CN114107230A

CN114107230A - 一种牛疱疹病毒1型ul41缺失毒株及其获取方法

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Publication number: CN114107230A
Application number: CN202111446165.8A
Authority: CN
Inventors: 高明春; 戴海越; 郭永丽; 王君伟; 陈佳奇; 孟野; 佟欣; 吴佳楠; 杨鸿术; 安冉
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114107230B

Abstract

本发明提供了一种牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株及其获取方法，属于基因工程技术与生物制品制备技术领域。提供一种牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株和提高BHV‑1毒株编辑效率。本发明提供了一种牛疱疹病毒(Bovine herpes virus type Ⅰ)1型UL41缺失毒株，所述牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株是以通过敲除亲本病毒中UL41基因得到的毒株，本发明所构建的牛疱疹病毒1型缺失毒株在病毒生物学特性上与亲本毒株表现出一定的差异性，即缺失毒株的复制起始时间要早于亲本毒株约12小时，且相较于亲本毒株，缺失毒株对酸性环境和温度变化表现出更强的敏感性，而对碱性环境的敏感程度与亲本毒株相近。

Description

一种牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株及其获取方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株及其获取方法。

背景技术

牛疱疹病毒1型(Bovine herpes virus type Ⅰ，BHV-1，以下简称为BHV-1)是造成牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)的主要病原体，因此又称为牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)。BHV-1为双链DNA病毒，基因组全长约为138kb，编码73种蛋白，其中包括gB、gC、gD和gE等11种包膜糖蛋白。BHV-1可在三叉神经建立潜伏感染，组织嗜性较为广泛，可感染呼吸系统、生殖系统、神经系统和眼结膜等，还有垂直传播的特性。临床上，患病肉牛育肥率大幅降低，繁殖率显著下降，且严重影响奶牛产奶量，对世界范围内养牛行业有着巨大的经济冲击。19世纪50年代，美国首次发现BHV-1，我国于20世纪80年代从新西兰进口牛只中首次分离获得BHV-1。该病毒呈世界范围流行，世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)将牛传染性鼻气管炎列为通报性疫病，我国将其列为二类动物疫病。BHV-1在我国的感染率相对较高，2013年之前BHV-1感染率为32％，2013年以后升至43％，目前我国的防疫手段主要为灭活疫苗等常规疫苗免疫。因灭活疫苗和弱毒疫苗存在一些缺点，包括免疫期短，免疫原性较差，不能在体内增殖(灭活疫苗)；生物安全性不高，运输受环境影响大(弱毒疫苗)等，故而，对BHV-1新型疫苗的研制显得尤为重要。较欧洲国家而言，我国对BHV-1基因缺失疫苗的研究较晚，但也通过基因工程同源重组技术构建了gE-/TK-双基因缺失BHV-1毒株，gG-/TK-双基因缺失疫苗，gN-/TK-/gG-三基因缺失毒株。近年来，亚单位疫苗，DNA疫苗，基因缺失疫苗和病毒活载体疫苗等基因工程疫苗的研究技术越发成熟与进步，但对BHV-1基因编辑疫苗的优化仍需要进行探索，原因在于BHV-1对常用疫苗生产适用的动物细胞敏感性存在较大差异，不能在猴肾、小鼠肾、豚鼠肾、鸡胚肾细胞以及KB和L细胞内增殖，也不能在鸡胚内增殖，而在源于牛的多种细胞均可得到良好扩增，且在实现质粒核酸类分子转染的过程中，鲜有适宜转染的牛源动物细胞系，常用于科学研究且适于BHV-1繁殖的MDBK细胞转染效率极低。为进一步加快BHV-1缺失毒株的研究与构建进程，我们提出一种更为便捷快速的BHV-1缺失毒株构建方法，以加速国内对BHV-1基因缺失毒株的研究进程，加快对基因缺失疫苗免疫效果的评估。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株，为了提高sgRNA的转染效率、提高BHV-1毒株基因编辑效率和为制备BHV-1基因缺失疫苗奠定基础。

本发明提供了一种牛疱疹病毒(Bovine herpes virus type Ⅰ)1型UL41缺失毒株，所述牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株是以通过敲除亲本病毒中UL41基因得到的毒株。

进一步地限定，所述UL41基因序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地限定，所述亲本病毒为牛疱疹病毒1型毒株。

本发明提供上述的牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株的构建方法，所述构建方法步骤如下：

(1)将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行寡聚化反应，得到sgRNA寡聚化片段；

(2)将步骤(1)获得sgRNA寡聚化片段与pX330-Cas9载体连接获得重组的载体pX330-sgRNA_UL41；

(3)将步骤(2)获得的重组载体转染牛肺成纤维细胞，然后再进行牛疱疹病毒1型病毒感染牛肺原代成纤维细胞，感染48h后经过冻融得到混合病毒悬液，进行蚀斑纯化，获得牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株。

进一步地限定，步骤(1)所述寡聚化反应的条件为：30℃水浴10min，95℃作用5min，自然降至室温。

进一步地限定，步骤(1)所述寡聚化反应的体系为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、ATP、T4 PNK、10×T4 PNK Buffer和ddH₂O。

进一步地限定，步骤(3)所述重组载体以4μg/孔剂量转染牛肺成纤维细胞；所述牛疱疹病毒1型毒株以0.01MOI感染牛肺原代成纤维细胞。

本发明提供一种疫苗组合物，所述组合物含有疫苗上可接受的载体和权利要求1-3任一项所述的牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株。

进一步地限定，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗，二价疫苗或多价疫苗。

进一步地限定，所述牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株含量≥2.14×10⁸TCID₅₀/mL。

有益效果：本发明所构建的牛疱疹病毒1型缺失毒株在病毒生物学特性上与亲本毒株表现出一定的差异性，即缺失毒株的复制能力要早于亲本毒株，且相较于亲本毒株，缺失毒株对酸性环境和温度变化表现出更强的敏感性，而对碱性环境的敏感程度与亲本毒株相近，在一定程度上可与亲本毒株进行区别。本发明所构建的牛疱疹病毒1型缺失毒株方法对BHV-1重组缺失毒株的构建提供更为快捷的实现方式，可为基因缺失毒株制备的疫苗提供更为方便快捷的研究方式，同时，本发明为牛疱疹病毒1型缺失毒株的构建提供新的思路及方法。

附图说明

图1为BHV-1 UL41 sgRNA设计及特定编辑位点示意图；

图2为pX330-sgRNA_UL41重组质粒鉴定；其中A是pX330-sgRNA_UL41 1-3重组质粒PCR鉴定示意图，B是pX330-sgRNA_UL41 1-3重组质粒EcoR V酶切鉴定示意图；

图3为BL与MDBK转染效率对比图；其中A是BL和MDBK细胞过表达含EGFP基因表达质粒直接荧光检测转染效率对比图，B是pX330-sgRNAU_L41重组质粒于MDBK和BL细胞瞬时转染过表达Western blot鉴定转染效率对比图。

图4为pX330-sgRNA_UL41重组质粒BL细胞瞬时转染Western blot鉴定图；

图5为BHV-1 UL41缺失毒株Western blot初筛结果；其中A-D中标注A1-A31为经sgRNA_UL41-1向导编辑毒株，B1-B31为经sgRNA_UL41-2向导编辑毒株，C1-C31为经sgRNA_UL41-3向导编辑毒株，检测BHV-1 UL41和UL24蛋白表达抗体为所制备兔抗多克隆抗体；

图6为BHV-1 UL41缺失毒株UL41基因PCR扩增，其中，UL41^-是BHV-1 UL41缺失毒株基因组，-是水对照；

图7为抗原优势区原核表达构建图，其中M：DNA Ladder Marker，1：pET30a vectorKpn I+Hind III，2：pET30a vector BamH I+Xho I，3：gel-BHV-1 UL24 BamH I+Xho I，4：gel-BHV-1 UL26 Kpn I+Hind III，5：gel-BHV-1 UL41 BamH I+Xho I；

图8为原核表达质粒酶切鉴定图；其中M；DNA Ladder Marker，1：pET30a-BHV-1-UL24重组质粒，2：pET30a-BHV-1-UL24重组质粒Xho I单酶切，3：pET30a-BHV-1-UL24重组质粒Xho I+BamH I双酶切，4：pET30a-BHV-1-UL26重组质粒，5：pET30a-BHV-1-UL26重组质粒Xho I单酶切，6：pET30a-BHV-1-UL26重组质粒Xho I+Bgl II双酶切，7:pET30a-BHV-1-UL41重组质粒，8：pET30a-BHV-1-UL41重组质粒Xho I单酶切，9:pET30a-BHV-1-UL41重组质粒Xho I+BamH I双酶切；

图9为原核重组蛋白诱导表达；其中A是BHV-1 UL24重组蛋白，B是BHV-1 VP24重组蛋白，C是BHV-1 UL41重组蛋白；M：非预染蛋白分子Marker，1：pET30a(+)空载体蛋白，2：IPTG诱导后全菌体重组蛋白，3：全菌体重组蛋白超声后上清，4：全菌体重组蛋白超声后沉淀，5：切胶纯化后重组蛋白；

图10为原核重组蛋白诱导表达的his单抗Western blot鉴定；A是BHV-1 UL41重组蛋白，B是BHV-1 VP24重组蛋白，C是BHV-1 UL24重组蛋白；M：PageRuler^TM预染蛋白分子Marker，1：pET30a(+)空载体蛋白，2：IPTG诱导后全菌体重组蛋白，3：全菌体重组蛋白超声后上清，4：全菌体重组蛋白超声后沉淀，5：重组蛋白切胶纯化后蛋白；

图11为兔抗BHV-1 UL24/VP24/UL41多克隆抗体效价测定；其中A是兔抗BHV-1UL41多克隆抗体效价，B是兔抗BHV-1 UL24多克隆抗体血清效价，C是兔抗BHV-1 VP24多克隆抗体效价；

图12为兔抗BHV-1 UL24/VP24/UL41多克隆抗体特异性鉴定；其中A是BHV-1 UL41重组蛋白原核表达，一抗为兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体，B是BHV-1 VP24重组蛋白原核表达，一抗为兔抗BHV-1 VP24多克隆抗体，C是BHV-1 UL24重组蛋白原核表达，一抗为兔抗BHV-1 UL24多克隆抗体；M：PageRuler^TM预染蛋白分子Marker，1：pET30a(+)空载体蛋白，2：IPTG诱导后全菌体重组蛋白，3：全菌体重组蛋白超声后上清，4：全菌体重组蛋白超声后沉淀，5：重组蛋白切胶纯化后蛋白；

图13为兔抗BHV-1 UL24/VP24/UL41多克隆抗体特异性检测，其中A是100MOI BHV-1感染MDBK细胞12h后UL24/VP24/UL41病毒蛋白表达western blot鉴定，B是100MOI BHV-1感染MDBK细胞2h，4h，6h，8h，10h，12h和24h UL24/VP24/UL41病毒蛋白表达western blot鉴定；

图14为兔抗BHV-1 UL24/VP24/UL41多克隆抗体特异性测定，其中A是兔抗BHV-1UL24多克隆抗体作一抗检测结果，B是兔抗BHV-1 VP24多克隆抗体作一抗检测结果，C是兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体作一抗检测结果；M：PageRuler^TM预染蛋白分子Marker，1：BHV-1UL24重组蛋白，2：BHV-1 VP24重组蛋白，3：BHV-1 UL41重组蛋白；

图15为BHV-1 UL41缺失毒株与亲本毒株蚀斑形成形态大小比较示意图，其中A是MDBK细胞100倍光学显微镜下无CPE细胞形态，B是BHV-1 wt 10^-4稀释感染MDBK细胞蚀斑形成细胞CPE 100倍光学显微镜观察形态，C是BHV-1 UL41^-10^-4稀释感染MDBK细胞蚀斑形成细胞CPE 100倍光学显微镜观察形态，D是MDBK细胞无病毒感染蚀斑形成图，E是BHV-1 wt 10^-4稀释感染MDBK细胞蚀斑形成图，F是BHV-1 UL41^- 10^-4稀释感染MDBK细胞蚀斑形成图；

图16为病毒生长曲线的测定；其中，横坐标是时间，纵坐标是病毒滴度TCID₅₀/mL；

图17为BHV-1 UL41缺失毒株与亲本毒株对酸碱稳定性的测定，其中横坐标是组别，纵坐标是TCID₅₀/mL；

图18为BHV-1 UL41缺失毒株与亲本毒株对温度敏感性的测定，其中横坐标是组别，纵坐标是TCID₅₀/mL；

图19为BHV-1 UL41缺失毒株与亲本毒株细胞嗜性检测其中横坐标是组别，纵坐标是TCID₅₀/mL。

具体实施例

细胞及病毒：BL细胞为牛肺原代成纤维细胞，由本实验室制备；BHV-1(HLJ-H157株由本实验室临床分离获得)为本实验室保存，DH5α，Rosetta^TM(DE3)plysS E.coil感受态细胞由本实验室制备并保存。BL细胞的制备：无菌超净台内取健康犊牛肺组织，用大量含100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素(双抗)和0.25μg/mL两性霉素B的1×PBS缓冲溶液冲洗肺叶表面，保障肺脏湿润，将肺叶边缘表面剥开，灭菌剪镊于暴露区剪取小块牛肺脏组织置于灭菌玻璃平皿内，用含带双抗和两性霉素的1×PBS浸泡剪碎，于另一新灭菌平皿内加少许含双抗及两性霉素的10％DMEM培养基，将剪碎的肺脏组织置于新平皿的培养基内，用1mL移液枪头将含带肺脏组织的培养基转移进75cm³细胞培养瓶，于瓶内补加少量细胞培养液至肺脏组织碎块可触碰培养瓶底，且组织碎块周围恰好能接触到少量细胞培养液。将细胞培养瓶置于37℃含5％CO₂细胞培养箱内培养48～96h，至有成纤维状细胞从组织块周围爬出，待成纤维细胞将组织块包裹且呈有规律排列时，进行细胞传代培养，收集的细胞为第一代BL细胞，用0.25％胰酶消化瓶内成纤维细胞，传代时瓶内可留存组织碎块，继续爬瓶培养。BL细胞在传代过程中，胰酶消化终止后20min即可贴壁，故而在传代分瓶后20min更换一次10％DMEM培养基以达到细胞纯化的作用，按代次分别冻存BL细胞。待细胞培养瓶内培养的细胞几近全部呈成纤维状生长，后可应用于本发明构建方法使用。

主要试剂：PCR预混体系MonAmpTM 2×Taq Mix(+Dye)购自莫纳生物技术有限公司(130511)；PrimeSTAR HS DNA聚合酶(R010A)，pMDTM18-T Vector克隆试剂盒(6011，内含Solution Ⅰ)，2×PrimeSTAR GC Buffer(A2801C)，ATP(4041)，文内提及未作特殊说明的所有限制性内切酶，非预染蛋白分子量Marker(26610)，T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)及缓冲液(2021A)购自大连宝生物；Bbs Ⅰ-HF限制性内切酶及快切缓冲液购自NEB公司(R3539)；Trans2K(BM101)/2K Plus Ⅱ(BM121)/15K(BM161)DNA Marker，T4 DNA连接酶及缓冲液(FL101)购自全式金生物公司，高纯质粒小量制备试剂盒购自百泰克生物技术有限公司(DP1002)；脂质体转染试剂Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司(L3000015)；PageRulerTM预染蛋白分子Marker(26617)及DMEM细胞培养基购自赛默飞世尔公司(12100046)；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科股份有限公司(110118611)；RIPA裂解液(弱)(P0013D)和蛋白酶抑制剂PMSF(ST505)购自上海碧云天。

向导RNA(sgRNA)寡聚核苷酸及U6-F(ATGGACTATCATATGCTTACCGTA)鉴定，Cas9表达载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒(商品名称)(Addgene ID 42230以下简称pX330-Cas9)由东北农业大学微生物实验室馈赠。

实施例1.

一、sgRNA及相关质粒构建

1.sgRNA由在线CRISPR sgRNA设计工具-ATUM(CRISPR gRNA Design tool–ATUM)设计并选取评分较高的三组sgRNA，分别连入pX330-Cas9载体，构建携带sgRNA序列的重组pX330-sgRNA_UL41 1-3。

sgRNA及其引物序列：

sgRNA-1-F：5’-CACCGATGTGCCAGCTTGGGCGCGT-3’(SEQ ID NO.1)；

sgRNA-1-R：5’-AAACACGCGCCCAAGCTGGCACATC-3’(SEQ ID NO.2)；

sgRNA-2-F：5’-CACCGCTTGGGCGCGTTGGCCCGCG-3’(SEQ ID NO.3)；

sgRNA-2-R：5’-AAACCGCGGGCCAACGCGCCCAAGC-3’(SEQ ID NO.4)；

sgRNA-3-F：5’-CACCGTACGCGTAACGCAGTAGCTT-3’(SEQ ID NO.5)；

sgRNA-3-R：5’-AAACAAGCTACTGCGTTACGCGTAC-3’(SEQ ID NO.6)；

三组sgRNA寡聚化方法如下表1获得sgRNA寡聚化片段：

表1

sgRNA-F(100μM)	1μL
		sgRNA-R(100μM)	1μL
ATP	4μL
		T4 PNK	1μL
10×T4 PNK Buffer	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	至20μL

混合均匀，30℃水浴10min，95℃作用5min，自然降至室温。

2.pX330-Cas9表达载体酶切如下：pX330-Cas9质粒在Bbs

和rCutSmart^TMBuffer缓冲体系中，37℃消化1h成线性状态，琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体片段。

连接方法如下表2：连接条件：16℃金属浴过夜。

表2

转化：将连接产物加入到体积为75μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激1min 30s，再放回到冰盒上冰浴2min，加入200μL LB液体培养基，于37℃恒温震荡摇床震荡培养1h后，将培养物均匀涂于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB细菌培养平板上，37℃倒置培养14～16h。

挑取单克隆菌落，接至5mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温震荡摇床培养10～12h，用质粒提取试剂盒抽提质粒。

pX330-sgRNA_UL41 1-3(pX330-sgRNA_UL41 1是含有sgRNA-1重组载体，pX330-sgRNA_UL41 2是含有sgRNA-2重组载体，pX330-sgRNA_UL41 3是含有sgRNA-3重组载体)重组质粒鉴定方法如下：多聚酶链式反应(PCR)鉴定体系如表3所示；

表3

重组质粒	0.1μL
		U6-F(10μM)	0.2μL
sgRNA-R(10μM)	0.2μL
		2×Taq Mix(+Dye)	5μL
ddH<sub>2</sub>O	至10μL

PCR条件为：95℃，30s，57℃，30s，70℃，30s；35个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增鉴定结果。

酶切鉴定条件如表4所示；

表4

重组质粒	2.5μL
		EcoR V	0.5μL
10×H缓冲液	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	6μL

结果：根据CRISPR/Cas9在线sgRNA设计软件按图1标定位点分别设计的三对sgRNA经寡聚化连入经Bbs I消化后的pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9载体，含带sgRNA的重组质粒经PCR和单酶切鉴定均与预期结果相符(图2)，经华大基因测序后鉴定sgRNA序列连入正确，重组pX330-sgRNA_UL411-3构建成功。

3.BL与MDBK细胞转染效率比对

为实现BHV-1基因组CRISPR/Cas9系统编辑，需选择转染效率相对较高且病毒嗜性偏好细胞系。BL和MDBK细胞瞬时过表达含带EGFP基因的重组质粒和pX330-sgRNA_UL411-3重组质粒，经免疫荧光显微镜和western blot检测细胞转染效率。

4.缺失毒株的构建

CRISPR/Cas9基因编辑系统定点编辑UL41断裂位点，通过细胞非同源重组修复系统，于BL细胞(牛肺原代成纤维细胞)中瞬时转染pX330-sgRNA_UL411-3重组质粒，分别过表达UL41三组sgRNA，后通过BHV-1在BL细胞内复制，Cas9编辑系统定点编辑断裂，以获取重组BHV-1 UL41缺失病毒，具体方法如下：

于细胞六孔板内按10⁶个/孔接种BL细胞，在细胞贴壁24h内，4μg每孔Lipo3000瞬时转染重组px330-sgRNA_UL411-3质粒到BL细胞中，24h后，BHV-1按0.01MOI剂量感作BL细胞2h，后更换2％胎牛血清DMEM细胞维持培养液继续培养，48h后，封口膜封闭六孔板，于超低温冰箱反复三次冻融病毒及细胞混合物，收集悬液，12000r/min，离心10min，收集上清液，保存于-80℃超低温冰箱。收集BHV-1感染48h后的混合病毒悬液(经病毒感染后的细胞经三次反复冻融后基本裂解，彻底释放出细胞内的病毒粒子，为降低细胞碎片本身对细胞可能造成的潜在影响，经离心后将细胞碎片舍弃)，进行蚀斑纯化。

病毒毒力的测定采用Reed-Meunch法，具体操作为，将病毒进行10倍倍比稀释，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8稀释病毒，100μL每孔感作MDBK细胞，每个稀释度进行10个重复孔并相应设置两个空白对照孔，37℃培养箱感作2h后，更换为2％DMEM，37℃细胞培养箱内继续培养48～72h，观察细胞病变情况，计算病毒滴度。

结果：1.将构建成功的pX330-sgRNA_UL411-3重组质粒分别瞬时转染进BL细胞，经Western blot图4鉴定，pX330载体中含带Flag标签的Cas9蛋白得以检出，即携带sgRNA的CRISPR/Cas9编辑系统成功导入BL细胞。

2.BHV-1 UL41重组缺失病毒Western blot筛选

收集三组sgRNA编辑过的病毒蚀斑，Western blot检测UL41蛋白表达情况。，图5A-D中，标记为A1-A32的毒株为经sgRNA_UL41-1编辑毒株，B1-B32为经sgRNA_UL41-2编辑毒株，C1-C32为经sgRNA_UL41-3编辑毒株。其中BHV-1 UL24为病毒蛋白检测对照组蛋白，即经BHV-1感染细胞可由western blot检测到UL24表达，UL41蛋白为重组缺失毒株筛选鉴定检测蛋白，即检测到UL41表达为野生型BHV-1或未发生移码异位表达毒株，而未检测到UL41表达的毒株即为BHV-1 UL41基因表达失败毒株，即BHV-1 UL41重组缺失毒株。此时UL41基因序列经编辑系统剪切编辑，非同源重组后出现UL41基因移码错位突变，从而使得UL41表达沉默。根据图5A显示，A2株可确定为BHV-1 UL41表达缺失株，故将A2再次进行两轮蚀斑纯化，提取病毒基因组，克隆UL41基因(图6)，连入克隆载体后送华大基因进行测序，测序结果如SEQ IDNO：1所示。

3.图3A中BL细胞绿色荧光信号显示过表达质粒转染成功且过表达，即转染效率较高，而在MDBK细胞中未检测到明显荧光信号，说明MDBK细胞不适用于质粒过表达转染。DAPI染色定位细胞位置，由蓝色荧光信号展现。图3B显示pX330-sgRNA_UL411-3重组质粒于BL细胞和MDBK细胞过表达情况，pX330-sgRNA_UL411-3重组质粒中含带Cas9-Flag基因，通过瞬时转染过表达，收集细胞裂解物，恒定细胞浓度后，经western blot实验检出重组质粒于BL细胞中成功过表达，而在科研常用牛源细胞MDBK中未检测到表达。经图3结果说明，BL细胞相较于MDBK细胞更适于细胞瞬时转染过表达实验，即BL细胞转染效率要显著高于MDBK细胞，故而我们通过BL细胞来实现重组缺失毒株的构建。

4.牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株含量≥2.14×10⁸TCID₅₀/mL。

实施例2.兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体的制备

1.UL41抗原优势区的设计与克隆

提取BHV-1病毒基因组，设计BHV-1 UL41克隆引物(F：CGGCGCTTTCGCTCGCCTCTTA(SEQ ID NO.7)；R：CGCCTCCTGGGACCGATTT(SEQ ID NO.8)，通过Perimer Star DNA聚合酶及2×GC Perimer Star Buffer扩增BHV-1 UL41基因，退火温度为57℃，琼脂糖凝胶电泳回收片段后，连入pMD18-T克隆载体，连接方法如下表5所示：

表5

胶回收UL41基因片段	4.5μL
		SolutionⅠ	5μL
pMD18-T vector	0.5μL

室温连接30min，转化宿主菌，经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定后送北京华大公司测序。利用DNA STAR 7.1.0(44)软件对BHV-1 UL41测序序列进行分析，选取亲水性高，可达性高，灵活性高和抗原性强的区域，拟定BHV-1 UL41第84-404位氨基酸为抗原表位优势区。UL41基因序列如SEQ ID NO.9所示，UL24基因序列如SEQ ID NO.10所示，UL26基因序列如SEQ ID NO.11所示；

UL24克隆引物：

UL24-S：CAGGTAGATACGCACGACGCGGAGA(SEQ ID NO.12)

UL24-A：TACAAAGACGCGGTCCGCGACTGCG(SEQ ID NO.13)

UL26克隆引物：

UL-26-S：GCCAACCTGACGTTCCTCTGCG(SEQ ID NO.14)

UL-26-A：CACCGTGTTATTTGCGGCTGTTT(SEQ ID NO.15)

BHV-1 UL24和UL26(VP24)基因克隆过程同BHV-1 UL41，UL24抗原优势区区域拟定为第69为至第271位氨基酸，VP24抗原优势区区域拟定为第115位至第488位氨基酸。多克隆抗体制备过程及多抗特异性敏感性鉴定方法同兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体。

结果：BHV-1 UL24/UL26/UL41原核表达载体的构建

获得经限制性内切酶酶切并回收的酶切后载体和酶切后片段(图7)，DNA连接酶将两者连接形成重组蛋白表达质粒，UL26编码VP24蛋白(UL26与UL24同为UL41蛋白表达对照蛋白，但在后续筛选过程中发现病毒UL26蛋白的表达量不如UL24，主要使用UL24蛋白作为病毒感染对照蛋白)，图8表明重组蛋白表达质粒构建成功，经华大基因测序无移码突变。

2.BHV-1 UL41重组蛋白原核表达及兔抗BHV-1 UL41重组蛋白免疫原的制备

对拟定抗原优势区进行亚克隆，UL41抗原表位优势区特异性引物(F：CGCGGATCCCGCGGCATCCACGGGG(SEQ ID NO.16)；R：CCGCTCGAGTTAGAGCCGAGGGTCGGG(SEQ IDNO.17)进行优势截短区扩增。BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶亚克隆片段及pET30a(+)载体，经T4 DNA连接酶连接，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，经酶切鉴定后送华大公司测序。提取经测序无误的单菌株质粒，转化到Rosetta大肠杆菌感受态细胞中，载体挑取单菌落后，经1mmol/L IPTG诱导表达BHV-1 UL41重组蛋白。确定重组蛋白表达形式，将表达与目的蛋白预期大小相符的蛋白于丙烯酰胺凝胶中切下，切胶缓冲液为2M KCl盐溶液，于超低温冰箱反复冻融揉碎的胶粒，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色辅助验证免疫原纯化情况。

UL24抗原表位优势区特异性引物：

30a-UL24-S:GCGGATTCCTGCAAAGCCGGCGGCCCGATT(SEQ ID NO.18)

30a-UL24-A:CGCTCGAGATTGCCGCCCGACGCGTCTTTA(SEQ ID NO.19)

UL26抗原表位优势区特异性引物：

30a-UL26-S:GGGGTACCGCCCCCTCGCTCACGC(SEQ ID NO.20)

30a-UL26-A:CCCAAGCTTATTAGCGTGCGACGGTGGCGG(SEQ ID NO.21)

结果：BHV-1 UL41原核蛋白诱导表达及鉴定

将病毒蛋白重组质粒转入Rosetta表达菌株，0.1％IPTG诱导重组蛋白大肠杆菌表达，图9，图10结果表明重组BHV-1 UL26和UL41截短优势区蛋白主要为包涵体形式表达，UL24截短优势区蛋白主要为可溶性表达(三种兔抗病毒蛋白多克隆抗体的免疫原制备中，重组UL24和UL26蛋白为后续病毒感染细胞对照所用多抗的免疫原蛋白)。经切胶纯化后用以制备免疫原的蛋白也较为纯净，可用于兔抗病毒重组蛋白多克隆抗体的制备，重组蛋白将经SDS-PAGE线性化后切胶回收，后用胶粒包裹蛋白作免疫原。

3.兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体的制备和兔抗BHV-1 UL24和BHV-1 UL26多克隆抗体的制备

购进健康新西兰大白兔三只，用于多克隆抗体的制备，免疫原免疫剂量为1mg每只，初次免疫后间隔14天进行第二次免疫，时隔14天再进行加强免疫，加强免疫后第10天取兔全血，分离血清，即所制备多克隆抗体。于-40℃分装保存。

4.兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体特异性及敏感性鉴定

(1)兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体敏感性鉴定

镍离子金属螯合层析(Ni-NTA)亲和柱层析纯化重组BHV-1 UL41蛋白，经TGE透析液复性后浓缩，复性后重组蛋白用于兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体敏感性检测实验。重组蛋白按100μg/孔包被96孔ELISA板，重组蛋白以抗原包被液稀释，4℃包被过夜，弃孔内液体，更换5％脱脂牛奶37℃恒温培养箱封闭1h，1×PBST洗板5次，将制备的兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体按1:100开始2倍倍比稀释至1：204800，阴性血清作相同倍比稀释，100μL每孔37℃恒温培养箱孵育1h，1×PBST洗板5次，山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG按1：5000稀释，100μL每孔37℃恒温培养箱孵育1h，1×PBST洗板5次，TMB显色液100μL每孔加入ELISA板，室温避光显色10min，2M浓盐酸50μL每孔中止显色，OD_450nm读取吸光度。

(2)兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体特异性鉴定

BHV-1按100MOI感染MDBK 2h，4h，6h，8h，10h，12h和24h，弃上清培养液，1×PBS洗板3次，于冰盒上用细胞刮刀将板内细胞刮下，加入适当RIPA(含0.1μM PMSF)细胞裂解液，冰上裂解10min，免疫蛋白印迹法检测兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体的特异性。

结果：兔抗BHV-1 UL41多克隆抗体的制备与鉴定：经ELISA检测三种兔抗多克隆抗体血清效价均可达到1：102400(图11)，图12显示本发明中涉及制备的三种多克隆抗体特异性较为不错，与空载体蛋白基本不会产生抗原抗体反应，而在检测全菌体蛋白的结果中也表现出相对较为特异的反应性，图13进一步证实了所制备的三种兔抗病毒重组蛋白多克隆抗体具有良好的特异性，但BHV-1 UL26天然表达量低于UL24，见病毒感染24h检测结果，故而我们后续筛选UL41缺失重组病毒主要使用兔抗BHV-1 UL24多克隆抗体作病毒感染阳性对照。可用于重组缺失病毒的表达检测，图14表明所制备兔抗BHV-1 UL24/UL26/UL41多克隆抗体相互之间不发生抗原抗体反应，每种多抗具有良好的抗原特异性。

利用以下实验验证实验效果：

1.重组病毒的筛选与鉴定

MDBK细胞按2×10⁶个/孔接种六孔板，12h后更换细胞培养液为无血清DMEM，37℃恒温培养箱饥饿处理MDBK细胞1h。

将实施例1中步骤3收集的病毒混合悬液进行10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6倍系列稀释，取450μL不同稀释梯度病毒(10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6稀释度)37℃感作MDBK细胞2h，期间每隔15min晃板一次。

感作结束后，弃去培养板内病毒液，1×PBS洗板一次，2mL每孔铺入0.8％低熔点琼脂糖-2％胎牛血清DMEM混合液，室温静置1h至琼脂凝固，37℃恒温培养箱倒置培养48～72h，观察蚀斑生长情况。

挑取单个蚀斑分别接至48孔2％胎牛血清DMEM的MDBK细胞培养板，37℃培养48～72h，-80℃超低温冰箱反复冻融三次，收集细胞和病毒混合液，12000r/min，离心10min，收集上清液，细胞沉淀加适量RIPA(含0.1μM PMSF)细胞裂解液冰上裂解10min，免疫蛋白印记(WB)检测重组缺失病毒构建情况。经WB检测为UL41表达缺失的毒株，再进行两轮蚀斑纯化，提取病毒基因组，提取方法如下：

440μL病毒液于90℃水浴锅中水浴10min，待温度冷却后加入125μL蛋白酶K(终浓度为200μg/mL)和50μL 1％SDS。

56℃水浴40min后取出加入等体积约510μL酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)，充分混匀，10000r/min，离心5min，取上清液重复抽提一次。取上清液加2倍体积无水乙醇和伤情体积1/10的3M醋酸钠，轻柔颠倒EP管于-20℃沉降过夜。

将醇沉后样品取出，12000r/min，4℃离心15min。弃上清夜，加入200μL 70％乙醇，12000r/min，离心5min。弃去上清，室温干燥沉淀3～5min，加入30μL ddH₂O溶解沉淀，于-20℃保存。

利用BHV-1 UL41克隆引物(F：CGGCGCTTTCGCTCGCCTCTTA；R：CGCCTCCTGGGACCGATTT)多聚酶链式反应(PCR)扩增UL41表达缺失毒株中的UL41基因片段，扩增方法同实施例2步骤1。扩增基因后连入pMD18-T克隆载体，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑菌，提质粒，鉴定，送测序，方法同实施例2步骤1，测得序列结果见结果。

2.重组病毒的生物学特性

(1)病毒蚀斑形成形态大小比较：将亲本病毒和BHV-1 UL41重组缺失病毒按1MOI分别接种MDBK细胞，病毒感染24h后，收集病毒悬液，进行蚀斑形成实验检测，于100×光学显微镜下观察空斑形状，拍照记录病毒蚀斑形态及大小。

(2)重组缺失毒株与亲本毒株病毒生长曲线的测定：按照MOI＝0.01剂量将重组缺失毒株和亲本毒株接种至单层MDBK细胞12孔细胞培养板内，每板以2％胎牛血清DMEM培养基做正常对照，MDBK细胞分别在重组缺失病毒和亲本毒感染后6h，12h，24h，36h，48h，60h，72h收集病毒液，将收获的样品反复冻融3次后，12000r/min，离心10min，取上清过滤，按照Reed-Meunch方法分别测量两株病毒在上述7个时间点的病毒滴度，并绘制病毒的一步生长曲线。

(3)重组缺失毒株与亲本毒株毒力差异比较：重组缺失病毒与亲本毒分别于MDBK细胞上进行扩增，Reed-Meunch法计算病毒滴度，按MOI＝0.01接种MDBK细胞，37℃恒温培养箱培养至细胞出现病变，收集病毒液，测病毒滴度并进行分装。将重组缺失病毒和亲本毒株病毒悬液pH分别调制5和9，再调回培养基原pH，Reed-Meunch法计算经酸碱处理过的病毒滴度。

将分装病毒分别于42℃和56℃水浴锅作用30min，置于4℃保存30min，Reed-Meunch法计算经不同温度处理后的病毒滴度。

(4)重组缺失毒株与亲本毒株细胞嗜性差异比较：重组缺失病毒和亲本毒株按MOI＝0.01剂量分别接种BL(牛肺原代成纤维细胞)，PK-15(猪肾细胞)，BHK-21(乳仓鼠肾细胞)，72h后收集细胞混合液，反复冻融3次，12000r/min，离心10min。收集上清液，按Reed-Meunch方法分别计算重组缺失病毒和亲本毒在不同动物细胞上的病毒滴度。

结果：重组病毒的特性研究

1.病毒蚀斑形成形态大小比较：图15表明亲本毒株与UL41缺失毒株在蚀斑形成的形态和大小上均无明显差异，且形成的CPE也无显著差异。

2.重组病毒的生长曲线：BHV-1 UL41缺失毒株和亲本毒株的病毒一步生长曲线的测定，在7个时间点分别收集病毒悬液，计算各个时间点的病毒滴度。图16结果表明，BHV-1UL41缺失毒株相较于亲本毒株，缺失毒株病毒复制时间要早于亲本毒株，缺失毒株的复制起始时间要早于亲本毒株约12小时，但病毒复制情况整体呈现延缓的显现，即最终缺失毒株的病毒滴度与亲本毒株之间基本无差异，缺失毒株的病毒滴度为2.14×10⁸TCID₅₀/mL，亲本毒株病毒滴度为5.13×10⁷TCID₅₀/mL。

UL41为BHV-1晚期表达的一种皮层蛋白，也叫vhs(virion host shut-off)，参与病毒其它结构蛋白复制过程的调控，其酶底物特性与RNAse A相似，在病毒感染复制早期，UL41可降解宿主和自身mRNAs；病毒感染复制晚期，UL41可与其他皮层蛋白结合，不再发挥调节功能。结果说明在UL41缺失的情况下，UL41本身对病毒复制早期的抑制程度降低，使得BHV-1其他病毒早期蛋白更快速的转录，以完成病毒的复制，但随着病毒复制增殖时间的延长，缺失毒株病毒复制的速度反而呈现出相对于亲本毒株的减缓趋势，这可能与它参与的病毒和宿主蛋白的调节机制有关。

3.病毒滴度的测定

(1)pH敏感性测定

进一步对缺失毒株的环境敏感性进行检测，图17结果显示在pH＝5的环境下，亲本病毒的病毒滴度从5.13×10⁷TCID₅₀/mL下降到1.78×10⁵TCID₅₀/mL，重组缺失毒病毒滴度从2.14×10⁸TCID₅₀/mL下降到4.54×10²TCID₅₀/mL，BHV-1 UL41缺失毒株对酸性环境较亲本毒株更为敏感。在pH＝9的环境下，亲本病毒的病毒滴度从5.13×10⁷TCID₅₀/mL降低6.76×10⁵TCID₅₀/mL，重组缺失毒病毒滴度从2.14×10⁸TCID₅₀/mL下降到6.12×10⁶TCID₅₀/mL，缺失毒株和亲本毒株都对碱性环境均表现出一定的耐受力。

(2)温度敏感性测定

温度敏感性检测发现，BHV-1 UL41缺失毒株对环境温度的敏感程度较亲本毒株更强，缺失毒株与亲本毒株在56℃均可被灭活(图18)。

(3)重组病毒的细胞嗜性

为进一步探索BHV-1 UL41缺失毒株与亲本毒株之间是否存在细胞嗜性差异，根据病毒细胞嗜性检测，图19结果表明，BHV-1 UL41缺失毒株与BHV-1可在牛源细胞MDBK和BL进行病毒复制，而在PK-15和BHK-21等非本源动物细胞上未检测到病毒复制，未见明显差异。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株及其获取方法

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caccgatgtg ccagcttggg cgcgt 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aaacacgcgc ccaagctggc acatc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

caccgcttgg gcgcgttggc ccgcg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aaaccgcggg ccaacgcgcc caagc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caccgtacgc gtaacgcagt agctt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aaacaagcta ctgcgttacg cgtac 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cggcgctttc gctcgcctct ta 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgcctcctgg gaccgattt 19

<210> 9

<211> 1379

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atggggctct tcaagctact gcgttacgcg tacggcaatc ggctggtaaa gcacgacgcc 60

atcaccacgc cgccgggcgt gatgaccccg atcgcggtcg acctgtggaa cgtgatgtat 120

acgctcctgg agcgcttctg cggcgacgcg cccggcggcg tcggagacgc cgccgcgacc 180

gcgcgctgct tcctctcgct gctgcggatg ctgctcaagc gctcctacta cccgatcttt 240

gtagcggacc gcggcatcca cggggaccgg cgcgccacgc ggggcgccaa ggccatcgtg 300

gcgcagacga tgcgcgccgt cggcggctcg ggccgcctcg ggcggctcgt cagcgacgat 360

tatacctcgg aggacgaggt gctgggcgcg tacgagtacc ccgtcccgca cgcggacgcg 420

gcagccgacg acgacgagga ggcaacggcg aaggaatttg ccgggcgcgc ctcggcaggg 480

gccgcgcggg ccaacgcgcc caagctggca catcgcgtgt gcgtgagcct catccgcttt 540

ttgggctacg cgtacgtcga cgccgccgag acggaggcag acgacgtctg cgcaaacctc 600

ttccacacaa acaccgtggc gcacatctac acgacggaca cggacatgat ccttatgggc 660

tgtgacctga ttctggacgc ggcgccgttg ttccccccga cgctacgctg ccgcgacgtg 720

ctggcgtcgc tggggctcac gtacggccag ttcctcgcga cgttcgtgcg ctgccacacc 780

gacttgcacc agccgccgat gctgcgctcg gtgcagcagg tggtgcgggg gctgcggcgc 840

gctgccgagg ccgagcccgc gaccaccgag acggagtctg gctccgagcg cgagccggag 900

tccgagctcg gtcgtccggg cgctgggccg cggcgccggt tgccgcccgc ggtcgacgac 960

ccgctgaaaa ctacgacgcc ggcgaccgtg gaagcgcaca gcgtgcgcat gaagtataca 1020

tctcggtacc ctccgattgc gcagacgtgc gccgacgcgc tgcggctgct gccggcgtcc 1080

cagacgcgcg gcggcgtgct ggagcgcaaa tttgtaaagc acgtggtgga cacgatcgcg 1140

ccgcgaatgc gcgggcgctg ggccgtgctg aagcgcgtgc ccatcgcaca ggaagccccc 1200

gaccctcggc tcgtgtacga caccatcgtg agcgccgtgg gcagcgccgc cgaggccgac 1260

acgctgatgg ggctcttctg gaagcacatc cccactccac ccccatttgc cagggtgctg 1320

gcagactact gggacgaggc cccgcggggc cggggtcgcg acggacaacc cgccaataa 1379

<210> 10

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atggcgcgcg accgcgaccg acgtgcgcgc ctgcgcgccg ggatccggtg ccacagccgc 60

ttttacgagg cgctggcttg cgacgcacgc gcggcggttg gcgcgcagaa gctgcgcccg 120

cgcctcgccc agcttttggg caagttcggc gccccggagg tttttaagca ggtcgtgggc 180

gtgtctctga gctttgaggt aaacctgcaa agccggcggc ccgattgcgt gtgcctactc 240

cgggtcgcgg aggcagggca cgcccgggcc gtctgtctta tcgtggagct gaagacgtgc 300

cgtttttcaa cgaacatgaa cacgcccagc aagatggacc agcgcctcgg ggggctgcgg 360

cagctgcgcg actcggcccg gcttgtgcgc gatctcgccc ccccgggccc ggacccggtg 420

gtcctagcgc cggtgctggt gttcgtctcc cagcggggca tgcgcgtgct cagggtgacg 480

cgcctgccgg cccagacgat cgctagcaac gcggcgcgcc ttgaggctat aatagccggg 540

ctcgccgagt acgccccatt cgcgcgcgcg cgttcgcggc gagcggggcg atcgccgcgg 600

ggcaaacgca aagccgagca accgcggccg cggcggcaga aggggcagcc gcttcccctg 660

gctacgggca aaagggcggc tgtggccgcc accccgcggc cgcccgccgg cgaccccggc 720

cctgctgagg ccggggagag cggccgcccg gtgggcggca gcaggcacgc gggcaacagc 780

gccggcgggt gcgctaaaga cgcgtcgggc ggcgcggcgt gcctgggcga aatttcggcg 840

ctctttgtgg cggcatcggg gccatggcgc tcgggcgttt ag 882

<210> 11

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atggcggacg cgcccgacgg gggcagcgcc gacgcgcgcg tggacgccga gccttcggcg 60

cttgcgcgcg cgagcatgcc cgtctatgtg ggcgggtacc ttgccctcta cggcatgggc 120

gacgaaggag agctcgtcct cacgcgcgag caggtggcgc gcgcgctgcc gcccgccgcc 180

ccgctgccga tcaacattga ccacgcaagc gcctgcgaag tcggcgccgt gctagccctc 240

gccgacgacg acgccgggct gtttttcgtc ggcgtcatca actgcccgca actggccgac 300

acgctcgcgg gcgtggcgca ccccgcgttc ttcggcgccg acgccccctc gctcacgccg 360

cgcgagcgct tcctgtacct cgtcagcaac tacttgccct ccgtgtcgct ctcctcgcgc 420

cgcctcgcgc ccgacgaaga ggccgacggc acgctctttg ctcacgtcgc gctgtgcgtg 480

ctaggccgcc gcgtcgggac catcgtcacg tacgacgcca cgccggacgc ttgcgtggcg 540

cccttccgcc ggctctcgcc gcgcgcgcgc gccgccctcc tcgccaacgc ggaggccgcg 600

cgcgcggccc tcggcgaccg cgcctggccg gtgccccgcg aggcgctggc gcaaacgctg 660

ctctcgaccg ccgtgaacaa catgctcgtc cgggacaagt gggacaccgt ctcgcgtcgc 720

cgccgcgagg cgggcatcgc gggccacacg tacctgcagg cgagcgcggt gttcccgctg 780

ccgaccgggg gggaggggcc agagcgcacg ggcgggcgcg agcgggctca aaagagcgcg 840

gtcgcgggcg gcgtctgcat tgcgcttccc gtcgcgggcg gacgcgcacg ccagccagag 900

ctttcgccgg caccgccccc gccgccccca ccgcctgcca tgagcgcagc gcaccaagcc 960

ggtgcggccc cggcgcaccc cctgccggct ggggactacg tgtacgtgcc gactgctcag 1020

tacaaccagt tggtcgtcag ccaggcccgg ggggcggcga tggccgccgc gcctccgccg 1080

gctccgtatt ttttgccggc cgccgccgcc gctgccgccg ccgctccgcc cccgatgccg 1140

ggctggtacg gcgccgccgg cgccgcgccc tggcaccctg ggtacggttt cccgccgccg 1200

gggctcgaga gccaaatcat ggccctggcc ggcgccatcg ccgacggccg acgcgtgcaa 1260

gcgcacggcg cggacggctc gggctacgac ggccccctcg accgccgccc cctggccaag 1320

cggcgccggt acaactggga ccacccgcgc ggccggagcg gcggcggcga cgacgacgag 1380

gcctactacc cgggcgaggg cgcgccggcc gagctgccgc ctcaccacca ctctcctccg 1440

ccgccgcacc cgccaccgtc gcacgctctt tccaagctcg cctccgccgt gtcctcgctg 1500

cagcaggagg tgagccagct gagggccggc tacccctacg gtcctgcctt cgctgctgcg 1560

caacacccgc ccgcggcgca tttgccgtgc ttgccgcagc agtacactgc cccgccccgg 1620

gtaggggcgg gcccggccca agtgccgacc ctcgcaccgg cccaggcgcc ggcgcaggcg 1680

ctgtccgttc ccgccgtagc tgcagcacca gcgaccgtcg cggccgccgc cgccgtcggg 1740

ccgccggagg agcccggggt ggccgcgacg gtggatgcca gcgccatggc cagcctgccg 1800

cccgcccaac cgccgcaagc gtgcgacccg gcggaaatct tcgtggccca gatgatgcgg 1860

cagcgctag 1869

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

caggtagata cgcacgacgc ggaga 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tacaaagacg cggtccgcga ctgcg 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gccaacctga cgttcctctg cg 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

caccgtgtta tttgcggctg ttt 23

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

cgcggatccc gcggcatcca cgggg 25

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ccgctcgagt tagagccgag ggtcggg 27

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gcggattcct gcaaagccgg cggcccgatt 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cgctcgagat tgccgcccga cgcgtcttta 30

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ggggtaccgc cccctcgctc acgc 24

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

cccaagctta ttagcgtgcg acggtggcgg 30

Claims

1.一种牛疱疹病毒(Bovine herpes virus typeⅠ)1型UL41缺失毒株，其特征在于，所述牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株是以通过敲除亲本病毒中UL41基因得到的毒株。

2.根据权利要求1所述的牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株，其特征在于，所述UL41基因序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求1所述的牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株，其特征在于，所述亲本病毒为牛疱疹病毒1型毒株。

4.一种权利要求1-3任一项所述的牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株的构建方法，其特征在于，所述构建方法步骤如下：

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述寡聚化反应的条件为：30℃水浴10min，95℃作用5min，降至室温。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述寡聚化反应的体系为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、ATP、T4 PNK、10×T4 PNK Buffer和ddH₂O。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述重组载体以4μg/孔剂量转染牛肺成纤维细胞；所述牛疱疹病毒1型毒株以0.01MOI感染牛肺原代成纤维细胞。

8.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物含有疫苗上可接受的载体和权利要求1-3任一项所述的牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为二联疫苗、多联疫苗、二价疫苗或多价疫苗。

10.权利要求8或9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述牛疱疹病毒1型UL41缺失毒株含量≥2.14×10⁸TCID₅₀/mL。