho e densidade, consistentes com uma composição lipídica de aproximadamente 25 % e um conteúdo de gpl20 de aproximadamente 100 por partícula. 0 gpl20 foi capaz de se dobrar em sua conformação nativa na fusão e reteve sua actividade biológica. De modo similar, epítopos de HIV gp41 foram melhorados ao fazer fusões internas com HBsAg, e a proteína de fusão auto-montada em partículas de lipoproteína de 22 nm [64].

Essa abordagem também foi utilizada para vacinas de malária. A Referência 65 relata que epítopos de até 61 aa do antigénio de malária gpl90 foram inseridos na sequência de HBsAg, e que as partículas híbridas expressas podem provocar uma resposta imune anti-gpl90 em animais. A Referência 66 relata uma proteína que tem 16 repetições de uma sequência de 4-mer da proteína de circunsporozoíta expresso como proteína de fusão com HBsAg. A Referência 67 relata a produção em levedura de partículas semelhantes a vírus compostas de Pfsl6 fundido a HBsAg. A Referência 68 35 revela um antigénio híbrido em que a proteína de circunsporozoíta é fundida a HBsAg. A Referência 69 revela uma fusão da região C-terminal da proteína 1 de superfície de merozoíto de P. vivax, que formou partículas imunogénicas de 20-45 nm de tamanho, a utilização de HBsAg para apresentação de antigénios de malária em forma particulada de auto-montagem é portanto, bem conhecido na técnica.

Portanto, a invenção pode ser utilizada com antigénios híbridos que compreendem um antigénio de superfície virai e um antigénio heterólogo. 0 antigénio heterólogo pode ser inserido na sequência de antigénio de superfície virai, ou pode ser fundido ao N-terminal ou C-terminal da sequência de antigénio de superfície virai. Se o antigénio de superfície virai nativo pode montar em partículas (por exemplo, HBsAg) então a inserção ou fusão não evitará essa montagem.

Nessas proteínas híbridas, o antigénio heterólogo pode ser de uma bactéria, de um fungo, de um parasita, de um vírus (mas, por definição, o antigénio heterólogo não é HBsAg) etc. É possível incluir um antigénio heterólogo completo na proteína híbrida, mas é mais usual incluir um fragmento antigénico do antigénio.

Particularmente quando o antigénio de superfície virai é HBsAg, o antigénio heterólogo pode ser de HIV, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariaeou Plasmodium ovale. Os antigénios de HIV adequados para fazer híbridos de HBsAg incluem glicoproteína de envelope gpl2 0 ou fragmentos antigénicos desses [63]. Os antigénios adequados de P. falciparum para fazer híbridos de HBsAg podem ser com base numa subunidade do antigénio de superfície de circunsporozoíta ("CSP"), por exemplo, eles podem incluir entre 3 e 20 repetições de seu motivo NANP (SEQ ID N°: 2), e/ou eles podem incluir a região C-terminal de CSP (mas tipicamente não incluindo os 12 aminoácidos 36 finais do C- terminal). Por exemplo, a invenção pode utilizar o antigénio conhecido como "RTS", que contém uma grande porção do C- terminal de CSP de NF54 ou 7G8 isolado de P. falciparum (aminoácidos 210 a 398, que incluem 19 repetições NANP e a região de epitopo de célula T nos aminoácidos 367 a 390), fundido ao N-terminal de HBsAg em quatro aminoácidos da porção preS2 de HBsAg. Quando é expresso em levedura, RTS forma partículas que incluem lípidos (primariamente fosfolípido) além da proteína. A sequência de RTS pode assim conter: (i) um resíduo de metionina N-terminal; (ii) Met-Ala-Pro; (iii) 189 aminoácidos que correspondem aos aminoácidos 210-398 de proteína CS de P. falciparum 7G8 ou aos aminoácidos 207-395 de proteína CS de P. falciparum NF54; (iv) Arg ou Gly; (v) Pro-Val-Thr-Asn de proteína Pré- S2 de hepatite B; e (vi) HBsAg. do isolado 7G8, RTS de comprimento total tem a sequência dada como Id. de SEQ ID N°: 1 na referência 70 (veja-se também a Figura 5 da referência 71):

VSU KPG5ANKPKD EfQYENDI EKKI CKMtKCS SvfNWNSRPVTKMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQS LDSM‘.TSLNFLCG8PVCLGqWSQSFTSNHãPTSCPPICPGYRWMÇLRRFXrFLFrLLLCLIFLÍVLLBYQGMLPVC PtlPGSTTTNTCPCKTCrrPA^fíSMFPSCCCrkPTDGNanCXPXPSSmFAKYl.WÊWASVRFSWLSLLYPFVqWF VGLSPTVWLSA.tWWíWYWGPSLYSíVSPPIPLLPIFPCi.WVYX {SEQ IO W:IJ A proteína híbrida pode ser expressa em levedura, utilizando uma sequência que codifica SEQ ID N°:l. É preferível co-expressar a proteína híbrida em levedura com HBsAg normal. Essa abordagem foi previamente utilizada com RTS, e o produto de co-expressão é referido como "RTS,S". uma razão de RTS: S de aproximadamente 1:4 é útil. A expressão em levedura S. cerevisiae é preferida, utilizando um plasmídeo que tem uma sequência que codifica a proteína híbrida, e que inclui: (1) um promotor a montante de um gene de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, para controle da expressão da sequência codificadora; e (2) um terminador de transcrição ARG3 a jusante da sequência codificadora. Os plasmídeos também incluirão tipicamente: 37 (3) um marcador de selecção de LEU2; (4) uma sequência de plasmídeo de 2μ.; e (5) uma origem de replicação funcional em Escherichia coli. RTS,S pode ser combinado com outros antigénios de malária, como proteína anónima relacionada a trombospondina (TRAP). Um adjuvante gordo preferido para utilização com RTS,S inclui uma emulsão óleo em água, 3d-MPL e uma saponina QS- 21.

Razão de adjuvante gordo e tensioactivo A razão de peso na composição do adjuvante gordo para o tensioactivo do antigénio é menor que 1.000:1.

Para um adjuvante MF59, a razão de peso baseia-se na quantidade de esqualeno. Para uma composição que contém 0,1 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio, a concentração de esqualeno será menor que 100 pg/ml. Para uma composição que contém 1 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio, a concentração de esqualeno será menor que 1 mg/ml. Para uma composição que contém 10 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio, a concentração de esqualeno será menor que 10 mg/ml, enquanto a concentração de esqualeno numa composição típica de adjuvante MF59 seria de 43 mg/ml (ou seja, 4.300:1).

Para um adjuvante 3D-MPL, a razão de peso baseia-se na quantidade de total de 3D-MPL, isto é, incluindo todas as formas diferentes de acil que podem estar presentes. Para uma composição que contém 0,1 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio, a concentração total de 3D-MPL será menor que 100 pg/ml. Para uma composição que contém 1 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio, a concentração total de 3D-MPL será menor que 1 mg/ml. A razão de 1.000:1 é uma máxima. Para também reduzir o potencial para interferência entre óleo num adjuvante e tensioactivo num antigénio, a razão pode ser reduzida. Assim a razão pode ser <500:1, <400:1, <300:1, <200:1, <100:1, <50:1, ou ainda <25:1. numa razão <100:1, a 38 composição que contém 10 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio deve ter um conteúdo de óleo (por exemplo, conteúdo de esqualeno ou 3D-MPL) de 1 mg/ml. numa razão <25:1, a composição que contém 10 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio deve ter um conteúdo de óleo (por exemplo, conteúdo de esqualeno ou 3D- MPL) <250 pg/ml; inversamente, a composição que compreende 100 pg/ml de 3D-MPL deve ter não menos que 4 pg/ml de tensioactivo como parte do antigénio. A razão é preferentemente maior que 1.5:1 por exemplo >2:1, >2,5:1, >3:1, >4:1, >5:1 OUmais.

Para 3D-MPL, uma razão entre 2,5:1 e 25:1 é preferida, mais preferentemente entre 2,5:1 e 10:1, e ainda mais preferentemente entre 2,5:1 e 5:1. Assim, a composição que contém 10 pg/ml de tensioactivo num componente antigénio deve ter um conteúdo de 3D-MPL entre 25 pg/ml e 250 pg/ml, preferentemente entre 25 pg/ml e 100 pg/ml, e ainda mais preferentemente entre 25 pg/ml e 50 pg/ml; inversamente, a composição que compreende 100 pg/ml de 3D-MPL deve incluir um antigénio que tem um conteúdo de tensioactivo entre 4 pg/ml e 40 pg/ml, preferentemente entre 10 pg/ml e 40 pg/ml, e ainda mais preferentemente entre 20 pg/ml e 40 pg/ml. A composição imunogénica

Assim como contendo antigénio e um adjuvante gordo (e, um baixo nivel de tensioactivo), as composições da invenção podem compreender portadores, adjuvantes, excipientes, tampões etc., como descrito em maiores detalhes abaixo. Esses componentes não antigénicos podem ter várias fontes. Por exemplo, eles podem estar presentes num dos materiais de antigénio ou adjuvante que serão utilizados durante o fabrico ou podem ser adicionados separadamente daqueles componentes.

Composições preferidas da invenção incluem um ou mais portadores e/ou excipientes farmacêuticos. 39

Para controlar a tonicidade, é preferível incluir um sal fisiológico, como um sal de sódio. Cloreto de sódio (NaCl) é preferido, que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml.

As composições terão geralmente uma osmolalidade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, e estarão mais preferentemente no intervalo de 280-320 mOsm/kg. A osmolalidade foi previamente relatada como não tendo um impacto sobre a dor causada pela vacinação [72], mas manter a osmolalidade nesse intervalo é, não obstante, preferível.

As composições da invenção podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Tampões serão tipicamente incluídos no intervalo de 5-50 mM, e preferentemente no intervalo de 5-20 mM. 0 pH da composição da invenção será geralmente entre 5,0 e 7,5, e mais tipicamente entre 5,0 e 6,0 para estabilidade óptima, ou entre 6,0 e 7,0. 0 processo da invenção pode assim incluir uma etapa de ajuste do pH da vacina antes da embalagem dela em contentores de dosagem. A vacina que contém toxóides diftéricos e tetânicos preferentemente tem um pH >6, para evitar o risco de reversão de toxicidade nos toxóides (particularmente no toxóide diftérico) , e assim a vacina que contém toxóides e antigénios HBsAg têm preferentemente um pH entre 6,0 e 7,0. para outras vacinas, incluindo vacinas monovalentes de HBsAg, um pH <6 pode ser aceitável.

As composições da invenção são preferentemente estéreis.

As composições da invenção são preferentemente não pirogénicas, por exemplo, contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e preferentemente <0,1 EU por dose. 40

As composições da invenção são preferentemente livres de glúten.

Se HBsAg absorvido é utilizado, o produto da vacina final pode ser uma suspensão com uma aparência turva. Essa aparência significa que contaminação microbiana não é facilmente visível, e assim a vacina preferentemente contém um agente antimicrobiano. Isso é particularmente importante quando a vacina é empacotada em contentores de multidose. Conservantes preferidos para inclusão são 2-fenoxietanol e/ou timerosal. É recomendado, no entanto, não usar conservantes mercuriais durante o processo da invenção, embora timerosal seja encontrado em várias vacinas de HBV existentes. Para segurança, no entanto, é preferível que a composição final contenha menos que aproximadamente 25 ng/ml de mercúrio. Mais preferentemente, o produto da vacina final mão deve conter timerosal detectável. Isso será geralmente atingido por remoção do conservante mercurial de uma preparação de antigénio antes de sua adição no processo da invenção ou ao evitar a utilização de timerosal durante a preparação dos componentes utilizados para fazer a composição. HBsAg pode ser submetido a diálise (por exemplo, com cisteína) para remover quaisquer conservantes mercuriais como timerosal que pode ter sido utilizado durante a preparação do HBsAg [73, 74].

Durante o fabrico, a diluição dos componentes para dar concentrações finais desejadas será comummente realizada com WFI (água para injecção). A concentração de qualquer fosfato de alumínio na composição da invenção, expressa em termos de Al3+, é preferentemente menos que 5 mg/ml por exemplo <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml etc. A concentração de HBsAg na composição da invenção é preferentemente menos que 100 pg/ml, por exemplo, <90 pg/ml, <80 pg/ml, <70 pg/ml, <65 pg/ml, <60 pg/ml, <55 pg/ml, <50 pg/ml, <45 pg/ml, <40 pg/ml etc. A concentração 41 de aproximadamente 40 pg/ml ou aproximadamente 20 pg/ml é típica.

As composições da invenção são preferentemente administradas a pacientes em doses de 0,5 ml. Referências a doses de 0,5 ml doses devem incluir variância normal, por exemplo, 0,5 ml + 0,05 ml. A invenção pode fornecer material de carga que é adequado para embalagem em doses individuais, que ser então distribuído para administração a pacientes. As concentrações mencionadas anteriormente são tipicamente concentrações em dose empacotada final, e assim, concentrações em vacina de volume podem ser maiores (por exemplo, para serem reduzidas às concentrações finais por diluição).

As composições da invenção estarão geralmente em forma aquosa.

Embalagem das composições da invenção

Depois da combinação do antigénio e adjuvante, os processos da invenção podem compreender uma etapa de extracção e embalagem de uma amostra de 0,5 ml da mistura num contentor. Para situações de multidose, as quantidades de múltiplas doses serão extraídas e empacotadas juntas num único contentor. Como mencionado anteriormente, numa disposição alternativa o antigénio e adjuvante são empacotados separadamente, para mistura extemporânea no momento da utilização.

Os processos da invenção podem compreender a etapa adicional de embalagem da vacina em contentores para utilização. Os contentores adequados incluem frascos e seringas descartáveis (preferentemente estéreis).

Quando a composição da invenção é empacotada em frascos, esses são preferentemente feitos de vidro ou de um material plástico. O frasco é preferentemente esterilizado antes da composição ser adicionada ao mesmo. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os frascos são 42 preferentemente selados com uma tampa livre de látex. 0 frasco pode incluir uma única dose de vacina, ou ele pode incluir mais de uma dose (um frasco de 'multidose' ) , por exemplo, 10 doses. Quando utiliza-se um frasco de multidose, cada dose deve ser retirada com uma agulha e seringa estéreis e sob condições assépticas estritas, tomando cuidado para evitar a contaminação do conteúdo do frasco. Os frascos preferidos são feitos de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um fecho de Luer) adaptada de modo que uma seringa pré-preenchida possa ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa pode ser expelido no frasco, e o conteúdo do frasco pode ser removido de volta para a seringa. Após a remoção da seringa do frasco, uma agulha pode ser então unida e a composição pode ser administrada a um paciente. A tampa é preferentemente localizada dentro de uma cobertura ou selo, de modo que a cobertura ou selo tenha que ser removido antes da tampa poder ser acessada.

Quando a composição é empacotada numa seringa, o que é preferível, a seringa não terá normalmente uma agulha unida a ela, embora uma agulha separada possa ser suprida com a seringa para montagem e utilização. Agulhas de segurança são preferidas. Agulhas de 1 polegada (2,54 cm) calibre 23, 1 polegada calibre 25 e 5/8 polegadas (1,3 cm) calibre 25 são típicas. As seringas podem ser fornecidas com rótulos destacáveis em que o número do lote e data de validade do conteúdo podem ser impressos, para facilitar a administração de registos. 0 êmbolo numa seringa preferentemente tem um tampo para evitar que o êmbolo seja acidentalmente removido durante a aspiração. Um tampo de êmbolo de borracha de butil é preferido. As seringas podem ter uma tampa de borracha de látex e/ou tampo. As seringas descartáveis contêm uma única dose da vacina. A seringa terá geralmente uma tampa de ponta para selar a ponta antes da anexação de uma agulha, e a tampa de ponta é 43 preferentemente feita de borracha de butil. Se a seringa e agulha são empacotadas separadamente, então a agulha é preferentemente ajustada com um proctetor de borracha de butil. Borracha de butil cinza é preferida. As seringas preferidas são aquelas comercializadas sob o nome comercial "Tip-Lok"™.

Quando um contentor de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco) é utilizado, então é preferível usar um contentor feito de um vidro de borossilicato em vez de um vidro de cal de soda.

Depois da composição ser empacotada num contentor, o contentor pode ser então colocado numa caixa para distribuição, por exemplo, dentro de uma caixa de cartolina, e a caixa será rotulada com detalhes da vacina, por exemplo, seu nome comercial, uma lista dos antigénios na vacina (por exemplo, "hepatite B recombinante" etc.), o contentor de apresentação (por exemplo, "Seringas Tip-Lok Descartáveis pré-preenchidas" ou "frascos de dose única de 10 x 0,5 ml"), sua dose (por exemplo, "cada um contendo uma dose de 0,5 ml"), recomendações (por exemplo, "para utilização adulta somente" ou "para utilização Pediátrica somente "), uma data de validade, uma indicação (por exemplo, "imunização activa contra infecção por virus da hepatite B (HBV) causada por todos os subtipos conhecidos para pacientes com insuficiência renal (incluindo pacientes de pré-hemodiálise e hemodiálise), de idade de 15 anos adiante" etc.), um número de patente etc. Cada caixa deve conter mais de uma vacina empacotada, por exemplo, cinco ou dez vacinas empacotadas (particularmente para frascos). Se a vacina é contida numa seringa então a caixa deve mostrar um retrato da seringa. A vacina pode ser distribuída juntamente (por exemplo, na mesma caixa) com um folheto informativo que contém detalhes da vacina, por exemplo, instruções para administração, detalhes do antigénios na vacina etc. As 44 instruções também podem conter advertências, por exemplo, para manter uma solução de adrenalina pronta disponível em caso de reacção anafilática após a vacinação etc. A vacina empacotada é preferentemente armazenada entre 2°C e 8°C. Ela deve não ser congelada. Métodos de tratamento e Administração da vacina

As composições da invenção são adequadas para administração a pacientes humanos, e a invenção fornece um método de despertar uma resposta imune num paciente, que compreende a etapa de administração da composição da invenção ao paciente. A invenção também fornece a utilização de (i) um antigénio de superfície virai purificado substancialmente na ausência de tensioactivo e (ii) um adjuvante gordo, no fabrico de um medicamento para administração ao paciente em que a razão de peso do adjuvante gordo em (ii) para tensioactivo em (i) é menor que 1.000:1.

As composições imunogénicas da invenção são preferentemente vacinas, por exemplo, para utilização na prevenção e/ou tratamento de infecção por vírus da hepatite B. Os pacientes que receberam composições da invenção preferentemente têm um título sérico anti-HBsAg GM >500 mIU/ml, medido 6 semanas depois da primeira imunização. Mais preferentemente, o título é >500 mIU/ml, quando medido depois de 12 meses.

As composições são particularmente úteis para a protecção contra e/ou tratamento de infecções por vírus da hepatite B em pacientes para os quais as vacinas de adjuvante existentes (como o produto ENGERIX B™) são ineficazes. Os subgrupos de pacientes para os quais as composições são particularmente adequadas incluem: pacientes imunocomprometidos; pacientes em hemodiálise; pacientes em pré-hemodiálise; pacientes com insuficiência renal; pacientes com falência renal; pacientes com falência renal precoce antes de necessitarem hemodiálise; pacientes 45 que esperam por transplante de fígado, por exemplo, em listas de espera; pacientes com falência renal de estágio final; pacientes que receberam um transplante de órgão (particularmente um transplante de fígado), por exemplo, no período de 6 meses que precede a primeira dose da vacina da invenção; pacientes que recebem (ou receberam, por exemplo, no período de 6 meses que precede a primeira dose da vacina da invenção) tratamento com imunoglobulina para hepatite B (HBIg); pacientes com um haplótipo HLA DQ2 [75]; pacientes com um haplótipo HLA DR3 [75] ; pacientes com um haplótipo HLA DR7 [75]; pacientes com o alelo de HLA DQB1*0202 [76] pacientes infectados com HIV; portadores crónicos de HBV pacientes que receberam recentemente transfusão sanguínea pacientes que receberam medicamentos imunossupressores pacientes que sofrem de SIDA; pacientes com ascite pacientes com cirrose; pacientes com encefalopatia, pacientes que recebem terapia com interferão, e em particular ifn-α; pacientes que fumam cigarros; pacientes que fumam charutos; pacientes com um índice de massa corporal >30 kg/m2; e pacientes que receberam uma vacina de HBsAg mas não foram soroconvertidos (por exemplo, eles têm um título sérico anti-HBsAg <10 mIU/ml após um esquema de dosagem padrão primário, como 3 doses de ENGERIX B™)

Esses pacientes podem ter uma taxa de depuração de creatinina menor que 30 ml/min (o intervalo saudável normal sendo -100-140 ml/min em homens e 90-130 ml/min em mulheres). Os pacientes têm preferentemente pelo menos 15 anos de idade, por exemplo, entre 15-40 anos, entre 15-60 anos, entre 40-60 anos, ou mesmo acima de 60. Os pacientes com mais de 55 podem ser tratados a despeito de qualquer doença subjacente.

As composições da invenção podem ser administradas por injecção intramuscular, por exemplo, no deltoide.

Quando as composições da invenção incluem um adjuvante a base de alumínio, um depósito dos componentes pode 46 ocorrer durante o armazenamento. A composição deve ser, portanto, agitada antes da administração a um paciente, a composição agitada será uma suspensão branca turva. Processos preferidos e vacinas da invenção

Um processo preferido para a preparação de uma composição imunogénica compreende as etapas de combinação de (i) um componente HBsAg que inclui polisorbato 20 e (ii) um componente adjuvante que compreende 3D-MPL adsorvido a um fosfato de alumínio, para dar uma composição em que a razão de peso de 3D-MPL para polisorbato 20 é menor que 1.000:1.

Uma composição imunogénica preferida é uma em que: (a) a composição compreende HBsAg, polisorbato 20, 3D-MPL e um adjuvante de fosfato de alumínio; e (b) a razão de peso do 3D-MPL para polisorbato 20 é menor que 1.000:1. 0 3D-MPL e o HBsAg são preferentemente adsorvidos ao fosfato de alumínio. A concentração de HBsAg é de aproximadamente 40 pg/ml. A concentração de 3D-MPL é aproximadamente 100 pg/ml. A concentração de AI3"1" é aproximadamente 1 mg/ml.

Uma outra composição preferida da invenção compreende (i) HBsAg, purificado de S. cerevisiae, e (ii) um adjuvante que compreende uma mistura de fosfato de alumínio e 3D-MPL. A concentração de HBsAg é de aproximadamente 40 pg/ml. A concentração de 3D-MPL é aproximadamente 100 pg/ml. A concentração de Al3+ é aproximadamente 1 mg/ml. HBsAg inclui polisorbato 20, e a razão de peso óleo:tensioactivo (ou seja, a razão de peso de 3D-MPL:polisorbato 20) é entre 2,5:1 e 100:1 ou seja, o polisorbato 20 está presente num nível entre 1 pg/ml e 40 pg/ml (ou seja, entre 2,5 pg e 100 pg de polisorbato 20 por 100 pg de HBsAg) . A razão é preferentemente entre 2,5:1 e 25:1 ou seja, o polisorbato 20 está presente num nível entre 4 pg/ml e 40 pg/ml. O 3D-MPL e o HBsAg são ambos adsorvidos ao fosfato de alumínio. Geral 47 0 termo "que compreende" abrange "que inclui" bem como "que consiste", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando for necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção. 0 termo "aproximadamente" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x ± 10 %. A menos que especificamente determinado, um processo que compreende uma etapa de mistura de dois ou mais componentes não requer qualquer ordem especifica de mistura. Assim, componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Quando há três componentes então dois componentes podem ser combinados um com o outro e então a combinação pode ser combinada com o terceiro componente etc. Como descrito anteriormente, os componentes podem ser misturados durante o fabrico ou extemporaneamente no momento da utilização.

Quando um antigénio é descrito com sendo "adsorvido" a um adjuvante, é preferível que pelo menos 50 % (em peso) daquele antigénio seja adsorvido, por exemplo, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou mais. É preferível que HBsAg seja totalmente adsorvido, isto é, nenhum seja detectável no sobrenadante.

Quando materiais animais (e particularmente bovino) são utilizados na cultura de células, eles devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), e em particular livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE).

As borrachas de butil incluem borrachas de clorobutil e bromobutil. 48

Deve ser percebido que grupos ionizáveis podem existir na forma neutra mostrada nas fórmulas no presente documento, ou podem existir em forma carregada, por exemplo, dependendo do pH. Portanto, um grupo fosfato pode ser mostrado como -P-0- (OH) 2, essa fórmula é meramente representativa do grupo fosfato neutro, e outras formas carregadas são abrangidas pela invenção. De modo similar, anéis de açúcar podem existir em forma aberta e fechada e, embora formas fechadas sejam mostradas em fórmulas estruturais no presente documento, formas abertas são também abrangidas pela invenção.

MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO

Três diferentes preparações de HBsAg foram estudadas: HBsAg expresso em células de S. cerevisiae, purificado com a utilização de tensioactivo não iónico. HBsAg expresso em células de levedura Hanensula, purificado com a utilização de tensioactivo não iónico. HBsAg expresso em células CHO, com sequência preS2, purificado sem a utilização de tensioactivos.

Dois adjuvantes diferentes foram estudados:

Hidróxido de alumínio (1 mg/ml) MF59 em tampão de citrato (13 mM)

Seis formulações foram preparadas, cada um com 20 pg/ml de HBsAg, 0,15 M deNaCl e 0,01 % de mertiolate: A B C D E F HBsAg CHO CHO Hanensula Hanensula S.cerevisiae S.cerevisiae Adjuvante AI Hydrox MF59 AI Hydrox MF59 AI Hydrox MF59 NaCl 0, 15M 0, 15 M 0, 15M 0, 15M 0, 15M 0, 15M Mertiolate 0,01% 0, 01 % 0, 01 % 0, 01 % 0, 01 % 0,01 % Tensioactivo — — + + + + MF59 foi relatado por melhorar a resposta de anticorpo em primatas a HBsAg recombinante [77]. As formulações A a D foram utilizadas para imunizar macacos verdes africanos. Grupos de 6 macacos foram imunizados por via intramuscular no dia 0 e dia 28. Sangue foi colhido no tempo 0 e então a 49 49 cada 2 semanas até a semana 8, e os títulos de anti-HBsAg (GMT) foram medidos por ELISA. Os títulos foram normalizados a 1,0, que foi o valor do dia 14 em cada grupo, e os resultados normalizados foram como se segue: A B C D Hospedeiro CHO CHO Levedura levedura Adjuvante AI Hydrox MF59 AI Hydrox MF59 Tensioactivo — + + Dia 14 1,0 1,0 1,0 1,0 Dia 28 0,9 0, 8 1,3 0,4 Dia 42 19, 2 159, 8 108, 8 85, 2 Dia 56 10, 8 32, 6 61, 3 24, 5

Observando os títulos do dia 42 e dia 56, esses dados mostram que o adjuvante MF59 aumentou os títulos muito mais marcadamente que o adjuvante de alumínio para antigénio expresso em CHO (aumento de 160 vezes vs. aumento de 20 vezes no dia 42), mas a situação foi revertida para o antigénio expresso em Hanensula (aumento de 85 vezes vs. aumento de 110 vezes no dia 42). A B E F Tensioactivo + + Adjuvante AI Hydrox MF59 AI Hydrox MF59 Dia 14 - 13,5 4,5 1,0

Experiências similares foram realizadas em babuínos, com a utilização das formulações B, E e F. Os valores de GMT foram medidos 14 dias após a primeira injecção e, em relação ao valor do grupo F, como se segue:_

Aqui, a utilização de MF59 em vez do adjuvante de alumínio leva a uma resposta menor de GMT (comparar grupos E e F) , enquanto um aumento deva ser esperado (grupo B e referência 77) .

As respostas de anti-HBsAg 28 dias depois da primeira injecção com a utilização das formulações E e F foram também comparadas em macacos rhesus, macacos verdes africanos e ratinhos C3H (NB: ratinhos receberam 60 % da 50 50 dose de HBsAg) . Bem como medindo os valores de GMT, o número daqueles que respondem foi também medido, isto é, animais que mostram um titulo >10 mIU/ml. Os resultados, normalizados ao grupo F, foram como se segue:_ GMT Respondedores E F E F Adjuvante Al Hydrox MF59 Al Hydrox MF59 Rhesus 4,2 1,0 60 % 20 % AGM 110,0 1,0 100 % 50 % Ratinho 0,1 1,0 94 % 100 %

Em contraste com os ratinhos, portanto, a utilização de MF59 como o adjuvante em primatas resultou numa diminuição substancial tanto em valores de GMT quanto nos niveis de respondedores para o HBsAg expresso em S. cerevisiae.

Grupo Adjuvante Aumento (x) E Al Hydrox 91,5 x F MF59 19,1 x

Finalmente, o aumento em GMT que resulta da vacinação de reforço com as formulações E e F foi medido em macacos verdes africanos seropositivos. Os títulos foram medidos antes da dose de reforço e então novamente 28 dias depois, e o aumento em títulos foi como se segue:_

Bem como dando um menor aumento em vezes que o adjuvante de hidróxido de alumínio, MF59 gerou um menor valor de GMT 28 dias após a dose de reforço.

No geral, portanto, MF59 parece ser um pior adjuvante que hidróxido de alumínio para HBsAg expresso em levedura em primatas, mas um melhor adjuvante para HBsAg expresso em CHO. Esses resultados podem ser explicados por uma interacção entre (a) tensioactivo residual em HBsAg purificado de levedura e (b) excesso de óleo de esqualeno 51 no adjuvante de MF59. Como um óleo, esqualeno é submetido à acção de tensioactivos em condições aquosas, e vice versa, e é proposto que o tensioactivo no antigénio seja incompatível com o óleo no adjuvante. Essa incompatibilidade pode ser solucionada com a purificação do HBsAg sem a utilização de detergentes (por exemplo, como no material expresso em CHO) , ou ao assegurar que o óleo não esteja presente num tal excesso que interfira com o tensioactivo no antigénio.

Numa composição de HBsAg com adjuvante MF59, um volume de MF59 é combinado com um volume de solução de antigénio.

Num volume de 100 ml, haverá assim, 50 ml de MF59 e 50 ml de HBsAg em solução. Esses 100 ml contêm 2,15 g de esqualeno do MF59 e, numa concentração de HBsAg de 40 pg/ml, contém 2 mg de HBsAg. Numa concentração de polisorbato 20 de 25 pg por 100 pg de HBsAg [35], os 100 ml contêm 0,5 mg de polisorbato 20. A razão óleo:tensioactivo numa vacina típica de adjuvante MF59 é assim 4300:1. Por meio da redução do excesso de óleo para menos que 1000:1, a interacção entre óleo no adjuvante e tensioactivo no antigénio pode ser substancialmente reduzida, dessa forma reduzindo a interferência.

Deve ser entendido que a invenção foi descrita somente por via de exemplo e que podem ser feitas modificações, embora permanecendo dentro do âmbito e espírito da invenção. REFERÊNCIAS (cujos conteúdos são aqui incorporados por referência) [1] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 de Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. 0'Hagan.

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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> NOVARTIS VACCINES AND MAGNOSTICS SRL CONTORNI Mario

<150> REDUÇÃO DE INTERFERÊNCIA ENTRE ADJUVANTES QUE CONTÊM

ÓLEO E ANTIGÉNIOS QUE CONTÊM TENSIOACTIVOS

<130> PD41598WO

<140> PCT/IB2006/YYYYYY <141> 02-08-2006 <150> GB-0515906.6 <151> 02-08-2005 <150> GB-0522599.0 <151> 04-112-005 <150> GB-0523923.1 <151> 24-11-2005 <16 0>2

<170> SeqWin99, versão 1.02 <210> 1 <211>4 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 1 Àsn Ala Asn Pro 1

<210>2 <211>423 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum 400> 2 56 riet Met Ala Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 S 10 15

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala ao 25 30

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 35 40 45

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 5D 55 bO

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

t>5 70 75 flO

Asn Pro Asn Lys Asn Asn Gin Gly Asn Gly Gin Gly His Asn Met Pro AS <50

Asn Asp Pro Asn Arg Asn Vai Asp Glu Asn Asn Ala Asn Asn Ala Vai 100 105 110

Lys Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His Ile Glu 61n Tyr 57 115 iso 155

Leu Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser 130 135 140

Vai Thr Cys Gly Asn 61y Ile Gin Vai Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala

145 15D 155 IbO

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Ile Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser Vai Phe Asn Vai Vai Asn Ser y 1&0 IflS Π0

Arq Pro Vai Thr Asn flet Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro ns SOO 205

Leu Leu Vai Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr

310 215 22D

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Ile Pro biπ ^ 23f f 235 240 riu Cor Pro Vai Cys Leu Gly Gin Asn Ser Gin Ser Pro Thr Ser Asn

Gly ser rro ^ 250 255

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Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr 3D5 310 315 320

CyS Thr Thr pro Ala Gin Gly Asn Ser flet Phe Pro Ser Cys Cys Cys y 325 330 335

Thr Lvs Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser

y 3110 345 35D

Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Vai Arg Phe Ser

3bD 3LS

Trp Leu Ser Leu Leu Vai Pro Phe Vai Gin Trp Phe Vai Gly Leu Ser 370 375 3fi0

Pro Thr Vai Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 3fl5 310 3^5 400

Cor 1 pij Tur Ser Ile Vai Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe

Ser Leu Tyr ^ M1D 43,5

Phe Cys Leu Trp Vai Tyr Ile 420 58

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9843670 A [0002] • WO 9014837 A [0152] • US 6299884 B [0152] • US 6451325 B [0152] • WO 9511700 A [0152] • US 6080725 A [0152] • WO 2005097181 A [0152] • GB 2220211 A [0152] • WO 9421292 A [0152] • WO 9400153 A [0152] • WO 9701640 A [0152] • WO 9626741 A [0152] • WO 9319780 A [0152] • US 6375945 B [0152] • WO 0000462 A [0152] • US 6764840 B [0152] • US 20050107600 A [0152] • WO 03011223 A [0152] • US 20050215517 A [0152] • US 4857317 A [0152] • US 4683294 A [0152] • WO 9010058 A [0152] • JP 63239234 B [0152] • US 4694074 A [0152] • EP 0341733 A [0152] • US 5242812 A [0152] 59 • RU 2128707 [0152] • US 5928902 A [0152] • WO 9310152 A [0152] • WO 0212287 A [0152] • WO 03066094 A [0152] • GB 2006YYYYYY W [0153] • GB 0515906 A [0153] • GB 0522599 A [0153] • GB 0523923 A [0153]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 de Methods in Molecular Medicine series). vol. 42 [0152] • Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach.

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Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a preparação de uma composição imunogénica que compreende as etapas de combinação de (i) um componente antigénio de superfície virai que inclui um tensioactivo e (ii) um componente adjuvante gordo, para se obter uma composição em que a razão de peso entre o adjuvante gordo e o tensioactivo é menor que 1.000:1.

2. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que o adjuvante gordo compreende um óleo metabolizável. 3. 0 processo de acordo com a reivindicação 2, em que o adjuvante gordo compreende uma emulsão óleo em água submicrométrica de esqualeno e polisorbato 80. 4. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que o adjuvante gordo compreende uma molécula que compreende um grupo de ácido gordo. 5. 0 processo de acordo com a reivindicação 4, em que o adjuvante gordo é um monofosforil lípido A 3-desoxiacilado ("3D- MPL"). 6. 0 processo de acordo com a reivindicação 5, em que o 3D-MPL é uma mistura de moléculas que variam em sua acilação. 7. 0 processo de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6, em o adjuvante gordo inclui: 2

em que o 8. Ο reivindicações 5 a 7, partículas. qualquer 3D-MPL está na uma das forma de 9. 0 processo de acordo com a reivindicação 8, em que as partículas podem ser esterilizadas por filtração. 10. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, em que o 3D-MPL está em combinação com um sal de alumínio. 11. 0 processo de acordo com a reivindicação 10, em que o sal de alumínio é um fosfato de alumínio. 12. 0 processo de acordo com a reivindicação 11, em que o 3D-MPL é adsorvido sobre o sal de alumínio.

13. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o tensioactivo é um éster de polioxietileno sorbitano. 3 14. 0 processo de acordo com a reivindicação 13, em que o éster é polisorbato 20.

15. O processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que a concentração de tensioactivo é de não mais que 50 pg/ml.

16 . O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o antigénio de superfície virai é um antigénio de superfície de hepatite B em partículas ("HBsAg"), purificado na presença de tensioactivo.

17. O processo de acordo com a reivindicação 16, em que o HBsAg é expresso numa célula de levedura.

18. O processo de acordo com a reivindicação 17, em que a levedura é Saccharomyces cerevisíae. 19. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, em que o HBsAg é não glicosilado e/ou inclui fosfatidilinositol.

20. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, em que o HBsAg é do subtipo adw2 do vírus da hepatite B.

21. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o antigénio é uma proteína híbrida que compreende um antigénio de superfície virai e um antigénio heterólogo.

22. O processo de acordo com a reivindicação 21, em que o antigénio de superfície virai é HBsAg e o antigénio heterólogo é um antigénio de malária. 4 23. 0 processo de acordo com a reivindicação 22, em que a proteína híbrida compreende HBsAg e um fragmento da proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum. 24. 0 processo de acordo com a reivindicação 23, em que a proteína híbrida compreende uma porção C-terminal de uma proteína circunsporozoíta de P. falciparum de Plasmodium falciparum, quatro ou mais repetições em tandem da região imunodominante da proteína circunsporozoíta e HBsAg. 25. 0 processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a razão de peso entre o adjuvante gordo e o tensioactivo é menor que 500:1.

26. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a razão de peso entre o adjuvante gordo e o tensioactivo é menor que 50:1.

27. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o adjuvante gordo é um 3D-MPL e a razão de peso entre o adjuvante gordo e o tensioactivo é entre 2,5:1 e 25:1.

28. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a composição tem uma osmolalidade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg. 29. 0 processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a composição inclui um tampão de fosfato.

30. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a composição tem um pH entre 6,0 e 7,0. 5

31. A utilização de (i) um componente de antigénio de superfície virai que inclui um tensioactivo e (ii) um adjuvante gordo no fabrico de um medicamento para administração a um paciente, em que a razão de peso entre o adjuvante gordo em (ii) e o tensioactivo em (i) é menor que 1.000 :1.

32. Um processo para a preparação de uma composição imunogénica que compreende as etapas de combinação de (i) um componente HBsAg que inclui polisorbato 20 e (ii) um componente adjuvante que compreende 3D-MPL adsorvido a um fosfato de alumínio, para se obter uma composição em que a razão de peso entre 3D- MPL e polisorbato 20 é menor que 1.000:1.

33. Uma composição imunogénica em que: (a) a composição compreende HBsAg, polisorbato 20, 3D- MPL e um adjuvante de fosfato de alumínio em que o polisorbato 20 é incorporado nas partículas de HBsAg durante a purificação; e (b) a razão de peso entre 3D-MPL e polisorbato 20 é menor que 1.000 :1.