CN113122511B - 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用，属于生物疫苗制品技术领域。本发明通过同源重组方法构建的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株是在II型非洲猪瘟病毒基因组的基础上同时缺失了CD2v，MGF(12L,13L,14L)和I177L基因片段的基因缺失毒株，其相对于亲本毒株明显减毒，且不会影响基因缺失病毒株的稳定复制和免疫原性。将其接种实验猪后不会出现实验猪体温明显升高、关节肿胀、发病或死亡现象，也无病毒血症发生，表现出良好的安全性和良好的免疫攻毒保护效果。因此本发明提供的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株可以作为一种具有良好安全性和免疫保护效果的候选疫苗株。

Description

一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物疫苗制品技术领域，具体涉及一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用，尤其涉及一种同时缺失CD2v，MGF(12L,13L,14L)和I177L基因部分片段的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和在疫苗制备中的应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是非洲病毒科中唯一的非洲病毒属，也是目前唯一的DNA虫媒病毒属。该病毒主要靠口或鼻腔直接接触感染，同时拥有多个循环传播方式，主要存在于血液、组织液、内脏、分泌物和排泄物中，具有感染率高，传播迅速，致死率高等特点，对全球养猪业造成了巨大经济损失。
针对病毒预防的最主要方法是疫苗接种。然而对于非洲猪瘟病毒，市场上还没有可用的疫苗产品，虽然已经尝试开发了非洲猪瘟病毒灭活疫苗、减毒活疫苗及基因工程疫苗等，但经过效果评价后，均未获得预期的免疫效果。其中灭活疫苗无法使动物体内产生中和抗体，因此不能产生抵抗强毒攻击的免疫力；减毒活疫苗免疫副作用多且易引起多重感染等问题，存在一定的生物安全隐患；通过基因工程制备的DNA疫苗可使动物获得一定的免疫保护，但并未检测到相应抗体，推测可能为细胞免疫占主导地位。
研究表明，在非洲猪瘟病毒编码的蛋白成分中，很多具有免疫抑制特性，例如已经明确的与免疫抑制有关的基因主要为CD2V、MGF和9GL等。因此，目前针对非洲猪瘟病毒疫苗的研究主要集中在利用这些免疫抑制基因缺失的毒株作为疫苗株制备疫苗。其中研究较多的为CD2v和MGF基因缺失株，然而CD2v缺失对毒株的毒力影响有限(几乎没有影响)，MGF基因缺失后不同剂量的研究会引起接种猪体温变化，并且会与非洲猪瘟流行毒株发生重组而返回毒性。虽然专利文献CN110551695A(以下称文献1)已公开一种CD2v和MGF基因(MGF360-12L、MGF-13L和MGF-14L)同时缺失的减毒疫苗株，其毒力减弱主要是MGF-360基因缺失导致的，并且可表现出良好的免疫保护作用。然而，虽然利用该文献1公开的基因缺失疫苗株接种仔猪后，仔猪未显示异常不良反应，但会导致仔猪在接种后第2～3天出现短暂的体温升高，最高体温能达到41.3℃，有潜在的安全性问题。另一方面由于MGF基因属于多基因家族，其中的重复序列很容易通过自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位而导致毒力返强，并且MGF360-12L、MGF-13L和MGF-14L附近及本身就是一个比较容易重组的片段，现有研究也表明该病毒的野生毒株在传代细胞上进行传代培养导致的缺失位点或在自然界中直接分离到的自然缺失株所缺失的位点基本上都在这几个MGF基因附近，如图1所示(其中黑色箭头表示MGF-360不同基因，空心箭头表示MGF-505不同基因，虚线边框箭头表示缺失部位)，其中A幅表示未发生基因缺失的ASFV野生毒株；B幅和C幅分别表示从自然界直接分离获得的ASFV强毒株(西班牙毒株E75和葡萄牙毒株OURT 88/3)，均显示出部分MGF基因片段的缺失(Chapman DA,Tcherepanov V,Upton C,Dixon LK.2008.Comparison of the genomesequences of non-pathogenic and pathogenic African swine fever virusisolates.J Gen Virol 89:397–408)；D幅和E幅分别表示自然分离株(BA71和佐治亚分离株ASFV-G)在Vero细胞上分别连续传代得到的基因缺失株的MGF基因片段，也可见均表现出部分MGF基因片段的缺失(de la Vega I,Vinuela E,Blasco R.1990.Genetic variationand multigene families in African swine fever virus.Virology 179:234-246；
Figure BDA0003018017710000021
RJ,Rodriguez JM,Nogal ML,Yuste L,Enriquez C,Rodriguez JF,VinuelaE.1995.Analysis of the complete nucleotide sequence of Africanswine fevervirus.Virology 208:249–278；Krug PW,Holinka LG,O’Donnell V,Reese B,Sanford B,FernandezSainz I,Gladue DP,Arzt J,Rodriguez L,Risatti GR,Borca MV.2015.Theprogressive adaptation of a Georgian isolate of African swine fever virus toVero cells leads to a gradual attenuation of virulence in swine correspondingto major modifications of the viral genome.J Virol 89:2324-2332.)。因此，MGF360-12L、MGF-13L和MGF-14L等MGF基因片段的这种极易发生自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位的现象，极有可能会造成采用上述文献1的缺失CD2v和MGF360(12L,13L,14L)基因的疫苗株制备的减毒活疫苗面临潜在的毒力返强安全风险。鉴于以上专利文献1存在的多方面的安全性问题，迫切需要一种安全性更高的非洲猪瘟病毒疫苗产品。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其在II型非洲猪瘟病毒的基因组中缺失以下基因或片段：
CD2V基因、MGF360(12L,13L,14L)和I177L基因片段，其中所述I177L基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
上述II型非洲猪瘟病毒包括但不限于ASFV-SY18、Georgia 2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia2007/1、ASFV GZ2018。
本发明另一方面还提供一种减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段将亲本II型非洲猪瘟病毒的CD2V基因、MGF360(12L,13L,14L)基因和I177L基因片段缺失，其中所述I177L基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
上述方法中，所述基因工程手段为同源重组技术，具体包括以下步骤：
S1)将MGF360(12L,13L,14L)基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第一同源重组转移载体；
S2)将CD2V基因的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第二同源重组转移载体；
S3)将I177L基因片段的左右同源臂和第三筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第三同源重组转移载体；
S4)将步骤S1)的第一同源重组转移载体用转染试剂转染至使用所述亲本II型非洲猪瘟病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒筛选获得缺失MGF360(12L,13L,14L)基因的第一重组病毒；
S5)将步骤S2)的第二同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S4)获得的第一重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒和第二筛选表达盒筛选获得同时缺失MGF360(12L,13L,14L)基因和CD2V基因的第二重组病毒；
S6)将步骤S3)的第三同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S5)获得的第二重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒、第二筛选表达盒和第三筛选表达盒筛选获得同时缺失MGF360(12L,13L,14L)基因、CD2V基因和I177L基因片段的第三重组病毒，作为减毒非洲猪瘟病毒毒株。
上述方法中，所述第一筛选表达盒、第二筛选表达盒和第三筛选表达盒为不同的筛选表达盒，均选自mCherry、EGFP和EBFP表达盒。
本发明再一方面还提供一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其由上述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株制备获得。
上述非洲猪瘟病毒减毒活疫苗中，减毒非洲猪瘟病毒的病毒含量≥107.0TCID50/ml。
本发明再一方面还提供了上述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
T1)将上述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代PAM细胞，扩大培养，收获病毒液；
T2)以病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液(例如可以通过浓缩步骤T1收获的病毒液获得)直接或配合佐剂制成疫苗。
上述制备方法中，所述佐剂包括但不限于纳米佐剂、白介素和干扰素。
基于以上技术方案提供的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株在MGF360(12L,13L,14L)基因和CD2v基因缺失的基础上，还缺失了I177L基因部分片段，获得一种相对于野生毒株显著减毒(MGF360(12L,13L,14L)基因缺失和I177L基因部分片段缺失的双重减毒效果)、且能够高效稳定增殖、保持较高的毒力和免疫原性、并可以区别于野生毒株(利用CD2v基因的缺失)的非洲猪瘟病毒毒株(rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2v/I177L)。经试验证明，利用本发明提供的rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2v/I177L毒株对实验猪进行接种后，按照低剂量(103.0TCID50/头)接种和高剂量(105.0TCID50/头)接种实验猪，均不会出现实验猪体温明显升高(不超过40.3℃)、关节肿胀、发病或死亡现象，也无病毒血症发生，表现出比文献1和文献2公开的基因缺失株更好的安全性，同时还表现出良好的免疫攻毒保护效果，保护率为100％；另一方面，本发明是两种毒力基因(I177L基因片段和MGF360(12L,13L,14L)基因)的同时缺失，其中I177L基因在整个基因组中仅有单个基因，其不像多基因家族基因(例如MGF360基因)一样容易被多次复制或重组而发生缺失回补的现象，并且由于I177L基因片段单独缺失时就可以表现出显著的减毒效果，即使MGF360(12L,13L,14L)基因发生缺失回补的现象，也不会导致本发明的基因缺失株毒力返强，因此本发明提供的基因缺失株消除了毒力返强的潜在风险。
附图说明
图1为非洲猪瘟病毒I177L基因片段缺失后的蓝色蛋白表达荧光照片，其中A幅表示非洲猪瘟病毒I177L-D基因片段缺失后的荧光照片，B幅表示非洲猪瘟病毒I177L-A和I177L-B基因片段缺失后的荧光照片，D幅表示非洲猪瘟病毒I177L-C基因片段缺失后的荧光照片；
图2为同源重组转移载体PCR鉴定电泳图；
图3为非洲猪瘟病毒MGF360(12L,13L,14L)基因缺失后的红色蛋白表达荧光照片；
图4为重组病毒PCR鉴定电泳图；
图5为非洲猪瘟病毒CD2V基因缺失后的绿色蛋白表达荧光照片。
具体实施方式
针对现有技术中存在的利用基因缺失疫苗株制备的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗存在的潜在安全风险和毒力返强安全风险，本发明旨在提供一种安全性更高的非洲猪瘟病毒减毒基因缺失疫苗株，该疫苗株安全性好，且不存在毒力返强的潜在风险。本发明还提供了该基因缺失疫苗株的构建方法和基于该基因缺失疫苗株的安全性和免疫保护能力均较佳的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1：非洲猪瘟病毒毒株分离及其鉴定
1.1、毒株
实施例中使用的非洲猪瘟病毒野生毒株为由由华南农业大学兽医学院禽病教研室野外分离的广东毒株，命名为ASFV GZ2018，具体操作包括以下步骤(在生物安全3级实验室中操作)：将检测为阳性ASFV感染的病死猪的脾脏组织称取0.1g，放入2.0mL的无菌EP管中，在管中加入1mL无菌PBS溶液，再放入3粒无菌的组织研磨钢珠，将EP管放入组织研磨仪里，进行震荡研磨，注意将研磨仪提前预冷至4℃并配平放置，将研磨后的组织液反复冻融3次后，用0.45μm的滤膜进行过滤后，接种到培养的原代PAM细胞(华南农业大学兽医学院禽病教研室制备，以10％FBS的PRMI1640培养基(购自Gibco)进行培养)上，能够出现细胞病变效应(CPE)，再进行病毒的分离。
1.2、毒株的鉴定
ASFV GZ2018毒株的鉴定由华南农业大学兽医学院禽病教研室完成，具体为通过基因组测序，获得该毒株的基因组数据(Genebank登录号为MT496893)，并将其基因组序列与Genebank中已有的ASFV基因组数据(例如II型ASFV毒株ASFV-SY18，其Genebank登录号为MH713612；II型ASFV毒株Georgia 2008/1，其Genebank登录号为MH910495；II型ASFV毒株Pig/HLJ/2018，其Genebank登录号为MK333180；I型ASFV毒株Ba71V，其Genebank登录号为FJ174348等)进行比对，证明ASFV GZ2018毒株为基因II型ASFV野毒株。
该ASFV GZ2018毒株通过高致病性病原微生物转运手续审批后运送至金宇保灵生物药品有限公司生物安全3级实验室保存。
实施例2：I177L基因缺失片段的确定
虽然Manuel V.Borca等人(Development of a highly effective Africanswine fever virus vaccine by deletion of the I177L gene results in sterileimmunity against the current epidemic Eurasia strain，Journal of Virology，2020；DOI：10.1128/JVI.02017-19，以下称文献2)已经证明II型非洲猪瘟病毒Georgia2007/1的基因组中缺失I177L基因片段(Georgia 2007/1的Genebank登录号为NC_044959.1，其中I177L基因片段缺失位置是第174530-174671(共142bp)中的112bp；相当于ASFV GZ2018毒株的基因组MT496893中第174572-174713中的112bp)可以获得安全性和免疫保护效果均良好的基因缺失疫苗株ASFV-G-ΔI177L。然而，该文献2并没有具体公开缺失的I177L基因片段的位置；并且由于该基因非常短，表达的蛋白不会刺激生物体产生相应的抗体，因此上述文献2构建的非洲猪瘟病毒基因缺失株用于接种仔猪后，无法区分是疫苗接种产生的抗体还是野毒感染产生的抗体，非常不利于非洲猪瘟病毒的防控和净化。虽然可以想到通过进一步缺失其他基因以构建能够区分疫苗株和野毒的多基因(例如I177L和CD2v)缺失疫苗株，但是多种基因的同时缺失还可能会导致病毒毒力过度致弱(尤其是多种毒力基因的同时缺失)，不能实现免疫保护效果，甚至会导致基因缺失株不能稳定复制。另一方面，I177L基因(其CDS区为MT496893中第174513-174713(共计201bp)，ORF区为MT496893中第174513-175043(共计531bp))也是其下游基因的起始区，因此该基因的完全缺失或者某些片段的缺失可能会导致下游基因无法表达，进而可能会导致病毒的基因缺失株无法稳定复制或丧失病毒的免疫原性。
因此，发明人首先在上述实施例1获得的GZ2018毒株的基础上，构建了该毒株的多种I177L基因片段(包括MT496893中第174513-174713(共计201bp，命名为I177L-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、第174513-175043(共计531bp，命名为I177L-B，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)、第174516-174599(共计84bp，命名为I177L-C，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、第174600-174710(共计111bp，命名为I177L-D，其核苷酸序列如SEQID NO:14所示)缺失的基因缺失株，以从中选择确定合适的I177L基因缺失片段，而不会影响到构建的基因缺失株的繁殖稳定性。具体操作包括以下步骤。
2.1、同源重组载体的构建
2.1.1、缺失I177L-A的同源重组载体的构建：利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即I177L-A的左同源臂(长度为1200bp左右)和I177L-A的右同源臂(长度为1200bp左右)，与P72启动子基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)和EBFP基因序列(蓝色荧光蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)合成同源臂，命名为I177L-A-P72-EBFP，将其定向克隆至pBluescript II KS载体(NTCC商购)，获得缺失I177L-A的同源重组转移载体，命名为pBlue-LR-ΔI177L-A-EBFP；
2.1.2、利用同步骤2.1.1的方法还分别构建了缺失I177L-B、I177L-C和I177L-D的同源重组转移载体，分别命名为pBlue-LR-ΔI177L-B-EBFP、pBlue-LR-ΔI177L-C-EBFP和pBlue-LR-ΔI177L-D-EBFP。
2.2、基因缺失重组病毒的构建
用ASFV GZ2018野生毒株感染原代PAM细胞，将步骤2.1构建的同源重组转移载体pBlue-LR-ΔI177L-A-EBFP、pBlue-LR-ΔI177L-B-EBFP、pBlue-LR-ΔI177L-C-EBFP和pBlue-LR-ΔI177L-D-EBFP分别用TurboFectin8.0转染试剂(购自美国Origene公司)，转染被野生毒株感染的原代PAM细胞，于37℃培养48h后(培养基为含10％FBS的PRMI1640培养基)，分别于显微镜下观察是否有蓝色荧光信号。
结果如图1所示，其中A幅表示转染pBlue-LR-ΔI177L-D-EBFP的原代PAM细胞的荧光照片(有大量的蓝色荧光信号)，B幅表示转染pBlue-LR-ΔI177L-A-EBFP和pBlue-LR-ΔI177L-B-EBFP的原代PAM细胞的荧光照片(没有观察到蓝色荧光信号)，C幅表示转染pBlue-LR-ΔI177L-C-EBFP的原代PAM细胞的荧光照片(仅观察到极少量的蓝色荧光信号)，可见不同I177L基因片段的缺失对病毒复制的影响不同，其中I177L-D片段的缺失不会影响病毒的复制，而I177L-A和I177L-B的缺失会导致病毒无法复制，I177L-C片段的缺失会严重影响病毒的复制能力，而不能稳定增殖。因此，本发明选择确定缺失I177L-D基因片段，即ASFVGZ2018毒株的MT496893中第174600-174710位核苷酸(共计111bp)，该片段的缺失不会影响构建的基因缺失重组病毒的复制能力，将构建获得的基因缺失重组病毒命名为rASFVGZ2018ΔI177L-D。
实施例3：缺失MGF360(12L,13L,14L)、CD2V和I177L-D基因的重组病毒的构建
对于非洲猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性效果，又要兼顾致病性和安全性能。虽然毒力基因MGF360(12L,13L,14L)的敲除(上述文献1)，或者单独的I177L基因特定片段的敲除(上述文献2)已经被证实均能获得减毒的非洲猪瘟病毒疫苗株，并具有良好的免疫保护效果。然而多种毒力基因的缺失可能会造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护效果减弱，甚至也会影响基因缺失重组病毒的复制能力，而不能拯救病毒。基于此，发明人尝试从ASFV GZ2018毒株出发，构建其同时缺失MGF360(12L,13L,14L)、CD2V和I177L-D基因的重组病毒，并验证是否能够获得稳定复制的基因缺失重组病毒，具体包括以下步骤。
3.1、同源重组载体的构建
3.1.1、缺失MGF360(12L,13L,14L)的同源重组转移载体的构建：利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即MGF360(12L,13L,14L)的左同源臂和MGF360(12L,13L,14L)的右同源臂，与P72启动子基因序列和mCherry基因序列(红色荧光蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)合成同源臂，命名为MGF360-P72-mCherry，将其定向克隆至pBluescript II KS载体，获得缺失MGF360(12L,13L,14L)基因的同源重组转移载体，名命名为pBlue-LR-ΔMGF360-P72-mCherry(全长3301bp)，图2中泳道1-3示出了该重组转移载体的鉴定凝胶电泳图(其中M表示DL5000 Marker、-表示阴性对照，+表示空载体pBluescript II KS对照)；
3.1.2、缺失CD2V的同源重组转移载体的构建：利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即CD2V的左同源臂和CD2V的右同源臂，与EGFP基因序列(绿色荧光蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)合成同源臂，命名为CD2V-EGFP，将其定向克隆至pBluescript II KS载体，获得缺失CD2V基因的同源重组转移载体，名命名为pBlue-LR-ΔCD2V-EGFP(全长2871bp)，图2中泳道4-6示出了该重组转移载体的鉴定凝胶电泳图；
3.1.3、缺失I177L-D的同源重组转移载体的构建：为实施例2中构建获得的同源重组转移载体pBlue-LR-ΔI177L-D-EBFP(全长3310bp)，图2中泳道7-9示出了该重组转移载体的鉴定凝胶电泳图。
3.2、重组病毒的构建
3.2.1、用ASFV GZ2018野生毒株感染原代PAM细胞，将步骤3.1.1构建的同源重组转移载体pBlue-LR-ΔMGF360-P72-mCherry用TurboFectin8.0转染试剂转染被野生毒株感染的原代PAM细胞，于37℃培养48h后，显微镜下可见存在大量的红色荧光斑点，结果如图3所示，挑取带有红色荧光的细胞至新鲜的原代PAM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，得到表达红色荧光蛋白的MGF360(12L,13L,14L)基因缺失的非洲猪瘟重组病毒，命名为rASFV GZ2018ΔMGF360，其相对于ASFV GZ2018野生毒株缺失了MGF360(12L,13L,14L)的完整阅读框，缺失MGF360(12L,13L,14L)基因的重组病毒的PCR鉴定(鉴定MGF360(12L,13L,14L)基因缺失使用的引物为：5’-aacatgcggtacacacgatg-3’(SEQ ID NO:5)和5’-acggccagcaacaaaagttt-3’(SEQ ID NO:6))结果如图4中泳道1-3所示，其中M表示DL5000Marker，泳道1表示阳性对照(ASFV GZ2018野生毒株)，泳道2表示重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360，泳道3表示阴性对照。
3.2.2、用ASFV GZ2018野生毒株感染原代PAM细胞，将步骤3.1.2构建的pBlue-LR-ΔCD2V-EGFP按照同上述步骤3.2.1同样的方法转染PAM细胞，在于37℃培养48h后，显微镜下可见存在大量的绿色荧光斑点，结果如图5所示。按照步骤3.2.1的方法重复挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的原代PAM细胞中，最终得到表达绿色荧光蛋白的CD2V基因缺失的非洲猪瘟重组病毒，命名为rASFV GZ2018ΔCD2V，其相对于ASFV GZ2018野生毒株缺失了CD2V的完整阅读框。
3.2.3、用步骤3.2.1获得的rASFV GZ2018ΔMGF360感染原代PAM细胞，将步骤3.1.2构建的pBlue-LR-ΔCD2V-EGFP按照同上述步骤3.2.1同样的方法转染PAM细胞，并在显微镜下重复挑取红、绿双荧光斑点进行纯化，最终得到表达红、绿双荧光蛋白的MGF360(12L,13L,14L)和CD2V基因都缺失的非洲猪瘟重组病毒，命名为rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V，其相对于ASFV GZ2018野生毒株缺失了MGF360(12L,13L,14L)和CD2V的完整阅读框，PCR鉴定(鉴定CD2V基因缺失使用的引物为：5’-accgcactaggaaaaacggttg-3’(SEQ ID NO:7)和5’-agttggtttgttctcgcagc-3’(SEQ ID NO:8))结果如图4中泳道4-6所示，其中泳道4表示阳性对照(即rASFV GZ2018ΔMGF360重组病毒)，泳道5表示重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V，泳道6表示阴性对照。
3.2.4、用步骤3.2.2获得的rASFV GZ2018ΔCD2V感染原代PAM细胞，将步骤3.1.3构建的pBlue-LR-ΔI177L-D-EBFP按照同上述步骤3.2.1同样的方法转染PAM细胞，并在显微镜下重复挑取蓝、绿双荧光斑点进行纯化，最终得到表达蓝、绿双荧光蛋白的I177L-D和CD2V基因都缺失的非洲猪瘟重组病毒，命名为rASFV GZ2018ΔCD2V/ΔI177L-D，其相对于ASFV GZ2018野生毒株缺失了CD2V和I177L-D的阅读框。
3.2.5、用步骤3.2.3获得的rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V感染原代PAM细胞，将步骤3.1.3构建的pBlue-LR-ΔI177L-D-EBFP按照同上述步骤3.2.1同样的方法转染PAM细胞，并在显微镜下重复挑取红、绿、蓝三荧光斑点进行纯化，最终得到表达红、绿、蓝三荧光蛋白的MGF360(12L,13L,14L)、CD2V和I177L-D基因都缺失的非洲猪瘟重组病毒，命名为rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D，其相对于ASFV GZ2018野生毒株缺失了MGF360(12L,13L,14L)、CD2V和I177L-D的阅读框，PCR鉴定(鉴定I177L-D基因缺失使用的引物为：5’-gtgggccccttaagatcaca-3’(SEQ ID NO:9)和5’-ccactctgatactccccagc-3’(SEQ IDNO:10))结果如图4中泳道7-9所示，其中泳道7表示重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D，泳道8表示阳性对照(即rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V重组病毒)，泳道9表示阴性对照。
经测序结果表明，该实施例3成功构建了同时缺失MGF360(12L,13L,14L)、CD2V和I177L-D的重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D，并且该重组病毒能够在原代PAM细胞中稳定复制繁殖，在感染PAM细胞时能够表达红、绿、蓝三色荧光，不会出现由于多种毒力基因的缺失而导致重组病毒无法复制繁殖的问题。
实施例4：重组病毒的滴度测定
该实施例对上述实施例2构建的重组病毒rASFV GZ2018ΔI177L-D，上述实施例3构建的重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/ΔI177L-D以及重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的滴度进行测定，并与野生毒株ASFV GZ2018的滴度进行比较。非洲猪瘟病毒的滴度测定分别采用半数细胞感染剂量TCID50和半数血球吸附量HAD50两种方法进行操作，其中：
TCID50滴定按照下面步骤进行：将ASFV以无血清1640培养液再作10倍连续稀释，接种培养于96孔培养板、密度约90-100％的PAM细胞，每个稀释度接种8个孔，100μl/孔，于37℃、5％浓度CO2条件下培养，观察3-7天，根据细胞病变或荧光变化和Reed and Muench方法计算半数细胞感染量(TCID50)。
HAD50试验操作按照《非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程》进行操作，并作适当调整：在96孔细胞培养板中接种原代PAM细胞，将待检样品进行10倍梯度稀释，20μl/孔，病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的玫瑰花环进行判定，观察7天，根据Reedand Muench方法计算半数血球吸附剂量(HAD50)。
具体测定操作包括以下步骤。
(1)将猪原代PAM细胞铺入6孔板中，长成单层后，分别接种0.1MOI病毒液(ASFVGZ2018、rASFV GZ2018ΔI177L-D、rASFV GZ2018ΔCD2V/ΔI177L-D或rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D)，37℃孵育2h，分别于感染后0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、72h收获扩增病毒，反复冻融3次，高速离心，取上清，分别获得培养病毒液；
(2)分别将上述步骤(1)获得的培养病毒液按照10倍梯度进行稀释，感染已铺在96孔板中形成单层的猪原代PAM细胞，于感染后72h测定HAD50；基因缺失重组病毒也可直接利用荧光显微镜观察，按照Reed-Muench法计算病毒的滴度，以TCID50/mL为单位。
结果显示：在所测定的72h时间内，三株基因缺失重组病毒的平均滴度均低于野生毒株ASFV GZ2018，其中在感染后48h时，ASFV GZ2018、rASFV GZ2018ΔI177L-D、rASFVGZ2018ΔCD2V/ΔI177L-D及rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的病毒滴度分别为107.20TCID50/mL、104.30TCID50/mL、104.28TCID50/mL、104.25TCID50/mL；在感染后72h时，ASFVGZ2018、rASFV GZ2018ΔI177L-D、rASFV GZ2018ΔCD2V/ΔI177L-D及rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的病毒滴度分别为107.50TCID50/mL、105.80TCID50/mL、105.65TCID50/mL、105.25TCID50/mL。可见，在感染PAM细胞后，基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的滴度明显低于野生毒株ASFV GZ2018的滴度(前者比后者低100倍至1000倍)，也明显低于文献1公开的SY18ΔMC组病毒(缺失MGF360(12L,13L,14L)和CD2V)的滴度(感染后48h的平均滴度为8.472×106TCID50/mL)，并且与文献2公开的只缺失I177L基因片段的基因缺失株ASFV-G-ΔI177L的毒力相当，并没有因为缺失更多的毒力基因而导致基因缺失株rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的病毒滴度过低和免疫原性的过渡致弱。
因此本发明构建获得的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D是一种相对于野生毒株明显减毒的非洲猪瘟病毒基因缺失重组病毒，并且仍保持相对较高的病毒滴度和较高的免疫原性。理论上，在不降低免疫原性的情况下，毒力基因缺失越多，病毒毒力越弱，其安全风险就越低，因此本发明提供的同时缺失MGF360(12L,13L,14L)、CD2V和I177L-D基因的重组病毒相对于野生毒株、文献1和文献2公开的基因缺失株将具有更高的安全性，并且由于I177L在基因组中为单一基因，不会轻易发生自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位的现象，也可以避免潜在的毒力返强安全风险。
实施例5：基因缺失株rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的毒力检测
该实施例对上述实施例3获得的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的毒力进行检测，以对其安全性进行评价，具体包括以下步骤。
(1)选取20头健康仔猪(非洲猪瘟病毒抗原、抗体均阴性)，购自内蒙古包头市草原立新猪场，随机分为4组(A、B、C和D组)；
(2)分别选用103TCID50/头低感染剂量和105TCID50/头高感染剂量的rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D对A和B组仔猪进行肌肉注射；同时采用感染剂量为103TCID50/头的野生毒株ASFV GZ2018对C组仔猪进行肌肉注射，作为对照；还采用1640培养基(2ml)作为阴性对照肌肉注射D组仔猪；试验方案如下表1所示；
(3)接种后每日对各组仔猪测定采食量、体温、体重变化情况，并记录仔猪存活情况，直至接种后28天；在观察期内，每5天对各组仔猪采集猪外周血、唾液、粪便和泪腺(若仔猪死亡，则停止对该死亡仔猪进行采集)，以检测仔猪血液中病毒含量(HAD50)和唾液、粪便以及泪腺等部位是否存在排毒情况。
表1：基因缺失株rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D的毒力检测试验方案
Figure BDA0003018017710000111
结果显示：C组仔猪经肌肉注射接种103.0TCID50/头剂量ASFV GZ2018毒株后，所有仔猪均在接种3日后发生高热，高达42℃以上，精神沉郁，4～6天左右开始死亡，并在10天内全部死亡。剖检可见淋巴结、脾脏、肾脏等部位严重出血，病毒血症一直持续到猪只死亡。而使用rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D接种后，无论是低剂量(103.0TCID50/头)还是高剂量(105.0TCID50/头)接种后，所有仔猪的平均体温均未超过40.3℃，后期亦未见体温异常，精神状态正常，采食量未见异常，体重增加明显。另外，观察期内所有仔猪无病毒血症发生，粪便、唾液、泪腺等部位无排毒现象，相对于文献2公开的基因缺失株ASFV-G-ΔI177L，接种本发明提供的基因缺失株rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D后，检测的仔猪血液中病毒含量一直处于更低水平，这与实施例4中重组病毒的滴度检测结果一致。
该实施例结果表明，本发明构建的减毒的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D对仔猪确实具有良好的安全性。
实施例6：基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D作为疫苗株对仔猪的免疫保护效果评价
该实施例利用基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D作为疫苗株对仔猪进行免疫，以通过抗体检测和攻毒试验评价其免疫保护效果，具体包括以下步骤。
(1)选取3～4周龄健康仔猪20头，随机分成3组(a、b、c和d组)，每组5头；a组仔猪用基因缺失株rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D于颈部肌肉注射，103.0TCID50/头，2周后同样剂量加强免疫一次；b组仔猪用基因缺失株rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D于颈部肌肉注射，105.0TCID/头，2周后同样剂量加强免疫一次；c组和d组为阴性对照，同样方法注射生理盐水2ml；三组分别隔离饲养。试验方案如下表2所示。
(2)免疫后抗体检测：免疫后分别于3日、5日、7日、14日、21日和28日从各组仔猪的前腔静脉采血，对非洲猪瘟病毒抗体进行检测(英吉纳抗体试剂盒)，评价其免疫效果。
(3)攻毒保护试验：接种后第28日，从各组仔猪采血结束后，a组、b组和c组仔猪颈部肌肉接种ASFV GZ2018(50HAD50/头)进行攻毒保护试验，d组仔猪注射生理盐水2ml。
表2：免疫保护效果评价试验方案
Figure BDA0003018017710000121
抗体检测结果显示：a组和b组仔猪于免疫后3日、5日和7日均未产生特异性抗体；z组仔猪于免疫后14日、21日及28日后抗体阳性率分别为40％、80％和100％；b组仔猪于免疫后14日、21日和28日抗体阳性率均为100％。c组和d组仔猪在观察期内均未产生特异性抗体。在观察期内，a组和b组仔猪的体温均在正常温度范围之内，未见任何异常临床表现，无病毒血症发生，粪便、唾液、泪腺等部位无排毒。剖检可见所有免疫仔猪未发现明显病理变化。
免疫攻毒保护试验结果显示：a组和b组仔猪免疫攻毒后的保护率均为100％，而c组5头仔猪全部于攻毒后12日内死亡，d组仔猪表现正常。结果如下表3所示。
表3：免疫攻毒试验结果
Figure BDA0003018017710000122
综上所述，可见当将本发明构建的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D作为疫苗株按照首次免疫后14日加强免疫一次的方案接种仔猪后，不论是低剂量组(103.0TCID50/头)还是高剂量组(105.0TCID50/头)均能产生较好的免疫应答，提供100％的攻毒保护效果。其中103.0TCID50/头低剂量组在首免后14日二免前抗体转阳率为40％，二免后7日和14日抗体阳性率持续上升，攻毒前抗体阳性率达到100％；105.0TCID50/头高剂量组在首免后14日二免前即可达到100％抗体阳性率，并且所有仔猪体温均在正常范围之内，未见任何异常临床表现，无病毒血症发生，粪便、唾液、泪腺等部位无排毒，接种后血液病毒含量一直处于较低水平。表明野生毒株ASFV GZ2018缺失MGF360(12L,13L,14L)、CD2v和I177L-D后仍然保留较高的免疫原性并且免疫健康易感猪后可提供有效的攻毒保护效果，该基因缺失株可以提供安全、有效的免疫保护作用，因此可以作为一种候选的非洲猪瘟病毒疫苗株。在作为疫苗株制备减毒活疫苗时，可以将本发明构建的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代PAM细胞，扩大培养，收获病毒液并测定病毒滴度，可以在浓缩后选择病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液直接或与配合佐剂(例如纳米佐剂、白介素或干扰素)制成疫苗，制备得到的疫苗中的病毒含量可高达107.0TCID50/ml以上。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 金宇保灵生物药品有限公司
华南农业大学
中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaggaaaa gtcaaaaggg gcaggtagtt catacaccaa aaagtttttt ttttctgcca 60
gcaagagcgt gtcaataatt ttaagctgat cgttaattaa tttttggttt aactctttgt 120
tattatcaag atccttcgca taaaccgcca tatttaataa aaacaataaa ttatttttat 180
aacattatat 190
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg aggggcgagg gcgagggcga tgccaccaac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgagcca cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaccta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcgtcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaacttcaa cagccacaac atctatatca tggccgtcaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacgtggagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacagccac 600
tacctgagca cccagtccgt gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tccgcaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 3
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacatgcggt acacacgatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acggccagca acaaaagttt 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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accgcactag gaaaaacggt tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agttggtttg ttctcgcagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgggcccct taagatcaca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccactctgat actccccagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaaaagtag atgaacctct tttgtttttt attgggttca tttttactaa atttatgaac 60
tggaaaaaac tttaacggca taattatcaa atgcgaaggg ggatccgtat aaaatcctag 120
cttgccggta atggctatta agttaaattt ggtaccagta acactaatat ttaaaaagcc 180
ctgatcatta actttccaca t 201
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<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaaaagtag atgaacctct tttgtttttt attgggttca tttttactaa atttatgaac 60
tggaaaaaac tttaacggca taattatcaa atgcgaaggg ggatccgtat aaaatcctag 120
cttgccggta atggctatta agttaaattt ggtaccagta acactaatat ttaaaaagcc 180
ctgatcatta actttccaca ttaaaagatt attatattcg aatgtttgtc caatatggac 240
aactttgtca ccagatgtta catttgattt ggttgttagt ggctgaagct tggcacaatc 300
aaaaataagc ccattaacac taagatatag aggagtgggt tgatctattt tctcatagtt 360
taatattcca tctttccacg taatagcttg ataattatcc gcagcaatga gttgaaattt 420
tataaatagt acaggggttt tagttgtcgt tatacattta aagggtgttt tataaaaata 480
aaaaataata attgttaaaa gtatgataat aatcgccaaa ataatttcat a 531
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagtagatg aacctctttt gttttttatt gggttcattt ttactaaatt tatgaactgg 60
aaaaaacttt aacggcataa ttat 84
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaatgcgaa gggggatccg tataaaatcc tagcttgccg gtaatggcta ttaagttaaa 60
tttggtacca gtaacactaa tatttaaaaa gccctgatca ttaactttcc a 111

Claims (9)

1.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其在II型非洲猪瘟病毒的基因组中缺失以下基因或片段：
CD2V基因、MGF360（12L,13L,14L）和I177L基因片段，所述MGF360（12L,13L,14L）表示MGF360-12L基因、MGF360-13L基因和MGF360-14L基因这3个连续的基因序列，其中所述I177L基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
2.根据权利要求1所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其中所述II型非洲猪瘟病毒包括但不限于ASFV-SY18、Georgia 2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia 2007/1、ASFV GZ2018。
3.权利要求1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段将亲本II型非洲猪瘟病毒的CD2V基因、MGF360（12L,13L,14L）基因和I177L基因片段缺失。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其中所述基因工程手段为同源重组技术，具体包括以下步骤：
S1）将MGF360（12L,13L,14L）基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pBluescriptII KS载体，获得第一同源重组转移载体；
S2）将CD2V基因的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第二同源重组转移载体；
S3）将I177L基因片段的左右同源臂和第三筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第三同源重组转移载体；
S4）将步骤S1）的第一同源重组转移载体用转染试剂转染至使用所述亲本II型非洲猪瘟病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒筛选获得缺失MGF360（12L,13L,14L）基因的第一重组病毒；
S5）将步骤S2）的第二同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S4）获得的第一重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒和第二筛选表达盒筛选获得同时缺失MGF360（12L,13L,14L）基因和CD2V基因的第二重组病毒；
S6）将步骤S3）的第三同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S5）获得的第二重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒、第二筛选表达盒和第三筛选表达盒筛选获得同时缺失MGF360（12L,13L,14L）基因、CD2V基因和I177L基因片段的第三重组病毒，作为减毒非洲猪瘟病毒毒株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其中所述第一筛选表达盒、第二筛选表达盒和第三筛选表达盒为不同的筛选表达盒，均选自mCherry、EGFP和EBFP表达盒。
6.一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其由权利要求1或2所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株制备获得。
7.根据权利要求6所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其中的减毒非洲猪瘟病毒的病毒含量≥107.0TCID50/ml。
8.权利要求6或7所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
T1）将权利要求1或2所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代PAM细胞，扩大培养，收获病毒液；
T2）以病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液直接或配合佐剂制成疫苗。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中所述佐剂包括但不限于纳米佐剂、白介素和干扰素。
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