CN113862230B - 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株，其中，该猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX‑2017为亲本毒株，使其TK、gI、gE、US9和US2蛋白失活而获得的减毒株。本发明提供的该猪伪狂犬病病毒减毒株可制备成活疫苗，对猪伪狂犬病具有较高的安全性和免疫保护效果。高剂量的猪伪狂犬病病毒减毒株免疫靶动物PRV阴性哺乳仔猪后没有出现任何临床表现，且不排毒；用于非靶动物小鼠后不致病；对猪伪狂犬病具有很好的免疫保护效果，免疫PRV阴性哺乳仔猪后14天可对强毒攻毒提供完全保护，与当前的商品苗相比，攻毒后没有出现任何临床症状和体温变化，适于作为防控伪狂犬病的疫苗候选株。

Description

一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法 和应用

技术领域

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用，属于基因工程技术和动物病毒学领域。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是感染猪的重要疫病之一，农业农村部于2008年将其列为二类动物疫病，目前猪伪狂犬病在我国规模化猪场普遍存在，直接或间接影响养猪业的持续健康发展。伪狂犬病于1902年在匈牙利被首次报道，我国在70年代末从匈牙利引进的Bartha-K61基因缺失疫苗被广泛使用，大多数的猪场通过免疫该疫苗有效地控制了伪狂犬病。猪伪狂犬病的病原体是伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)，PRV能感染不同年龄段的猪，出现高热、精神消沉、厌食、咳嗽、打颤、腹泻、系统性神经紊乱、消瘦甚至死亡等系列临床表现。PRV能在感染动物体内终生潜伏，导致其在特定条件下成为新的传染源。然而，自2011年底开始，在我国华北和东北很多地区免疫过Bartha-K61疫苗的猪群接连暴发了伪狂犬病新疫情，发病率和死亡率较高，病原学研究证实病原体是PRV变种，与经典的PRV强毒株相比，变异毒株对易感动物猪、小鼠和绵羊的致病性都显著增强。

流行病学调查研究显示，PRV变异株从2011年在华北出现之后，2012年迅速蔓延至河南、河北、江西和江苏等地，于2013年在包括浙江、广东和广西在内的南方省市流行。来自20多个不同地区的PRV gE抗体水平持续监测结果显示，自2014年～2019年，疫情总体呈现下降并逐渐趋于平缓的态势，但少数猪场可见散发临床病例，种猪群带毒依然是主要问题。疫苗免疫接种仍然是当前预防、控制与消灭猪伪狂犬病的重要途径。研究结果表明，Bartha-K61疫苗株对当前的PRV流行变异株不能提供完全有效的保护，不能阻止排毒以及病毒在动物大脑、扁桃体、脾脏和肺等部位的定植，仅能提供有限的交叉保护效率。分子病毒学研究结果显示，与经典毒株相比，当前国内的PRV变异株为基因II型，存在宽泛的基因变异，病毒的多个基因都存在替换、插入和缺失。不同基因型之间的遗传差异对病毒的毒力和免疫原性都产生了影响，从而导致基因I型的Bartha-K61株对当前变异株保护力不充分。随着全球养殖业不断向规模化、集中化方向发展，包含猪伪狂犬病在内的疫病防控尤为重要。针对现有商品苗对新出现的PRV变种保护效率存在局限性的现状，基于流行变异株的基因缺失疫苗成为近年来兽用生物制品研发的一个热点和重要方向。

TK基因具有神经靶向功能，TK基因的缺失可有效降低病毒在神经细胞的复制；虽然TK基因的存在可通过增强粘膜免疫促使疫苗毒株进入脑神经细胞提前“占位”，抵抗野毒感染，但是TK基因导致的神经毒力可引起潜伏感染，对妊娠母猪的安全性不够。Chun-HuaWang等公开了(Vaccine 32(2014):3379-3385：Chun-Hua Wang,Jin Yuan,Hua-Yang Qin,et al.,A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid and completeprotection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China)PRV变异株双基因(rPRVTJ-delgE/gI)对仔猪安全，可提供100％完全保护，但是对易感动物小鼠和绵羊却出现严重的瘙痒、神经症状及死亡。Xin Cong等公开了(Veterinary Microbiology 182(2016):170-177:Xin Cong,Jian-Lin Lei,Shui-Li Xia,et al.,Pathogenicity and immunogenicity of a gE/gI/TKgene-deleted pseudorabies virus variant in susceptible animals)在此基础上进一步缺失毒力基因TK，构建得到的三基因缺失疫苗株(rPRVTJ-delgE/gI/TK)安全性显著提高，同时攻毒保护实验结果表明TK基因的缺失没有改变双基因缺失毒株的免疫原性。

中国专利申请CN110527669A公开了一种gI、gE、US9和US2蛋白失活的猪伪狂犬病病毒减毒株的构建，以该毒株制备成的活疫苗或灭活疫苗接种30日龄仔猪，对猪伪狂犬病具有很好的免疫保护效果，没有出现任何临床症状。但是该减毒株是在Cre重组酶的作用下缺失两端携带LoxN位点的标记基因GFP得到的，最终在缺失位置残留了一个LoxN位点，残留的一个34bp的LoxN位点对基因缺失株的遗传稳定性和安全性如何是未知的。TK基因的存在是否对非靶动物安全，该专利申请未能提供该减毒株在非靶动物的安全性。

中国专利申请CN104862286A公开了猪伪狂犬病弱毒株PRV HN1202 gI/gE/11K/28K/TK的构建，公开了一种gI/gE/11K/28K整个ORP缺失、TK基因C端缺失770bp的伪狂犬病病毒，通过同源重组在缺失部位插入两端携带LoxP位点的标记基因GFP表达框，然后在Cre重组酶的作用下缺失标记基因GFP表达框，以该病毒滴鼻接种5头7日龄的仔猪后无临床症状，以该病毒制备的活疫苗经肌肉注射方式免疫5头9日龄仔猪，在免疫后28天可对强毒攻毒提供100％完全保护，无异常临床症状。但由于其利用loxp-cre的基因工程操作手段，在最终得到的猪伪狂犬病弱毒株PRV HN1202 gI/gE/11K/28K/TK其基因组TK和gI/gE/11K/28K缺失位置分别留下一个34bp的LoxP位点，残留的两个LoxP位点对基因缺失株的遗传稳定性和安全性如何是未知的。根据本领域常规经验，商品化减毒活疫苗株Bartha-K61株在用于仔猪后存在短时间的鼻腔排毒，该专利申请未能提供疫苗毒株接种后排毒，以及哨兵猪的临床实验数据。而且根据本领域转基因生物安全评价中对基因缺失活疫苗株用于非靶动物的要求，该专利申请未能提供该减毒株在非靶动物的安全性。

发明内容

发明人对变异分离株与之前的包括Bartha-K61在内的PRV毒株基因组序列进行比对分析，发现大多数的病毒基因出现了基因替换、插入或缺失，这暗示着当前的PRV流行分离株发生了变异。当前，市场急切需要基于现有流行毒株开发的PRV疫苗。

为了解决当前市场缺乏伪狂犬病病毒变异株疫苗不足的现状，本发明的目的之一是提供一株与当前流行变异株同源性很高，能代表当前流行变异特点，与猪伪狂犬病病毒经典株差异明显的强毒株。该毒株可作为基因改造的亲本毒株，为开发针对流行毒株的PRV疫苗提供亲本材料。

本发明的亲本毒株猪伪狂犬病毒PRV GX-2017是2017年从中国广西某猪场发病的猪脑组织中分离得到的。该毒株与当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株同源性很高，但是与猪伪狂犬病病毒经典株差异明显，在gE基因第48位氨基酸突变插入一个天冬氨酸。动物实验结果表明，PRV GX-2017株对小鼠和仔猪都表现出强致死性；仔猪感染PRV GX-2017株后，出现猪伪狂犬病典型症状。

该猪伪狂犬病毒PRV GX-2017已于2021年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为CGMCCNo.22110。

本发明的另一个目的是提供一株基于上述猪伪狂犬病毒PRV GX-2017经基因工程方法构建的缺失TK、gI、gE、US9和US2基因的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株。该毒株为针对当前流行的猪伪狂犬病病毒强毒株变异株的弱毒株，可用于制备PRV疫苗。

本发明的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017为出发毒株，使其TK、gI、gE、US9和US2蛋白失活获得的减毒株。其中，所述TK基因序列如序列表中序列1所示；gI基因序列如序列表中序列2所示；所述gE基因序列如序列表中序列3所示；所述US9基因序列如序列表中序列4所示；所述US2基因序列如序列表中序列5所示。

该猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株通过将猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017的TK、gI、US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失而获得所述的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株。

在本发明的一个实施例中，所述缺失的基因序列为：PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间的DNA序列，以及gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间的DNA序列。

本发明提供的针对当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株的弱毒株是一株猪伪狂犬病病毒变异株的基因缺失毒株，名称为PRV GX-ΔTK/IES。

本发明的再一个目的是提供一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株的构建方法。

发明通过以下技术方案实现：

发明以PRV变异株PRV GX-2017作为亲本毒株，利用分子生物学和细胞生物学的方法构建了TK、gI、gE、US9和US2基因缺失的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株PRV GX-ΔTK/IES，发明构建的缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES缺失了PRV GX-2017变异毒株的基因组中TK基因的部分序列、gI基因的部分序列、US2基因的部分序列、gE基因的全部序列和US9基因的全部序列。

所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株的构建方法，其构建步骤为：

(1)gI-US2转移质粒的构建，以pUC载体为骨架载体，构建转移载体pUC-IES和pUC-IES-EGFP：在pUC载体中插入猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株基因组中gI基因缺失位点之前的部分序列作为左同源臂、US2基因缺失位点之后的部分序列作为右同源臂，得到转移载体pUC-IES；左右同源臂间插入EGFP基因表达框，得到pUC-IES-EGFP。

(2)TK转移质粒的构建，以pUC载体为骨架载体，构建转移载体pUC-TK-EGFP：在pUC载体中插入猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株基因组中TK基因缺失5′位点之前的部分序列作为左同源臂、TK基因缺失3′位点之后的部分序列作为右同源臂，得到转移载体pUC-TK；左右同源臂间插入EGFP基因表达框，得到pUC-TK-EGFP。

(3)缺失gI-US2基因病毒的构建，转移载体pUC-TK-EGFP转染经亲本GX-2017病毒感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP；然后转移载体pUC-TK转染经缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔIES。

(4)缺失TK基因病毒的构建，转移载体pUC-TK-EGFP转染经缺失病毒PRV GX-ΔIES感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP，然后将转移载体pUC-TK转染经缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES。

优选的，所述步骤(1)中，所述左同源臂的序列为序列表中序列6，所述右同源臂的序列为序列表中序列7；所述步骤(2)中，所述左同源臂的序列为序列表中序列8，所述右同源臂的序列为序列表中序列9。

本发明的目的之三是提供了一种病毒载体，所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株在基因工程疫苗研制方面的应用，其特征在于作为病毒载体可插入一种和/或多种核酸序列，以获得的表达基因的重组病毒，在制备重组载体基因工程疫苗中的应用。

本发明的目的之四是提供构建的伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株在制备防治伪狂犬病病毒引起的动物传染病药物中的应用。

本发明所构建的PRV变异株基因缺失毒株可制备成活疫苗，对猪伪狂犬病病毒都具有很好的免疫保护效果，接种猪只没有出现任何临床症状，安全性高，免疫后能够迅速产生PRV特异性抗体，能够对当前PRV变异株的攻击提供完全保护。

附图说明

图1是猪场病猪脑组织样品的PCR鉴定结果图。泳道1为250bp DNA Ladder，泳道2为TK基因扩增条带，泳道3为gE基因扩增条带，泳道4为gB基因扩增条带。

图2是基因缺失病毒构建示意图。

图3是基因缺失毒株的PCR鉴定结果图，左图为基因TK缺失区域的鉴定，右图为gIgEUS9US2区域的鉴定结果图。

图4是基因缺失株接种仔猪后14天的体温监测结果。

图5是基因缺失株接种小鼠后的病理变化。

图6是哨兵猪与基因缺失疫苗免疫接种组动物同居圈养体温监测结果图。

图7是哨兵猪与基因缺失疫苗免疫接种组动物同居圈养后gE和gB抗体检测结果图。

图8是攻毒后实验组和对照组动物体温14天内的监测结果图。

图9是基因缺失病毒制备成活疫苗接种阴性仔猪后gE和gB抗体检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的优选实施方式进行进一步的说明。需要本领域普通技术人员理解的是，本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行修改和变更，但都落入本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的实验材料和实验试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的pEGFP-N1、pUC18购自美国CIontech公司；猪肾细胞系(Porcine Kidney,PK-15)和非洲绿猴肾细胞系Vero购自美国菌种中心ATCC。

实施例1、猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株的分离鉴定

我国广西某猪场疑似PRV感染的病猪体的脑组织样品，取部分样品提取组织的基因组DNA，利用特异性引物对P1F/P1R、P2F/P2R、P3F/P3R分别PCR扩增PRV的TK、gE和gB基因，电泳结果显示呈阳性(图1)，扩增条带大小分别约是954bp、3700bp、2800bp，结果与预期相符合；同时将gE基因的PCR产物测序结果与NCBI公布的多株PRV gE基因的相应区域进行序列比对，结果显示在gE基因第48位氨基酸突变插入一个天冬氨酸。基于gE基因核苷酸序列的进化树分析表明PRV GX-2017株与当前的PRV变异株同源性极高，但是与猪伪狂犬病病毒经典株差异明显。

将脑组织样品用DMEM培养基匀浆后离心、过滤，取滤液接种单层PK-15细胞，孵育2小时后换为含2％胎牛血清的DMEM培养基，于5％CO₂、37℃条件下继续培养3-5天，可观察到合胞体形式的细胞病变，待细胞病变95％时收获病毒液，为PRV GX-2017株原代病毒。PRVGX-2017株接种PK-15细胞扩增，分装后冻于-80℃保存。

小鼠和仔猪动物实验结果表明，PRV GX-2017株对小鼠和仔猪均表现出强致死性；选取PRV抗体和抗原阴性的30日龄健康易感仔猪4头，分别颈部肌肉注射10⁶TCID₅₀ PRV GX-2017株，接种后连续观察14日，观察、记录临床症状。4头仔猪在均接种后第2～4天体温升高，并相继出现显著的精神萎靡、不喜运动、久卧不起、食欲不振，接种后5～8天其中3头仔猪死亡。结果表明，仔猪感染PRV GX-2017株后，出现典型猪伪狂犬病症状，是强毒力毒株。

该猪伪狂犬病毒PRV GX-2017已于2021年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为CGMCCNo.22110。

实施例2、PRV GX-2017株基因缺失毒株的构建(图2)

本发明的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以实施例1分离的猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017为亲本毒株，通过将该猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017的TK、gI和US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失(PRV GX-2017变异株基因组中TK基因CDS区第303位碱基至第908位碱基之间的DNA序列，以及gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间的DNA序列)，使其TK、gI、gE、US9和US2蛋白失活而获得的减毒株。所述TK、gI、gE、US9和US2蛋白的序列分别为序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。

一、包含GFP基因的同源重组转移质粒的构建与鉴定

1、首先在载体pUC18的基础上设计缺失57bp的一段多克隆位点，并通过人工基因合成后环化获得载体pUC。

根据NCBI公布的PRV序列，分别设计并合成引物对P4F/P4R、P5F/P5R、P6F/P6R、P7F/P7R，以亲本病毒PRV GX-2017DNA为模板，通过P4F/P4R扩增包含gI基因的左同源臂gI-L(序列6)，P5F/P5R扩增包含US2基因的右同源臂US2-R(序列7)。将PCR产物左同源臂gI-L通过EcoRI和HindIII克隆到载体pUC，得到亚克隆pUC-gIL；然后将右同源臂US2-R经HindIII和MluI酶切位点克隆到pUC-gIL，获得转移质粒pUC-IES。然后，以亲本病毒PRV GX-2017DNA为模板，通过P6F/P6R扩增包含TK基因5′端的左同源臂TK-L(序列8)，P7F/P7R扩增包含TK基因3′端的右同源臂TK-R(序列9)。将PCR产物左同源臂TK-L通过EcoRI和HindIII克隆到载体pUC，得到亚克隆pUC-TKL；然后将右同源臂TK-R经HindIII和MluI酶切位点克隆到pUC-TKL，获得转移质粒pUC-TK。

2、以pEGFP-N1质粒为模板，通过引物P8F/P8R扩增质粒的全长，利用ToYoBo点突变试剂盒KOD-Plus-Mutagenesis Kit对其进行小片段缺失突变，缺失594-668位碱基，以去除多克隆位点，得到质粒pEGFP-N1-del；然后，以pEGFP-N1-del质粒为模板，通过引物P9F/P9R扩增EGFP完整的表达框，得到PCR产物EGFP。

3、将片段EGFP经HindIII酶切位点分别克隆到转移质粒pUC-IES、pUC-TK，获得最终的转移质粒pUC-IES-EGFP和pUC-TK-EGFP。

二、缺失病毒PRV GX-ΔIES的构建

以感染系数0.1将亲本病毒PRV GX-2017感染单层Vero细胞1-2小时，将2.5μg转移载体pUC-IES-EGFP和10μL Lipofectamine^TM 2000试剂按照Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)说明书进行转染，在转染后24小时观察细胞的病变和绿色荧光蛋白的表达，反复冻融三次后收获细胞裂解物。将转染后的细胞裂解物接种于6孔板单层PK-15细胞，在接种后1-2小时弃去培养基并用PBS清洗一遍，加入2mL含1％低熔点琼脂糖、2％FBS的DMEM培养基后持续培养3-5天；当肉眼可见直径为1-2mm的蚀斑时，荧光显微镜下观察，挑取表达绿色荧光蛋白的蚀斑于500μL DMEM培养基。将以上的蚀斑纯化步骤重复至少15轮进行筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP。

按照Lipofectamine^TM 2000说明书，将质粒pUC-IES转染经表达绿色荧光蛋白的重组缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP感染的PK-15细胞，转染后3-5天观察细胞病变和荧光蛋白的表达情况，反复冻融三次后收获细胞裂解物；连续重复该转染步骤至少3次，收获细胞裂解物上清；通过蚀斑纯化步骤挑取不表达EGFP的蚀斑，将该细胞裂解物上清蚀斑纯化至少15轮进行筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔIES。

三、缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES的构建与鉴定

以感染系数0.1将缺失病毒PRV GX-ΔIES感染单层Vero细胞1-2小时，将2.5μg转移载体pUC-TK-EGFP和10μL Lipofectamine^TM 2000试剂按照Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)说明书进行转染，在转染后24小时观察细胞的病变和绿色荧光蛋白的表达，反复冻融三次后收获细胞裂解物。将转染后的细胞裂解物接种于6孔板单层PK-15细胞，在接种后1-2小时弃去培养基并用PBS清洗一遍，加入2mL含1％低熔点琼脂糖、2％FBS的DMEM培养基后持续培养3-5天；当肉眼可见直径为1-2mm的蚀斑时，荧光显微镜下观察，挑取表达绿色荧光蛋白的蚀斑于500μL DMEM培养基。将以上的蚀斑纯化步骤重复至少15轮进行筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP。

按照Lipofectamine^TM 2000说明书，将质粒pUC-TK转染经表达绿色荧光蛋白的重组缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP感染的PK-15细胞，转染后3-5天观察细胞病变和荧光蛋白的表达情况，反复冻融三次后收获细胞裂解物；连续重复该转染步骤至少3次，收获细胞裂解物上清；通过蚀斑纯化步骤挑取不表达EGFP的蚀斑，将该细胞裂解物上清蚀斑纯化至少15轮进行筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES(图2)。

将得到的无标记基因缺失病毒提取基因组，分别通过引物P1F/P1R、P2F/P2R扩增基因以确定目的基因片段的缺失。结果表明，得到的缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES其缺失区域与预期一致，TK基因部分缺失，gI、US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失(图3)(序列28是以PRV GX-ΔTK/IES为模板，用引物P1F/P1R扩增TK基因缺失区域的序列，与亲本毒株PRVGX-2017扩增954bp相比片段小了很多，证明TK基因部分缺失；序列29是用引物P2F/P2R扩增包含gI-US2基因缺失区域，与亲本毒株PRV GX-2017相比片段小了很多，证明gI、US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失)。

表1本发明所涉及的相关引物信息

实施例3、基因缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES制备成活疫苗在靶动物猪体和非靶动物小鼠的安全性

一、对仔猪的安全性试验

选取PRV抗体和抗原阴性的哺乳仔猪21头，随机分成4组。其中，实验组a、b和c组各6头/组，分别颈部肌肉注射基因缺失活疫苗PRV GX-ΔTK/IES，a组单剂量10⁶TCID₅₀、b组单剂量重复和c组高剂量10⁷TCID₅₀；同时，设对照组d组3头动物，颈部肌肉注射1.0mL DMEM培养基。免疫后连续观察14日，免疫前、免疫后每天对所有接种猪只进行体温测定，并观察、记录临床症状。临床观察结果显示，接种PRV GX-ΔTK/IES基因缺失毒株疫苗后，14天内所有动物均没有表现出任何临床症状，接种部位正常，采食规律无异常，精神状态良好，与PBS对照d组的临床表现没有任何差异。体温检测结果如图4所示，整个监测期间所有动物未出现发热现象、体温正常(表2)。

表2基因缺失株接种仔猪后14天的体温监测结果

二、对小鼠的安全性试验

29只小鼠随机分成3组。第1组12只小鼠每只腹腔接种10³TCID₅₀ PRV GX-ΔTK/IES株；第2组12只小鼠每只动物腹腔接种10⁴TCID₅₀ PRV GX-ΔTK/IES株；第3组为空白对照，5只小鼠每只动物腹腔接种相同体积的PBS。PRV GX-ΔTK/IES株接种的2组小鼠，分别在接种后的第4、7和14天随机挑出4只，分别采集血液用于PCR检测疫苗毒的存在；同时，剖杀4只小鼠，观察组织病变情况，并将采集的组织样本进行PCR检测疫苗毒的存在。接种后14天观察期内，所有小鼠均存活，没有表现出任何临床症状，采食规律无异常，精神状态良好，与PBS对照组的5只小鼠临床表现没有任何差异。分别在接种后第4、7和14天剖杀小鼠，观察组织器官病变情况。结果显示，10³TCID₅₀和10⁴TCID₅₀剂量接种组的小鼠其脑、肝、心、肺、脾和肾等器官与PBS接种组一致，没有病理变化(图5)。小鼠血液中病毒基因组的PCR检测结果显示，10³TCID₅₀剂量和10⁴TCID₅₀剂量所有小鼠血液PRC检测结果呈阴性；小鼠组织中病毒检测也结果显示所有小鼠组织检测结果呈阴性(表3)。以上结果说明，PRV GX-ΔTK/IES株用于非靶动物小鼠没有致病性，对小鼠安全。

表3 PRV GX-ΔTK/IES株在小鼠血液和组织中的检测结果

备注：接种免疫组每组12只小鼠，在接种后4、7和14天，每次随机挑出4只，先采集血液，然后剖杀取组织用于PCR检测。

三、在仔猪的水平传播能力检测

选取PRV抗体和抗原阴性的30日龄健康易感仔猪10头，随机分成2组。10头仔猪，每组5头动物。实验组每头动物右颈部肌肉接种10⁷TCID₅₀ PRV GX-ΔTK/IES(高剂量)，哨兵组5头动物不接种疫苗并与实验组混合饲养28天。在疫苗接种仔猪后，每天测量所有动物体温，观察并记录临床反应。在接种后7、14、21、28天分别收集所有接种和未接种的动物血清，按照IDEXX PRV gB和gE阻断ELISA抗体检测试剂盒说明书的操作步骤检测血清中的抗体水平。

临床观察结果显示，所有接种免疫的动物均没有表现出任何临床症状，接种部位正常，采食规律无异常，精神状态良好，与同居未接种5头哨兵猪的临床表现没有任何差异。体温检测结果如图6所示，整个监测期间所有动物未出现发热现象、体温正常(表4)。

表4哨兵猪与基因缺失疫苗免疫接种组动物同居圈养体温监测结果

分别在接种免疫后7、14、21和28天收集所有动物的血清，特异性gE和gB特异性抗体的检测结果如图7所示，所有接种仔猪和同居未接种哨兵猪的gE抗体一直呈现阴性(图7A，表5)；5头接种免疫动物gB抗体在免疫后7天转阳，5头同居对照动物整个实验过程gB抗体一直保持阴性(图7B，表6)。说明基因缺失PRV GX-ΔTK/IES株毒力显著降低，高剂量免疫仔猪安全、没有致病性，且不具有向周围同居动物水平传播的能力。

表5哨兵猪与基因缺失疫苗免疫接种组动物同居圈养后gE抗体检测结果

备注：判定标准：阴性S/N值＞0.7，可疑0.6≤S/N值≤0.7，阳性S/N值＜0.6。

表6哨兵猪与基因缺失疫苗免疫接种组动物同居圈养后gB抗体检测结果

备注：判定标准：阴性S/N值＞0.7，可疑0.6≤S/N值≤0.7，阳性S/N值＜0.6。

实施例4、基因缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES制备成活疫苗在靶动物猪体的免疫效力评价一、疫苗肌肉注射途径在靶动物猪体的免疫效力评价

选取PRV抗体和抗原阴性的哺乳仔猪13头，随机分成A、B、C共3组。其中，A组5头动物颈部肌肉途径注射基因缺失活疫苗PRV GX-ΔTK/IES(10⁶TCID₅₀)，B组5头动物按照产品说明书免疫市场商品活疫苗Bartha-K61，设对照组仔猪3头，颈部肌肉注射1.0mL DMEM培养基。3组动物隔栏养殖。免疫后2周对所有仔猪用PRV GX-2017毒株滴鼻攻毒1mL(10⁶TCID₅₀)，免疫后和攻毒后每天对所有猪进行临床症状观察，在免疫后第0、7、14、21、28天用IDEXX试剂盒进行gB和gE特异性抗体检测。

攻毒后对照组的3头动物在第3～5天相继发病，出现伪狂犬病典型症状，表现为体温升高、精神沉郁、四肢呈划水状、共济失调，神经症状显著；其中，1头动物在攻毒后第7天死亡，另外2头动物一直表现高温稽留、伏地不起的状态直至试验结束。与对照组相比，疫苗PRV GX-ΔTK/IES免疫组和商品苗Bartha-K61免疫组的所有动物在强毒攻毒后均没有出现伪狂犬病的症状，提供100％完全保护。攻毒后各组动物的体温监测结果如图8所示，PRVGX-ΔTK/IES株免疫组动物在攻毒后体温没有显著变化，商品苗Bartha-K61免疫组动物在攻毒后第3和4天有一过性轻微发热，攻毒对照组的3头动物在攻毒后第三天体温升至41℃以上且高热稽留(表7)。

表7攻毒后实验组和对照组动物体温14天内的监测结果

免疫7天后PRV gE和gB抗体检测结果显示，免疫PRV GX-ΔTK/IES株和Barth-K61的gB抗体转为阳性，在免疫后7天、14天疫苗PRV GX-ΔTK/IES免疫组动物血清gB检测OD650S/N值均低于商品苗Bartha-K61免疫组(图9B，表9)；疫苗免疫A和B组的所有动物gE抗体在免疫后7天和14天均为阴性(图9A，表8)。对照组动物在攻毒后7天gB抗体转为阳性，攻毒后14天gE抗体检测也为阳性。这也进一步说明基因缺失PRV GX-ΔTK/IES株不表达gE蛋白，能够通过对gE抗体的检测实现鉴别诊断。

表8基因缺失病毒制备成活疫苗接种阴性仔猪后gE抗体检测结果

备注：判定标准：阴性S/N值＞0.7，可疑0.6≤S/N值≤0.7，阳性S/N值＜0.6

表9基因缺失病毒制备成活疫苗接种阴性仔猪后gB抗体检测结果

备注：判定标准：阴性S/N值＞0.7，可疑0.6≤S/N值≤0.7，阳性S/N值＜0.6。

二、疫苗滴鼻途径在靶动物猪体的免疫效力评价

选取PRV抗体和抗原阴性的哺乳仔猪8头，随机分成2组。其中，实验组5头动物经滴鼻途径免疫基因缺失活疫苗PRV GX-ΔTK/IES(10⁶TCID₅₀)，设对照组仔猪3头，滴鼻1.0mLDMEM培养基。2组动物隔栏养殖。免疫后2周对所有仔猪用PRV GX-2017毒株滴鼻攻毒1mL(10⁶TCID₅₀)，免疫后和攻毒后每天对所有猪进行临床症状观察，在免疫后第0、7、14、21、28天用IDEXX试剂盒进行gB和gE特异性抗体检测。

攻毒后对照组的3头动物在攻毒后第2天温度升高，随后1～3天出现伪狂犬病典型症状，表现出精神沉郁、四肢呈划水状、共济失调等症状；其中，1头动物在攻毒后第6天死亡，1头动物在攻毒后第8天死亡，剩下1头动物一直表现高温稽留、伏地不起的状态直至试验结束。与对照组相比，疫苗PRV GX-ΔTK/IES滴鼻免疫组的所有动物在强毒攻毒后均没有出现伪狂犬病的症状，提供100％完全保护。攻毒后各组动物的体温监测结果如表10所示，PRV GX-ΔTK/IES株滴鼻免疫组动物在攻毒后体温没有显著变化，攻毒对照组的3头动物在攻毒后第二天体温升高，在第三天升高至41℃以上且高热稽留。

表10攻毒后滴鼻免疫组和对照组动物体温14天内的监测结果

免疫7天后PRV gE和gB抗体检测结果显示，滴鼻免疫PRV GX-ΔTK/IES组的动物，gB抗体在免疫后14天OD650 S/N值在0.06至0.5之间(表12)；滴鼻免疫PRV GX-ΔTK/IES的所有动物gE抗体在免疫后7、14和21天为阴性，在攻毒后14天5头动物中有2头gE抗体转为阳性(表11)。攻毒对照组动物在攻毒后第7天gB抗体转为阳性，攻毒后14天gE抗体检测也为阳性。

表11基因缺失病毒制备成活疫苗接种阴性仔猪后gE抗体检测结果

备注：判定标准：阴性S/N值＞0.7，可疑0.6≤S/N值≤0.7，阳性S/N值＜0.6；“—”表示动物死亡。

表12基因缺失病毒制备成活疫苗接种阴性仔猪后gB抗体检测结果

备注：判定标准：阴性S/N值＞0.7，可疑0.6≤S/N值≤0.7，阳性S/N值＜0.6；“—”表示动物死亡。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

<130> WHOI210057

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 1

tctgttcgac acggacacgg tggccggtat ttacgatgcg cagacccgga agcagaacgg 60

cagcctgagc gaggaggacg cggccctcgt cacggcgcag caccaggccg ccttcgcgac 120

gccgtacctg ctgctgcaca cgcgcctggt cccgctcttc gggcccgcgg tcgagggccc 180

gcccgagatg acggtcgtct ttgaccgcca cccggtggcc gcgacggtgt gcttcccgct 240

ggcgcgcttc atcgtcgggg acatcagcgc ggcggccttc gtgggcctgg cggccacgct 300

gcccggggag ccccccggcg gcaacctggt ggtggcctcg ctggacccgg acgagcacct 360

gcggcgcctg cgcgcccgcg cgcgcgccgg ggagcacgtg gacgcgcgcc tgctcacggc 420

cctgcgcaac gtctacgcca tgctggtcaa cacgtcgcgc tacctgagct cggggcgccg 480

ctggcgcgac gactgggggc gcgcgccgcg cttcgaccag accgtgcgcg actgcctcgc 540

gctcaacgag ctctgccgcc cgcgcgacga ccccgagctc caggacaccc tcttcggcgc 600

gtacaaggcg cccgagctct gcgaccggcg cgggcgcccg ctcgaggtgc acgcgtgggc 660

gatggacgcg ctcgtggcca agctgctgcc gctgcgcgtc tccaccgtcg acctggggcc 720

ctcgccgcgc gtctgcgccg cggccgtggc ggcgcaggcg cgcggcatgg aggtgacgga 780

gtccgcgtac ggcgaccaca tccggcagtg cgtgtgcgcc ttcacgtcgg agatgggggt 840

gtgaccctcg cccctcccac ccgcgccgcg gccggatgga gaccgcgacg gaggcaacga 900

cgacggcgtg ggagggggct cggggcgcgt ataaagccat gtgtatgtca tccc 954

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 2

atgatgatgg tggcgcgcga cgtgacccgg ctccccgcgg ggctcctcct cgccgccctg 60

accctggccg ccctgacccc gcgcgtcggg ggcgtcctct tcaggggcgc cggcgtcagc 120

gtgcacgtcg ccggcagcgc cgtcctcgtg cccggcgacg cgcccaacct gacgatagac 180

gggacgctgc tgtttctgga ggggccctcg ccgagcaact acagcgggcg cgtggagctg 240

ctgcgcctcg accccaagcg cgcctgctac acgcgcgagt acgccgccga gtacgacctc 300

tgcccccgcg tgcaccacga ggccttccgc ggctgcctgc gcaagcgcga gccgctcgcc 360

cggcgcgcgt ccgccgcggt ggaggcgcgc cggctgctgt tcgtctcgcg cccggcctcg 420

ggggacgcgg ggtcgtacgt gctgcgggtc cgcgtgaacg ggaccacgga cctctttgtg 480

ctgacggccc tggtgccgcc gagggggcgc cccgtcccca cgtcgccgtc cgcggacgag 540

tgccggcccg tcgtcggatc gtggcacgac agcctgcgcg tcgtggaccc cgccgaggac 600

gccgtgttca ccacccagcc cccgcccgag cccgagccgc cgacgacccc cgcgccaccc 660

cgggggaccg gcgccacccc cgagccccga tcggacgagg aggaggaggg tgacgcggag 720

acgacgacgc cgacgatgac cccggcgccc gggaccctgg acgcgaacgg cacgatggtg 780

ctgaacgcca gcgtcgtgtc gcgcgtcctg ctcgccgccg ccaacgccac ggcgggcgcc 840

cggagccccg ggaagatagc catggtgctg gggcccacga tcgtcgtcct cctgatcttc 900

ctgggcggga tcgcctgcgt ggcccggcgc tgcgcgcgga atcgcatcta ccggccgcga 960

cccgggcgcg gatcggcggt ccacgcggcg cccccgcggc gcccgccccc caaccccgtc 1020

gccggggcgc ccgtccccca gcccaagatg acgttggccg agctgcgcca gaagctcgcc 1080

accatcgcag aagaacaata a 1101

<210> 3

<211> 1665

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 3

atgcggccct ttctgctgcg cgccgcgcag ctcctggcgc tgctggccct ggcgctctcc 60

accgaggccc cgagcctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt 120

ccctcggccg aggtctggga cgaccgctcc accgaggccg gcgacgatga cctcaacggc 180

gacgaccgcc gcgcgggctt cggctcggcc ctcgcctccc tgagggaggc gcccccggcc 240

catctggtga acgtgtccga gggcgccaac ttcaccctcg acgcgcgcgg cgacggcgcc 300

gtgctggccg ggatctggac gttcctgccc gtccgcggct gcgacgccgt gtcggtgacc 360

acggtgtgct tcgagaccgc gtgccacccg gacctggtgc tgggccgcgc ctgcgtcccc 420

gaggccccgg agatgggcat cggcgactac ctgccgcccg aggtgccgcg gctccggcgc 480

gagccgccca tcgtcacccc ggagcggtgg tcgccgcacc tgagcgtcct gcgggccacg 540

cccaacgaca cgggcctcta cacgctgcac gacgcctcgg ggccgcgggc cgtgttcttt 600

gtggcggtgg gcgaccggcc gcccgcgccg gcggacccgg tgggccccgc gcgccacgag 660

ccccgcttcc acgcgctcgg cttccactcg cagctcttct cgcccgggga cacgttcgac 720

ctgatgccgc gcgtggtctc ggacatgggc gactcgcgcg agaactttac cgccacgctg 780

gactggtact acgcgcgcgc gcccccgcgg tgcctgctgt actacgtgta cgagccctgc 840

atctaccacc cgcgcgcgcc cgagtgcctg cgcccggtgg acccggcgtg cagcttcacc 900

tcgccggcgc gcgcgcggct ggtggcgcgc cgcgcgtacg cctcgtgcag cccgctgctc 960

ggggaccggt ggctgaccgc ctgccccttc gacgccttcg gcgaggaggt gcacacgaac 1020

gccaccgcgg acgagtcggg gctgtacgtg ctcgtgatga cccacaacgg ccacgtcgcc 1080

acctgggact acacgctcgt cgccaccgcg gccgagtacg tcacggtcat caaggagctg 1140

acggccccgg cccgggcccc gggcaccccg tggggccccg gcggcggcga cgacgcgatc 1200

tacgtggacg gcgtcacgac gccggcgccg cccgcgcgcc cgtggaaccc gtacggccgg 1260

acgacgcccg ggcggctgtt tgtgctggcg ctgggctcct tcgtgatgac gtgcgtcgtc 1320

ggggggccgt ctggctctgc gtgctgtgct cccggcgccg ggcggcctcg cggccgttcc 1380

gggtgccgac gcgggcgcgg acgcacatgc tctctccggt gtacaccagc ctgcccacgc 1440

acgaggacta ctacgacggc gacgacgacg acgaggaggc gggcgtcgtc cgccggcggc 1500

ccgcctcccc cggcggggac agcggctacg aggggccgta cgcgagcctg gaccccgagg 1560

acgagttcag cagcgacgag gacgacgggc tgtacgtgcg ccccgaggag gcgccccgct 1620

ccggcttcga cgtctggttc cgcgatccgg agaaaccgga agtga 1665

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 4

atgcccagcg ccgcctccgt cgacatggac acgtttgacc ccagcgcccc cgtcccgacg 60

agcgtctcga acccggccgc cgacgtcctg ctggccccca agggaccccg ctccccgctg 120

cgcccccagg acgactcgga ctgctactac agcgagagcg acaacgagac gcccagcgag 180

ttcctgcgcc gcgtgggacg ccggcaggcg gcgcgtcgga gacgccgccg ctgcctgatg 240

ggcgtcgcga tcagcgccgc cgcgctggtc atctgctcgc tgtccgcgct actcgggggc 300

atcgtcgcca ggcacgtgta g 321

<210> 5

<211> 771

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 5

atgggggtga cggccatcac cgtggtcacg ctgatggacg gggccgggca catccccgcc 60

ttcgtgggcg aggcgcaccc ggacctgtgg aaggtgctca ccgagtggtg ctacgcgtcg 120

atggtgcagc agcggcgcgc cgccgacgag aactcgccgc ggcagcacgt ggtgttgcgc 180

tcctcggaga tctccccggg ctcgctggcc ctgctgccgc gcgccgtgcg ccccgtcgtg 240

cggacgcggt ccgaccccac ggcgccgttc tacatcacca ccgagacgca cgagctgacg 300

cggcgccccc cggcggacgg ctcgaagccc ggggagcccc tccggatcag cccgcccccg 360

cggctggaca cggagtggtc gtccgtcctg aacgggatcc agtacctgaa ctcgggggcc 420

cggggcacgg cccccgtcca cctgtggatc ctgggcgccg ccgacctctg cgaccaggtg 480

ctcctggccg cctcccgcag caccgccgcc ggagcctccc acgcccagac gggcgcgcgc 540

ctgacccggc gccggcccgg gctgacggac gccgacgccc tggacgtgat cgtcgccggg 600

atccaggcga cccgcgccat gttcgcgcgg gtccacaacc gctcctggcg ccacgccggc 660

gagtggacgg aggccctgca ctcccagatc gtgacccggg gcgacgtgcg ccggcgccga 720

ggcgggcgcg gcaacggacg cgagcgcgcc ccgcgatgta ccatctccta g 771

<210> 6

<211> 1352

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 6

ggaattcggt ggtggcgctg atctccgacc cgcaggtgga ccggctgctg aacgaggcgg 60

tggcccaccg gcggcccacg taccgcgccc acgtggcctg gtaccgcatc gcggacgggt 120

gcgcgcacct gctgtacttt atcgagtacg ccgactgcga ccccaggcag atctttgggc 180

gctgccggcg ccgcaccacg ccgatgtggt ggaccctgtc cgcggactac atgctcccca 240

cggaggacga gctggggctg ctcatggtgg ccccggggcg gttcaacgag ggccagtacc 300

ggcgcctggt gtccgtcgac ggcgtgaaca tcctcaccga cttcatggtg gcgctccccg 360

aggggcaaga gtgcccgttc gcccgcgtgg accagcaccg cacgtacaag ttcggcgcgt 420

gctggagcga cgacagcttc aagcggggcg tggacgtgat gcgattcctg acgccgttct 480

accagcagcc cccgcaccgg gaggtggtga actactggta ccgcaagaac ggccggacgc 540

tcccgcgggc ctacgccgcc gccacgccgt acgccatcga ccccgcgcgg ccctcggcgg 600

gctcgccgag gcccaggccc cggccccggc ccaggccccg gccgaagccc gagcccgccc 660

cggcgacgcc cgcgcccccc ggccgcctgc ccgagccggc gacgcgggac cacaccgccg 720

gggggcgccc cacgccgcga cccccgaggc ccgagacgcc gcaccgcccc ttcgccccgc 780

cggccgtcgt gcccagcggg tggccgcagc ccgcggagcc gttcccgccc cggaccaccg 840

ccgcgccggg cgtctcgcgc caccgctcgg tgatcgtcgg cacgggcacc gcgatgggcg 900

cgctcctggt gggcgtgtgc gtctacatct tcttccgcct gaggggggcg aaggggtatc 960

gcctcctggg cggtcccgcg gacgccgacg agctaaaagc gcagcccggt ccgtagcctc 1020

cgcagtaccg gcgtcgatga tgatggtggc gcgcgacgtg acccggctcc ccgcggggct 1080

cctcctcgcc gccctgaccc tggccgccct gaccccgcgc gtcgggggcg tcctcttcag 1140

gggcgccggc gtcagcgtgc acgtcgccgg cagcgccgtc ctcgtgcccg gcgacgcgcc 1200

caacctgacg atagacggga cgctgctgtt tctggagggg ccctcgccga gcaactacag 1260

cgggcgcgtg gagctgctgc gcctcgaccc caagcgcgcc tgctataact tcgtatagta 1320

taccttatac gaagttataa gcttacgcgt cg 1352

<210> 7

<211> 618

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 7

cccaagctta taacttcgta tagtatacct tatacgaagt tatagacgca cgagctgacg 60

cggcgccccc cggcggacgg ctcgaagccc ggggagcccc tcaggatcag cccacccccg 120

cggctggaca cggagtggtc gtccgtcctg aacgggatcc agtacctgaa ctcgggggcc 180

cggggcacgg cccccgtcca cctgtggatc ctgggcgccg ccgacctctg cgaccaggtg 240

ctcctggccg cctcccgcag caccgccgcc ggagcctccc acgcccagac gggcgcgcgc 300

ctgacccggc gccggcccgg gctgacggac gccgacgccc tggacgtgat cgtcgccggg 360

atccaggcga cccgcgccat gttcgcgcgg gtccacaacc gctcctggcg ccacgccggc 420

gagtggacgg aggccctgca ctcccagatc gtgacccggg gcgacgtgcg ccggcgccga 480

ggcgggcgcg gcaacggacg cgagcgcgcc ccgcgatgta ccatctccta gacggcagga 540

tctctccgcg tcccccaccc ccccccaaaa aaaaacaata aacgctctcg ctctggcacc 600

cgatgacacg acgcgtcg 618

<210> 8

<211> 1154

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 8

cgctccagcg gccgcagctg ctcgtccacc tcggcctcga ggcgcgcgcc cgcggccatg 60

gcgttgtcca gcgccgcggc ggccgcgcgg cggcgcgcgt tcgcgtgcgc cagcgcgagg 120

cgcgcgtcga ggccctcgcc gaagcccggg cgggcccaga agcccacggg gaacgggggc 180

gcgatgaagt ggcgcgcgct gcccgggatc gcagcggcct cgaaggcgaa ccacgcgcgg 240

tccatggcgc ggggggacat gggccgcgcg gcggcgcgcg ccgccttatc atccccgctc 300

cccgccgccg cccggcccgg ccccgcgcgc gccgcgatcg cgatcaccgc cgcggcccgg 360

cgacgtactc ggcgaggccg cgcacggtcg cggccatcgc gctcgcgttg ccgcgcgtct 420

gggtgcaggg caggcgcgtc acgtcgagca cgcgcatgct ccgctgggcc acaaacacca 480

gcaggggcac gagcgtgatc tcctcgccgc ccgggggcac ggcggcggcg aggaggcgcg 540

ccgagtcgcg cagctggcac agcccctcgt gccgctgccc gcgcttgctg ggcgtgttga 600

ggttccgggg gaagcggcac gtcttgagct cgatgaggaa gcacaggtgc gggcccgccc 660

ccagccgcac cacgcacacg cagtcggggc ggcgcacccc gaggttgact tcaaaggcca 720

gggtcaagga cgccttctta agcgtctctc ggggaagccc gaagagactc tcgccgtacg 780

cggacgggtc gcgtcgcagg cgttcgtaga agcggttgtg gcagcggatc cccgcccgga 840

agcgcgccgg gatgcgcatc ctccggatct acctcgacgg cgcctacggc accggcaaga 900

gcaccacggc ccgggtgatg gcgctcggcg gggcgctgta cgtgcccgag ccgatggcgt 960

actggcgcac tctgttcgac acggacacgg tggccggtat ttacgatgcg cagacccgga 1020

agcagaacgg cagcctgagc gaggaggacg cggccctcgt cacggcgcag caccaggccg 1080

ccttcgcgac gccgtacctg ctgctgcaca cgcgcctggt cccgctcttc gggcccgcgg 1140

tcgagggccc gccc 1154

<210> 9

<211> 1013

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 9

acggcgacca catccggcag tgcgtgtgcg ccttcacgtc ggagatgggg gtgtgaccct 60

cgcccctccc acccgcgccg cggccggatg gagaccgcga cggaggcaac gacgacggcg 120

tgggaggggg ctcggggcgc gtataaagcc atgtgtatgt catcccaata aagtttgccg 180

tgcccgtcac catgcccgcg tcgtccgtgc gcctcccgct gcgcctcctg accctcgcgg 240

gcctcctggc cctcgcgggg gccgccgccc tcgcccgcgg cgcgccgcag ggtgggccgc 300

cctcgccgca ggggggtccc gcgcccaccg cggcgcccgc gcgcgggccc accctgttcg 360

tcctggtcgg cgacggctcc gcgtggttcg tcttccagct cggcgggctg ggggcgctca 420

acgacacgcg catccgcggg cacctgctcg gccggtacct cgtctcgtac caggtggtgc 480

ccccgcccgt ctccgcgtgg tactttgtgc agcgcccgcg cgagcgcccg cgcctctcgg 540

ggccgccctc gggcgcggag ctcgtggcct tcgacgcgcc cggcgtccgg cgcacgtaca 600

ccacggcggc ggtgtggccc gcggaggtgg ccgtcctcgc ggacgcggag gcgcgctgcc 660

ccgcggccgt cttcaacgtg acgctgggcg aggccttcct cggcctgcgc gtcgcgctgc 720

gctccttcct gccgctggag gtcatcatct ccgccgagcg gatgcgcatg atcgcgcccc 780

cggcgctcgg ctcggacctg gagccgccgg gcccgcccgc gggccgcttc cacgtgtaca 840

cgctcggctt cctctccgac ggggccatgc accagacgat gcgcgacgtg gccgcctacg 900

tgcacgagag cgacgactac ctcgcccagc tgtcggcggc gcacgcggcc gccctggccg 960

ccgtggtgca gcccgggccg tactactttt accgcgcggc ggtgcgcctc ggc 1013

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 10

tctgttcgac acggacac 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 11

gggatgacat acacatggc 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 12

gcgacgcgcc caacctgacg a 21

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 13

ggcccccgag ttcaggtact ggatcc 26

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 14

tttccatctg cggggagggg gcta 24

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 15

gatatatccg cgagctggtg ctggcg 26

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 16

ggaattcggt ggtggcgctg atctccgacc cg 32

<210> 17

<211> 70

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 17

cgacgcgtaa gcttataact tcgtataagg tatactatac gaagttatag caggcgcgct 60

tggggtcgag 70

<210> 18

<211> 66

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 18

cccaagctta taacttcgta tagtatacct tatacgaagt tatagacgca cgagctgacg 60

cggcgc 66

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 19

cgacgcgtcg tgtcatcggg tgccagagcg agagcg 36

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 20

ggaattccgc tccagcggcc gcagctgctc gtccacctcg gcctc 45

<210> 21

<211> 68

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 21

cccaagctta taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgggcggg ccctcgaccg 60

cgggcccg 68

<210> 22

<211> 69

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 22

cccaagctta taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatacggcga ccacatccgg 60

cagtgcgtg 69

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 23

cgacgcgtgc cgaggcgcac cgccgcgcgg taaaagtagt acgg 44

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 24

cggtcgccac catggtgagc aag 23

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 25

gcggatctga cggttcacta aaccagctc 29

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 26

cccaagcttt tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attag 45

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 27

cccaagcttc tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg 40

<210> 28

<211> 384

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 28

tctgttcgac acggacacgg tggccggtat ttacgatgcg cagacccgga agcagaacgg 60

cagcctgagc gaggaggacg cggccctcgt cacggcgcag caccaggccg ccttcgcgac 120

gccgtacctg ctgctgcaca cgcgcctggt cccgctcttc gggcccgcgg tcgagggccc 180

gcccataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatac ggcgaccaca tccggcagtg 240

cgtgtgcgcc ttcacgtcgg agatgggggt gtgaccctcg cccctcccac ccgcgccgcg 300

gccggatgga gaccgcgacg gaggcaacga cgacggcgtg ggagggggct cggggcgcgt 360

ataaagccat gtgtatgtca tccc 384

<210> 29

<211> 285

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)

<400> 29

gcgacgcgcc caacctgacg atatacggga cgctgctgtt tctggagggg ccctcgccga 60

gcaactacgg cgggcgcgtg gagctgctgc gcctcgaccc caagcgcgcc tgctataact 120

tcgtatagta taccttatac gaagttatag acgcacgagc tgacgcggcg ccccccggcg 180

gacggctcga agcccgggga gcccctcagg atcagcccac ccccgcggct ggacacggag 240

tggtcgtccg tcctgaacgg gatccagtac ctgaactcgg gggcc 285

Claims (5)

1.一株猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)变异强毒株，命名为PRV GX-2017，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No.22110。

2.一株猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株的基因缺失毒株，其特征在于所述的毒株是在权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒变异强毒株PRV GX-2017的基础上，通过基因工程方法，将PRV GX-2017基因组中TK基因部分序列、gI基因的部分序列、US2基因的部分序列、gE基因的全部序列和US9基因的全部序列缺失，获得所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株的基因缺失毒株；缺失的基因序列为：PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间的DNA序列，以及gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间的DNA序列；

所述TK基因的序列如序列表中序列1所示；所述gI基因的序列如序列表中序列2所示；所述gE基因的序列如序列表中序列3所示；所述US9基因的序列如序列表中序列4所示；所述US2基因的序列如序列表中序列5所示。

3.权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株的构建方法，其特征在于，该毒株的构建步骤为：

(1)gI-US2转移质粒的构建，以pUC载体为骨架载体，构建转移载体pUC-IES和pUC-IES-EGFP：在pUC载体中插入猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株基因组中gI基因缺失位点之前的部分序列作为左同源臂、US2基因缺失位点之后的部分序列作为右同源臂，得到转移载体pUC-IES；左右同源臂间插入EGFP基因表达框，得到pUC-IES-EGFP；

(2)TK转移质粒的构建，以pUC载体为骨架载体，构建转移载体pUC-TK-EGFP：在pUC载体中插入猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株基因组中TK基因缺失5′位点之前的部分序列作为左同源臂、TK基因缺失3′位点之后的部分序列作为右同源臂，得到转移载体pUC-TK；左右同源臂间插入EGFP基因表达框，得到pUC-TK-EGFP；

(3)缺失gI-US2基因病毒的构建：转移载体pUC-IES-EGFP转染经亲本GX-2017病毒感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP；然后转移载体pUC-IES转染经缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔIES；

(4)缺失TK基因病毒的构建，转移载体pUC-TK-EGFP转染经缺失病毒PRV GX-ΔIES感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP，然后将转移载体pUC-TK转染经缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES；

所述步骤(1)中，所述左同源臂的序列为序列表中序列6，所述右同源臂的序列为序列表中序列7；所述步骤(2)中，所述左同源臂的序列为序列表中序列8，所述右同源臂的序列为序列表中序列9。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，由权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株和药学上可接受的佐剂组成。

5.权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株在制备预防猪伪狂犬病疫苗中的应用。