JP3026029B2 - 組換え水痘ウイルスとその作製法 - Google Patents

組換え水痘ウイルスとその作製法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換え水痘ウイルスとそ
の作製法に関するものであり、これより得られる組換え
水痘ウイルスとその抗原並びにゲノムＤＮＡは、ワクチ
ン、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、遺伝子工学試薬等
として利用できる。
【０００２】
【従来の技術】（第１−３行は変更なし；第４−５行の
記載を次の通り変更する）によるウサギやマウスのβ−
グロビンの生産［Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２７
７，１０８−１１４，１９７９；同上， ２８１，３５
−４０，１９７９］等において散見される。そして、１
９８０年、ＷＨＯ（世界保健機構）総会が、（以下の行
は変更なし）
【０００３】ＶＺＶは通常その感染性が生細胞内でのみ
維持される細胞依存性ウイルス（ cell-associated vir
us) であり、該ウイルスの分離、試験管内での培養・継
代、及び量産はいずれも困難であるため、ＶＺＶワクチ
ン及び診断剤の開発は言うに及ばず、水痘の病原体とし
てのＶＺＶの基礎及び臨床研究は躊躇される傾向にあっ
た。そのため、ＶＺＶの研究は、本発明者らが1975年に
細胞遊離（cell-free）の、水痘生ワクチン用の弱毒Ｖ
ＺＶ岡株を確立するまで、遅々として進展していなかっ
た（ Biken Journal, 23, 53-55, 1975; 特公昭51-190
18; 特公昭 53-41292;特公昭56-42144）。しかし、上記
の弱毒ＶＺＶ岡株を用いる生ワクチンの開発が契機とな
り、爾来、世界各地でＶＺＶの基礎と臨床並びに応用研
究が急速に展開され、現在では、この弱毒ＶＺＶ岡株を
有効成分として用いる水痘生ワクチンが世界各国で広く
実用に供されている［Requirements for Varicella Vac
cine (Live) Adopted 1984: WHO Technical Report Ser
ies, No.725, pp.102-124,1985 。また、ＶＺＶの基
礎、臨床、診断、疫学等に係る膨大なデータも既に蓄積
されており［“Virology”，vol.2, pp.2011-2054, B.
N. Fieldsら編，RavenPress (USA) 1990年発行］、就
中、ＶＺＶゲノムの構造解析に関しては、１９８０年代
に入り、遺伝子のクローニングとその発現、モノクロー
ナル抗体等の技術の開発と普及に伴い、ＶＺＶゲノムＤ
ＮＡの制限酵素地図作成や全塩基配列決定等（Journal
of Genaral Virology, 67, 1759-1816, 1986; 同上， 6
7, 1817-1829, 1986; ウイルス，37, 71-80, 1987 ）に
より、長足の進歩を遂げている。ところで、上記の文献
に基づくＶＺＶに関するウイルス学上の主な知見は次の
通りである。
【０００４】ＶＺＶは、エンベロープを有し、分類学的
には単純ヘルペスウイルス群、即ち、ヘルペスウイルス
科アルファヘルペス亜科に属する直径が約 180-200 nm
のＤＮＡ型ウイルスである。そのゲノムは、約 120 kb
(kilobase)の２本鎖で線状のＤＮＡからなり、ヌクレオ
キャブシド内部の直径約 75 nmのドーナツ状のコアに内
在している。該ゲノムＤＮＡは、ユニークな配列（Ｕ）
の長いセグメント（ＵL）と短いセグメント（ＵS）、Ｕ
Lに隣接するterminal repeat （ＴＲ）配列（ＴＲL）と
ＵSに隣接の配列（ＴＲS）、及びこれ等の各ＴＲに相補
的で塩基配列の方向が逆向きの２つの inverted repeat
（ＩＲ）、すなわちＴＲLに相補的なＩＲL、及びＴＲS
に相補的なＩＲSからなっている。そして、これ等の６
断片は、５´から３´末端の方向に、ＴＲL・ＵL・ＩＲ
L・ＩＲS・ＵS・ＴＲSの順に並んでいる。また、現在、
合計７１個のＯＲＦ(open reading frame)が５´末端か
ら順に１から７１まで番号付けされており、これ等の遺
伝子のうち、機能が確認または推定されているものは次
の２１ＯＲＦである［尚、下記（数字）はＯＲＦ番号を
それぞれ意味する］：(4) 早期蛋白、(8) デオキシウリ
ジントリホスファターゼ、 (10) ｔｒａｎｓ誘導蛋白、
(13)チミジン合成酵素、(14)糖蛋白（以下ｇｐと略記す
る）Ｖ、(18)ポヌクレオチド還元酵素小サブニット、(1
9)ポヌクレオチド還元酵素大サブニット、(28)ＤＮＡ合
成酵素、(29)ＤＮＡ結合蛋白、(31)ｇｐII、(36)チミジ
ンキナーゼ（以下ｔｋと略記する）、(37)ｇｐIII 、(4
0)キャブシド蛋白、(48)エキソヌクレアーゼ、(62, 71)
早期蛋白、(63, 70)早期蛋白、(66)プロティンキナー
ゼ、(67)ｇｐIV、及び(68)ｇｐＩをコードする各遺伝
子。
【０００５】また、ＶＺＶをウイルスベクターとして使
用し作出された組換えＶＺＶについては、下記が公知で
ある：ＶＺＶのｇｐＩ遺伝子プロモーターの下流領域に
外来遺伝子を挿入連係して得た組換えＶＺＶであり、外
来遺伝子がエプスタイン・バーウイスルのｇｐ350 遺伝
子（特開昭 63-12277 又は欧州公開公報第 251534 号；
特開昭 63-141589; Journal of Virology, 61, 1796-18
07, 1987）、外来遺伝子がＢ型肝炎ウイルス（以下ＨＢ
Ｖと略記する）のｐｒｅＳ２及び表面抗原（以下ＨＢｓ
と略記する）遺伝子（特開昭 63-12277 又は欧州公開公
報第 251534 号）であるもの；ＶＺＶのｇｐＩ遺伝子プ
ロモーターの下流にエプスタイン・バーウイスルのｇｐ
350 とｇｐ220 の各遺伝子を連結した遺伝子断片を更に
ＶＺＶのｔｋ遺伝子内に挿入連係し、エプスタイン・バ
ーウイスル遺伝子をｔｋとの融合蛋白として発現させる
よう作製した組換えＶＺＶ［Proceedings of National
Academy of Science USA , 84, 3896-3900, 1987;“UL
CA Symposia on MolecularBiology; New Series, vol.8
4: Technical Advances of Vaccine Development”，p
p. 235-241, R.W. Ellis ら著，Alan R.Liss, Inc. (US
A) 1988年発行］等。しかし、これ等の組換えＶＺＶは
いずれも、免疫原性が低く、しかも、安全性と有効性が
確認されていない。また、斯かるＶＺＶを抗原として用
いワクチンや診断剤を市場に乗せる動きは現在、知られ
ていない。従って、組換えＶＺＶは未だ実用の域には到
達していないと判断される。
【０００６】その理由として、主に以下の事実を挙げる
ことができる。（１）ゲノムの長さが通常、約 10 kbで
ある小型ウイルスに比べ、前述の通り、ＶＺＶは大型で
あり、その感染性ゲノムは約 120 kb と極めて長く、斯
かるＤＮＡ長鎖は切断され易く不安定である；（２）Ｖ
ＺＶは本来、熱に極めて不安定な細胞依存性ウイルスで
あり、その感染性維持には−６０℃以下での保存を必須
とする等、その取扱い、培養、量産等が容易ではない；
（３）ウイルス培養における１細胞当たりの感染性ウイ
ルス粒子生産数に関し、他のウイルスが通常、約 10-10
0 粒子であるのに対し、ＶＺＶの場合は約 0.1個と生産
収率が極めて低い等である。そしてこれらの理由により
ＶＺＶ培養によるゲノムの量産のみならず、試験研究段
階での使用に耐えるＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの調製とクロー
ニングは甚だ困難であり、かつ、産業利用上、質と量共
に適格な組換えＶＺＶを選別採取する確率が極めて低
い。換言すれば、組換えＶＺＶ株の確立には、斯かる著
しく困難な条件を克服する必要がある。
【０００７】本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなさ
れたものであり、組換えＶＺＶ株の作出に係る上記の困
難を克服し、産業上利用の観点から、量産コストに見合
った遺伝子発現機能を有し、しかも、斯かる発現能が継
代下で遺伝学的に安定であり、かつ、生ワクチンの有効
成分として適格な安全性と有効性を兼備した組換えＶＺ
Ｖ株と、その作製法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述のＷ
ＨＯの提唱に呼応すると共に、上記の課題を解決するた
め、２０余年にわたり蓄積した独自の経験と知識を糧と
して更に、鋭意試験と試行を重ね、産業上利用とその必
要性の観点から、特に培養と量産の困難なＨＢＶ遺伝子
の発現能と生産量が共に安定で量産に最適の、優れて有
用な組換えＶＺＶ株を確立した。
【０００９】すなわち、本発明は、ＶＺＶの遺伝子プロ
モーターの下流領域に、ＨＢＶゲノムの遺伝子群から選
ばれる１種以上の遺伝子を挿入連係された組換えＶＺＶ
と、その作製法を提供する。さらに本発明は、上記の組
換えＶＺＶのゲノムＤＮＡ、この組換えＶＺＶを含有す
る生ワクチン、この組換えＶＺＶに由来する抗原、およ
びこの抗原を含有する診断剤をも提供する。以下、その
構成につき説明する。
【００１０】ウイルスベクターとしてのＶＺＶ株：本発
明では、安全性、有効性及び均質性を併有する組換え生
ワクチン株の作出を主な目的とすることから、ＶＺＶゲ
ノムをベクターとして使用する。本発明によれば、ＶＺ
Ｖとして、例えば、岡（ATCCVR-795)、Ｗebster（ATCC
VR-916)、Ｅllen（ATCC VR-586)、ＹＳ、ＹＧ、Ｓcot
t、河口、Ｄumas等の既存の公知株（ Journal of Gener
al Virology, 67, 1816-1829,1986; ウイルス，37, 71-
80, 1987 ）の各株や将来分離されるＶＺＶ株等を随意
に使用できる。これ等のＶＺＶ株のうち、試験研究や製
造上での取扱いでの安全性の確保、並びに安全性と有効
性とを兼備した生ワクチンや診断剤の提供等の産業上利
用を考慮すると、弱毒ＶＺＶ株の使用が望ましい。特
に、上記の主目的の観点から、弱毒ＶＺＶ岡株は、水痘
生ワクチン株（ＷＨＯ Technical Report Series, No.7
25, pp.102-124, 1985）として、その安全性と有効性が
世界的に確定かつ公認され、現在、世界のレベルで使用
されている唯一のＤＮＡ型の弱毒ウイルスであるため、
外来遺伝子の発現ベクターとして最適である。
【００１１】ＶＺＶの培養とその細胞の選択：ヒト、サ
ル、モルモット等に由来のＶＺＶ感受性の公知の細胞を
使用できる。これ等の細胞のうち、迷入因子や癌原性因
子の混入の確率、ワクチン用ウイルス株培養の細胞とし
ての適格性、産生ウイルス量等を考慮すると、生ワクチ
ン製造用として公認のヒト２倍体細胞、例えば、ＨＥＬ
２９９（ATCC No.CCL 137)、ＭＲＣ−５（ATCC No.CCL
171 ）、ＷＩ−３８（ATCC No.CCL 75）等の使用が望ま
しい。また、これらの細胞の増殖と維持両培地、及びウ
イルス培養培地として、市販の合成培地、例えば、１９
９培地［Difco社（米国）製］、ＭＥＭ培地［ Gibco社
（米国）製］等を使用できる。斯かる培地は使用直前
に、約 7％(w/v) のＮａＨＣＯ3水溶液を滴下混合して
ｐＨを約 6.8-8.0に調整の後、更に、市販のウシ胎児血
清［例えば、Flow社（米国）製］を最終濃度が約 2-15
％(w/v) になるよう追加して添加混合し、培養に供す
る。ＶＺＶの培養は、予め調製した培養細胞にそのシー
ドウイルスを接種した後、維持培地を用いて行う。培養
温度は 25-40℃、好ましくは、33-38 ℃が推奨される。
【００１２】ＨＢＶ遺伝子を挿入連係するＶＺＶ遺伝子
の選択：本発明によれば、理論的には、前述の７１個の
全てのＶＺＶ遺伝子をそれぞれ、ＨＢＶ遺伝子を挿入連
係する部位として使用できる。尚、斯かる使用上の留意
点として、これ等の各遺伝子のプロモーターが機能でき
るよう、プロモーターの下流を占めるＯＲＦ領域にＨＢ
Ｖ遺伝子を挿入連係すること、及び翻訳が円滑に進行す
るようＶＺＶ遺伝子と外来遺伝子相互のコドンを破壊す
ることなく挿入連係する等をあげることができる。ま
た、一般に、外来遺伝子が挿入連係された遺伝子は破壊
され本来の機能を発揮しなくなることがあるので、ＨＢ
Ｖを連結する遺伝子プロモーターとしては、ウイルスの
感染性や増殖性に影響を及ぼさず、しかも、多量発現能
を有する、プロモーターの強度の強い遺伝子、例えば、
ｔｋ遺伝子やｇｐ遺伝子等の採用が望ましい。特に、弱
毒ＶＺＶ岡株を用いる場合には、前述の７１遺伝子のう
ち、遺伝子１４のｇｐＶ遺伝子の欠損又は発現機能の低
下（Journal of Virology, 64, 4540-4548, 1990）が知
られているため、この遺伝子領域の使用は推奨できな
い。しかし、ＶＺＶ野生株のｇｐＶ遺伝子の使用は可能
であり、そのプロモーターの下流にＨＢＶ遺伝子を挿入
連係することにより、該ｇｐＶをコードする遺伝子領域
の破壊や発現量低下を惹起させることができるので、こ
れより得られる組換えＶＺＶは、弱毒ＶＺＶ岡株に類似
の弱毒株として、極めて高い有用性が期待される。
【００１３】ＶＺＶ遺伝子内に挿入連係するＨＢＶ遺伝
子の選択：本発明によれば、理論的には、ＶＺＶの増殖
性と感染性に支障を来さない範囲内で、ＨＢＶゲノムの
遺伝子群から選ばれる１種以上の遺伝子を外来遺伝子と
して使用できる。但し、組換えＶＺＶの生ワクチン株と
しての使用を考慮し、毒性物質、為害作用物質、毒素等
をコードする遺伝子領域が外来遺伝子中に連座しないよ
う、細心の注意を払う必要がある。例えば、ＨＢＶのｐ
ｒｅＳ１領域と、重合ヒト血清アルブミン・レセプター
であるｐｒｅＳ２の一部領域は共に肝細胞への親和性が
知られているので、斯かる領域をコードする遺伝子の近
傍を外来遺伝子として使用する場合には、該当領域を制
限酵素で開裂除去する必要がある。このようにしてＨＢ
Ｖ遺伝子を挿入連係した弱毒組換えＶＺＶは、ＨＢＶと
ＶＺＶに係る両者の抗原性と免疫原性を併有し、しか
も、弱毒株であるため、Ｂ型肝炎と水痘に対する同時免
疫が可能な２価生ワクチンの有効成分として、また、Ｈ
ＢＶとＶＺＶ両抗原からなる診断用の２価抗原として実
用に供することができる。ここで付記かつ特筆すべき
は、従来技術では不活化ワクチンとしてしか提供され得
ない抗原、例えば、ＨＢＶ抗原を、本発明によれば、生
ワクチンとして実用に供し得ることである。
【００１４】組換えＶＺＶの作製：次の手順で行う。外
来遺伝子を挿入連係しようとするＶＺＶ遺伝子のクロー
ニング；外来遺伝子のクローニング；クローニングした
ＶＺＶ遺伝子に外来遺伝子を挿入連係したキメラプラス
ミドの構築；斯かるキメラプラスミドとＶＺＶゲノムと
の間の組換えによる、組換えＶＺＶの作出。以下、この
順序で説明する。
【００１５】（１）ＶＺＶ遺伝子のクローニング：後述
の実施例１に記載の要領でＶＺＶゲノムＤＮＡをその感
染細胞から抽出精製の後、このＤＮＡを制限酵素で消化
し、常法のアガロースゲル電気泳動で分画し調製したＶ
ＺＶ遺伝子ＤＮＡ断片を、市販又は公知のベクターとそ
の宿主（ P.H.Pouwels著，“Cloning Vector -A Labora
tory Manual ”，全２巻，Elsevier 1985 年発行；“ A
TCC Recombinant DNA Materials ”，American Type Cu
lture Collection 1989 年発行）を用いて、ベクターの
制限酵素サイトにクローニングする。例えば、ＶＺＶの
ｔｋ遺伝子は、ＶＺＶゲノムを制限酵素ＳａｃＩで消化
して調製したＨ断片（Intervirology,29, 301-310, 198
8）を大腸菌プラスミドーベクターｐＵＣ１２［Methods
in Enzymology, vol.101, pp.20-78, Academic Press
（米国）1983年発行］のＳａｃＩサイトに挿入連係の
後、これを大腸菌ＪＭ１０９株（ATCC No. 53323）に移
入して形質転換させることにより、クローニングでき
る。また、この工程の簡略化には、既にクローニング済
みのＶＺＶ遺伝子（例えば、Journal of General Virol
ogy, 67, 1817-1829, 1986）を利用できる。
【００１６】（２）ＨＢＶ遺伝子のクローニング：摘出
したＨＢＶ感染組織細胞、培養したＨＢＶ感染細胞の、
界面活性剤による溶解液、超音波による破壊液、また、
ウイルス培養上清、感染個体の血液等を出発材料として
使用できる。精製手段として、公知の常法を組合わせて
用いることができる。例えば、硫安塩析法、低速遠心
法、密度勾配超遠心法等を組合わせて用いることによ
り、出発材料から先ずウイルス粒子の精製画分を調製す
る。斯かる精製画分からのゲノムＤＮＡの抽出と精製
は、その不可逆的変性を避けるため、ｐＨ 3-10 での実
施が望ましく、公知の常法により実施できる。例えば、
100 ℃のＮａＣｌ溶液を用いる熱食塩法、ＳＤＣ（デオ
キシコール酸ナトリウム）やＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）等を用いる洗剤法、２相分配の原理に基づくフ
ェノール抽出法、塩酸グアニジンの濃厚液を用いる塩酸
グアニジン法、ＮａＯＨ溶液やＮａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ
3緩衝液等を用い約ｐＨ 10 でのアルカリ法、冷エタノ
ールを用いアルコール沈殿法等を適宜組合わせて採用す
ることによりゲノムＤＮＡを調製できる。斯かるＤＮＡ
は、上記の（１）と同様の要領で、ベクターの制限酵素
サイトにクローニングする。尚、この工程を簡略化する
ため、既にクローニング済みのＨＢＶ遺伝子を用いるこ
とができる。例えば、ｐＭ１Ｂ１１［特開昭 63-22098
(微工研条寄第1081号）］にクローニングされたＨＢＶ
のｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−ＨＢｓ抗原遺伝子等を利用
できる。
【００１７】（３）ＶＺＶ−ＨＢＶ遺伝子のキメラプラ
スミドの構築：上述（１）の要領でＶＺＶ遺伝子をクロ
ーニングしたベクター内のＶＺＶ遺伝子の下流領域を制
限酵素で開裂し、その開裂サイトに、上記（２）でクロ
ーニングしたＨＢＶ遺伝子を制限酵素により消化し調製
したＤＮＡ断片を挿入連係の後、これを宿主細胞に移入
して形質転換させることにより、ＶＺＶ遺伝子とＨＢＶ
遺伝子が連係のキメラプラスミドを構築する。
【００１８】（４）組換えＶＺＶの作出：前述のＶＺＶ
ゲノムと上記（３）で調製のキメラプラスミドを同時に
宿主細胞に導入し、これ等の両者の間で、組換えを起こ
させることにより、組換えＶＺＶを作出する。細胞への
ＤＮＡの導入には、公知の常法、例えば、ＤＥＡＥデキ
ストラン法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法等を適用
できる。リン酸カルシウム法（Virology, 52, 465-467,
1973 ）の場合、リン酸イオンとカルシウムイオンの共
存下で形成される上記両ＤＮＡの共沈殿物を調製の後、
これを細胞培養に接触させ、コ・トランスフェクション
させる。また、ＶＺＶ親株を事前に接種して約２−３時
間培養した感染細胞に、キメラプラスミドＤＮＡのリン
酸カルシウム共沈殿物を滴下し接触させ、該ＤＮＡをＶ
ＺＶ感染細胞に導入することもできる。次いで、これ等
の細胞を培養し、その培養系でＶＺＶゲノムとキメラプ
ラスミド両ＤＮＡの間で組換えを起こさせ、組換えＶＺ
Ｖを作出できる。
【００１９】（５）組換えＶＺＶとその培養：本発明に
より得られる種々の組換えＶＺＶクローンはいずれも、
弱毒ＶＺＶ株であり、生ワクチンの有効成分として使用
できる。例えば、ＶＺＶとＨＢＶ両遺伝子の間の組換え
ＶＺＶクローンは、後述の実施例５に開示の通り、ｒＨ
Ｖ岡株シリーズと総称され、命名された次の２０株から
なる：ｒＶＨ１岡株、以下、ｒＶＨ２、ｒＶＨ３、ｒＶ
Ｈ４、ｒＶＨ５、ｒＶＨ６、ｒＶＨ７、ｒＶＨ８、ｒＶ
Ｈ９、ｒＶＨ１０、ｒＶＨ１１、ｒＶＨ１２、ｒＶＨ１
３、ｒＶＨ１４、ｒＶＨ１５、ｒＶＨ１６、ｒＶＨ１
７、ｒＶＨ１８、ｒＶＨ１９、及びｒＶＨ２０の各岡
株。尚、本発明の組換えＶＺＶは、後述の参考例３に記
載の要領で、培養細胞に組換えＶＺＶシードウイルスを
接種し培養できる。その培養上清および感染細胞内に
は、感染性の組換えＶＺＶ粒子以外に、組換えＶＺＶゲ
ノムの発現産物である種々の抗原が生産される。例え
ば、上記のｒＶＨ７岡株（国際寄託番号）を培養する
と、組換えＶＺＶ粒子以外に、その培養上清には分子量
が 30k、35K 等のＨＢｓポリペプチドが、また、感染細
胞細胞内には 26k、30K 等のＨＢｓポリペプチドがそれ
ぞれ生産される。組換えＶＺＶの培養物中に生産され
る、これ等の抗原、ウイルス粒子とそのＤＮＡはいずれ
も、ワクチン、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、又は遺
伝子工学試薬として利用できる。
【００２０】組換えＶＺＶゲノムＤＮＡの制限酵素解
析：公知の常法、例えば、サザン・ブロット法（Journa
l of Molecular Biology, 98, 503,1975）により解析で
きる。即ち、ＶＺＶゲノムを制限酵素で消化し調製した
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分画し、これ等
の画分をニトロセルロースフィルター上に移した後、Ｒ
Ｉ（ラジオアイソトープ）で標識のプローブとの間でハ
イブリダイゼーションを行い、上記泳動画分の反応像を
ラジオオートグラフィーにより解析する。
【００２１】組換えＶＺＶ抗原の測定、検出及び同定：
組換えＶＺＶ培養により生産されるウイルス粒子や各種
抗原の測定、検出及び同定は、免疫学や血清診断で常用
されている公知の方法、例えば、抗体でコートした赤血
球をもちいるＲＰＨＡ（逆受身赤血球凝集反応）法、酵
素で標識した抗体を使用するＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体
免疫アッセイ）又はＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩ
で標識した抗体を用いるＲＩＡ（ラジオ免疫アッセ
イ）、ＦＩＴＣ（ fluorescein isothiocyanate ）で標
識した抗体で感染細胞を染色し蛍光顕微鏡下で抗原の存
在を判定する免疫蛍光法、また、ＲＩ標識した培地成分
を添加混合の培地中で組換えＶＺＶを培養し調製したＲ
Ｉ標識抗原と予め作製した抗体との間の免疫沈降反応物
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動）にかけ分子量の大きさにより分画の後、その泳動
像をオートラジオグフィーで解析する免疫沈降法等の採
用が可能である。尚、この工程を簡略化するため、市販
されている種々の測定キットを使用できる。また、抗原
密度は、公知の常法、例えば、密度勾配平衡遠心法によ
り測定できる。抗原粒子の形状は、電子顕微鏡で観察で
きる。
【００２２】組換えＶＺＶの感染価の測定：公知の常
法、例えば、感染細胞のラウンディングを指標とするＣ
ＰＥ（細胞変性効果）を光学顕微鏡下で判定するＣＰＥ
法；ニュートラルレッドとアガロースを含有の固形培養
培地を重層した感染細胞の培養により形成される各プラ
ークを１単位とするＰＦＵ（プラーク形成単位）を肉眼
で数えるプラークアッセイ；ホルマリンで固定した感染
細胞をメチレンブルー溶液で染色しＰＦＵを肉眼で数え
るプラークアッセイ；感染細胞が形成するフォーカスの
数、ＦＦＵ（フォーカス形成単位）を光学顕微鏡下で計
数するフォーカス法；等を採用できる。
【００２３】組換えＶＺＶのクローニング：公知の常
法、例えば、感染細胞のクローニングにはフォーカス
法、組換えＶＺＶのクローニングにはプラークアッセイ
が採用できる。フォーカスやプラークの採取には、ガラ
ス製、プラスチック製、金属製等の円筒細管ないしはシ
リンダーを使用できる。クローニングした感染細胞や組
換えＶＺＶは、クローン毎に新鮮な細胞培養に接種し、
ウイルスを培養する。
【００２４】組換えＶＺＶ免疫原性の判定：組換えＶＺ
Ｖを含有の溶液をサル、ウサギ、モルモット、マウス等
の実験小動物の皮下に接種の後、これ等の免疫動物を飼
育管理する。斯かる飼育の間、ウイルス接種後、週又は
月単位で一定期間毎に、例えば、モルモットの場合に
は、その大腿部静脈から約 3 ml の部分採血を行い、そ
の血中抗体価を測定する。抗体価の測定には、免疫学や
血清診断で常用されている公知の方法、例えば、免疫に
使用した抗原でコートした赤血球を用いるＰＨＡ（受身
赤血球凝集反応）法、既知の一定量の感染ウイルスとそ
の抗血清との間で抗原抗体反応させた後、その感染ウイ
ルス量を50％中和減少させる抗血清の最高希釈倍数を、
ＣＰＥ法やプラークアッセイにより測定する中和試験法
等を採用できる。
【００２５】組換えＶＺＶを有効成分として含有する生
ワクチンの製造：ヒト２倍体細胞培養を用いて組換えＶ
ＺＶを培養の後、その培養物を、例えば、遠心法により
精製し、組換えＶＺＶ画分を採取する。これにワクチン
安定化剤としてアミノ酸や糖類等の溶液を添加混合て
し、生ワクチン１ドーズ当たりのウイルス含量が1,000P
FU 以上になるよう希釈調整し、生ワクチンを製造す
る。生ワクチンは、その一部サンプルにつき、厚生省告
示第１９５号に規定の生物学的製剤基準（1989年）、例
えば、「乾燥弱毒生水痘ワクチン」、「組換え沈降Ｂ型
肝炎ワクチン（酵母由来）」等に準拠して、安全性、有
効性及び均質性に関する各種試験検定を行い、そのワク
チンとしての適格性を確認・確定の後、使用に供する。
乾燥ワクチンは、約 3- 30 ml 容のバイヤル瓶又はアン
プル中で凍結乾燥され、気密密閉の状態で提供され、５
℃以下に保存する。斯かるワクチンの使用は、これに添
付の使用書の記載に従い、使用直前に滅菌蒸留水で乾燥
内容物を完全に再溶解した後、例えば、１ドーズ、0.5
mlを皮下に接種する。
【００２６】組換えＶＺＶ抗原を有効成分として含有す
る診断剤の製造：ヒト２倍体細胞培養を用いて組換えＶ
ＺＶを培養の後、その培養物を、例えば、遠心法により
精製し、組換えＶＺＶ抗原画分を採取する。その抗原
を、例えば、ホルマリンの添加、または56℃で加熱等に
より不活化した後、抗原蛋白量が 1-10 μｇ/ml になる
よう、例えば、ＰＢＳで希釈調整し、診断剤を調製す
る。斯かる抗原は、2-50 ml 容のバイヤル瓶又はアンプ
ル中で密閉され、液状又は乾燥の状態で提供される。斯
かる抗原は、これに添付の使用書の記載に従い、種々の
血清診断、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＰＨＡ等の抗原とし
て、また、抗体の作製に使用できる。尚、乾燥製品の場
合には、蒸留水で乾燥内容物を完全に再溶解して用い
る。
【００２７】以下、本発明の具体例につき、参考例及び
実施例をあげて説明する。但し、本発明は、斯かる参考
例及び実施例にのみ限定されるものではない。
【００２８】
【参考例】参考例１ 細胞培養：ヒト２倍体繊維芽細胞、ＭＲＣ−５を37℃で
培養した。基礎培地としてＭＥＭ培地［ Gibco社（米
国）製］を使用した。尚、該基礎培地は使用直前に 7％
(w/v)NaHCO3水溶液を添加混合し、増殖培地はｐＨ 7.
4、維持培地はｐＨ7.8 に各々調整した。次いで、市販
のウシ胎児血清を、その最終濃度が増殖培地では10％(v
/v) 、また、維持培地では 3％(v/v) になるよう追加混
合し使用した。 参考例２ ＶＺＶ培養：参考例１で得たＭＲＣ−５細胞培養に、Ｖ
ＺＶ岡株（ ATCC VR-795）シードウイルスをＭＯＩ（感
染多重度）0.01にて接種の後、37℃で３日間,培養し
た。培地には、参考例１に記載の維持培地を使用した。
ＶＺＶ培養の間、ＶＺＶの増殖に伴い感染細胞領域が次
第に広がる。ＶＺＶ感染細胞は、検鏡下でラウンディン
グを呈し、いわゆる、ＣＰＥ（細胞変性効果）として検
出できる。従って、斯かるＣＰＥに基づく感染細胞の広
がりを検鏡下で観察することにより、ＶＺＶ増殖の程度
を判定できる。ＣＰＥが細胞培養モノシート全域で認め
られる時点で、ＶＺＶ培養を終了した。 参考例３ 生水痘ワクチン株の培養：生水痘ワクチン株である岡株
（ WHO Technical Report Series, No.725, pp.102-12
4, 1985）シードウイルスを、参考例２の記載と同様の
要領で培養した。培養容器として、培養面積210 cm２
のルー瓶５本を使用した。 参考例４ ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）の調製：NaClを 8.0ｇ、
KCl を 0.2ｇ、Na2HPO4・12 H2O を 2.9ｇ、KH2PO4を
0.2ｇ、CaCl2を 0.1ｇ、及び MgCl 2・ 6 H2Oを 0.1
ｇ、蒸留水に溶解して1,000 mlにし、ＰＢＳを調製し
た。また、２価のイオン、CaCl2とMgCl2・6H2O とを含
まないＰＢＳ（−）も別途に調製した。
【００２９】（明細書第１７頁，下第６行の記載を次の
通り変更する）ＶＺＶのｔｋ遺伝子の発現に代わり、Ｈ
ＢＶのｐｒｅＳ２の２７個のアミノ酸と
【００３０】以下の実施例では、ｒＶＨ岡株シリーズ中
の組換えＶＺＶ株の代表例として、ｒＶＨ７岡株（国際
寄託番号）を使用する。尚、ｒＶＨ７岡株の親株は、参
考例３及び実施例１に記載の通り、弱毒ＶＺＶの岡水痘
生ワクチン株である。 実施例６ 組換えＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの制限酵素解析：ザザン・ブ
ロット法（Journal ofMolecular Biology, 98, 503, 19
75)により行った。親株である岡水痘性生ワクチン株と
組換え株の各ゲノムＤＮＡを実施例１の記載と同様にし
て抽出調製の後、各ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ（Ｓｓｔ
Ｉ）で消化して得られるＤＮＡ断片を、0.8 ％(w/v) ア
ガロースゲル電気泳動で分画し、泳動済みのゲルをエチ
ジウムブロマイドで染色した。次いで、このゲルにニト
ロセルロースフィルターを重ね、各ＤＮＡ分画を該フィ
ルターに移し、ＲＩで標識のプローブによるハイブリダ
イゼーションを行った後、ラジオオートグラフィーにか
けた。尚、プローブとして、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで標
識したｐＭ１Ｂ１１及びｐＨＨの各ＤＮＡを使用した。
その結果、親株では本来のＳａｃＩ−Ｈ断片が、また、
組換え株ではＳａｃＩ−Ｈ´断片がそれぞれ検出され
た。そのため、ＳａｃＩ−Ｈ断片はＶＺＶｔｋ遺伝子を
含み、組換え株のＨＢｓとｔｋ両遺伝子領域にはＳａｃ
Ｉサイトがないことを考慮すると、親株のＳａｃＩ−Ｈ
断片が、組換え株ではＳａｃＩ−Ｈ´断片にシフトした
と考えられる。また、親株のＳａｃＩ−Ｈ断片はｐＨＨ
プローブだけと反応するのに対し、組換え株のＳａｃＩ
−Ｈ´断片はｐＭ１Ｂ１１及びｐＨＨ両プローブとそれ
ぞれハイブリダイゼーションするため、組換えＶＺＶゲ
ノムのｔｋ遺伝子にはＨＢｓ遺伝子が挿入されていると
判定される。 実施例７ ＶＺＶ組換え株の感染細胞で産生されるＨＢｓ抗原の検
出と同定：実施例５で得たｒＶＨ７岡株を、培養面積15
0 cm2のプスチック製フラスコ５本を用いて、参考例２
に記載と同様にして培養した。その培養上清をプール
し、3,000 rpm で20分間、4 ℃で遠心した。感染細胞
を、培養フラスコ内壁面からラバーポリースマンで剥離
の後、ＰＢＳに浮遊させた。
【００３１】（１）ＨＢｓ抗原の産生量の測定：上記の
遠心上清 35 mlを、更に、27,000 rpmで 3時間、4 ℃で
遠心し、ペレットを採取し、これを 0.2 ml のＰＢＳに
懸濁し、組換え株培養上清画分とした。一方、上記の感
染細胞約106個を１mlのＰＢＳに浮遊させ、超音波（20
KＨz, 150 mA, 4秒）で細胞を破壊の後、3,000 rpmで20
分間、4 ℃で遠心し、その上清を採取し、組換え株感染
細胞画分とした。両画分について、抗ＨＢｓ血清でコー
トした細胞を用いるＲＰＨＡ（逆受身赤血球凝集反応）
試験により、ＨＢｓ抗原価を測定した。ＲＰＨＡには市
販の試験キット（ミドリ十字製）を使用した。また、比
較対照として、上記と同様に約106個の細胞から調製し
た未感染細胞画分及び親株感染細胞画分、並びに酵母で
生産したＨＢｓ抗原（特開昭63-22098）をそれぞれ用い
た。尚、これ等の検体は、２倍階段希釈し、測定した。
その結果を表１に示す。表１から、ＶＺＶ組換え株の培
養によるＨＢｓの産生量は、感染細胞画分では10μg/m
l、培養上清画分では 4μg/ml（濃縮前の、もとの培養
上清では23ng/ml)であると算出推定される。
【００３２】
【表１】
【００３３】（２）ＨＢｓ抗原の免疫蛍光法による検
出：実施例５に記載のＨＢｓ抗原のモノクローナル抗体
を用いる免疫蛍光法により、上記の組換え株感染細胞で
のＨＢｓ抗原産生の有無を検定した。その結果、感染細
胞質内でのＨＢｓ抗原の産生が確認された。 （３）培養上清のＨＢｓ抗原の電子顕微鏡による確認：
上記の培養上清を5,000 rpm で20分間、遠心の後、その
上清にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）6000を最終濃
度が10％(w/v) になるよう添加混合し、沈殿物を形成さ
せた。次いで、低速遠心により回収した沈殿物ペレット
をＴＥＮ液［20 mM Tris-HCl(pH 7.4),1mM EDTA-2Na,15
0mM NaCl］に浮遊させた後、この浮遊液を、SW27ロータ
ーを用いるCsCl密度勾配平衡遠心に２回かけた。尚、遠
心カラムとして密度1.15、1.25及び1.4 g/cm3からなる
不連続勾配を使用し、このカラムに沈殿物浮遊液を重層
の後、23,000 rpm、20時間、 4℃で遠心した。遠心終了
後、カラムを分画し、ＨＢｓ抗原画分を、上述のＲＰＨ
Ａ試験により決定した。これより得られたＨＢｓ抗原画
分は、ＴＥＮ液と混合し、CsClで密度を 1.2g/cm3に調
整の後、更に、SW41ローターにて、33,000 rpm、40時
間、4 ℃で遠心した。遠心終了後、カラムを分画し、Ｈ
Ｂｓ抗原画分を採取して希釈し、これを10％(w/v) 蔗糖
クッションの上に重層の後、SW41ローターにて、40,000
rpmで 3時間、4 ℃で遠心した。そのペレットを、ＰＢ
Ｓに浮遊させ、電子顕微鏡で観察した。その結果、最終
の精製ＨＢｓ画分には、多数の直径20-30 nmの粒子が検
出された。この結果から、粒子状のＨＢｓ抗原が、感染
細胞から分泌されていると判断される。
【００３４】（４）培養上清のＨＢｓ抗原の密度の測
定：上記の電子顕微鏡による観察で用いた精製ＨＢｓ画
分の一部を、SW41ローターにて、33,000rpm 、4 ℃で40
時間、密度1.2 g/cm3のＣｓＣｌ密度勾配平衡遠心にて
分画した。各画分の体積と重量を測定し密度を算出する
と共に、そのＨＢｓ抗原価をＲＰＨＡ試験で測定した。
その結果、ＨＢｓ活性のピークを示す精製ＨＢｓ画分の
密度は、 1.20 g/cm3であった（図３）。 実施例８ ＶＺＶ組換え株のＶＺＶ及びＨＢｓ両抗原の同定：参考
例１の記載と同様して、直径100mm のシャーレ３枚にＭ
ＲＣ−５細胞を培養した。その１枚にはｒＶＨ７岡株
を、他の１枚にはその親株をそれぞれ接種した。残り１
枚の細胞培養は、ウイルスを接種せず、対照抗原の調製
に用いた。そして、これ等の各細胞を、メチオニンを含
有しないＭＥＭ培地に50μＣi/mlの［35Ｓ］メチオニン
とシスティンを添加し調製した基礎培地を用いて、参考
例２の記載と同様に 4時間、培養を行った。次いで、各
細胞を剥離し、ＲＩＰＡ緩衝液［20 mM Tris-HCl(pH 8.
0),1 ％(w/v) Triton X-100, 0.1 ％(w/v) SDS ，150mM
NaCl, 及び 1 mM phenylmethylsulfonyl fruoride ］
で細胞溶解の後、35,000 rpmで 1時間、遠心し、その上
清を採取した。また、培養上清は、3,000 rpm で20分
間、遠心し、その上清を採取した。得られた６種の上清
の各々は、抗ＶＺＶモルモット血清（Virology,156, 42
3-426, 1987）と混合し、免疫沈降反応させた。各反応
系で形成された免疫複合体は、プロティンＡセファロー
スＣＬ−４Ｂ［ファーマシアＬＫＢ（スウェーデン）
製］のカラムクロマトグラフィーにより、それぞれ分離
した。ＨＢｓ抗原（特開昭63-22098）を用いて作製した
抗ＨＢｓウサギ血清と上記６種の上清との間でも、上記
と同様に各免疫複合体を形成させ、これを分離した。次
いで、これ等の免疫複合体をそれぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動した後、ラジオオートグラフィーを行った。
その結果、ＶＺＶポリペプドは、親株及び組換え株の両
感染細胞において同様に検出された。しかし、分子量が
26Kと30K の両ＨＢｓ抗原は、組換え株の感染細胞内だ
けに検出された。また、これ等の 26Kと30K 両抗原とは
対照的に、組換え株の培養上清では、実施例７に記載の
組換え株の感染細胞が分泌するＨＢｓ抗原が、 30Kと35
K の両ポリペプチドとして同定された。このことから、
感染細胞内で合成された 26Kと30K のＨＢｓ抗原は、そ
の培養上清に分泌される間に、修飾とプロセッシングを
受け 30Kと35K のＨＢｓ抗原になると判定される。 実施例９ 組換えＶＺＶを有効成分とする生ワクチンの製造：培養
面積210 cm2のルー瓶20本のＭＲＣ−５細胞培養に、実
施例５で得たｒＶＨ７岡株シードウイルスを接種の後、
参考例３の記載と同様にして培養した。培養終了後、培
養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を200 mlのＰＢＳ
（−）にて２回洗浄した。次いで、 20m1の 0.03 ％(w/
v) EDTA-3Naを各ルー瓶内の感染細胞に重層し、細胞を
ルー瓶内壁面から剥離させ浮遊させた。各ルー瓶内の感
染細胞浮遊液をプールし、2,000 rpm にて10分間、4 ℃
で遠心し、感染細胞のペレットを採取した。これを100
mlのＰＢＳ（−）に再浮遊の後、凍結融解を１回、行っ
た。次に、氷水浴中で超音波処理( 20 KＨz,150 mA, 0.
3 秒/ml ）した後、3,000 rpm で20分間、4 ℃で遠心
し、細胞遊離ウイルスを含有の上清を採取し、これを生
ワクチン原液とした。この原液から検定用として30mlを
サンプリングし、残りの原液70mlに、ＰＢＳ（−）に溶
解したサッカロース及びゼラチン加水分解物をワクチン
安定化剤として最終濃度が5 ％(w/v) 及び2.5 ％(w/v)
になるよう添加混合し、140ml の生ワクチン最終バルク
を調製した。この最終バルクから検定用として30mlをサ
ンプリングの後、残りバルクを 3ml容のバイヤル瓶に0.
5 mlずつ分注し、凍結乾燥の後、窒素ガスを充填しゴム
栓で封をしバイヤル瓶内部を気密密閉した。この生ワク
チン小分品は、 4℃で保存し、使用の直前に注射用蒸留
水 0.5mlを添加し乾燥内容物を完全に溶解し用いる。一
方、サンプリングした上記のワクチン原液と最終バル
ク、及び小分品20本につき、検定試験を行った。斯かる
検定試験は、安全性、有効性及び均質姓を確認し、生ワ
クチンとしての適格性を確定するため、厚生省告示第１
９５号に規定の生物学的製剤基準（１９８９年）「乾燥
弱毒生水痘ワクチン」に準拠し、かつ、同じく規定の基
準「組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチン（酵母由来）」をも考
慮し、実施した。斯かる検定試験の結果、上記の小分品
は、そのウイルス含量が２×１０4ＰＦＵ（プラーク形
成単位）/0.5mlであり、かつ、上記基準に規定の各種試
験に合格したため、適格性を備えた生ワクチンとして爾
後の使用に供した。 実施例１０ 診断剤用の組換えＶＺＶ抗原の製造：培養面積210 cm2
のルー瓶20本のＭＲＣ−５細胞培養に、実施例５で得た
ｒＶＨ７岡株シードウイルスを接種し、参考例３の記載
と同様にして培養した。１日間培養の後、各ルー瓶の培
養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を200 mlのＰＢＳに
て２回洗浄した。次いで、フェーノレッドを抜いた１９
９培地［ Difco社（米国）製］を各ルー瓶に注入し、更
に３日間、37℃で培養を続けた。培養終了後、各ルー瓶
から培養液を採取し、プールした。これを 3,000 rpmに
て20分間遠心し、その上清をミニタン限外濾過機ＭＷ10
000 ［ミリポア（米国）製］で、体積を1/20に濃縮し
た。次に、この濃縮液を56℃で30分間加熱し、ウイルス
を不活化した。得られた不活化濃縮液中の組換えＶＺＶ
の抗原蛋白含量が 5μｇ/ml になるようＰＢＳで希釈調
整し、これを 3ml容のアンプルに 2 ml ずつ分注の後、
熔封し、水痘及びＢ型肝炎の診断剤として使用に供し
た。 実施例１１ 組換えＶＺＶを有効成分とする組換え生ワクチンの免疫
原性の判定：実施例９で製造した組換え水痘生ワクチン
株の免疫原性を、モルモットを用いて測定した。比較対
照として、親株生ワクチンである市販の乾燥弱毒生水痘
ワクチン（財団法人阪大微生物病研究会製）、組換え沈
降Ｂ型肝炎ワクチン［特開昭63-22098より製造、及びメ
ルク社（米国）製の両ワクチン］、ＭＲＣ−５未感染細
胞から実施例９と同様の工程を経て調製した対照抗原の
合計５種を使用した。これ等の各ワクチンを３週令の平
均体重 250ｇのモルモット３匹にそれぞれ皮下接種し
た。ワクチン接種は、接種量が組換え株及び親株両生ワ
クチンでは、 3,000 PFU又は2,000 PFU／モルモットに
なるよう各ワクチンをＰＢＳ（−）で希釈調整して行っ
た。上記のＢ型肝炎両ワクチンは、ＨＢｓ抗原量10μｇ
／モルモットを接種した。そして、ワクチン接種後、
４、６及び８週目に、各被接種モルモットの大腿部静脈
から部分採血し、その血中抗体価を測定した。抗体価の
測定には、ＶＺＶでは中和試験法（Journal of General
Virology, 61, 255-269, 1982) を、ＨＢｓではＨＢｓ
抗原をコートした細胞を用いるＰＨＡ（受身赤血球凝集
反応）試験キット（化学及血清療法研究所製）をそれぞ
れ採用した。その結果を表２及び表３に示す。親株及び
組換え株の両ワクチンは共にＶＺＶ抗体を同レベルに誘
導した。しかし、ＨＢｓ抗体は組換え株ワクチン接種だ
けに検出された（表２）。更に、組換え株ワクチンのＨ
Ｂｓに対する免疫原性は、市販のＢ型肝炎ワクチンと同
じであった（表３）。これらの結果から、組換え株ワク
チンが保有の、ＶＺＶ及びＨＢｓ両抗原に対する免疫原
性は共に良好であると判定される。
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【発明の効果】（１）多価生ワクチンの提供：本発明に
より提供される組換えＶＺＶ株はＶＺＶ遺伝子と１種以
上のＨＢＶ遺伝子とを同時に発現する弱毒ウイルスであ
り、しかも、その各発現産物は現行のワクチン抗原と同
等の免疫原性を保有しており、また、その発現能はウイ
ルス継代下で遺伝学的に安定かつ良好であり、更に、こ
の組換えＶＺＶは生ワクチン株としての安全性と有効性
とを兼備しているため、従来の混合又は不活化ワクチン
に代わる多価生ワクチン又は多機能生ワクチンの有効成
分として実用に供することができる。 （２）不活化ワクチン抗原の生ワクチンへの変換：従
来、迷入因子混入の危険性、培養、精製等に係る技術的
制約のため、体液性免疫のみを誘導し、その免疫の持続
性の不良が公知であるにも拘らず、不活化ワクチンとし
てしか実用化され得ない抗原を、体液性と細胞性の両免
疫を誘導し、その増強された免疫効果が良好に永続する
生ワクチンに変換し提供することを可能にする。
【００３８】（３）混合ワクチンの製造コストの低減：
従来の混合ワクチンは、各ワクチン成分を個別に調製の
後、これ等を混合し製造されたものである。本発明によ
れば、２種以上の相互に異種の抗原を、組換えＶＺＶを
１回培養することにより、同時に製造できるため、ワク
チンの製造コストが極度に低減される。 （４）本発明により、培養や量産が困難なＨＢＶ抗原の
大量生産が可能になる。
【００３９】（５）バイオハザードの確率の高い病原体
抗原を安全に製造できる。 （６）本発明による組換えＶＺＶ抗原は、相異なる２種
以上の抗原を有するため、これ等の２種以上の病原体を
１度に判定できる多価診断剤としても有用である。ま
た、該組換えＶＺＶ遺伝子ＤＮＡは、２種以上の異種遺
伝子ＤＮＡからなるキメラプローブとして遺伝子診断に
利用できる。
【００４０】（７）ＷＨＯのＥＰＩ（免疫拡大計画）に
寄与：以上に加え、ＷＨＯが提唱の混合又は多価ワクチ
ン使用による接種と被接種両者間での省力化に基づく予
防接種の普及を考慮すると、本発明が、ワクチン製造、
防疫と衛生行政、臨床検査、個人の予防接種等における
経済性と省力化の確保に寄与すると共に、更には、予防
接種の普及と促進の布石となる免疫効果の改善と増強の
側面から人類に多大の福音をもたらすことは明らかであ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えＶＺＶ構築の順序を示した説明図であ
る。
【図２】ＶＺＶｔｋ遺伝子とＨＢＶｐｒｅＳ２−ＨＢｓ
遺伝子の連係部位のＤＮＡ塩基配列とその由来を示した
説明図である。
【図３】組換えＶＺＶの培養液中に分泌されるＨＢｓ抗
原画分を、更に、ＣｓＣｌ密度勾配平衡遠心法により分
画したＨＢｓ抗原各画分のＨＢｓ活性と密度を示す測定
図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｂ 33/576 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (56)参考文献 特開 昭63−12277（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−109795（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−150292（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84，Ｎｏ．11, （1987），ｐ．3896−3900

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 岡水痘生ワクチン株のゲノムＤＮＡおよ
    びＢ型肝炎表面抗原遺伝子のＨpa II断片を有する組換
    え水痘ウイルスであって、Ｈpa II断片はゲノムＤＮＡ
    のチミジンキナーゼ遺伝子Ｈinc II部位に挿入されてお
    り、これによって、Ｈpa II断片の５'末端がチミジンキ
    ナーゼ遺伝子の開始コドンと解読枠を一致するように連
    係され、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子がチミジンキナーゼ遺
    伝子プロモーターの単独支配下で発現される組換え水痘
    ウイルス。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の組換えウイルスに由来
    の分子量が２６ｋ、３０ｋ及び３５ｋからなるＢ型肝炎
    ウイルス抗原群から選ばれる１種以上の抗原。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の組換え水痘ウイルスゲ
    ノムＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 水痘及びＢ型肝炎に対するワクチンであ
    って、請求項１に記載の組換え水痘ウイルスを、免疫を
    奏する量、含有する生ワクチン。
  5. 【請求項５】 Ｂ型肝炎の診断剤であって、請求項２に
    記載の抗原を、抗原抗体反応を呈する量、含有する診断
    剤。
  6. 【請求項６】 岡水痘生ワクチン株のゲノムＤＮＡにＢ
    型肝炎表面抗原遺伝子のＨpa II断片を挿入連係して組
    換え水痘ウイルスを作成する方法であって、Ｈpa II断
    片の５'末端がゲノムＤＮＡチミジンキナーゼ遺伝子の
    開始コドンと解読枠を一致するようにＨpa II断片をチ
    ミジンキナーゼ遺伝子のＨinc II部位に挿入することを
    特徴とする組換え水痘ウイルスの作成法。
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