CN114908065B - 猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建得到猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株，即以猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗毒株Bartha‑K61为骨架包含变异毒株HB1201免疫保护基因gB、gC、gD的嵌合病毒，命名Bartha‑gBCDHB1201。该弱毒疫苗株遗传性质稳定，复制效率高且安全性好，同时能刺激机体产生针对国内流行的变异毒株的中和抗体，Bartha‑gBCDHB1201疫苗株能更好的阻止感染仔猪发病、降低组织病毒载量和减轻病毒感染造成的脏器损伤，提供100％完全免疫保护，适用于弱毒活疫苗与灭活疫苗的制备和使用。

Description

猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用
技术领域
本发明是关于病毒基因工程的技术领域，特别是关于一种猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用。
背景技术
伪狂犬病（Pseudorabies，PR或Aujeszky’s disease，AD）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染猪引起的急性、接触性传染病，PRV是具有囊膜的双链DNA病毒，属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）、水痘病毒属（Varicellovirus）的成员，该病毒引起猪发生亚临床感染和潜伏感染，主要临床症状仔猪表现为高热、食欲不振、呼吸急促或者困难、腹泻和震颤、共济失调，抽搐，瘙痒等症状；母猪表现为流产，产死胎或者木乃伊胎；公猪表现为睾丸肿胀，萎缩等。
在2011年我国免疫Bartha-K61疫苗的猪场相继暴发由PRV变异株引起的PR，研究表明，PRV变异株的毒力显著增强，抗原性发生变异，能够突破经典疫苗株Bartha-K61提供的免疫保护。为更好的控制PRV变异株的疫情，国内学者构建了一系列的以变异株为遗传背景的基因缺失疫苗，但是这些疫苗的安全性和保护效果仍需要进一步研究和评价。就猪伪狂犬病病毒所属的疱疹病毒而言，由于其基因组庞大，过去通常利用同源重组或者细菌人工染色体技术（BAC）对其进行基因编辑。但是同源重组费时费力，细菌人工染色体技术（BAC）构建和筛选比较困难。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用，病毒感染后，该弱毒疫苗株能够更好的阻止仔猪发病、降低组织病毒载量和减轻脏器损伤。
本发明的另一目的在于Bartha-gBCDHB1201的抗原含量高，能诱导机体产生更高的具有交叉中和能力的中和抗体。
为实现上述目的，本发明提供了猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，包括以下步骤：
（1）以PRV疫苗毒株Bartha-K61为骨架，利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha-K61的基因组第53203~54617位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gC基因，得到嵌合病毒Bartha-gCHB1201，所述gC基因为HB1201基因组第52665~54100位核苷酸；
（2）利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha-K61的基因组第119529~120650位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gD基因，得到嵌合病毒Bartha-gCDHB1201，所述gD基因为HB1201基因组第114954~116081位核苷酸，所述gD基因在CRISPR/Cas9系统的编辑区域进行序列同义突变遗传标记；
（3）利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha-K61的基因组第16575~18803位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gB基因，得到嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201，所述gB基因为HB1201基因组第15760~17982位核苷酸，所述gB基因在CRISPR/Cas9系统的编辑区域进行序列同义突变遗传标记。
在本发明的一实施方式中，步骤（1）包括：
A、序列分析PRV疫苗毒株Bartha-K61与变异毒株HB1201基因组的gC基因，利用CRISPR/Cas9系统，在Bartha-K61的gC基因的编辑区域设计sgRNA，经退火处理形成双链sgRNA，并将其克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-gC和pX335-right-gC；
B、以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gC编辑区域两端的同源臂Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm；
C、以pEGFP-N2为模板PCR扩增GFP基因，将扩增后的GFP基因分别与Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm进行融合，得到融合产物GFP-donor，将GFP-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序，GFP-donor测序正确后，PCR扩增，得到线性GFP-donor；
D、将疫苗毒株Bartha-K61的基因组、线性GFP-donor、pX335-left-gC和pX335-right-gC共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒BarthaΔgC-GFP；
E、利用CRISPR/Cas9系统，在GFP基因两端设计sgRNA，将退火处理形成的双链sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-GFP和pX335-right-GFP；
F、以变异毒株HB1201基因组为模板，PCR扩增所需gC基因区域（HB1201基因组第52665~54100位核苷酸），得到扩增产物gCHB1201，利用融合PCR，将gCHB1201分别与Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm进行融合，得到融合产物gC-donor，然后将gC-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序正确后，PCR扩增，得到线性gC-donor；
G、将BarthaΔgC-GFP基因组、线性gC-donor、pX335-left-GFP和pX335-right-GFP共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒Bartha-gCHB1201。
在本发明的一实施方式中，步骤（2）包括：
a、序列分析PRV疫苗毒株Bartha-K61与变异毒株HB1201基因组的gD基因，利用CRISPR/Cas9系统，在Bartha-K61的gD基因编辑区域设计sgRNA，将退火处理形成的双链sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-gD和pX335-right-gD；
b、以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gD基因编辑区域两端的同源臂，gD-left-arm和gD-right-arm；
c、以变异毒株HB1201为模板，PCR扩增gD所需基因区域（HB1201基因组第114954~116081位核苷酸），得到扩增产物gDHB1201， PCR融合gDHB1201与gD-left-arm和gD-right-arm，得到融合产物gD-donor，其中，在CRISPR/Cas9系统中的sgRNA靶向识别gD-donor的序列设置同义突变遗传标记，然后将gD-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序正确后，PCR扩增，得到线性gD-donor；
d、将Bartha-gCHB1201基因组、线性gD-donor、pX335-left-gD和pX335-right-gD共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒Bartha-gCDHB1201。
在本发明的一实施方式中，步骤（3）包括：
①序列分析PRV疫苗毒株Bartha-K61与变异毒株HB1201基因组的gB基因，利用CRISPR/Cas9系统，在Bartha-K61的gB基因编辑区域设计sgRNA，将退火处理形成的双链sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-gB和pX335-right-gB；
②以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gD基因编辑区域两端的同源臂gB-left-arm和gB-right-arm
③以变异毒株HB1201为模板，PCR扩增gB所需基因区域（HB1201基因组第15760~17982位核苷酸），得到扩增产物gBHB1201，然后PCR融合gBHB1201与gB-left-arm和gB-right-arm，得到融合产物gB-donor，其中，在CRISPR/Cas9系统中的sgRNA靶向识别gB-donor的序列设置同义突变遗传标记，将gB-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序正确后，PCR扩增，得到线性gB-donor；
④将Bartha-gCDHB1201基因组、线性gB-donor、pX335-left-gB和pX335-right-gB共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201。
本发明还提供一种猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株，如上述的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法得到的嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201。
本发明还提供如上述的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株在制备弱毒活疫苗和灭活疫苗中的应用。
与现有技术相比，根据本发明的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用，
猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株Bartha-gBCDHB1201免疫仔猪表现较强的安全性，PRV变异株HB1201感染仔猪后，Bartha-gBCDHB1201疫苗保护能更好的阻止仔猪发病、降低组织病毒载量和减轻病毒感染造成的脏器损伤，提供100%完全的免疫保护，显著减轻PRV变异株HB1201感染后的仔猪临床症状和死亡率。gC非必需基因的编辑，增加拯救重组GFP绿色荧光标签的嵌合病毒，构建嵌合病毒的过程中利于正向与反向筛选，提高筛选的成功率；gB与gD必需基因的编辑，对sgRNA靶向gB供体的区域进行同义突变，成功拯救Bartha-gBHB1201嵌合病毒，拯救成功率为100%，同义突变避免了sgRNA切割供体的几率，增加了同源重组的效率。Bartha-gBCDHB1201的体外增殖能力与HB1201无差异，显著高于亲本毒株Bartha-K61，病毒滴度可达到108.50 TCID50/mL，最大可相差1个滴度，抗原含量高，嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与变异株HB1201具有相同的更好的抗原性。Bartha-gBCDHB1201能诱导机体产生更高的具有交叉中和能力的中和抗体，适用于弱毒活疫苗与灭活疫苗的制备和使用。
附图说明
图1为本实施例1的利用CRISPR/Cas9编辑PRV基因组策略示意图，其中图1A图为非必需基因（gC）嵌合病毒构建示意图，图1B图为必需基因（gB和gD）嵌合病毒构建示意图。
图2为本实施例1的以拯救HB1201ΔgC-GFP为例，线性供体与质粒供体对CRISPR/Cas9编辑PRV基因组成功率的影响示意图。
图3 为本实施例2的CRISPR/Cas9的sgRNA靶向供体基因的区域同义突变示意图；图3A为以拯救嵌合病毒Bartha-gBHB1201为例，供体同义突变和无突变的拯救病毒噬斑图；图3B为分析同义突变对同源重组效率的影响示意图；图3C对拯救病毒噬斑单克隆测序分析示意图。
图4为本实施例2的嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201的间接免疫荧光鉴定示意图。
图5为本实施例2的嵌合病毒测序鉴定示意图。
图6为本实施例3的嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201在Vero CCL81细胞上噬斑大小示意图（6A和6B）与体外增殖曲线图（6C）。
图7为本实施例4的Bartha-K61阳性血清对嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201的交叉中和能力图。
图8为本实施例5的嵌合病毒免疫仔猪后体温及日增重变化，图8A为Bartha-K61与嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201免疫仔猪的体温变化示意图；图8B为Bartha-K61与嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201免疫仔猪的日增重变化示意图。
图9为本实施例5的嵌合病毒免疫仔猪后的gB和gE抗体和中和抗体水平动态图，图9A为Bartha-K61与嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201免疫仔猪的gB和gE抗体动态图，图9B嵌合病毒Bartha-K61与嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201抗血清交叉中和变异株HB1201的能力图。
图10为本实施例6的PRV变异株HB1201攻毒已免疫仔猪后的临床评分、体温、生存曲线及日增重变化示意图。
图11为本实施例6的攻毒后仔猪肺脏、脑、扁桃体、肾脏和下颌淋巴结的剖检病理图。
图12为本实施例6的攻毒后仔猪肺脏、脑和肾脏的组织病理变化图。
图13为本实施例6的攻毒后仔猪肺脏、脑、扁桃体、肾脏和下颌淋巴结中病毒载量分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
一种猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，提供一种效率高，时间短，方便的编辑伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）基因组的方法，利用CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）/Cas（CRISPR-associated）系统有效完成PRV基因的缺失、置换和突变。
猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建得到猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株，即以PRV疫苗毒株Bartha-K61（GenBank: JF797217.1）为骨架包含变异毒株HB1201（GenBank: KU057086.1）免疫保护基因gB、gC、gD的嵌合病毒，命名为Bartha-gBCDHB1201。其中，Bartha-K61为自然缺失gE和gI基因的毒株，遗传性质稳定且安全性较好，避免了弱毒疫苗株毒力易返强的风险，同时毒株中置入的PRV变异毒株HB1201免疫原蛋白gB、gC和gD编码区，在接种后能够刺激机体产生针对国内流行的变异毒株的中和抗体，提高了该疫苗的免疫保护效力，适用于弱毒活疫苗与灭活疫苗的制备和使用。
本发明涉及的Vero CCL81细胞(非洲绿猴肾细胞)用DMEM培养基和胎牛血清培养均购自于Gibco公司，Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase购自与南京诺唯赞公司；Lipofectamine 2000购自于invitrigen公司；pEASY Blunt克隆质粒和大肠杆菌Trans10均购自北京全式金生物技术有限公司；质粒中提试剂与T4 DNA ligase均购自于Promega公司；仔猪购自于保定满城诚信养殖场。
猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，包括以下步骤：
（1）序列分析猪伪狂犬病毒（PRV）疫苗毒株Bartha-K61与变异株HB1201的gC基因，gC基因分子选取HB1201基因组第52665~54100位核苷酸，利用CRISPR/Cas9系统，在Bartha-K61的gC基因的编辑区域上设计sgRNA（gC基因的编辑区域上设计sgRNA的位置对应于Bartha-K61全基因组第53200~53219 bp位置和第54601~54620 bp位置），并将其克隆至pX335质粒中并分别命名为pX335-left-gC，pX335-right-gC；
（2）以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gC基因编辑区域两端的同源臂，扩增产物命名为Bartha-gC-left-arm，Bartha-gC-right-arm；
（3）以pEGFP-N2为模板PCR扩增GFP (Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)基因并命名为GFP，利用融合PCR，将GFP分别与Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm进行融合，融合产物命名为GFP-donor，然后将GFP-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，GFP-donor测序正确后，PCR扩增线性GFP-donor；
（4）将疫苗毒株Bartha-K61基因组、线性GFP-donor、pX335-left-gC和pX335-right-gC共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，嵌合病毒命名为BarthaΔgC-GFP；
（5）为敲除GFP基因，利用CRISPR/Cas9系统，在GFP基因两端设计sgRNA，并将退火处理形成的双链sgRNA克隆至pX335质粒中并分别命名为pX335-left-GFP，pX335-right-GFP；
（6）以变异毒株HB1201基因组为模板，PCR扩增所需gC基因区域即编辑区域（HB1201基因组第52665~54100位核苷酸），扩增产物命名为gCHB1201，利用融合PCR，将gCHB1201分别与Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm进行融合，融合产物命名为gC-donor，然后将gC-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，gC-donor测序正确后，PCR扩增线性gC-donor；
（7）将BarthaΔgC-GFP基因组、线性gC-donor、pX335-left-GFP和pX335-right-GFP共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，嵌合病毒命名为Bartha-gCHB1201，Bartha-K61基因组第53203~54617位核苷酸替换为HB1201基因组第52665~54100位核苷酸。
（8）序列分析疫苗株Bartha-K61与变异株HB1201的gD基因，gD基因分子选择HB1201基因组114954~116081位核苷酸，利用CRISPR/Cas9系统，在Bartha-K61的gD基因的编辑区域上设计sgRNA（基因的编辑区域上设计sgRNA的位置对应于Bartha-K61全基因组第119529~119548bp位置和第120631~120650bp位置），并将退火处理形成的双链sgRNA克隆至pX335质粒中并分别命名为pX335-left-gD，pX335-right-gD；
（9）以猪伪狂犬病毒（PRV）的疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gD基因编辑区域两端的同源臂，扩增产物命名为gD-left-arm，gD-right-arm；
（10）以猪伪狂犬病毒（PRV）的变异毒株HB1201为模板，PCR扩增gD所需基因区域即编辑区域（HB1201基因组第114954~116081位核苷酸），扩增产物命名为gDHB1201，然后PCR融合gDHB1201与gD-left-arm，gD-right-arm，融合产物命名为gD-donor，然后将gD-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，gD-donor测序正确后，PCR扩增线性gD-donor（注意：因为病毒基因组和donor存在相同的sgRNA靶向识别序列，因此为避免CRISPR/Cas9系统对donor的切割，将sgRNA靶向识别donor的区域序列进行同义突变）；
（11）将Bartha-gCHB1201基因组、线性gD-donor、pX335-left-gD和pX335-right-gD共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，嵌合病毒命名为Bartha-gCDHB1201，Bartha-K61基因组第119529~120650位核苷酸替换为HB1201基因组114954~116081位核苷酸，且其CRISPR/Cas9编辑区域存在序列同义突变遗传标记。
（12）序列分析疫苗株Bartha-K61与变异株HB1201的gB基因，利用CRISPR/Cas9系统，在gB基因的编辑区域上设计sgRNA（gB基因的编辑区域上设计sgRNA的位置对应于Bartha-K61全基因组第16575~16594bp位置和第18784~18803bp位置），并将退火处理形成的双链sgRNA克隆至pX335质粒中并分别命名为pX335-left-gB，pX335-right-gB；
（13）以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gB基因编辑区域两端的同源臂，扩增产物命名为gB-left-arm，gB-right-arm；
（14）以变异毒株HB1201为模板，PCR扩增gB基因区域即编辑区域（HB1201基因组第15760~17982位核苷酸），扩增产物命名为gBHB1201，然后PCR融合gBHB1201与gB-left-arm，gB-right-arm，融合产物命名为gB-donor，然后将gB-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，gB-donor测序正确后，PCR扩增线性gB-donor（注意：因为病毒基因组和donor存在相同的sgRNA靶向识别序列，因此为避免CRISPR/Cas9系统对donor的切割，将sgRNA靶向识别donor的区域序列进行同义突变）；
（15）将Bartha-gCDHB1201基因组、线性gB-donor、pX335-left-gB和pX335-right-gB共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，嵌合病毒命名为Bartha-gBCDHB1201，gB基因分子特征在于Bartha-K61基因组第16575~18803位核苷酸替换为HB1201基因组第15760~17982位核苷酸，且其CRISPR/Cas9编辑区域存在序列同义突变遗传标记。
gB基因、gC基因和gD基因的基因编码区分别是猪伪狂犬病病毒gB基因、gC基因和gD基因的基因全长，通过序列分析Bartha-K61与HB1201的基因存在变异，插入Bartha-K61的是HB1201的gB基因、gC基因和gD基因的编辑区域，gB基因的编辑区域是HB1201基因组第114954~116081位核苷酸，gC基因的编辑区域是HB1201基因组第52665~54100位核苷酸，gD基因的编辑区域是HB1201基因组第114954~116081位核苷酸。
嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201中gB基因全长即gB基因编码区序列（SEQ ID NO.1）为CTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTCGAGGCGCTGGTAGTGCCGGCGGCGCGTGGCCATCGCCCCGACGCGGCTGGCCAGCAGCGCGGGCCCGCTGTTCTTCTTGCGCGCCTTGTGCTCCTGCTGCTCGAGGGCCGACACGATGGACATGTACCGGATCATGTCCCGGGCCTGGTCCAGCTTGGCCTCGTCCACGTCGCCCTCGTCGACGCCGTCCTCCTTGAGCGTCTTCGTCGTGACGGGGTACAGGGCCTTCATGGGGTTGCGACGCAGGCGCGAGATGTGCCGGTAGGCCAGGAAGGCCGCGACCAGGCCGGCCAGCACCAGCAGCCCGATGGCGAGCGCCCCGAAGGGGTTGGACAGGAAGGACACCATGCCGCCGACGGCCGAGATCACGGCCCCCGTGGCGCCCAGGACCACCTTGCCGACGGCGGCGCCCACGTCGCCGAGGCCCTGGAAGAAGTTGGCGATGCCGCGCAGCAGCACCACATTATGATCTACTTTTACTACGCGGTCAATGTCGTAGAACTTGAGCGCGTGCAGCTGGTTGCGGCGCTGGATCTCGCTGTAGTCCAGGAGGCCCGTGTCGGCGAGCTCCTCGCGCGTGTACACCTCGAGGGGCAGGAACTCGCGGTCCTCGAGCAGCGTCAGGTTCAGGGTCACCCGCGTGCTGATCGTCTCGGGCACCTCCACCATGCGCACGTAGCTGTAGTCCTCGTAGTACACGTACCCGCCGCCCAGCTTAAAGTAGCGCCGGTGGTTGCCGGTGCAGGGCTCGATGAGGTCGCGCGAGATGAGGAGCTCGTTGTCGTCGCCGAGCTGGCCCTCGATCACGCCCGTGCCGTTGTGCTCGAAGGTCACCAGCGGGCGGCTGTAGCACGTGCCGCGCTCGCCGGGCACGCGCATGGAGTTCTGCACGTACACGCCGCCGCGCACCTCCACGCACCGCGAGATGGCCATCACGTCGCCGAGCATGCGCGCCGAGACGCGCTGGCCCAGCGCGGCCGTGGCCACGGCGCTGGGGTTCAGGCGCGACATCTCGCCCCACAGGGTGCGGTCCTTGTTCTGCAGCTCGCACCAGGCGGCCGCGATGCGGCTCAGCATGTCGTTCACGTGCGCCTGGATGTGGTCGTAGGTGAACTGCAGGCGCGCAAACTCGGCCGAGCCCGTGGTGATGCGCAGGTGCCCCGTGCCGTTGACGGCCGGCGGCTCGGGCGTCCCCGCCGGGCCGGGGGAGCGCCGGGCCCGACGGGCGGCCGCGGGGGACGCGGGGCCCACGACGCCGGCGAGGCCGAGGCGCTCGAGCTCGCGCGCGTACAGCTGCGCCAGCTCGTTCGAGATCAGCGGGCGGAAGGCCACCACGAAGCCCCCGCGGGCGAGGTACACCTCGGGCTTGTCGCCGGCCAGCACGTGCGTGTTGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGGCGTCGATGGCCTCCGAGGCCTCGCGGAGGACGCAGTCGCCCAGGTGCACGCGCTGCAGGTCGAGCTGCGTGACGTCGCTGACGAAGGAGGCGCCCAGGGCCCGCGACGTGAAGCGGAAGGACCCGTCGCGCGTCTCGTCGCGGATCATCTCCTCGGCCTCGCGCCACTTGGCCAGGCTGCACACGCGCCGCGTCTTGGGGGCCCAGTCCCAGGCCACCGTGAAGTGCGGCGTGCGCAGAAAGTTGCGCGTCACGCTCTCGGAGGCGCGGAGGCGCGAGTCCAGGTCGATGGGGTAGTAGTGCTCCACCTGCTGGAAGCGCCCGGGCGCGTAGCCGATGTGCTCCCCGTGGGCCCCCTCGCGCAGGCCGTAGAAGGGGGACATGTACACGATGTCCCCCGTGGACAGGGCGAAGGAGTCGTAGGGGTACACGGAGCGCGCCTCCACCTCCTCGACGATGCAGTTGACGGAGGTGCCCGTGTGGTAGAAGCCCGCGGCGCCGATCTTGGTGTAGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGATCTCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCACGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGCGAGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGCGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCGGTCGCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGCCGTACTCGCCGTCGGGGGCGTCCGAGGGGCCGGGGGAGACGGCCCCGTCGATCTCCTCGAGGGACTCCTCCGCGGAGAAGCCGTCTGGGGTGGCGCCCGTCCCGGGCGCGGGCGAGGCCGAGGCGGCCCGCGTCACGGCCGCCGCGCCGCACGTCGGGGTCGCGGCGAGCGCCAGCAGCAGCAGCGCTAGCGCGACGGCGCCCCGCGCAGCTGCAGCGTGGTGTGGAGCAGGCCAAAGACGTCCGAGGCCAGCACCGCCGTGATGTCCTGGTCGGTGTCCTCGGGGCCCGCGCCAAAGACCGCCACCAGCGGGCAT。
gC基因全长即gC基因编码区序列（SEQ ID NO.2）为ATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATGCTCGCGCTGCTGGCGCTCTACACGGCGGCCATCGCCGCGGCGCCGTCGTCCACGACGGCGCTCGGCACGACGCCCAACGGGGGCGGGGGCGGCAACAGCAGCGCGGGCGAGCTCTCGCCCTCGCCGCCCTCGACGCCCGAGCCCGTCTCGGGGACGACGGGGGCCGCGGCCTCCACGCCCGCCGCCGTCTCGACGCCCCGGGTCCCGCCGCCCTCGGTCTCGCGCCGGAAGCCCCAGCGGAACGGCAACAGGACGCGCGTCCACGGCGACAAGGCCACCTCGCACGGGCGCAAGCGCATCGTGTGCCGCGAGCGGCTGTTCTCGGCGAGGGTGGGGGACGCGGTCAGCTTCGGGTGCGCCGTCGTCCCGCGCGCCGGGGAGACCTTCGAGGTCCGCTTCTGCCGCCGCGGGCGCTTCCGCTCGCCCGACGCCGACCCCGAGTACTTTGACGAGCCCCCGCGCCCGGAGCTCCCGCGGGAGCGGCTCCTCTTCAGCTCCGCCAACGCCTCCCTCGCCCACGCGGACGCGCTCGCCTCCGCCGTCGTCGTCGAGGGCAAGCGCGCGACCGTCGCCAACGTCTCGGGCGAGGTGTCCGTGCGCGTGGCCGCGGCGGACGCCGAGACCGAGGGCGTCTACACGTGGCGCGTGCTGTCCGCCAACGGCACCGAGGTCCGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTACCACCAGCCCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCCCGTCCTCTTCGGCGAGCCCTTCCGGGCGGTGTGCGTCGTCCGCGACTACTACCCGCGGCGCAGCGTGCGCCTGCGCTGGTTCGCGGACGAGCACCCGGTGGACGCCGCCTTCGTGACCAACAGCACCGTGGCCGACGAGCTCGGGCGCCGCACGCGCGTCTCCGTGGTGAACGTGACGCGCGCGGACGTCCCGGGCCTCGCGGCCGCGGACGACGCGGACGCGCTCGCGCCGAGCCTGCGCTGCGAGGCCGTGTGGTACCGCGACAGCGTGGCCTCGCAGCGCTTCTCCGAGGCCCTGCGCCCCCACGTCTACCACCCGGCGGCGGTCTCGGTGCGCTTCGTCGAGGGCTTCGCCGTCTGCGACGGCCTCTGCGTGCCCCCGGAGGCGCGCCTCGCCTGGTCCGACCACGCCGCCGACACCGTCTACCACCTCGGCGCCTGCGCCGAGCACCCCGGCCTGCTCAACGTGCGGAGCGCCCGCCCGCTGTCGGACCTCGACGGGCCCGTCGACTACACCTGCCGCCTCGAGGGCATGCCCTCGCAGCTGCCCATCTTCGAGGACACGCAGCGCTACGACGCCTCCCCCACGTCCGTGAGCTGGCCCGTCGTGACCAGCATGATCACCGTCATCGCCGGCATCGCCATCCTAGCCATCGTGCTGGTCATCATGGCGACGTGCGTCTACTACCGCCGGGCGGGGCCGTGA。
gD基因全长即gD基因编码区序列（SEQ ID NO.3）为ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGCGGCGCTGGTCGCCCGGACGACGCTCGGCGCGGACGTGGACGCCGTGCCCGCGCCGACCTTCCCCCCGCCCGCATATCCATATACAGAATCGTGGCAGCTGACGCTGACGACGGTCCCCTCGCCCTTCGTCGGCCCCGCGGACGTCTACCACACGCGCCCGCTGGAGGACCCGTGCGGGGTGGTGGCGCTGATCTCCGACCCGCAGGTGGACCGGCTGCTGAACGAGGCGGTGGCCCACCGGCGGCCCACGTACCGCGCCCACGTGGCCTGGTACCGCATCGCGGACGGGTGCGCGCACCTGCTGTACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCAGATCTTTGGGCGCTGCCGGCGCCGCACCACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACCGGCGCCTGGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTGCTGGAGCGACGACAGCTTCAAGCGGGGCGTGGACGTGATGCGATTCCTGACGCCGTTCTACCAGCAGCCCCCGCACCGGGAGGTGGTGAACTACTGGTACCGCAAGAACGGCCGGACGCTCCCGCGGGCCTACGCCGCCGCCACGCCGTACGCCATCGACCCCGCGCGGCCCTCGGCGGGCTCGCCGAGGCCCAGGCCCCGGCCCCGGCCCAGGCCCCGGCCGAAGCCCGAGCCCGCCCCGGCGACGCCCGCGCCCCCCGGCCGCCTGCCCGAGCCGGCGACGCGGGACCACGCCGCCGGGGGGCGCCCCACGCCGCGACCCCCGAGGCCCGAGACGCCGCACCGCCCCTTCGCCCCGCCGGCCGTCGTGCCCAGCGGGTGGCCGCAGCCCGCGGAGCCGTTCCCGCCCCGGACCACCGCCGCGCCGGGCGTCTCGCGCCACCGCTCGGTGATCGTCGGCACGGGCACCGCGATGGGCGCGCTCCTGGTGGGCGTGTGCGTCTACATCTTCTTCCGCCTGAGGGGGGCGAAGGGGTATCGCCTCCTGGGCGGTCCCGCGGACGCCGACGAGCTAAAAGCGCAGCCCGGACCATAA。
gB基因的编辑区域序列（SEQ ID NO.4）为CATTATGATCTACTTTTACTACGCGGTCAATGTCGTAGAACTTGAGCGCGTGCAGCTGGTTGCGGCGCTGGATCTCGCTGTAGTCCAGGAGGCCCGTGTCGGCGAGCTCCTCGCGCGTGTACACCTCGAGGGGCAGGAACTCGCGGTCCTCGAGCAGCGTCAGGTTCAGGGTCACCCGCGTGCTGATCGTCTCGGGCACCTCCACCATGCGCACGTAGCTGTAGTCCTCGTAGTACACGTACCCGCCGCCCAGCTTAAAGTAGCGCCGGTGGTTGCCGGTGCAGGGCTCGATGAGGTCGCGCGAGATGAGGAGCTCGTTGTCGTCGCCGAGCTGGCCCTCGATCACGCCCGTGCCGTTGTGCTCGAAGGTCACCAGCGGGCGGCTGTAGCACGTGCCGCGCTCGCCGGGCACGCGCATGGAGTTCTGCACGTACACGCCGCCGCGCACCTCCACGCACCGCGAGATGGCCATCACGTCGCCGAGCATGCGCGCCGAGACGCGCTGGCCCAGCGCGGCCGTGGCCACGGCGCTGGGGTTCAGGCGCGACATCTCGCCCCACAGGGTGCGGTCCTTGTTCTGCAGCTCGCACCAGGCGGCCGCGATGCGGCTCAGCATGTCGTTCACGTGCGCCTGGATGTGGTCGTAGGTGAACTGCAGGCGCGCAAACTCGGCCGAGCCCGTGGTGATGCGCAGGTGCCCCGTGCCGTTGACGGCCGGCGGCTCGGGCGTCCCCGCCGGGCCGGGGGAGCGCCGGGCCCGACGGGCGGCCGCGGGGGACGCGGGGCCCACGACGCCGGCGAGGCCGAGGCGCTCGAGCTCGCGCGCGTACAGCTGCGCCAGCTCGTTCGAGATCAGCGGGCGGAAGGCCACCACGAAGCCCCCGCGGGCGAGGTACACCTCGGGCTTGTCGCCGGCCAGCACGTGCGTGTTGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGGCGTCGATGGCCTCCGAGGCCTCGCGGAGGACGCAGTCGCCCAGGTGCACGCGCTGCAGGTCGAGCTGCGTGACGTCGCTGACGAAGGAGGCGCCCAGGGCCCGCGACGTGAAGCGGAAGGACCCGTCGCGCGTCTCGTCGCGGATCATCTCCTCGGCCTCGCGCCACTTGGCCAGGCTGCACACGCGCCGCGTCTTGGGGGCCCAGTCCCAGGCCACCGTGAAGTGCGGCGTGCGCAGAAAGTTGCGCGTCACGCTCTCGGAGGCGCGGAGGCGCGAGTCCAGGTCGATGGGGTAGTAGTGCTCCACCTGCTGGAAGCGCCCGGGCGCGTAGCCGATGTGCTCCCCGTGGGCCCCCTCGCGCAGGCCGTAGAAGGGGGACATGTACACGATGTCCCCCGTGGACAGGGCGAAGGAGTCGTAGGGGTACACGGAGCGCGCCTCCACCTCCTCGACGATGCAGTTGACGGAGGTGCCCGTGTGGTAGAAGCCCGCGGCGCCGATCTTGGTGTAGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGATCTCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCACGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGCGAGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGCGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCGGTCGCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGCCGTACTCGCCGTCGGGGGCGTCCGAGGGGCCGGGGGAGACGGCCCCGTCGATCTCCTCGAGGGACTCCTCCGCGGAGAAGCCGTCTGGGGTGGCGCCCGTCCCGGGCGCGGGCGAGGCCGAGGCGGCCCGCGTCACGGCCGCCGCGCCGCACGTCGGGGTCGCGGCGAGCGCCAGCAGCAGCAGCGCTAGCGCGACGGCGCCCCGCGCAGCTGCAGCGTGGTGTGGAGCAGGCCAAAGACGTCCGAGGCCAGCACCGCCGTGATGTCCTGGTCGGTGTCCTC
gC基因的编辑区域序列（SEQ ID NO.5）为
TCGCGCGTGCGATGCTCGCGCTGCTGGCGCTCTACACGGCGGCCATCGCCGCGGCGCCGTCGTCCACGACGGCGCTCGGCACGACGCCCAACGGGGGCGGGGGCGGCAACAGCAGCGCGGGCGAGCTCTCGCCCTCGCCGCCCTCGACGCCCGAGCCCGTCTCGGGGACGACGGGGGCCGCGGCCTCCACGCCCGCCGCCGTCTCGACGCCCCGGGTCCCGCCGCCCTCGGTCTCGCGCCGGAAGCCCCAGCGGAACGGCAACAGGACGCGCGTCCACGGCGACAAGGCCACCTCGCACGGGCGCAAGCGCATCGTGTGCCGCGAGCGGCTGTTCTCGGCGAGGGTGGGGGACGCGGTCAGCTTCGGGTGCGCCGTCGTCCCGCGCGCCGGGGAGACCTTCGAGGTCCGCTTCTGCCGCCGCGGGCGCTTCCGCTCGCCCGACGCCGACCCCGAGTACTTTGACGAGCCCCCGCGCCCGGAGCTCCCGCGGGAGCGGCTCCTCTTCAGCTCCGCCAACGCCTCCCTCGCCCACGCGGACGCGCTCGCCTCCGCCGTCGTCGTCGAGGGCAAGCGCGCGACCGTCGCCAACGTCTCGGGCGAGGTGTCCGTGCGCGTGGCCGCGGCGGACGCCGAGACCGAGGGCGTCTACACGTGGCGCGTGCTGTCCGCCAACGGCACCGAGGTCCGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTACCACCAGCCCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCCCGTCCTCTTCGGCGAGCCCTTCCGGGCGGTGTGCGTCGTCCGCGACTACTACCCGCGGCGCAGCGTGCGCCTGCGCTGGTTCGCGGACGAGCACCCGGTGGACGCCGCCTTCGTGACCAACAGCACCGTGGCCGACGAGCTCGGGCGCCGCACGCGCGTCTCCGTGGTGAACGTGACGCGCGCGGACGTCCCGGGCCTCGCGGCCGCGGACGACGCGGACGCGCTCGCGCCGAGCCTGCGCTGCGAGGCCGTGTGGTACCGCGACAGCGTGGCCTCGCAGCGCTTCTCCGAGGCCCTGCGCCCCCACGTCTACCACCCGGCGGCGGTCTCGGTGCGCTTCGTCGAGGGCTTCGCCGTCTGCGACGGCCTCTGCGTGCCCCCGGAGGCGCGCCTCGCCTGGTCCGACCACGCCGCCGACACCGTCTACCACCTCGGCGCCTGCGCCGAGCACCCCGGCCTGCTCAACGTGCGGAGCGCCCGCCCGCTGTCGGACCTCGACGGGCCCGTCGACTACACCTGCCGCCTCGAGGGCATGCCCTCGCAGCTGCCCATCTTCGAGGACACGCAGCGCTACGACGCCTCCCCCACGTCCGTGAGCTGGCCCGTCGTGACCAGCATGATCACCGTCATCGCCGGCATCGCCATCCTAGCCATCGTGCTGGTCATCATGGCGACGTGCGTCTACTAC
gD基因的编辑区域序列（SEQ ID NO.6）为
GCATATCCATATACAGAATCGTGGCAGCTGACGCTGACGACGGTCCCCTCGCCCTTCGTCGGCCCCGCGGACGTCTACCACACGCGCCCGCTGGAGGACCCGTGCGGGGTGGTGGCGCTGATCTCCGACCCGCAGGTGGACCGGCTGCTGAACGAGGCGGTGGCCCACCGGCGGCCCACGTACCGCGCCCACGTGGCCTGGTACCGCATCGCGGACGGGTGCGCGCACCTGCTGTACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCAGATCTTTGGGCGCTGCCGGCGCCGCACCACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACCGGCGCCTGGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTGCTGGAGCGACGACAGCTTCAAGCGGGGCGTGGACGTGATGCGATTCCTGACGCCGTTCTACCAGCAGCCCCCGCACCGGGAGGTGGTGAACTACTGGTACCGCAAGAACGGCCGGACGCTCCCGCGGGCCTACGCCGCCGCCACGCCGTACGCCATCGACCCCGCGCGGCCCTCGGCGGGCTCGCCGAGGCCCAGGCCCCGGCCCCGGCCCAGGCCCCGGCCGAAGCCCGAGCCCGCCCCGGCGACGCCCGCGCCCCCCGGCCGCCTGCCCGAGCCGGCGACGCGGGACCACGCCGCCGGGGGGCGCCCCACGCCGCGACCCCCGAGGCCCGAGACGCCGCACCGCCCCTTCGCCCCGCCGGCCGTCGTGCCCAGCGGGTGGCCGCAGCCCGCGGAGCCGTTCCCGCCCCGGACCACCGCCGCGCCGGGCGTCTCGCGCCACCGCTCGGTGATCGTCGGCACGGGCACCGCGATGGGCGCGCTCCTGGTGGGCGTGTGCGTCTACATCTTCTTCCGCCTGAGGGGGGCGAAGGGGTATCGCCTCCTGGGCGGTCCCGCGGACGCCGACGAGCTAAAAGCGCAGCCCGGACCATAA。
猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株Bartha-gBCDHB1201在Vero CCL81的体外增殖特性与变异株HB1201无差异，显著高于其亲本毒Bartha-K61，病毒滴度可达到108.50TCID50/mL，最大可相差1个滴度。与Bartha-K61单嵌合HB1201的gB基因重组病毒（Bartha-gBHB1201）和Bartha-K61双嵌合HB1201的gC和gD基因重组病毒（Bartha-gCDHB1201）相比，Bartha-gBCDHB1201作为候选疫苗毒株其抗原含量显著提高。猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株Bartha-gBCDHB1201为活疫苗，具有与PRV变异株相同的抗原性，免疫仔猪所诱导的中和抗体具有较高的交叉中和活性。猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株Bartha-gBCDHB1201以最小的免疫剂量即105TCID50免疫仔猪，即可提供完全的免疫保护。
以仔猪作为评价疫苗保护的模式动物，通过选择疫苗株Bartha-K61、嵌合病毒Bartha-gCDHB1201与Bartha-gBCDHB1201人工肌肉注射免疫仔猪，分析嵌合病毒作为候选疫苗的安全性，和比较其对PRV变异株HB1201感染的免疫保护性，结果发现Bartha-K61、Bartha-gCDHB1201与Bartha-gBCDHB1201免疫仔猪均表现较强的安全性，但是PRV变异株HB1201感染仔猪后，与Bartha-gCDHB1201相比，Bartha-gBCDHB1201能更好的阻止仔猪发病、降低组织病毒载量和减轻病毒感染造成的脏器损伤，提供100%完全的免疫保护；可作为猪伪狂犬病疫苗候选株开发。该嵌合疫苗的应用将有利于我国猪群PRV的净化。
实施例1 CRISPR/Cas9编辑PRV基因组所需sgRNA与供体质粒构建
参考并分析PRV Bartha-K61的gB，gC和gD基因序列，利用CRISPR/Cas9 gRNA设计工具（http://crispr.mit.edu/）设计敲除gB，gC和gD基因编辑区域所需的sgRNA互补引物（表1）和扩增PRV相关基因和GFP基因的引物（表2）用于PRV嵌合毒株的构建，引物由上海生工生物工程公司合成，用无核酸酶的灭菌水配成使用浓度。
表1CRISPR/Cas9系统敲除PRV基因所需的sgRNA引物
为构建CRISPR/Cas9系统所用的重组sgRNA质粒，用稀释为浓度100μM的sgRNA上下游引物各取10μL直接退火，退火条件为：95℃ 5min，25℃ 30min。退火产物用T4 DNAligase克隆到BbsI酶切的pX335质粒中，经测序正确后，分别命名为pX335-left-gB/pX335-right-gB、pX335-left-gC/pX335-right-gC、pX335-left-GFP/pX335-right-GFP和pX335-left-gD/pX335-right-gD。
提取PRV基因组条件如下：将PRV分别以1 MOI的接种剂量接种到长满单层VeroCCL81的10cm2的细胞培养皿中，24h-36h后待细胞完全病变后收取细胞加入8ml的细胞裂解液，37℃孵育4h后加入等体积的Tris平衡酚4℃充分混匀并置于4℃离心机中8000r/min离心10min，取上清继续加入等体积的Tris平衡酚4℃充分混匀并置于4℃离心机中8000r/min离心10min，取上清加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）溶液4℃充分混匀并置于4℃离心机中8000r/min离心10min，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃冰箱中静置30min，4℃离心机中8000r/min离心20min，弃上清并用70%的无水乙醇洗涤沉淀，4℃离心机中8000r/min离心20min，弃上清，晾干并加入无核酸酶的超纯水500μL溶解，测浓度后置-20℃保存备用。
构建嵌合病毒所需的供体策略见图1。在PRV中，由于gC基因是非必需基因（如图1A所示），构建含有HB1201 gC基因的Bartha-K61嵌合病毒具体实施方案如下：首先以pEGFP-N2质粒为模板，GFP-F/GFP-R为引物，扩增筛选标记GFP基因，命名为GFPBartha；同时，以gCBartha-left-arm-F/R和gCBartha-right-arm-F/R为引物，分别扩增同源重组所需上下游同源臂，并分别命名为gCBartha-left-arm和gCBartha-right-arm；然后以HB1201基因组为模板，gCHB1201-F/R为引物扩增HB1201的gC基因，扩增产物命名为gCHB1201。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查后，用OMEGA Gel Extraction Kit纯化回收。将纯化后的gCBartha-left-arm和gCBartha-right-arm用融合PCR分别与GFPBartha或者gCHB1201基因两端进行融合，融合产物即为供体，并命名为GFPBartha-donor和gCHB1201-donor；将融合产物克隆至pEASY-Blunt平末端载体上，连接产物转化至Trans10感受态中，经菌液PCR和测序鉴定正确后，利用Promega中提质粒试剂盒提取质粒，置-20 ℃保存备用。
在PRV中，gB和gD为必需基因，在构建供体过程中为避免sgRNA识别供体序列进而对供体产生切割，故在构建必需基因嵌合病毒的供体时，需要通过引物将sgRNA识别供体区域的碱基进行同义突变（如图1B所示）。具体实施方案如下：为构建拯救gB嵌合病毒所需的供体（donor）DNA，以Bartha-K61基因组为模板，gB-left-arm-F/R和gB-right-arm-F/R为引物扩增构建嵌合病毒所需上下游同源臂，并命名为gBBartha-left-arm/gBBartha-right-arm；然后以HB1201基因组为模板，gB-F/R为引物扩增gB置换区域基因并命名为gBHB1201；扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查后，用OMEGA Gel Extraction Kit纯化回收。利用融合PCR将上下游同源臂与gBHB1201基因两端进行融合，融合产物即为供体，并命名为gBHB1201-donor。同理，利用相同方法构建gD嵌合病毒所需的供体（donor）命名为gDHB1201-donor。将融合产物克隆至pEASY-Blunt平末端载体上，连接产物转化至Trans10感受态中，经菌液PCR和测序鉴定正确后，利用Promega质粒中提试剂盒提取质粒，置-20 ℃保存备用。
为提高嵌合病毒的重组效率，需将供体DNA线性化（如图2所示），即以构建成功的pEASY-Blunt重组质粒为模板，用Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase分别扩增gBHB1201-donor、gCHB1201-donor、GFPBartha-donor和gDHB1201-donor, PCR产物回收后置-20 ℃备用。
表2嵌合病毒的构建所用引物
注：引物序列斜体碱基为同义突变碱基或者突变后不影响gB和gD正常翻译的碱基。简并碱基：R: A/G。
实施例2猪伪狂犬病病毒嵌合弱毒疫苗株Bartha-gBCDHB1201的构建
首先，为拯救Bartha-K61含有HB1201 gC基因的嵌合病毒Bartha-gCHB1201，拯救策略参考图1，取2μg Bartha-K61基因组，各1.5μg pX335-left-gC/pX335-right-gC质粒，5μgGFPBartha-donor，15μL Lipofectamine 2000共转染至约长满85%的单层Vero CCL81细胞中，4天后观察病变，并将拯救成功的BarthaΔgC-GFP进行噬斑和有限稀释纯化，经测序鉴定成功后，扩繁-80℃保存备用。提取BarthaΔgC-GFP基因组后，2μg BarthaΔgC-GFP基因组，各1.5μgpX335-left-GFP/pX335-right-GFP质粒，5μg gC-donor，15μL Lipofectamine 2000共转染至约长满85%的单层Vero CCL81细胞中，4天后观察病变，并将拯救成功的Bartha-gCHB1201进行噬斑和有限稀释纯化，经间接免疫荧光和测序鉴定成功后（图4与图5），扩繁-80℃保存备用。
第二，为拯救Bartha-K61含有HB1201 gC和gD基因的嵌合病毒Bartha-gCDHB1201，取2μg Bartha-gCHB1201基因组，各1.5μg pX335-left-gD/pX335-right-gD质粒，5μg gDHB1201-donor，15μL Lipofectamine 2000共转染至约长满85%的单层Vero CCL81细胞中，4天后观察病变，并将拯救成功的Bartha-gCDHB1201进行噬斑和有限稀释纯化，经间接免疫荧光和测序鉴定成功后（图4与图5），扩繁-80℃保存备用；
第三，为拯救Bartha-K61含有HB1201 gB、gC和gD基因的嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201，取2μg Bartha-gCDHB1201基因组，各1.5μg pX335-left-gB/pX335-right-gB质粒，5μg gBHB1201-donor，15μL Lipofectamine 2000共转染至约长满85%的单层Vero CCL81细胞中，4天后观察病变，并将拯救成功的Bartha-gBCDHB1201进行噬斑和有限稀释纯化，经间接免疫荧光和测序鉴定成功后（如图4与图5所示），扩繁-80℃保存备用；
第四，通过以上嵌合病毒的拯救，本专利总结了CRISPR/Cas9技术编辑PRV非必需基因和必需基因的方法。其中，（i）非必需基因的编辑。由于非必需基因（gC）缺失不影响病毒的存活，基于此特性，为增加嵌合病毒构建的成功率，方案设计为两步法拯救策略，其特色是增加了拯救重组GFP绿色荧光标签的嵌合病毒，其目的是在构建嵌合病毒的过程中为了利于正向与反向筛选，提高筛选的成功率（如图1A所示）。此外，为分析不同形式供体是否对同源重组效率有影响，本专利以拯救HB1201ΔgC-GFP为例，通过比较线性供体和质粒供体的同源重组效率，结果表明线性供体同源重组效率显著高于质粒供体（如图2所示）。（ii）必需基因的编辑。由于必需基因（gB与gD）的缺失影响病毒的存活，本专利提供了另一方案，即采用一步法构建策略。以拯救Bartha-K61含有HB1201毒株gB基因的嵌合病毒（Bartha-gBHB1201）为例，本专利通过对sgRNA靶向gB供体的区域进行同义突变可成功拯救Bartha-gBHB1201嵌合病毒（如图3A所示），挑取拯救病毒的噬斑进行纯化测序，结果表明，嵌合病毒的拯救成功率为100%（如图3B与3C所示）。同义突变避免了sgRNA切割供体的几率，增加了同源重组的效率。通过以上平台的建立，可以通过对供体的改造如:突变，缺失等，进而完成对PRV基因组的编辑。
将Bartha-gBCDHB1201嵌合病毒、Bartha-gBHB1201嵌合病毒（实验室已构建成功）、Bartha-gCDHB1201嵌合病毒、变异毒株HB1201和疫苗毒株Bartha-K61分别按照10-1~10-6倍比稀释，然后分别将每个稀释度的病毒液加入到刚长满单层的Vero细胞六孔板中，每孔1mL病毒液，37℃细胞培养箱中孵育1h后，弃掉病毒液，并用PBS洗两次，然后加入2mL含有0.5%的甲基纤维素的DMEM，置于37℃细胞培养箱中培养60h后，弃掉液体，PBS洗一遍，加入1mL含有结晶紫的4%多聚甲醛固定染色30min，用水清洗细胞，然后在显微镜下测量并分析病毒的噬斑大小（图6A与图6B），Ü表示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与其亲本毒Bartha-K61的差异；#表示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与Bartha-gBHB1201的差异；δ表示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与Bartha-gCDHB1201的差异。结果显示HB1201形成的噬斑大小明显显著大于Bartha-K61（P< 0.001）, Bartha-K61的噬斑大小与Bartha-gBHB1201、Bartha-gCDHB1201、Bartha-gBCDHB1201无显著差异。
将Bartha-gBCDHB1201嵌合病毒、Bartha-gBHB1201嵌合病毒、Bartha-gCDHB1201嵌合病毒、变异毒株HB1201和疫苗毒株Bartha-K61以0.01 MOI剂量接种Vero CCL81，每隔12h取上清测定其TCID50值，绘制病毒在宿主细胞的多步生长曲线。结果表明，各个病毒感染VeroCCL81细胞后均在48-60h达到增殖高峰，其中Bartha-gBCDHB1201的体外增值能力与HB1201并无差异，但是显著高于亲本毒株Bartha-K61，病毒滴度可达到108.50 TCID50/mL，最大可相差1个滴度（图6C）；值得注意的是，Bartha-gBCDHB1201的体外增值能力与Bartha-gBHB1201和Bartha-gCDHB1201相比，Bartha-gBCDHB1201作为候选疫苗毒株其抗原含量显著提高。
将Bartha-gBCDHB1201嵌合病毒、Bartha-gBHB1201嵌合病毒、Bartha-gCDHB1201嵌合病毒、变异毒株HB1201和疫苗毒株Bartha-K61分别用无血清的DMEM稀释毒价为200TCID50，同时用无血清的DMEM将三份Bartha-K61阳性血清分别以2-1-2-10的稀释梯度进行倍比稀释，然后加入等体积200TCID50的嵌合病毒和其亲本毒株种毒，37℃孵育1h后加入刚长满单层Vero的96孔细胞板中，每孔100μL并且设置4个重复，置于37℃细胞培养箱中72h后观察结果，能以中和病毒半数感染量的最高血清稀释度为中和病毒的效价。
结果显示（图7），抗血清中和Bartha-gBCDHB1201与亲本毒Bartha-K61、Bartha-gBHB1201差异显著（P<0.05），抗血清中和Bartha-gBCDHB1201的能力接近于HB1201。这结果表明，与Bartha-gBHB1201和Bartha-gCDHB1201相比，嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与变异株HB1201具有相同的更好的抗原性。其中，Bartha-gCDHB1201抗原性好于Bartha-gBHB1201抗原性。
实施例5 嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201免疫仔猪后安全评价及抗体测定
为分析与变异株HB1201抗原性相似的嵌合病毒Bartha-gCDHB1201与Bartha-gBCDHB1201的免疫保护效果，将23头30日龄健康仔猪随机分为5组，及嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201（5头）嵌合病毒Bartha-gCDHB1201（5头）、Bartha-K61（5头）、DMEM组（5头）和Negative control组（3头）4个试验组在不同的动物房内隔离饲养。其中病毒组每组颈部肌肉注射2mL 1×105TCID50各自病毒液，Negative control组与DMEM组注射2mL的DMEM，每日观察实验仔猪的临床症状、记录体温及体重变化。同时分别于免疫后0、、7、、14、21、28 d采集各实验猪血液。将分离到的血清样本用于gB、gE抗体检测和中和抗体的测定。
结果显示，如图8所示，嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201组、嵌合病毒Bartha-gCDHB1201组及对照Bartha-K61组免疫后均未表现出PRV典型的临床症状，实验期间嵌合病毒组的体温变化与Bartha-K61趋势一致且无差异（图8A）。嵌合病毒组的仔猪日增重与Bartha-K61趋势一致且无差异（图8B）。
为监测免疫后的抗体产生的动态，将分离到的血清利用PRV gB、gE抗体ELISA检测试剂盒（IDEXX，美国）检测gB、gE抗体水平，结果表明嵌合病毒组和Bartha-K61组免疫两周后gB抗体均全部转为阳性，且三周到四周抗体水平最高，未免疫组和空白对照组免疫期间gB抗体均为阴性；同时整个免疫期间各个试验组gE抗体水平均为阴性（图9A）；结果表明嵌合病毒免疫仔猪后均有效的产生针对PRV病毒的抗体。中和实验表明Bartha-gBCDHB1201组与Bartha-gCDHB1201组中和HB1201的中和抗体水平显著高于Bartha-K61组，其中，Bartha-gBCDHB1201组的血清中和能力显著高于Bartha-gCDHB1201组，结果表明，与Bartha-gCDHB1201相比，Bartha-gBCDHB1201能诱导机体产生更高的具有交叉中和能力的中和抗体（图9B）。
实施例6 Bartha-gBCDHB1201的攻毒免疫保护效果评价
为研究嵌合毒株对变异的免疫保护效果，在免疫仔猪4周后，本发明选择PRV变异株HB1201人工感染仔猪，分析比较其对PRV变异株感染的免疫保护性，以评估PRV Bartha-gBCDHB1201作为弱毒嵌合疫苗的可行性。除Negative control组接种2mL DMEM培养液外，其余试验组均滴鼻接种2mL 1×107 TCID50 PRV变异株HB1201，感染周期为14天，在此期间观察仔猪临床症状和死亡状况，记录其体温及日增重情况14天后安克死所有存活猪，剖检自然死亡及安乐死的猪只，观察大脑、肺脏、肾脏、扁桃体和下颌淋巴结的脏器病理变化及组织病理变化，荧光定量检测感染仔猪的脏器病毒载量及鼻腔排毒情况，分析PRV Bartha-gBCDHB1201毒株对感染仔猪的免疫保护性。
仔猪HB1201攻毒后，Bartha-K61和DMEM组猪第2天逐渐均表现PRV的临床症状，随着时间的延长，感染猪最高体温在41-42℃之间，呈现明显的呼吸道症状和神经症状，表现为打喷嚏，呼吸急促、打喷嚏、精神沉郁、食欲不振或者废绝、转圈、兴奋、奇痒、划水和出现眼结膜炎等症状临床，临床症状评分如图10A，Ü表示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与Bartha-gCDHB1201的差异；#表示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与其亲本毒Bartha-K61的差异；δ表示嵌合病毒Bartha-gCDHB1201与其亲本毒Bartha-K61的差异。嵌合病毒Bartha-gCDHB1201组平均体温第3 d达到40℃以上，第4 d到第5 d平均体温均在41-42 ℃之间，持续时间为2 d，第6 d体温开始下降，并且第7 d平均体温下降到40 ℃以下并且逐步恢复到正常水平，在此期间嵌合病毒Bartha-gCDHB1201组的体温在第2、3、6、7、9、10 d显著低于Bartha-K61组（如图10B，Ü表示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与Bartha-gCDHB1201的差异；#表示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201与其亲本毒Bartha-K61的差异；δ表示嵌合病毒Bartha-gCDHB1201与其亲本毒Bartha-K61的差异）；除发热外，Bartha-gCDHB1201组的仔猪会出现轻微咳嗽、呼吸急促和食欲不振等轻微临床症状。相比于Bartha-gCDHB1201组，而嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201组除第3~5天出现轻微发热（均低于41℃）外（10B），并无其它明显的临床症状。攻毒后第4~7天攻毒对照组的猪只全部死亡，并且Bartha-61组在攻毒后第4天和第6天死亡两只猪，嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201组与Bartha-gCDHB1201组均无死亡现象（图10C）。攻毒后，Bartha-gBCDHB1201组日增重与空白对照组无显著差异，但高于Bartha-gCDHB1201组（图10D）。由此表明，相比于Bartha-K61，嵌合病毒Bartha-gCDHB1201与Bartha-gBCDHB1201可有效减轻PRV变异株HB1201感染后的仔猪临床症状和死亡率，但Bartha-gBCDHB1201的效果显著好于Bartha-gCDHB1201。
攻毒后，将自然死亡和14d后安乐死死亡的猪进行解剖，然后对脏器逐一观察并记录，结果显示DMEM和Bartha-K61组的死亡猪的所有肺脏发生严重的实变，出血，肿大；大脑实变严重出血；肾脏严重出血；扁桃体和所有淋巴结均肿大严重出血。Bartha-gCDHB1201组除肺脏可发现轻微的组织损伤，其余组织均未发现明显的病变Bartha-gBCDHB1201组的的组织均未发现明显的病变；Negtive control组脏器均未发现相应的病理变化（图11）。
将肺脏和肾脏通过固定HE染色，并通过显微镜观察并分析脏器的组织病理学变化，结果表明Bartha-K61组和DMEM组肺脏的肺泡隔毛细血管扩张充血，淤血，肺泡消失。肾脏淤血，肾小管间质淤血，肾小管上皮细胞脱离基底膜；Bartha-gCDHB1201组无明显的病理变化（图12），Negative control组与Bartha-gBCDHB1201组均无相应的病理变化（图12）。
攻毒后分别采集剖检后采集并研磨大脑、肺脏、扁桃体、肾脏和下颌淋巴结，利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（天根，北京，中国）提取鼻拭子和脏器组织中的病毒DNA，根据分析PRV毒株gB保守序列设计SYRB Green 染料法荧光定量PCR引物gB-F：5’-GTCTGTGAAGCGGTTCGTGAT-3，gB-R ：5’-ACAAGTTCAAGGCGCACATCTAC-3’，由上海生工公司合成。按照荧光定量试剂盒所需的反应条件，检测脏器组织样品，计算组织中病毒拷贝数。结果显示嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201组与Bartha-gCDHB1201组各个脏器组织中的病毒载量显著低于Bartha-K61组（P<0.05），但Bartha-gBCDHB1201的效果显著好于Bartha-gCDHB1201。（图13）。
综上所述，经动物安全性试验及攻毒保护性试验证明，本发明所获得的猪伪狂犬病嵌合疫苗株Bartha-gBCDHB1201的抗原性与变异株HB1201相同，接种仔猪后的安全性较好，诱导较高的交叉中和抗体水平；PRV变异株感染仔猪后，综合对临床症状、病理变化、病毒载量等方面的评价，Bartha-gBCDHB1201的免疫保护效果显著好于嵌合病毒Bartha-gCDHB1201，即Bartha-gBCDHB1201可提供100%的免疫保护，显著减轻PRV变异株感染带来的危害。
该嵌合疫苗的病毒骨架来源于临床上广泛应用的Bartha-K61疫苗毒株，该毒株遗传稳定且安全性高；同时，毒株中置入的PRV变异毒株免疫保护蛋白gB、gC和gD的基因编码区，在接种后也能够刺激机体产生针对流行变异毒株的中和抗体，提高了该疫苗的免疫保护效力，该基因工程弱毒疫苗毒株可作为防控PRV的新型候选疫苗毒株。
本发明所提供的基因工程弱毒疫苗毒株构建方法获得的拯救病毒能够在体外连续传代，其遗传学特性较为稳定，所以此拯救病毒能够作为有效的科研材料进行与PRV免疫蛋白功能相关的科学研究。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctacagggcg tcggggtcct cgctctcgag gcgctggtag tgccggcggc gcgtggccat 60
cgccccgacg cggctggcca gcagcgcggg cccgctgttc ttcttgcgcg ccttgtgctc 120
ctgctgctcg agggccgaca cgatggacat gtaccggatc atgtcccggg cctggtccag 180
cttggcctcg tccacgtcgc cctcgtcgac gccgtcctcc ttgagcgtct tcgtcgtgac 240
ggggtacagg gccttcatgg ggttgcgacg caggcgcgag atgtgccggt aggccaggaa 300
ggccgcgacc aggccggcca gcaccagcag cccgatggcg agcgccccga aggggttgga 360
caggaaggac accatgccgc cgacggccga gatcacggcc cccgtggcgc ccaggaccac 420
cttgccgacg gcggcgccca cgtcgccgag gccctggaag aagttggcga tgccgcgcag 480
cagcaccaca ttatgatcta cttttactac gcggtcaatg tcgtagaact tgagcgcgtg 540
cagctggttg cggcgctgga tctcgctgta gtccaggagg cccgtgtcgg cgagctcctc 600
gcgcgtgtac acctcgaggg gcaggaactc gcggtcctcg agcagcgtca ggttcagggt 660
cacccgcgtg ctgatcgtct cgggcacctc caccatgcgc acgtagctgt agtcctcgta 720
gtacacgtac ccgccgccca gcttaaagta gcgccggtgg ttgccggtgc agggctcgat 780
gaggtcgcgc gagatgagga gctcgttgtc gtcgccgagc tggccctcga tcacgcccgt 840
gccgttgtgc tcgaaggtca ccagcgggcg gctgtagcac gtgccgcgct cgccgggcac 900
gcgcatggag ttctgcacgt acacgccgcc gcgcacctcc acgcaccgcg agatggccat 960
cacgtcgccg agcatgcgcg ccgagacgcg ctggcccagc gcggccgtgg ccacggcgct 1020
ggggttcagg cgcgacatct cgccccacag ggtgcggtcc ttgttctgca gctcgcacca 1080
ggcggccgcg atgcggctca gcatgtcgtt cacgtgcgcc tggatgtggt cgtaggtgaa 1140
ctgcaggcgc gcaaactcgg ccgagcccgt ggtgatgcgc aggtgccccg tgccgttgac 1200
ggccggcggc tcgggcgtcc ccgccgggcc gggggagcgc cgggcccgac gggcggccgc 1260
gggggacgcg gggcccacga cgccggcgag gccgaggcgc tcgagctcgc gcgcgtacag 1320
ctgcgccagc tcgttcgaga tcagcgggcg gaaggccacc acgaagcccc cgcgggcgag 1380
gtacacctcg ggcttgtcgc cggccagcac gtgcgtgttg ttgtagcgcc gccggtagat 1440
ggcgtcgatg gcctccgagg cctcgcggag gacgcagtcg cccaggtgca cgcgctgcag 1500
gtcgagctgc gtgacgtcgc tgacgaagga ggcgcccagg gcccgcgacg tgaagcggaa 1560
ggacccgtcg cgcgtctcgt cgcggatcat ctcctcggcc tcgcgccact tggccaggct 1620
gcacacgcgc cgcgtcttgg gggcccagtc ccaggccacc gtgaagtgcg gcgtgcgcag 1680
aaagttgcgc gtcacgctct cggaggcgcg gaggcgcgag tccaggtcga tggggtagta 1740
gtgctccacc tgctggaagc gcccgggcgc gtagccgatg tgctccccgt gggccccctc 1800
gcgcaggccg tagaaggggg acatgtacac gatgtccccc gtggacaggg cgaaggagtc 1860
gtaggggtac acggagcgcg cctccacctc ctcgacgatg cagttgacgg aggtgcccgt 1920
gtggtagaag cccgcggcgc cgatcttggt gtaggtgtcg ttggtggtgt gccagccgcg 1980
ggtgccgagc gcgttcaggc gcgaggggcg caggtccacc tcgacggggt tctcgtcgcg 2040
gtcgaaggcg gtcaccttgt ggttgttgcg cacgtactcg gccttggaga cgcacttgcc 2100
gcggcggtcg atcacgtccg tgatctcctg cacggggacg ggcacgcggt ccgtgaagcg 2160
gttcgtgatg gccgcgtacg tgctcccgga ccacacggtc gtgacgatga cgttcttgta 2220
gtagatgtgg gccttgaact tgtgcggggc gatgttctcc ttgaagagca cggcgatccc 2280
ctccgtgaag ttgcgcccct gcgagtactc ggggcaggcc tgctcgggct ccaggcgcac 2340
caccgtggag ccggacggcg gcgggcagac gtagaagcgg tcccgctcgg tcgcggccgc 2400
gcgcacggcc gtgcgcgcgt ccaggtcgcc gtactcgccg tcgggggcgt ccgaggggcc 2460
gggggagacg gccccgtcga tctcctcgag ggactcctcc gcggagaagc cgtctggggt 2520
ggcgcccgtc ccgggcgcgg gcgaggccga ggcggcccgc gtcacggccg ccgcgccgca 2580
cgtcggggtc gcggcgagcg ccagcagcag cagcgctagc gcgacggcgc cccgcgcagc 2640
tgcagcgtgg tgtggagcag gccaaagacg tccgaggcca gcaccgccgt gatgtcctgg 2700
tcggtgtcct cggggcccgc gccaaagacc gccaccagcg ggcat 2745
<210> 2
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcctcgc tcgcgcgtgc gatgctcgcg ctgctggcgc tctacacggc ggccatcgcc 60
gcggcgccgt cgtccacgac ggcgctcggc acgacgccca acgggggcgg gggcggcaac 120
agcagcgcgg gcgagctctc gccctcgccg ccctcgacgc ccgagcccgt ctcggggacg 180
acgggggccg cggcctccac gcccgccgcc gtctcgacgc cccgggtccc gccgccctcg 240
gtctcgcgcc ggaagcccca gcggaacggc aacaggacgc gcgtccacgg cgacaaggcc 300
acctcgcacg ggcgcaagcg catcgtgtgc cgcgagcggc tgttctcggc gagggtgggg 360
gacgcggtca gcttcgggtg cgccgtcgtc ccgcgcgccg gggagacctt cgaggtccgc 420
ttctgccgcc gcgggcgctt ccgctcgccc gacgccgacc ccgagtactt tgacgagccc 480
ccgcgcccgg agctcccgcg ggagcggctc ctcttcagct ccgccaacgc ctccctcgcc 540
cacgcggacg cgctcgcctc cgccgtcgtc gtcgagggca agcgcgcgac cgtcgccaac 600
gtctcgggcg aggtgtccgt gcgcgtggcc gcggcggacg ccgagaccga gggcgtctac 660
acgtggcgcg tgctgtccgc caacggcacc gaggtccgca gcgccaacgt ctcgctcgtc 720
ctgtaccacc agcccgagtt cggcctgagc gcgccgcccg tcctcttcgg cgagcccttc 780
cgggcggtgt gcgtcgtccg cgactactac ccgcggcgca gcgtgcgcct gcgctggttc 840
gcggacgagc acccggtgga cgccgccttc gtgaccaaca gcaccgtggc cgacgagctc 900
gggcgccgca cgcgcgtctc cgtggtgaac gtgacgcgcg cggacgtccc gggcctcgcg 960
gccgcggacg acgcggacgc gctcgcgccg agcctgcgct gcgaggccgt gtggtaccgc 1020
gacagcgtgg cctcgcagcg cttctccgag gccctgcgcc cccacgtcta ccacccggcg 1080
gcggtctcgg tgcgcttcgt cgagggcttc gccgtctgcg acggcctctg cgtgcccccg 1140
gaggcgcgcc tcgcctggtc cgaccacgcc gccgacaccg tctaccacct cggcgcctgc 1200
gccgagcacc ccggcctgct caacgtgcgg agcgcccgcc cgctgtcgga cctcgacggg 1260
cccgtcgact acacctgccg cctcgagggc atgccctcgc agctgcccat cttcgaggac 1320
acgcagcgct acgacgcctc ccccacgtcc gtgagctggc ccgtcgtgac cagcatgatc 1380
accgtcatcg ccggcatcgc catcctagcc atcgtgctgg tcatcatggc gacgtgcgtc 1440
tactaccgcc gggcggggcc gtga 1464
<210> 3
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgctgctcg cagcgctatt ggcggcgctg gtcgcccgga cgacgctcgg cgcggacgtg 60
gacgccgtgc ccgcgccgac cttccccccg cccgcatatc catatacaga atcgtggcag 120
ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc 180
ccgctggagg acccgtgcgg ggtggtggcg ctgatctccg acccgcaggt ggaccggctg 240
ctgaacgagg cggtggccca ccggcggccc acgtaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc 300
atcgcggacg ggtgcgcgca cctgctgtac tttatcgagt acgccgactg cgaccccagg 360
cagatctttg ggcgctgccg gcgccgcacc acgccgatgt ggtggacccc gtccgcggac 420
tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg ctgctcatgg tggccccggg gcggttcaac 480
gagggccagt accggcgcct ggtgtccgtc gacggcgtga acatcctcac cgacttcatg 540
gtggcgctcc ccgaggggca agagtgcccg ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacgtac 600
aagttcggcg cgtgctggag cgacgacagc ttcaagcggg gcgtggacgt gatgcgattc 660
ctgacgccgt tctaccagca gcccccgcac cgggaggtgg tgaactactg gtaccgcaag 720
aacggccgga cgctcccgcg ggcctacgcc gccgccacgc cgtacgccat cgaccccgcg 780
cggccctcgg cgggctcgcc gaggcccagg ccccggcccc ggcccaggcc ccggccgaag 840
cccgagcccg ccccggcgac gcccgcgccc cccggccgcc tgcccgagcc ggcgacgcgg 900
gaccacgccg ccggggggcg ccccacgccg cgacccccga ggcccgagac gccgcaccgc 960
cccttcgccc cgccggccgt cgtgcccagc gggtggccgc agcccgcgga gccgttcccg 1020
ccccggacca ccgccgcgcc gggcgtctcg cgccaccgct cggtgatcgt cggcacgggc 1080
accgcgatgg gcgcgctcct ggtgggcgtg tgcgtctaca tcttcttccg cctgaggggg 1140
gcgaaggggt atcgcctcct gggcggtccc gcggacgccg acgagctaaa agcgcagccc 1200
ggaccataa 1209
<210> 4
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cattatgatc tacttttact acgcggtcaa tgtcgtagaa cttgagcgcg tgcagctggt 60
tgcggcgctg gatctcgctg tagtccagga ggcccgtgtc ggcgagctcc tcgcgcgtgt 120
acacctcgag gggcaggaac tcgcggtcct cgagcagcgt caggttcagg gtcacccgcg 180
tgctgatcgt ctcgggcacc tccaccatgc gcacgtagct gtagtcctcg tagtacacgt 240
acccgccgcc cagcttaaag tagcgccggt ggttgccggt gcagggctcg atgaggtcgc 300
gcgagatgag gagctcgttg tcgtcgccga gctggccctc gatcacgccc gtgccgttgt 360
gctcgaaggt caccagcggg cggctgtagc acgtgccgcg ctcgccgggc acgcgcatgg 420
agttctgcac gtacacgccg ccgcgcacct ccacgcaccg cgagatggcc atcacgtcgc 480
cgagcatgcg cgccgagacg cgctggccca gcgcggccgt ggccacggcg ctggggttca 540
ggcgcgacat ctcgccccac agggtgcggt ccttgttctg cagctcgcac caggcggccg 600
cgatgcggct cagcatgtcg ttcacgtgcg cctggatgtg gtcgtaggtg aactgcaggc 660
gcgcaaactc ggccgagccc gtggtgatgc gcaggtgccc cgtgccgttg acggccggcg 720
gctcgggcgt ccccgccggg ccgggggagc gccgggcccg acgggcggcc gcgggggacg 780
cggggcccac gacgccggcg aggccgaggc gctcgagctc gcgcgcgtac agctgcgcca 840
gctcgttcga gatcagcggg cggaaggcca ccacgaagcc cccgcgggcg aggtacacct 900
cgggcttgtc gccggccagc acgtgcgtgt tgttgtagcg ccgccggtag atggcgtcga 960
tggcctccga ggcctcgcgg aggacgcagt cgcccaggtg cacgcgctgc aggtcgagct 1020
gcgtgacgtc gctgacgaag gaggcgccca gggcccgcga cgtgaagcgg aaggacccgt 1080
cgcgcgtctc gtcgcggatc atctcctcgg cctcgcgcca cttggccagg ctgcacacgc 1140
gccgcgtctt gggggcccag tcccaggcca ccgtgaagtg cggcgtgcgc agaaagttgc 1200
gcgtcacgct ctcggaggcg cggaggcgcg agtccaggtc gatggggtag tagtgctcca 1260
cctgctggaa gcgcccgggc gcgtagccga tgtgctcccc gtgggccccc tcgcgcaggc 1320
cgtagaaggg ggacatgtac acgatgtccc ccgtggacag ggcgaaggag tcgtaggggt 1380
acacggagcg cgcctccacc tcctcgacga tgcagttgac ggaggtgccc gtgtggtaga 1440
agcccgcggc gccgatcttg gtgtaggtgt cgttggtggt gtgccagccg cgggtgccga 1500
gcgcgttcag gcgcgagggg cgcaggtcca cctcgacggg gttctcgtcg cggtcgaagg 1560
cggtcacctt gtggttgttg cgcacgtact cggccttgga gacgcacttg ccgcggcggt 1620
cgatcacgtc cgtgatctcc tgcacgggga cgggcacgcg gtccgtgaag cggttcgtga 1680
tggccgcgta cgtgctcccg gaccacacgg tcgtgacgat gacgttcttg tagtagatgt 1740
gggccttgaa cttgtgcggg gcgatgttct ccttgaagag cacggcgatc ccctccgtga 1800
agttgcgccc ctgcgagtac tcggggcagg cctgctcggg ctccaggcgc accaccgtgg 1860
agccggacgg cggcgggcag acgtagaagc ggtcccgctc ggtcgcggcc gcgcgcacgg 1920
ccgtgcgcgc gtccaggtcg ccgtactcgc cgtcgggggc gtccgagggg ccgggggaga 1980
cggccccgtc gatctcctcg agggactcct ccgcggagaa gccgtctggg gtggcgcccg 2040
tcccgggcgc gggcgaggcc gaggcggccc gcgtcacggc cgccgcgccg cacgtcgggg 2100
tcgcggcgag cgccagcagc agcagcgcta gcgcgacggc gccccgcgca gctgcagcgt 2160
ggtgtggagc aggccaaaga cgtccgaggc cagcaccgcc gtgatgtcct ggtcggtgtc 2220
ctc 2223
<210> 5
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgcgcgtgc gatgctcgcg ctgctggcgc tctacacggc ggccatcgcc gcggcgccgt 60
cgtccacgac ggcgctcggc acgacgccca acgggggcgg gggcggcaac agcagcgcgg 120
gcgagctctc gccctcgccg ccctcgacgc ccgagcccgt ctcggggacg acgggggccg 180
cggcctccac gcccgccgcc gtctcgacgc cccgggtccc gccgccctcg gtctcgcgcc 240
ggaagcccca gcggaacggc aacaggacgc gcgtccacgg cgacaaggcc acctcgcacg 300
ggcgcaagcg catcgtgtgc cgcgagcggc tgttctcggc gagggtgggg gacgcggtca 360
gcttcgggtg cgccgtcgtc ccgcgcgccg gggagacctt cgaggtccgc ttctgccgcc 420
gcgggcgctt ccgctcgccc gacgccgacc ccgagtactt tgacgagccc ccgcgcccgg 480
agctcccgcg ggagcggctc ctcttcagct ccgccaacgc ctccctcgcc cacgcggacg 540
cgctcgcctc cgccgtcgtc gtcgagggca agcgcgcgac cgtcgccaac gtctcgggcg 600
aggtgtccgt gcgcgtggcc gcggcggacg ccgagaccga gggcgtctac acgtggcgcg 660
tgctgtccgc caacggcacc gaggtccgca gcgccaacgt ctcgctcgtc ctgtaccacc 720
agcccgagtt cggcctgagc gcgccgcccg tcctcttcgg cgagcccttc cgggcggtgt 780
gcgtcgtccg cgactactac ccgcggcgca gcgtgcgcct gcgctggttc gcggacgagc 840
acccggtgga cgccgccttc gtgaccaaca gcaccgtggc cgacgagctc gggcgccgca 900
cgcgcgtctc cgtggtgaac gtgacgcgcg cggacgtccc gggcctcgcg gccgcggacg 960
acgcggacgc gctcgcgccg agcctgcgct gcgaggccgt gtggtaccgc gacagcgtgg 1020
cctcgcagcg cttctccgag gccctgcgcc cccacgtcta ccacccggcg gcggtctcgg 1080
tgcgcttcgt cgagggcttc gccgtctgcg acggcctctg cgtgcccccg gaggcgcgcc 1140
tcgcctggtc cgaccacgcc gccgacaccg tctaccacct cggcgcctgc gccgagcacc 1200
ccggcctgct caacgtgcgg agcgcccgcc cgctgtcgga cctcgacggg cccgtcgact 1260
acacctgccg cctcgagggc atgccctcgc agctgcccat cttcgaggac acgcagcgct 1320
acgacgcctc ccccacgtcc gtgagctggc ccgtcgtgac cagcatgatc accgtcatcg 1380
ccggcatcgc catcctagcc atcgtgctgg tcatcatggc gacgtgcgtc tactac 1436
<210> 6
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcatatccat atacagaatc gtggcagctg acgctgacga cggtcccctc gcccttcgtc 60
ggccccgcgg acgtctacca cacgcgcccg ctggaggacc cgtgcggggt ggtggcgctg 120
atctccgacc cgcaggtgga ccggctgctg aacgaggcgg tggcccaccg gcggcccacg 180
taccgcgccc acgtggcctg gtaccgcatc gcggacgggt gcgcgcacct gctgtacttt 240
atcgagtacg ccgactgcga ccccaggcag atctttgggc gctgccggcg ccgcaccacg 300
ccgatgtggt ggaccccgtc cgcggactac atgttcccca cggaggacga gctggggctg 360
ctcatggtgg ccccggggcg gttcaacgag ggccagtacc ggcgcctggt gtccgtcgac 420
ggcgtgaaca tcctcaccga cttcatggtg gcgctccccg aggggcaaga gtgcccgttc 480
gcccgcgtgg accagcaccg cacgtacaag ttcggcgcgt gctggagcga cgacagcttc 540
aagcggggcg tggacgtgat gcgattcctg acgccgttct accagcagcc cccgcaccgg 600
gaggtggtga actactggta ccgcaagaac ggccggacgc tcccgcgggc ctacgccgcc 660
gccacgccgt acgccatcga ccccgcgcgg ccctcggcgg gctcgccgag gcccaggccc 720
cggccccggc ccaggccccg gccgaagccc gagcccgccc cggcgacgcc cgcgcccccc 780
ggccgcctgc ccgagccggc gacgcgggac cacgccgccg gggggcgccc cacgccgcga 840
cccccgaggc ccgagacgcc gcaccgcccc ttcgccccgc cggccgtcgt gcccagcggg 900
tggccgcagc ccgcggagcc gttcccgccc cggaccaccg ccgcgccggg cgtctcgcgc 960
caccgctcgg tgatcgtcgg cacgggcacc gcgatgggcg cgctcctggt gggcgtgtgc 1020
gtctacatct tcttccgcct gaggggggcg aaggggtatc gcctcctggg cggtcccgcg 1080
gacgccgacg agctaaaagc gcagcccgga ccataa 1116
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccggtcaa ggtggaccac aacg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaccgttgt ggtccacctt gacc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgtgccc gggccgatgc ccgc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacgcgggc atcggcccgg gcac 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccgagcat cgcacgcgcg agcg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaccgctcg cgcgtgcgat gctc 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacccgacgt gcgtctacta ccgc 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacgcggta gtagacgcac gtcg 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caccgccctt gctcaccatg agcg 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaccgctca tggtgagcaa gggc 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cacctggacg agctgtacaa gcgc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaacgcgctt gtacagctcg tcca 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccgactcg gtgtacgggt acgc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacgcgtac ccgtacaccg agtc 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccgtccgt agcctccgca gtac 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaacgtactg cggaggctac ggac 24
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctasrgggcg tcggggtcct cgttctc 27
<210> 24
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaccgcgtag taaaagtaga tcataatgtg gtgctgctgc gcggcatcgc caacttct 58
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgtcctggt cggtgtcctc ggggcccgcg ccaaagaccg ccaccag 47
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgggctgct tcgacgcgca cagcttcatg 30
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cacattatga tctactttta ctacgcggtc ratgtcgtag aacttgag 48
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgcgggcccc gaggacaccg accaggacat cacggcggtg ctggcctcgg acgtctttg 59
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gctcttcgcc ctcgtcttat cggccgcctc 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcgaggccat ggcgcgtgcg aatggccccc 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgccgggcgg ggccgtgacg ccccgcgcgt 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cagccggtgg ccgtgcccgc cgccgccgcg 30
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gggggccatt cgcacgcgcc atggcctcgc tcatggtgag caagggcgag gagctg 56
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgcgcgggg cgtcacggcc ccgcccggcg cttgtacagc tcgtccatgc cgagagtgat 60
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gggggccatt cgcacgcgcc atggcctcgc tcgcgcgtgc gatgctcgc 49
<210> 36
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgcgcgggg cgtcacggcc ccgcccggcg gtagtagacg cacgtcgcca tga 53
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cggcctccag ctctcggtcg agaccgagac 30
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cagctgccac gattctgtat atggatatgc gggcgggggg aaggtcggcg cgggcac 57
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gaccataagg aggggtctac cggcgtcgat gatgatggtg g 41
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcagcacgta cgaccccgcg tcccccgagg 30
<210> 41
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcatatccat atacagaatc gtggcagctg acgctgacga cggtcccc 48
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atcgacgccg gtagacccct ccttatggtc cgggctgcgc ttttagctcg tcggcgtccg 60

Claims (6)

1.一种猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以PRV疫苗毒株Bartha-K61为骨架，利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha-K61的基因组第53203~54617位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gC基因，得到嵌合病毒Bartha-gCHB1201，所述gC基因为HB1201基因组第52665~54100位核苷酸；
（2）利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha-K61的基因组第119529~120650位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gD基因，得到嵌合病毒Bartha-gCDHB1201，所述gD基因为HB1201基因组第114954~116081位核苷酸，所述gD基因在CRISPR/Cas9系统的编辑区域设置序列同义突变遗传标记；
（3）利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha-K61的基因组第16575~18803位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gB基因，得到嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201，所述gB基因为HB1201基因组第15760~17982位核苷酸，所述gB基因在CRISPR/Cas9系统的编辑区域设置序列同义突变遗传标记。
2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，其特征在于，步骤（1）包括：
A、序列分析PRV疫苗毒株Bartha-K61与变异毒株HB1201基因组的gC基因，利用CRISPR/Cas9系统，在gC基因变异区域两端设计sgRNA，经退火处理形成双链sgRNA并将所述双链sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-gC和pX335-right-gC；
B、以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gC基因编辑区域两端的同源臂Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm；
C、以pEGFP-N2为模板PCR扩增GFP基因，将扩增后的GFP基因分别与Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm进行融合，得到融合产物GFP-donor，将GFP-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序，GFP-donor测序正确后，PCR扩增，得到线性GFP-donor；
D、将疫苗毒株Bartha-K61的基因组、线性GFP-donor、pX335-left-gC和pX335-right-gC共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒BarthaΔgC-GFP；
E、利用CRISPR/Cas9系统，在GFP基因两端设计sgRNA，并将两端设计sgRNA，经退火处理形成双链sgRNA并将所述sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-GFP和pX335-right-GFP；
F、以变异毒株HB1201基因组为模板，PCR扩增所述gC基因，得到扩增产物gCHB1201，利用融合PCR，将gCHB1201分别与Bartha-gC-left-arm和Bartha-gC-right-arm进行融合，得到融合产物gC-donor，然后将gC-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序正确后，PCR扩增，得到线性gC-donor；
G、将BarthaΔgC-GFP基因组、线性gC-donor、pX335-left-GFP和pX335-right-GFP共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒Bartha-gCHB1201。
3.如权利要求1所述的的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，其特征在于，步骤（2）包括：
a、序列分析PRV疫苗毒株Bartha-K61与变异毒株HB1201基因组的gD基因，利用CRISPR/Cas9系统，在gD基因变异区域两端设计sgRNA，经退火处理形成双链sgRNA并将所述双链sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-gD和pX335-right-gD；
b、以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gD基因编辑区域两端的同源臂，gD-left-arm和gD-right-arm；
c、以变异毒株HB1201为模板，PCR扩增所述gD基因，得到扩增产物gDHB1201，PCR融合gDHB1201与gD-left-arm和gD-right-arm，得到融合产物gD-donor，其中，在CRISPR/Cas9系统中的sgRNA靶向识别所述gD-donor的序列设置所述gD-donor在CRISPR/Cas9系统中的sgRNA编辑区域设置序列同义突变遗传标记，然后将gD-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序正确后，PCR扩增，得到线性gD-donor；
d、将Bartha-gCHB1201基因组、线性gD-donor、pX335-left-gD和pX335-right-gD共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒Bartha-gCDHB1201。
4.如权利要求1所述的的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，其特征在于，步骤（3）包括：
①序列分析PRV疫苗毒株Bartha-K61与变异毒株HB1201基因组的gB基因，利用CRISPR/Cas9系统，在gB基因变异区域两端设计sgRNA，经退火处理形成双链sgRNA并将所述双链sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335-left-gB和pX335-right-gB；
②以疫苗毒株Bartha-K61为模板，PCR扩增得到gD基因编辑区域两端的同源臂gB-left-arm和gB-right-arm
③以变异毒株HB1201为模板，PCR扩增所述gB基因，得到扩增产物gBHB1201，然后PCR融合gBHB1201与gB-left-arm和gB-right-arm，得到融合产物gB-donor，其中，在CRISPR/Cas9系统中的sgRNA靶向识别所述gB-donor的序列设置同义突变遗传标记，将gB-donor克隆到pEASY-Blunt载体上，测序正确后，PCR扩增，得到线性gB-donor；
④将Bartha-gCDHB1201基因组、线性gB-donor、pX335-left-gB和pX335-right-gB共转染Vero CCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201。
5.一种猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株，其特征在于，如权利要求1-4任一项所述的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法得到的嵌合病毒Bartha-gBCDHB1201。
6.如权利要求5所述的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株在制备弱毒活疫苗和灭活疫苗中的应用。
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