CN112852761B - 基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及作为疫苗的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40的构建及作为疫苗的应用。本发明采用基因工程手段在非洲猪瘟亲本毒株ASFVCN/GS/2018中联合缺失了MGF‑110‑9L基因和MGF‑360‑9L基因编码蛋白的功能，降低了亲本毒株的毒性，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株免疫猪后对猪完全致弱、免疫猪健康，且能够对ASFV CN/GS/2018强毒株攻毒(100HAD50剂量)提供100％免疫保护，可作为安全和有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。

Description

基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及作为疫苗的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及作为疫苗的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁，其中与2018年8月相比，2019年9月中国生猪产量下降了40％，猪肉价格自2019年8月以来上涨了一倍，已造成全国40％以上减产率，损失严重。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，无法满足我国规模化养猪的需要。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(ASFV)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗问世。
目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过三种方式：一是直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二是筛选出有效诱导免疫应答的病毒蛋白，进而制备亚单位疫苗和活载体疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟病毒编码免疫抑制、免疫耐受和抗体依赖增强作用(ADE)等蛋白，灭活疫苗免疫猪内无法提供有效的免疫保护作用；第二种方面是非洲猪瘟病毒结构复杂，目前诱导免疫应答的蛋白还未清楚，获得的抗原还不足以诱导坚强的免疫保护作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通过对免疫抑制、耐受、ADE等毒力相关基因的敲除，获得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫猪获得免疫保护作用的疫苗候选毒株。例如，中国专利CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株，该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的四基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和三个多基因家族基因(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)编码产物，接种仔猪免疫28天后，以ASFV原始毒进行攻毒试验，结果免疫猪群均获得完全保护；又如中国专利CN110093324B公开了一种基因II型的非洲猪瘟病毒MGF-360-505R缺失和CD2V与MGF-360-505R联合缺失的基因缺失病毒，这两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，这两株基因缺失病毒免疫后21天能够提供充分的强毒攻击保护。
综上，对于猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性，又要兼顾致病性和安全性能。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还考量如下因素：(1)敲除的毒力基因是否减少带毒、排毒，是否带来组织损伤和影响生产性能等是生物安全的一个重要指标，也是基因缺失疫苗安全性不断提升的一个重要指标；(2)不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分存在毒力和致病性残留问题；以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；(3)非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达160多个，虽然工程巨大，但对调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要。
ASFV基因组含有多个独特的多基因家族(multigene families，MGF)，根据基因表达蛋白大小可以划分为MGF-360、MGF-110、MGF-300和MG-505/530等，MGF-360基因处于ASFV全基因组结构左末端或右末端高度可变区且基因产物具有相似的结构，是ASFV的主要毒力基因的一部分，也是ASFV基因缺失疫苗优先敲除的基因之一。MGF-360-9L是MGF-360成员之一。MGF-110家族位于ASFV基因组的左端，含有疏水性的氨基端序列和保守富含半胱氨酸区域。MGF-110家族蛋白的表达涉及宿主噬性和病毒的毒力。MGF-110-9L是MGF-110家族成员之一。前期实验发现，20或40单敲虽然降低毒性，但是构建的减毒株无法为动物提供全面的保护。而且文献(Afonso C L,Zsak L,Carrillo C C,et al.African swi ne fevervirus NL gene is not required for virus virulence.Afonso等)公开了将欧洲分离株E70的NL基因(即DP71L基因)敲除后，所得ASFV的毒力完全消失；专利CN110093324A公开了在Benin 97/1株中缺失DP148R基因使得病毒充分致弱，免疫猪后存活率也是100％；但是文献(Deletion of virulence associated genes from attenuated African swine fevervirus isolate OUR T88/3decreases its ability to protect against challengewith virulent virus，Abr ams等)公开了在非洲猪瘟天然株OUR T88/3中敲除了DP71L和DP96R两个基因产生的重组病毒OUR T88/3△DP2的免疫保护力仅为66％；可见尽管上述两个基因单独敲除能够达到较好的免疫保护效果，但是联合敲除并不一定能够达到更好的保护效果。
本发明发现，通过联合丧失MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能，获得了一株安全性较好的减毒非洲猪瘟病毒株；肌肉注射高剂量所述减毒非洲猪瘟病毒株(每头猪免疫104HAD50)猪仍不发病，且与免疫猪同居猪核酸和抗体均是阴性，说明该毒株肌肉注射不能够致猪发病死亡、无水平传播现象；攻毒实验表明，所述减毒非洲猪瘟病毒株能对ASFV CN/GS/2018分离的强株攻毒具有100％免疫保护，因此，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。
并且，由于不同基因型非洲猪瘟病毒中的MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的序列具有高度同源性，尤其是目前流行的基因II型非洲猪瘟病毒的基因组成完全相同。因此，可以在不同基因型非洲猪瘟病毒，尤其是在各种基因II型非洲猪瘟病毒中敲除MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因，也能够成功构建非洲猪瘟减毒疫苗。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种构建减毒非洲猪瘟病毒株的策略，所述策略为：通过联合丧失亲本毒株中MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能。
根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码的蛋白功能同时丧失，成功构建减毒非洲猪瘟病毒株，例如：移码突变、点突变、缺失或插入核苷酸序列等。
本发明的具体内容为：
第一方面，本发明提供了一种通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合丧失MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFV CN/GS/2018分离株、China/2018/Anhui XCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV Cz echRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium 2018/1、ASFVGermany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASF V/pig/China/CAS19-01/2019中的任一种。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。
第二方面，本发明提供了一种通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合丧失MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟疫苗的应用。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFV CN/GS/2018分离株、China/2018/Anhui XCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV Cz echRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium 2018/1、ASFVGermany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASF V/pig/China/CAS19-01/2019中的任一种。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。
第三方面，本发明提供了一种通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF-110-9L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-360-9L基因的全部/部分核苷酸序列。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFV CN/GS/2018分离株、China/2018/Anhui XCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV Cz echRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium 2018/1、ASFVGermany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASF V/pig/China/CAS19-01/2019中的任一种。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。
优选地，所述缺失的基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第11627-12499位和第24164-25216位。
第四方面，本发明提供了一种通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF-110-9L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-360-9L基因的全部/部分核苷酸序列。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFV CN/GS/2018分离株、China/2018/Anhui XCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV Cz echRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium 2018/1、ASFVGermany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASF V/pig/China/CAS19-01/2019中的任一种。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。
优选地，所述缺失的基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第11627-12499位和第24164-25216位。
第五方面，本发明提供了一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的基因Ⅱ型非洲猪病毒，所述基因片段包括MGF-110-9L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-360-9L基因的全部/部分核苷酸序列。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFV CN/GS/2018分离株、China/2018/Anhui XCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV Cz echRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium 2018/1、ASFVGermany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASF V/pig/China/CAS19-01/2019中的任一种。
优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096。
优选地，所述缺失的基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第11627-12499位和第24164-25216位。
第六方面，本发明提供了一种非洲猪瘟疫苗，所述非洲猪瘟疫苗包括上述第五方面所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。
优选地，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株还包括CD2v基因、MGF-360-12L基因、MGF-360-13L基因、UK基因、MGF-360-14L基因或MGF-360-505R基因中一种或多种基因片段的缺失。
第七方面，本发明提供了一种制备上述第五方面所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，所述的方法是通过基因工程手段将原始基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中MGF-110-9L基因的全部/部分核苷酸序列和MGF-360-9L基因的全部/部分核苷酸序列缺失。
优选地，所述方法为同源重组技术。
第八方面，本发明提供了一种制备上述第五方面所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)选取MGF-110-9L基因片段上下游序列作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂基因与mCherry基因筛选表达盒基因片段p72-mCherrry-NOSpolyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒p20-mCherry；
(2)选取MGF-360-9L基因上下游序列作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂与eGFP基因筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40polyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒p40-eGFP；
(3)将重组质粒p20-mCherry和p40-eGFP依次转染至感染了ASFV原始毒株的BMDM细胞，构建得到MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因联合缺失的减毒非洲猪瘟病毒Δ20/40。
本发明的有益效果是：本发明通过联合丧失MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能，获得了一种减毒非洲猪瘟病毒株；所述的减毒非洲猪瘟病毒株毒力显著致弱，高剂量不产生发病和致死现象；同时用本发明所述减毒非洲猪瘟毒株免疫后，猪对亲本毒株ASFV CN/GS/2018分离株具有100％保护作用；且与免疫猪同居的猪不存在感染现象，具有良好的安全性能，适于作为预防非洲猪瘟的疫苗候选株。
上述策略为未来成功制备非洲猪瘟疫苗提供了理论依据和实践参考，研究人员可以通过同时丧失MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因及已公开的一种或几种基因(例如ASFVCD2V基因、ASFV UK基因、MGF-360-12L基因、MGF-360-13L基因、MGF-360-14L基因、MGF-360-505R基因等)编码的蛋白功能，最终制备出更加安全有效的非洲猪瘟疫苗。
附图说明
图1MGF-110-9L基因缺失策略示意图；
图2MGF-360-9L基因缺失策略示意图；
图3重组毒株Δ20/40感染细胞的荧光成像图，其中MGF-110-9L为红光，MGF-360-9L为绿光；
图4减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40纯净性检测结果图；
图5减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40免疫后或者ASFV CN/GS/2018分离株攻毒后实验猪的存活率，横坐标分别为免疫时间和攻毒时间，纵坐标为存活率；
图6减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40免疫及ASFV CN/GS/2018分离株攻毒后动物体温变化图，其中每条曲线代表一头动物，横坐标分别为免疫时间和攻毒时间，纵坐标为体温；
图7减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40免疫以及免疫后攻毒的动物血液带毒结果图，其中，横坐标分别为免疫时间和攻毒时间，纵坐标为病毒拷贝数。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：
原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，经3-7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒含量的滴定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。
ASFV CN/GS/2018分离株来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为5×107TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于2020年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：中国武汉，武汉大学；联系电话：027-68752319。
peGFP-N1载体、pUC57和pcDNA-mCherry载体均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司。
实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
定义
术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明的目的在于通过对非洲猪瘟病毒中MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因的部分或全部核苷酸序列进行敲除，导致MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能丧失，进而构建了MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒，并用于非洲猪瘟疫苗的生产。
术语“基因缺失”是指缺失是指染色体上某一区段及其带有的基因一起丢失，从而引起变异的现象，本发明的目的在于通过缺失MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因的部分或全部核苷酸序列获得了减毒非洲猪瘟重组病毒，降低了亲本毒株的毒性。
术语“基因突变”是指基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因，基因突变导致后代的表现中也就突然地出现从未有的新性状。本发明中，通过缺失MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因的部分或全部核苷酸序列，使MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码的蛋白无法正常表达，导致MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能缺失，获得了减毒非洲猪瘟病毒，降低了亲本毒株的毒性。在此基础上，根据本领域技术人员的公知常识，本领域技术人员也可通过将MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因突变、或基因片段的插入等本本领域公知的技术手段，导致基因编码的蛋白发生移码突变也能使MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的原有的性能消失，实现减毒非洲猪瘟重组病毒的构建。
基因缺失的方法一般是指基因敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。基因敲除的方法一般包括：同源重组技术、随机插入突变技术以及RNA干扰技术；其中，同源重组技术又叫基因打靶，是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合到预定的位置上，从而改变某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因；随机插入突变技术是指利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞；RNA干扰技术是指由与生物体内源靶基因mRNA同源的双链RNA特异性引发的靶mRNA降解，导致目的基因表达沉默的一种反向遗传学技术。
本发明虽然仅通过同源重组技术对MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因进行敲除，但是通过上述随机插入突变技术以及RNA干扰技术也能够对MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因进行敲除。
本发明以基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018分离株为例，对MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因进行了敲除。其中所述的MGF-110-9L基因位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因序列的11627-12499位(如SEQ ID NO.1所示)，所述的MGF-360-9L基因位于ASFVCN/GS/2018分离株全基因序列的24164-25216位(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明通过同源重组技术在ASFV CN/GS/2018分离株中敲除的MGF-110-9L基因序列位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的11627-12499位(如SEQ ID NO.1所示)；并且敲除的MGF-360-9L基因序列位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的24164-25216位(如SEQ ID NO.2所示)。本发明敲除策略使MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码的蛋白无法正常表达，联合丧失了MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白的功能，成功构建了MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，并作为疫苗侯选珠。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的基因缺失减毒病毒疫苗，其中所述缺失的基因为MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因，应当理解的是所述缺失的基因还可以包括毒力基因(例如CD2v基因、MGF-360-12L基因、MGF-360-13L基因、MGF-360-14L基因、MGF-360-505R基因等)中的任何一种或几种；突变被理解为在亲本ASFV CN/GS/2018毒株中野生型或未修饰的MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因的遗传信息中的变化。应当理解的是，由MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因突变获得重组突变体也可以用于制备非洲猪瘟疫苗。
本发明的非洲猪瘟疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
本发明公开的非洲猪瘟疫苗也可被用于制备联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。联合疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非猪瘟病毒，如此可以诱导针对多种非猪瘟病毒基因型的交叉保护性免疫应答。
本发明的非洲猪瘟疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
在本发明中虽然以基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018分离株为例，构建了MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失的非洲猪瘟减毒株，但是本发明并不局限于ASFV CN/GS/2018分离株。本领域技术人员公知：在不同的ASFV基因组中删除相关的基因后，观察到的表型差异与基因组成相关；并且现有流行的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒(包括China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV CzechRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium 2018/1、ASFV Germany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASFV/pig/China/CAS19-01/2019)与本申请所述的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒ASFVCN/GS/2018分离株的基因组成完全相同。因此，在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒的基因组成相同的基础上，本领域技术人员可以合理推断出除本发明所述的ASFV CN/GS/2018分离株外，以其他Ⅱ型非洲猪瘟病毒(包括China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV CzechRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium2018/1、ASFV Germany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASFV/pig/China/CAS19-01/2019)为出发毒株同样能够成功构建获得相关减毒非洲猪瘟病毒株及疫苗。因此，本发明并不局限于ASFV CN/GS/2018分离株，其他与ASFV CN/GS/2018分离株基因组成相同的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒均在本发明的保护范围之内，其中所述与ASFV CN/GS/2018分离株基因组成相同的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括但不局限于China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFV CzechRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium 2018/1、ASFV Germany 2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASFV/pig/China/CAS19-01/2019。
实施例1减毒非洲猪瘟病毒株的构建及纯化鉴定
1.筛选表达盒构建
为了便于筛选，构建筛选标记基因的表达盒。
增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein，eGFP)基因筛选表达盒构建：参照文献(O'Donnell V.African Swine Fever Virus Georgia 2007with aDeletion of Virulen ce-Associated Gene 9GL(B119L),when Administered at LowDoses,Leads to Virus Attenu ation in Swine and Induces an EffectiveProtection against Homologous Challenge.JVirol.2015；89(16):8556-66)，通过PCR扩增p72启动子(从p72基因上游的-196nt到+17之前序列)，备用；扩增引物为：正向引物5’-TTATAAAACATATGTTCATAAAAAGGGTCGCCGGAGGAAAAGTC-3’(SEQ ID NO.3所示)和反向引物5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATATATAATGTTATAAAAATAATT-3’(SEQ ID NO.4所示)；以peGFP-N1载体为模板，扩增eGFP基因，备用，扩增引物为：正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQID NO.5所示)和反向引物5’-ACCACAACTAGAATGCAGTG-3’(SEQ ID NO.6所示)；参照文献(Borca MV,Holinka LG,Berggren KA,Gladue DP.CRISPR-Cas9,a tool to efficientlyincrease thedevelopment of recombinant African swine fever viruses.SciRep.2018；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名为p72-eGFP-SV40polyA，该表达盒序列含SV40polyA终止序列。
红色荧光蛋白基因mCherry筛选表达盒构建：以pcDNA3-mCherry载体为模板，扩增红色荧光蛋白mCherry基因，正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQ ID NO.7所示)和反向引物5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO.8所示)；参照文献(Borca MV,Holinka LG,Berggren KA,Gladue DP.CRISPR-Cas9,a tool to efficiently inc reasethe development of recombinant African swine fever viruses.Sci Rep.2018；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和mCherry两个基因通过融合PCR的方法连接，获得mCherry筛选表达盒基因片段，命名为p72-mCherry-SV40polyA，该表达盒序列含SV40polyA终止序列。
2.同源重组转移载体的构建
利用pUC57载体作为骨架载体，构建MGF-110-9L基因敲除用同源重组转移载体，构建策略见图1；利用pUC19载体作为骨架载体，构建MGF-360-9L基因敲除用同源重组转移载体，构建策略见图2。所述缺失的基因序列分别位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因序列的11627-12499位和24164-25216位。
具体步骤为：选取MGF-110-9L基因上下游序列作为同源重组左臂(Left arm，SEQID NO.9所示)和右臂(Right arm，SEQ ID NO.10所示)，并分别克隆入pUC57载体中，获得MGF-110-9L基因组片段的重组转移载体；在MGF-110-9L基因组片段的重组转移载体左、右臂基因序列中间插入mCherry高强度筛选表达盒基因片段p72-mCherry-NOSpolyA；经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为p20-mCherry；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用；
选取MGF-360-9L基因上下游序列作为同源重组左臂(Left arm，SEQ ID NO.11所示)和右臂(Right arm，SEQ ID NO.12所示)，并分别克隆入pUC57载体中，获得MGF-360-9L基因的重组转移载体；在MGF-360-9L基因的重组转移载体左、右臂基因序列中间插入eG FP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40polyA；经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为p40-eGFP；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用；
3.细胞转染和重组病毒筛选
将同源重组转移载体p40-eGFP和
Figure BDA0002965060850000111
DNA转染试剂充分混匀，共转染至取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪的状态良好的骨髓巨噬细胞(BMDM)细胞，直接感染1MOI ASFV CN/GS/2018纯化病毒株，得到MGF-360-9L基因缺失的ASFV重组病毒Δ40；随后，以ASFV重组病毒Δ40为亲本毒株，将p20-mCherry转染至BMDM细胞，感染ASF V重组病毒Δ40，纯化病毒株，得到MGF-110-9L基因、MGF-360-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40。
显微镜观察结果如图3所示，低代次(F1)时，BMDM中只能观察到少量的GFP信号(绿色荧光)和mCherry信号(红色荧光)，证明重组毒基本构建成功；经多次单细胞传代后，在高代次(F9)时荧光显微镜下观察到大量的GFP信号(绿色荧光)和mCherry信号(红色荧光)，部分孔中荧光细胞数量比例可达100％，为全阳性孔，这说明重组毒(基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40)构建成功。
纯净性检测：选取MGF-110-9L-check-F/R引物对(MGF-110-9L-check-F：ACATACACC GGTCATGCCAC，SEQ ID NO.13所示；MGF-110-9L-check-R：TACCAATGACCCGGAGACCT，SEQ ID NO.14所示)；MGF-360-9L-check-F/R引物对(MGF-110-9L-check-F：AGGAGAGGATTCGCATAGACATGA，SEQ ID NO.15所示；MGF-110-9L-check-R：AAGTTCCCCCTTAAAGGGGGTTGA，SEQ ID NO.16所示)进行纯净检测；同时选取病毒基因组中的p72为内参基因，确保所检测病毒基因组的质量，针对P72检测的引物分别为p72-F：CGGGGGTTTTAATCGCATTGC(SEQ ID NO.17所示)和p72-R：CGGGGGTTTTAATCGCATTGC(SEQ ID NO.18所示)。
结果如图4所示，其中wt为ASFV CN/GS/2018分离株，Δ20/40本发明所述代表基因缺失减毒非洲猪瘟病毒。结果表明，本发明所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒Δ20/40的基因组中均已经检测不到MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因，说明MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因敲除成功；以上结果表明基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株已构建成功，并且已纯化，命名为Δ20/40。
综上所述，本发明通过同源重组技术成功构建了MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。
本发明并不局限于同源重组技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使MGF-110-9L和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失也能够获得MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。
实施例2病毒滴度的测定
非洲猪瘟病毒的滴度采用半数血细胞吸附量(50％haemadsorption,HAD50)表示，HAD50实验具体操作见文献(BorcaMV.Development of a highly effective Africanswine fever vir us vaccine by deletion of the I177L gene results in sterileimmunity against the current epi demic Eurasia strain.JVirol.2020.pii:JVI.02017-19)，同时对其进行适当调整：在96孔板中按照约1x105/孔细胞接种原代PAM细胞，待检重组毒连续10倍梯度稀释，共7个稀释度，每个稀释度下8孔，按照100μL/孔将稀释毒加至96孔板PAM中，随即加入红细胞，共三次重复。病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的花环进行判定，连续观察6天，统计阳性孔数，计算半数血细胞吸附量(HAD50)。滴度测定合格，进行致病性评价。
实施例3基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的毒力评价
为了检测基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的毒力，本实验用104HAD50剂量经肌肉注射仔猪对其毒力进行评价。
本实验用17头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康长白仔猪，共分为3组，其中基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40组6头，ASFVCN/GS/2018分离株组6头，基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40同居组5头。每天测量体温变化情况，采集外周血和唾液，参照文献(KingDP.Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control forthe detection of African swine fever virus.J Virol Methods 107:53-61)，并通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，检测至17天终止。统计各组动物的存活率，体温变化及血液中的A SFV病毒含量，对免疫后攻毒猪和未免疫攻毒猪的血液带毒情况进行了检测。
存活率结果如图5(免疫部分)所示，ASFVCN/GS/2018分离株组猪在注射ASFVCN/GS/2018分离株后第6天时出现死亡，到第7天时完全死亡，存活率为0；而基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40组猪在注射基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40后无死亡，存活率为100％。
体温变化结果如图6(免疫部分)所示，基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40组猪的体温正常，均未出现持续高温；基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40同居组在第6天后由两只出现暂时高温，但后期又恢复正常；而ASFVCN/GS/2018分离株组(ASFV)猪在第3天时体温开始持续升高，至第7天时全部死亡。
血液中的ASFV病毒含量检测结果如图7(免疫部分)所示，注射基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40的猪在注射后7天前后血液中检测到少量病毒，但在免疫至第17天后未检测到血液病毒；同时基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40同居组只有一头猪在第13天后检测到带毒情况，后恢复至正常；而ASFVCN/GS/2018分离株组猪在注射ASFVCN/GS/2018分离株后第2天后持续检测到病毒含量的升高，至第7天时全部死亡。
上述实验结果表明，在亲本ASFVCN/GS/2018分离株中使MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失后，获得的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的毒力完全致弱，未发生排毒现象，安全性较好。
实施例4基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的免疫保护效果评价
为了检测基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的免疫保护效果，本实验用102HAD50剂量的亲本ASFVCN/GS/2018分离株对未免疫的对照组猪(6头)和实施例3中的经过基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株免疫的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40组猪(6头)进行攻毒实验。统计各组动物的存活率，体温变化；根据实施例3所述方法对免疫后攻毒猪和未免疫攻毒猪的血液带毒情况进行了检测。
存活率结果如图5(攻毒部分)所示，未经免疫的对照组猪在ASFVCN/GS/2018分离株攻毒后第7天开始死亡，至第13天全部死亡，死亡率为100％；而经过基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40免疫的猪，在ASFVCN/GS/2018分离株攻毒后无死亡，死亡率为0％。
体温变化结果如图6(攻毒部分)所示，未经免疫的对照组猪在ASFVCN/GS/2018分离株攻毒后第3天开始持续升高，至第13天全部死亡；而经过基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40免疫的猪体温无显著变化。
血液中的ASFV病毒含量检测结果如图7(攻毒部分)所示，未经免疫的对照组猪在AS FVCN/GS/2018分离株攻毒后第5天左右时检测到较高含量的病毒；而经过基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40免疫的猪在ASFVCN/GS/2018分离株攻毒后基本检测不到病毒含量。
上述实验结果表明，在亲本ASFVCN/GS/2018分离株中使MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失后，获得的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的毒力完全致弱，免疫猪后未发生排毒现象，安全性较好。而且在亲本ASFVCN/GS/2018分离株攻毒后，经基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40免疫后的猪体温正常，存活率为100％。即，本发明所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/40对亲本ASFVCN/GS/2018分离株具有完全的免疫保护效果。
综上所述，在通过同源重组技术成功构建了MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒的基础上，研究人员可以通过同时使非洲猪瘟病毒中MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因及已公开的一种或几种毒力基因(ASFVCD2V基因、MGF-360-12L基因、MGF-360-13L基因、ASFVUK基因、MGF-360-14L基因或MGF-360-505R基因等)编码蛋白的功能丧失，最终制备出更加安全有效的非洲猪瘟疫苗。
需要说明的是，在本发明中虽然以基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018分离株为例，构建了MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因编码蛋白功能丧失的非洲猪瘟减毒株；但是本发明并不局限于ASFV CN/GS/2018分离株，其他与ASFV CN/GS/2018分离株基因组成相同的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒均在本发明的保护范围之内；所述与ASFV CN/GS/2018分离株基因组成相同的基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括但不局限于China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia 2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFVCzechRepublic 2017/1、ASFV Moldova 2017/1、ASFV Belgium2018/1、ASFV Germany2020/1、ASFV Arm/07/CBM/c2、ASFV Ken.rie1、ASFV Wuhan 2019-2、ASFV_HU_2018、ASFV/pig/China/CAS19-01/2019。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及作为疫苗的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 1
atgaaggtga ttgtgttcct tttggtactg gcggtcatgc agccggtcat tcaaagccaa 60
tcttttccag gaacaggaga gttaccaatg acccggagac ctccaaagag agagcttgag 120
tattggtgca cctatgcaaa atcgtgtgac ttctgctgga attgtcgaca cggggtttgt 180
aaaaataagg tttttgaaaa acaccctctc atcaaaaaaa atgattacat acaaatatgt 240
agggtttctc gctataatga aagatgtagc tactttacag actctaggat acgccgcttt 300
cacatcatga gctgtacaaa tcccacatat tatgattggt ttgatgagtt aatgcaaata 360
aaggaggata gggtcattga cactgagaat atcaaacata cttgtctttg tatgatagct 420
accattgctc tcataagcta tgttcgcaaa caatactcac gaatgcgaat gcaagccgct 480
acaagactgc ttatctttct tggcttctat gttcttttag gaattttgat gacgaacata 540
ataatgaacc tacctctttc cacagataat ccgatgcaaa tgcgtaggcc tcctgaaagg 600
gatctcaagt tctggtgcac ctatgcaaaa cactgtgact tctgctggac ctgtaaagat 660
ggaatgtgta aaaataaagt gtttagtgac caccctatta ttacgcaaaa tgattatatt 720
gttaattgta cagtttcccg gtggcatgac cggtgtatgt atgaagctca ctttaggata 780
cactatcaac ataacatgaa ttgttcacaa cccaaagatt tagaatggtt cattgagtta 840
aaacgacatg tgattaatca agatgatttg taa 873
<210> 2
<211> 1053
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 2
atggtcctct ctctgcagac tctcaccaaa aaggtgctgg ccagccagta tccggccaaa 60
tgccatcctc attttttgaa gtgctgcggt ctatggtggc ataatggccc tatcatgtat 120
catcaaaaga aaatatggac gccgtatttt aagaacggca caaatcttaa cgcggccttg 180
gtgaaagctg tggaggaaaa caatcacgat ctaatagaat tgttcaccga gtggggtgca 240
aacatcaact acggtttgct ttctgtcaac acggagcaca cccgagacct gtgcaggcag 300
ctaggtgcca aagaacagtt aaatgaccag gaaattttac gattttttta cacattgaaa 360
cgtgatctaa ctagcagtaa catcattttc tgccatgagg tattttctaa taatcccatt 420
ttagatacca taaatcgttt tgaagtaaag ggaatgattt atgaacaact ggagggatta 480
atggtagaaa ccgatatatt aagcgagatg tttactaaat attggtacgc gatggcaata 540
gaatgtaacc ttaaggaggc gatttgctat ttttatcaga gatatgctca tctacatcgg 600
tggcggctta tgtgcgccct tttttacaat aatgtgtttg aacttcacga agtgtacgaa 660
aaggagagga ttcgcataga catgaatgaa atgctaaagt gggcctgtcg caagaactat 720
aactatttaa cgatttatta ctgttgcgtc gtcttagggg ctgatatcaa tcaggccatg 780
tttcattcta ttcagttcta taatatcgga aacatattct tttgtataga cttaggcgcc 840
aatgcctttg aggagggaaa gactctagcg catcaaaaag acaactcgtt cattgccagc 900
atgttatcat taaattgtta taacatgaat gattctttat ctttaaaaga aactgatccc 960
gaagttataa aacgtatgtt aaaagattat cattcaaaaa acctgtccat agcacataaa 1020
cactatatta atgatgggtt taatgatata taa 1053
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttataaaaca tatgttcata aaaagggtcg ccggaggaaa agtc 44
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcctcgccc ttgctcacca tatataatgt tataaaaata att 43
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggtgagca agggcgagga g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accacaacta gaatgcagtg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggtgagca agggcgagga g 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttacttgtac agctcgtcca tgc 23
<210> 9
<211> 1500
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 9
aacagcatga aatacaagag tgcctgttac acgaataagt tctctcaaac cggggatggt 60
catactcaca tctatgaaat cctggtctag gagattcatt tgatgcatga tggccgcacc 120
cacacttatg agacactgaa gaactaaagg gtttaatttt gatctgaatg gtactatata 180
ggatgatggc aatccatatc aagattagag caatcaaaat cacctcctca agaagcatga 240
tgtagcctta aatcttagac tgctttaaac cttaggccct cactatcttt aatgaaggag 300
tttaaatttt gatccctttt tcaagaccca tttagaagaa aaaaataaag tttatatcaa 360
tctaattcat aagtcatctc tttcataaat cttcatgtat tctctatgtg gataagtatg 420
ggatgttgga tttgcgcagt ccatttgatg atctgtatgg tttttgggtc cttcataata 480
actacatata ccattccagc gggaaaccgt gcaatttata atccagtcat tttgatgaat 540
aactggccaa tctgtttgaa tcctgtttcg gcagataccg tggacgcatt cccagcaaaa 600
gtcacattgg tttgcgtaag tgcaccaata aactagctca tgttcaggag gataacgggt 660
tggtagtaaa tcttctaatt tacgtatagg agcggcttga aggacaacca cccccagtag 720
tactagaatc agtaccttta tagtggccac cctacactag acctctaagt tgaagacaaa 780
gaactaaaat ttagagccgt ttaattacta ctaataatta tattttttat tgtctacaat 840
aggattctat taaaaaataa tgatttttac caagaaatat ttttataaaa aattaatata 900
ttttgtaata aactttattt ccaatgactg ttaaaataag gaaactatcc ttagttagtc 960
gaggaagatg gttaggttat ttcgcaatcc gataaaatgt ttattttatc gtaggtctcg 1020
taaaatccag gaaaaaaaat tacggaagag tttaaaaaag ctaaattttt accaccctcc 1080
agaagattgt tgtcaaatat atcgtttgct agaaaatgtt cctggaggaa cttactttat 1140
tacagaaaat atgacgaatg atttaattat ggtcgtaaag gattcggtgg ataaaaaaat 1200
taaaagcatt aaattatatc ttcatggaag ttatattaag attcatcagc actattatat 1260
taatatttat atgtatctta tgagatatac ccaaatttat aaatatccct taatttgttt 1320
taacaaatat tataacatct aagtaaatat tcttggaatg gattttctta tagaatggtt 1380
acaggatatg tcagcgacag gcttaataac aaatttgtta atattttttt gttaaataaa 1440
tgaacaggcc accatttaat attacccgtt gcaaaataag aaaaaaaaac aaacttatag 1500
<210> 10
<211> 1500
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 10
ggctgcaact tataagttgc aacttatggg ttgcaatact gcaacgtata ggttgcacct 60
tatagatcgc gactcaaaag gtatgaaaac cttaccctca atacagaatt taagttttaa 120
tcctgataat gtatctgttt atgaaaaaaa atttttttta ctcatgtatg aattcttata 180
cgaatcataa tatgtaggct gagaataata attcatatac ggtgttgcgg gctcaataaa 240
aattttgtta ccacaaaaaa taaatgctgg atttttaaga tatatatcta ttaatgacta 300
aaccctttat acgctgtagg ctgaaaacaa tccatataat gaatatacgg tgatttgggt 360
ttaataaaat acatacaacg gtcaaaatag cgggcaatac tacattgact aatataatca 420
ttttgtttaa taagaggcat atcatcccac actttatttt tacaaatacc gttcctacat 480
tcccagcaga aatcacagtg ttttccatac gtgcaccagt attcaagctc tcttatagga 540
ggcgtataag tccttggtaa attttgtttc atataaaaga tggaaagggg tcgatttaaa 600
cccggctgag atagccaaat caaaatacat aaaagagcaa gtagtttcat agtggtattt 660
agatgtaaat ttttatagta tgcaaataca atgtaaccta caaatacaat actaaataca 720
aggtaaaaac aacaatgtct tataatgatt ggccaataat cacccccccc ccccccattt 780
ttccatgaat atttcatttc ctgtataggg tctaggatgt gaacactcca tgttatgatg 840
attaggcatt ttaactgata tttcataaaa acacccccag gaattgcgat taactataca 900
gtttacaatc gaattcatcg aattagactc atttgttatc ttatttttac aaatgccatt 960
ttgacaatcc cagcagaagt cacaattctt tacatacgta caccaatatg gaagctcctc 1020
cttaggagga tgctgggttc ttggtaattc tggtaattca tgtgcaagaa tgaggactga 1080
gtagcccaac aaaagtccta gaaccttcat gttgtgtcca aatggcacct gtcattttaa 1140
aaaagattta aattttgcta ccgcaaaaaa aaatccagta tgtatttttt taatacatat 1200
aattattgaa gtcttataag ataaagccga gaacactata ttttgtatag atgatgtatc 1260
cggtattcaa actctcttat aagtacatgt aggaaatggt caattattca agattggctg 1320
agataacaac aaaaccaaaa tactcaaaag cataagtaat ttcatggttg tactcagtcg 1380
tagatttttg cagatcgcaa atgcaacgca accagcaaat acaaagctaa atacaaggta 1440
aaaacaataa taccttataa tgattggcca attcttatcc ctccattttt ccatgaacat 1500
<210> 11
<211> 1000
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 11
agatccttac aaaaatatag attgttcgtc tgatgatgcc actgtgttgc agtgatggct 60
tgatcaatat cacctcccaa gacaaaacag tagtatatcg ttaaaaagtt gtaatctttc 120
atacaagcca actgcatcat tttatcgatg tccatatgaa cgatcttttg ctcgtatatt 180
tcatgaaggt caaatacatt gttgaagtaa atggcgcaca tgagtcgcca catactaagg 240
tgcccatatg tttgatagaa aaaggagata gctcttttaa gcttatattt tactgctatg 300
gcatagcagt atttaacgaa tacgttcatg ggtacattat ctaagatata aaatatgaaa 360
aactttaact ctcgatgaat ctcttccccc atttcctgta catttagagc ttccaacata 420
ggatttttat caaatatttc atgacataaa ataatgttat tgctcgtttt atgacgcatt 480
aaaccggtga aaatttcctt attatttaaa ctatctttag ctcctaactt tcgacacagc 540
tcctgagttt gttccgtcct agcacaggtc agcccataat aaatgtttgc tccccactcg 600
gtgaacagcc ttattacgtc atagttattt tcttttatgg ccatgattaa tgccacatca 660
agatgaagaa gttccccctt aaagggggtt gagcttaaaa taacgtaatt acagtagtga 720
cataagctaa tgggcttgtt ttgccaccat aagccacaat attttaaaat ataatgatac 780
tcctcaggca cgctctgttt ggccacagcc tttttggcca gggtttgcaa ggagagcatg 840
ataacttctt gaaaaaaaaa ctcaaattaa gttcctactt ttttaaaata ttagtatgga 900
cagatctacc atcatatgaa ggaattcttt catcgttaaa cactgaagag ataatacttt 960
catcgtatag agaatatcat gtcaatccat atattgaatg 1000
<210> 12
<211> 1000
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 12
atttcttttt tttgaaaaaa tcaaattaaa aaaatcatgc ttgtttagca tacatgtaat 60
attgttataa ttacgttata attacgttat aattacgtta taactatatt ataacaatgg 120
tataacaatg gtataacaat gttataacaa tgttataacg atgtatcatt gatgtcatca 180
ttcaactagg ccaacatact ttttaattta tagtttttta atagatgata tattttgcta 240
ggatctgctt cttttaacgt taatagcgag gagtctgcac tataaatgtc taatgataaa 300
tgatgagata tcaaatagta attccgttgc tctgctaggg cctttgcctc ttcaaaggcg 360
tcggctccca gatctataca aaagaacaag ttatccatat tataaaatcg tacgcaggca 420
agcatagctg aattaatatt agctcctaag agaaaacaat aatatatggt taaaaaattg 480
ttatcttttg tgcaggccat ccgcatcatt tcatccacgt ccatgcggat cttttccttt 540
tcatacaaat tatgtaggtc aaacagctta ttaaaacaaa gagcacagat taaccaccac 600
gtatttagat acttaaaatg ttggtaaaca taagaaatgg cctccctaag attatcctgc 660
aatgccacta taaaacagta tatcgttaac atatcaccat ccgacatatt acttaatatg 720
tcggtgtctt ctactaacct tttcaacttc caatatatgg atgaccttat ttcccttata 780
atgacatagg ctggaaaggg attatcatta aaaagtttaa gacataagat aatattactg 840
ctagtagtgc cagggtgtat taatttaaag aacatgtgca taatcttctt tttatccacg 900
cggtacttgg ctcctaattc ccagcaaaat tctcgaacag gcggcgtatt ggcgcaaatt 960
aacccatagt tgatgtctgc gccccattct gtaaacagtt 1000
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acatacaccg gtcatgccac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
taccaatgac ccggagacct 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggagaggat tcgcatagac atga 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagttccccc ttaaaggggg ttga 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgggggtttt aatcgcattg c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgggggtttt aatcgcattg c 21

Claims (7)

1.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF-110-9L基因的核苷酸序列和MGF-360-9L基因的核苷酸序列；所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096；所述缺失的基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第11627-12499位和第24164-25216位。
2. 通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF-110-9L基因的核苷酸序列和MGF-360-9L基因的核苷酸序列；所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096；所述缺失的基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第11627-12499位和第24164-25216位。
3. 一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的基因Ⅱ型非洲猪病毒，所述基因片段包括MGF-110-9L基因的核苷酸序列和MGF-360-9L基因的核苷酸序列；所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的保藏编号为CCTCC NO：V202096；所述缺失的基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第11627-12499位和第24164-25216位。
4.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗包括权利要求3所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。
5.一种制备权利要求3所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段将原始基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中MGF-110-9L基因的核苷酸序列和MGF-360-9L基因的核苷酸序列缺失。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为同源重组技术。
7.一种制备权利要求3所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）选取MGF-110-9L基因片段上下游序列作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂基因与mCherry基因筛选表达盒基因片段p72-mCherrry-NOSpolyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒p20-mCherry；
（2）选取MGF-360-9L基因上下游序列作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂与eGFP基因筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40polyA同时克隆至pUC57载体，获得重组质粒p40-eGFP；
（3）将重组质粒p20-mCherry和p40-eGFP依次转染至感染了ASFV原始毒株的BMDM细胞，构建得到MGF-110-9L基因和MGF-360-9L基因联合缺失的减毒非洲猪瘟病毒Δ20/40。
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