本發明解決了先前技術固有的問題且使得現有技術有顯著進步。 通常，本發明提供重組型犬腺病毒(rCAdV)載體，該載體包含編碼至少一個可操作連接至馬疱疹病毒-4 (EHV4)啟動子之異源DNA之表現盒。 本發明另外係關於rCAdV載體，其中馬疱疹病毒-4 (EHV4)啟動子包含4pgG600 (SEQ ID NO.:29)或4pMCP600 (SEQ ID NO.:30)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，其中該啟動子序列引起異源抗原之表現。 在特定態樣中，啟動子序列之功能片段或衍生物具有至少80%、85%序列一致性，較佳90%、91%、92%、93%、94%序列一致性，更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.9%序列一致性。 在特定態樣中，功能片段係4pgG600 (SEQ ID NO.:29)或其互補核苷酸序列之截短形式，較佳地序列一致性為關於整個長度至少72%。 在特定態樣中，功能片段係4pMCP600 (SEQ ID NO.: 30)或其互補核苷酸序列之截短形式，較佳地序列一致性為關於整個長度至少78% (或更高)。 在另一特定態樣中，啟動子4pgG600 (SEQ ID NO.:29)或4pMCP600 (SEQ ID NO.:30)序列之功能片段或衍生物具有550個核苷酸之長度，較佳500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430個核苷酸，最佳455或430個核苷酸。 在另一特定態樣中，rCAdV載體包含包括4pgG600 (SEQ ID NO.:29)之馬疱疹病毒-4 (EHV4)啟動子。 在另一特定態樣中，rCAdV載體包含包括4pMCP600 (SEQ ID NO.: 30)之馬疱疹病毒-4 (EHV4)啟動子。 在另一特定態樣中，rCAdV載體包含包括4pG430 (SEQ ID NO.:31)之馬疱疹病毒-4 (EHV4)啟動子。 在另一特定態樣中，rCAdV載體包含包括gMCP455 (SEQ ID NO.:32)之馬疱疹病毒-4 (EHV4)啟動子。 在本發明之特定態樣中，rCAdV載體係包裝為傳染性CAdV。 在本發明之再一實施例中，rCAdV載體包含編碼選自由以下組成之群之多肽之異源DNA：所關注所關注表位、生物反應調節劑、生長因子、識別序列、治療基因及融合蛋白。 在本發明之特定態樣中，異源DNA編碼所關注抗原性表位。 在本發明之再一實施例中，所關注抗原性表位係犬或貓病原體之抗原。 在本發明之特定態樣中，所關注抗原性表位係源於產食性動物病原體之抗原，更特定而言其中，產食性動物病原體源於豬、牛、馬、家禽及/或綿羊動物；且更特定而言，其中產食性動物病原體選自由以下組成之群：牛病毒腹瀉病毒(BVDV)、副流行性感冒-3病毒(PI-3)、傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)、牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛疱疹病毒(BHV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛腸病毒(BEV)、牛冠狀病毒(BCV)、牛狂犬病病毒(BR)、牛小病毒(BPV)、腺病毒星狀病毒、溶血性曼哈米亞桿菌(Mannheimia haemolytica) (先前稱為溶血性巴氏桿菌(Pasteurella haemolytica))、敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus) (綿羊嗜組織菌(Histophilus ovis)及阿古尼嗜血桿菌(Haemophilus agni))、放線菌屬(Actinomyces) (棒狀桿菌屬(Corynebacterium))、化膿性放線菌(Actinomyces pyogenes)、鸚鵡披衣菌(Chlamydia psittaci)、性病胚胎彎曲桿菌(Campylobacter fetus venerealis)及胚胎胚胎彎曲桿菌(Campylobacter fetus fetus) (先前稱為腸道胚胎彎曲桿菌(C fetus intestinalis))、問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira hardjo)、波蒙納鉤端螺旋體(Leptospira pomona)及感冒傷寒型鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體(哈德焦普拉基特諾鉤端螺旋體(Leptospira hardjoprajitno)及牛哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira hardjo-bovis))、流產布氏桿菌(Brucella abortus)、豬布氏桿菌(Brucella suis)及地中海熱布氏桿菌(Brucella melitensis)、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、鸚鵡披衣菌、氣腫疽梭菌(Clostridium chauvoei)、敗血性梭菌(Clostridium septicum)、溶血性梭菌(Clostridium haemolyticum)、諾維氏梭菌(Clostridium novyi)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風性梭菌(Clostridium tetani)、牛莫拉菌(Moraxella bovis)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella spp)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)；新港沙門桿菌(Salmonella newport)、鳥副結核分枝桿菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)、小隱胞子蟲(Cryptosporidium parvum)、人隱胞子蟲(cryptosporidium hominis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、壞乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、黴漿菌屬(Mycoplasma spp)、牛黴漿菌(Mycoplasma dispar)及尿素黴漿菌屬(Ureaplasma spp.)、胎兒三毛滴蟲(Tritrichomonas foetus)、疣狀髮癬菌(Trichophyton verrucosum)、鬚髮癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、沙凱斯維髮癬菌(Trichophyton sarkisovii)、犬新孢子蟲(Neospora caninum) (先前稱為弓蟲(Toxoplasma gondii))、雙芽巴貝蟲(Babesia bigemina)及牛巴貝蟲(Babesia bovis)、牛肺蟲(Dictyocaulus viviparous) (肺蟲病)及其組合。 在本發明之特定態樣中，所關注抗原性表位係源於產食性動物病原體之抗原，更特定而言其中，產食性動物病原體源於豬、牛、馬、家禽及/或綿羊動物；且更特定而言，其中產食性動物病原體選自由以下組成之群：沙門桿菌屬(Salmonella spp.)，具體而言鼠傷寒沙門桿菌(S. typhimurium)、豬霍亂沙門桿菌(S. choleraesuis)；星狀病毒；輪狀病毒；可傳播胃腸炎病毒；短螺旋體屬(Brachyspira spp.)，具體而言豬痢疾短螺旋體(B. hyodysenteriae)、多毛短螺旋體(B. pilosicoli)；梭菌屬(Clostridium spp.)，具體而言難養梭菌(C. difficile)、A型、B型及C型產氣莢膜梭菌(C. perfringens)、諾維氏梭菌(C. novyi)、敗血性梭菌(C. septicum)、破傷風性梭菌(C. tetani)；豬腸道小核糖核酸病毒；豬腸道杯狀病毒；呼吸道病原體，其包括：胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；支氣管敗血性博德氏菌(Bordetella bronchiseptica)；豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)，具體而言亞型1、7及14；巴氏桿菌屬(Pasteurella spp.)，具體而言敗血性巴氏桿菌(P. multocida)；黴漿菌屬，具體而言豬肺炎黴漿菌(M. hyopneumoniae)、豬鼻黴漿菌(M. hyorhinis)；豬流行性感冒A病毒；PRRS病毒；豬環狀病毒；豬小病毒；偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；豬附紅血球體(Eperythrozoonosis suis)、分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)，具體而言鳥分枝桿菌(M. avium)、胞內分枝桿菌(M. intracellulare)、牛分枝桿菌(M. bovis)；豬呼吸道冠狀病毒；豬冠狀病毒，具體而言TGEV、PEDV及德爾塔冠狀病毒(delta coronavirus)；化膿性隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)；豬腺病毒；古典豬瘟(Classical swine fever)；豬巨細胞病毒；非洲豬瘟(African swine fever)；或其他病原體，其包括大腸桿菌、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)，具體而言豬鏈球菌(S. suis)、豚鏈球菌(S. porcinus)、壞乳鏈球菌(S. dysgalactiae)，較佳類馬鏈球菌亞屬(subsp. equisimilis)；豬布氏桿菌，具體而言生物變型1、2及3；鉤端螺旋體屬(Leptospira spp.)，具體而言澳洲鉤端螺旋體(L. australis)、犬鉤端螺旋體(L. canicola)、感冒傷寒性鉤端螺旋體(L. grippotyphosa)、波蒙納鉤端螺旋體(L. pomona)、出血黃疸性鉤端螺旋體(L. icterohaemorrhagicae)、問號鉤端螺旋體(L. interrogans)、塔拉索夫鉤端螺旋體(L. tarassovi)、哈德焦鉤端螺旋體(L. hardjo)、塞諾鉤端螺旋體(L. sejroe)；腦心肌炎病毒；血球凝集性腦脊髓炎病毒；日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)；西尼羅病毒(West Nile virus)；裡奧病毒(Reovirus)；德國麻疹病毒屬(Rubulavirus)；梅南高病毒(Menangle virus)；立百病毒(Nipah virus)；水皰性口炎病毒；豬水疱疹病毒；豬痘病毒；豬疱疹病毒；及豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)及其組合。 在本發明之另一實施例中，所關注抗原性表位選自由以下組成之群：麻疹病毒(Morbillivirus)抗原、狂犬病病毒醣蛋白、貓白血病病毒(FeLV)套膜蛋白、免疫缺失病毒抗原、小病毒抗原、痘病毒抗原。 本發明進一步係關於包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體及醫藥或獸醫上可接受之載劑或稀釋劑之免疫原性或疫苗組合物。 在另一態樣中，包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體之免疫原性或疫苗組合物適於經口、經皮內、經肌內或經鼻內施用。 本發明進一步係關於產生用於降低與感染相關或由感染造成之一或多種臨床體徵之發生率或嚴重性且包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體之免疫原性組合物或疫苗的方法，該方法包含以下步驟：(a)將包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體之重組rCAdV載體引入宿主細胞中；(b)在適宜條件下培育經感染細胞；(c)收穫經感染細胞及/或載體及/或病毒組分；(d)視情況純化步驟(c)之收穫物；及(e)將該收穫物與醫藥上可接受之載劑混合。 本發明進一步係關於降低或預防動物中由病原體感染造成之臨床體徵或疾病或用於治療或預防動物之病原體感染之方法中的方法，其包含向動物投與治療有效量之包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體之免疫原性組合物或疫苗的步驟。 在上述實施例之任一方法之特定態樣中，免疫原性組合物係投與一次。 在上述實施例之任一方法之特定態樣中，免疫原性組合物係以兩個劑量來投與。 在上述實施例之任一方法之特定態樣中，免疫原性組合物係經口、經皮內、經肌內或經鼻內來投與。 在上述實施例之任一方法之特定態樣中，免疫原性組合物針對同源及/或異源病毒攻擊加以保護。 本發明進一步係關於使動物對該動物中由病原體造成之臨床疾病免疫之方法，其包含向該動物投與包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體之免疫原性組合物之步驟，其中該免疫原性組合物或疫苗不會造成感染之臨床體徵，但能誘導使動物對該病原體之病原形式免疫之免疫反應。 在根據上述方法之本發明之特定態樣中，免疫原性組合物係投與一次或另一選擇為以兩個劑量投與。 在根據上述方法之本發明之特定態樣中，免疫原性組合物係經口、經皮內、經肌內或經鼻內投與。 在根據上述方法之本發明之特定態樣中，免疫原性組合物針對同源及/或異源病毒攻擊加以保護。 本發明進一步係關於用於對動物進行疫苗接種以抵抗動物中與病原體相關或由病原體造成之一或多種臨床體徵相關之疾病及/或降低該一或多種臨床體徵之發生率或嚴重性之套組，該套組包含：(a)能向動物投與包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體之疫苗之分配器；及(b)包含上述實施例中任一者之重組型犬腺病毒(rCAdV)載體之免疫原性組合物或疫苗，及(c)視情況說明書單張。 本發明進一步係關於表現上述實施例之重組型犬腺病毒2型(rCAdV2)之真核宿主細胞系。 在另一特定態樣中，宿主細胞系係選自由以下組成之群之哺乳動物細胞系或昆蟲細胞系：PK/WRL細胞系、RK13細胞系、MDBK細胞系、ST細胞系、AI-ST細胞系、VERO細胞系、Sf9細胞系、Sf21、Sf+細胞系、MDCK細胞系及/或其衍生物。 在再一特定態樣中，宿主細胞系係表現上述實施例之第2型重組型犬腺病毒(rCAdV2)之原核宿主細胞系。
定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與歸檔時熟習本發明所屬技術領域者通常所瞭解含義相同之含義。應明確術語之含義及範圍，然而，在有任何潛在歧義的情況下，本文所提供之定義優先於任何字典或外在定義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語包括複數形式且複數術語包括單數形式。除非另有說明，否則本文所用「或」意指「及/或」。此外，所用術語「包括(including)」以及諸如「包括(includes)」及「包括(included)」等其他形式無限制性。本文所提及之所有專利及出版物皆以引用方式併入本文中。 除非另外指示，否則本發明之實踐將採用熟習此項技術者熟知之病毒學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習用技術。該等技術全面闡釋於文獻中。例如參見，Sambrook、Fritsch及Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第I卷、第II卷及第III卷，第二版(1989)；DNA Cloning, 第I卷及第II卷(D. N. Glover編輯1985)；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編輯1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編輯1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney編輯1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press，1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；連載，Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；Protein purification methods – a practical approach (E.L.V. Harris及S. Angal編輯，IRL Press，Oxford University Press)；及Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯1986, Blackwell Scientific Publications)。 在詳細闡述本發明之前，應理解，本發明並不限於特定DNA、多肽序列或製程參數，因此當然可變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅係出於闡述本發明之特定實施例之目的，而並非意欲具有限制性。必須指出，除非上下文另有明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a，an)」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，所提及之「抗原」包括兩種或更多種抗原之混合物，所提及之「賦形劑」包括兩種或更多種賦形劑之混合物，及諸如此類。
分子生物學定義
術語「載體」如業內已知係指多核苷酸構築體，通常為用於將遺傳物質傳遞至宿主細胞之質體或細菌人工染色體或減弱活病毒載體。載體可為(例如)細菌、病毒、噬菌體、細菌人工染色體、黏粒或質體。如本文所用載體可由DNA或RNA構成或含有DNA或RNA。在一些實施例中，載體由DNA構成。在一些實施例中，載體係傳染性病毒。此一病毒載體含有病毒基因體，該病毒基因體係以下列方式來處理：該病毒載體攜載外來基因，該外來基因在細胞培養物中或在宿主動物中在該病毒載體之複製中皆無功能。根據本發明之特定態樣，載體可用於多個態樣，例如僅傳遞遺傳物質，用於轉染宿主細胞或生物體，用作疫苗(例如DNA疫苗)或用於基因表現目的。基因表現係闡述如藉由稱為基因之特定多核苷酸序列所指導在細胞中生物合成蛋白質之術語。在特定態樣中，載體可為「表現載體」，其係當存在於適當環境中時能指導由載體攜載之一或多個基因編碼之蛋白質之表現的載體。 載體及製備及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法可藉由揭示於以下中之方法或以與該等方法類似之方式來達成：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update,」PNAS USA 93: 11349-11353，1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,」 PNAS USA 93: 11341-11348, 1996年10月；Smith等人，美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人，「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology, 1983年12月, 第3卷, 第12期, 第2156-2165頁；Pennock等人，「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector,」Molecular and Cellular Biology 1984年3月，第4卷，第3期，第406頁；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申請之美國申請案第920,197號；EP專利公開案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,」 PNAS USA 93:11307-11312, 1996年10月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,」PNAS USA 93: 11313-11318，1996年10月；Robertson等人，「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340，1996年10月；Frolov等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,」 PNAS USA 93: 11371-11377, 1996年10月；Kitson等人，J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；1996年7月3日提出申請之容許之美國申請案第08/675,556號及第08/675,566號(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992, 「Adenovirus as cloning vectors,」 Seminars in Virology (第3卷)第237-52頁, 1993；Ballay等人EMBO Journal, 第4卷，第3861-65頁, Graham, Tibtech 8, 85-87, 4月, 1990；Prevec等人，J. Gen Virol.70, 42434；PCTWO 91/11525；Felgner等人(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420, 1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號以及第WO 90/11092號、第WO93/19183號、第WO94/21797號、第WO95/11307號、第WO95/20660號；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry(尤其關於DNA表現載體)。亦參見WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人，美國專利第4,945,050號；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology 第9卷，第271-283頁(1997) (DNA載體系統)；Szoka等人，美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞中之方法)；McCormick等人，美國專利第5,677,178號(細胞病變病毒之使用)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文所引用之其他文件。 術語「病毒載體」闡述藉由重組型DNA技術處理之經遺傳修飾病毒，使得其進入宿主細胞產生特定生物活性，例如由載體攜載之轉基因之表現。在特定態樣中，轉基因係抗原。在靶細胞、組織或生物體中，病毒載體可或可不為複製勝任型的。 病毒載體之生成可使用業內熟知之任何適宜遺傳改造技術來實現，該等遺傳改造技術包括(但不限於)限制內核酸酶消化、連接、轉變、質體純化、DNA測序、在細胞培養物中轉染之標準技術，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))或K. Maramorosch及H. Koprowski (Methods in Virology，第VIII卷，Academic Press Inc. London, UK (2014))中所闡述。 病毒載體可納入來自任何已知生物體之基因體之序列。該等序列可以其天然形式納入或可以任一方式經修飾以獲得期望活性。舉例而言，該等序列可包含插入、缺失或取代。另外，序列可經「密碼子最佳化」以藉由增加所關注基因之轉譯效率來改良活生物體中之蛋白質表現。舉例而言，所關注基因可突變(或重新合成)以改變用於編碼特定胺基酸之密碼子，而不改變蛋白質本身之胺基酸序列。稀有密碼子可由宿主生物體基因中更豐富的密碼子替代。最佳化所關注基因中之密碼子可為增加宿主細胞背景中基因之功能及/或表現的最好方式。 病毒載體可包括兩種或更多種所關注蛋白之編碼區。舉例而言，病毒載體可包括第一所關注蛋白之編碼區及第二所關注蛋白之編碼區。第一所關注蛋白及第二所關注蛋白可相同或不同。在一些實施例中，病毒載體可包括第三或第四所關注蛋白之編碼區。第三及第四所關注蛋白可相同或不同。由一種病毒載體編碼之兩種或更多種所關注蛋白之總長度可變化。舉例而言，兩種或更多種蛋白之總長度可為至少約200個胺基酸。至少約250個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約800個胺基酸或更長。 較佳病毒載體包括犬腺病毒CAdV2載體。 根據本發明之特定態樣，術語「病毒載體」或另一選擇為「病毒構築體」係指源於病毒之重組型病毒構築體，該病毒選自腺病毒科(
Adenoviridae
，AdV)，例如CAdV-1及CAdV-2 (犬腺病毒)(參見van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Carstens, E.B., Estes, M.K., Lemon, S.M., Maniloff, J., Mayo, M.A., McGeoch, D.J., Pringle, C.R.及Wickner, R.B. (2000). Virus taxonomy. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego. 第1162頁)。 術語「病毒載體」及「病毒構築體」可互換使用。 如本文所用術語「構築體」係指人工生成之重組型核酸，例如質體、BAC或重組型病毒。 術語「質體」係指獨立於細菌染色體在細菌宿主細胞內複製之細胞質DNA。在本發明之特定態樣中，術語「質體」及/或「轉移質體」及/或「轉移片段」係指可用於構築(例如)用於插入病毒載體中之表現盒之重組型DNA技術之要素。在另一特定態樣中，術語「質體」可用於指定適用於DNA疫苗接種目的之質體。 如本文所用術語「核酸」及「多核苷酸」可互換使用且係指任一核酸。 如本文所用術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「多核苷酸」、「多核苷酸序列」、「RNA序列」或「DNA序列」係指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分且指基因體或合成來源之DNA或RNA，該DNA或RNA可為單鏈或雙鏈且代表有義鏈或反義鏈。序列可為非編碼序列、編碼序列或二者之混合物。本發明之核酸序列可使用熟習此項技術者熟知之標準技術來製備。 術語「核酸」及「多核苷酸」亦特定地包括由除5個生物鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外之鹼基構成之核酸。 術語「調控核酸」、「調控元件」及「表現控制元件」可互換使用且係指可影響特定宿主生物體中可操作連接之編碼序列之表現之核酸分子。該等術語廣泛用於且涵蓋促進或調控轉錄之所有元件，包括啟動子、啟動子序列、RNA聚合酶及轉錄因子之基本相互作用所需要之核心元件、上游元件、增強子及反應元件。原核生物中之實例性調控元件包括啟動子、處理子序列及核糖體結合位點。用於真核細胞中之調控元件可包括(但不限於)轉錄及轉譯控制序列，例如啟動子、增強子、剪接信號、多腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號、內部核糖體進入位點(IRES)、小核糖核酸病毒科2A序列及諸如此類，其提供及/或調控宿主細胞中編碼序列之表現及/或所編碼多肽之產生。 「內部核糖體進入位點」或「IRES」闡述獨立於IRES之基因5´在功能上促進轉譯起始且容許兩個順反子(開放閱讀框)自動物細胞中之單一轉錄物轉譯之序列。IRES提供獨立核糖體進入位點用於緊鄰其下游之開放閱讀框之轉譯。與可為多順反子(亦即，編碼自mRNA依序轉譯之若干不同多肽)之細菌mRNA不同，動物細胞之大多數mRNA為單順反子且編碼僅一種多肽之合成。在真核細胞中之多順反子轉錄之情況下，轉譯可自最5´轉譯起始位點開始，在第一終止密碼子處終止，且轉錄物可自核糖體釋放，從而僅轉譯mRNA中之第一編碼多肽。在真核細胞中，具有可操作連接至轉錄物中之第二或後續開放閱讀框之IRES之多順反子轉錄物容許依序轉譯該下游開放閱讀框以產生由同一轉錄物編碼之兩種或更多種多肽。IRES可具有不同長度且可來自多種來源，例如腦心肌炎病毒(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒、FMDV或脊髓灰白質炎病毒(PV)或C型肝炎病毒(HCV)。多種IRES序列及其在載體構築中之使用已有所闡述且為業內所熟知。下游編碼序列可在將不負面影響下游基因之表現之任一距離可操作連接至IRES之3´端。IRES與下游基因起點之間之最佳或可允許距離可藉由改變距離並量測隨距離變化之表現容易地測定。 術語「2a」或「2a肽」意指短寡肽序列，其闡述為2a及「2a樣」，其用作能藉由定義為核糖體跳躍之過程來調介蛋白質之間之共轉譯裂解之連接體。該等2a及「2a樣」序列(來自小核糖核酸病毒科及其他病毒或細胞序列)可用於將多個基因序列串聯成單一基因，從而確保其在同一細胞內之共表現(參見Luke及Ryan，2013)。 如本文所用術語「啟動子」或「啟動子序列」意指可以結合RNA聚合酶且指導基因之轉錄作用之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因之5'非編碼區，其靠近基因之轉錄開始位點。位在啟動子內具有起始轉錄作用功能之序列元件通常以共有核苷酸序列為特徵。啟動子之實例包括(但不限於)來自細菌、酵母、植物、病毒及動物(例如哺乳動物(包括馬、豬、牛及人類)、鳥或昆蟲)之啟動子。啟動子可為可誘導的、可抑制的及/或組成性的。可誘導啟動子因應培養條件之某一改變(例如溫度改變)而在其控制下起始增加之自DNA之轉錄程度(Ptashne, 2014)。熟習此項技術者熟知之啟動子之實例係(例如) SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延伸因子α啟動子、桿狀病毒多角體啟動子。 如本文在本發明之情況下所用術語啟動子尤其係指功能片段，例如4pgG600 (SEQ ID NO.: 29)或其互補核苷酸序列之截短形式，較佳序列一致性為關於整個長度(至少) 72% (或更高)。此外，如本文在本發明之情況下所用術語啟動子尤其係指功能片段，例如4pMCP600 (SEQ ID NO.: 30)或其互補核苷酸序列之截短形式，較佳地序列一致性為關於整個長度(至少) 78% (或更高)。最佳地「啟動子」係指p430 (SEQ ID NO.:31)或p455 (SEQ ID NO.:32)。術語「p430」、「gG 430」及「430」在整個說明書、圖、序列表等中可同義且互換使用。術語「p455」、「MCP 455」及「455」在整個說明書、圖、序列表等中可同義且互換使用。 EHV-4啟動子較佳為經截短之轉錄活性啟動子，其包含經病毒提供之反式活化蛋白反式活化之區及衍生出經截短轉錄活性啟動子之全長啟動子之最小啟動子區。出於此說明書之目的，「啟動子」係由對應於最小啟動子之DNA序列及上游調節序列之組合所構成；「最小啟動子」係由CAP位點加TATA盒構成(用於基本轉錄程度(未調控之轉錄程度)之最小序列)；且「上游調節序列」係由上游元件及/或增強子序列構成。此外，術語「經截短」意指並全長啟動子並未完全存在，亦即，已去除全長啟動子之某一部分。較佳實施例中之經截短啟動子源於馬疱疹病毒-4 (EHV-4基因體，其在本文中稱作4pgG600 (SEQ ID NO.:29)、4pMCP600 (SEQ ID NO.:30))，經截短啟動子係分別源於全長序列之pgG430 (SEQ ID NO.:31)或gMCP455 (SEQ ID NO.:32)。 啟動子可經截短使得大小自全長啟動子基於鹼基對降低5%、10%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、40%、45%、55%、60%、65%、70%、75%、80%且甚至高達90%；分別例如馬4pgG600 (SEQ ID NO.:29)、4pMCP600 (SEQ ID NO.:30)。實際上，本發明之經截短啟動子可基本上由被由插入經截短啟動子之病毒或系統提供之反式活化蛋白反式活化之截短內之任一區組成，且因此該經截短啟動子係最小啟動子。 本發明之經截短「轉錄活性」或「勝任」啟動子係指源於馬疱疹病毒4基因體之經截短轉錄活性真核疱疹病毒啟動子：EHV-4 gG430 (SEQ ID NO.:31)及gMCP455 (SEQ ID NO.:32)啟動子。「活性」 (或「勝任」)，經截短轉錄活性啟動子應展現全長啟動子之至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%之轉錄活性。核苷酸或全長啟動子之部分或區之缺失可自本文之教示進行，而無需過多實驗，以除所例示之彼等以外生成活性片段。 可用於實踐本發明之啟動子因此可包括全長啟動子之衍生物及/或子片段，該等衍生物及/或子片段維持足夠的啟動子活性且因此可用作啟動子，且其可有利地具有實質上類似於衍生出衍生物或子片段之實際或全長啟動子之啟動子活性。如本文所用術語「衍生物」或「子片段」係指具有諸如截短及/或取代/缺失等修飾，使得啟動子序列具有在與野生型啟動子相比時實質上等效之功能之核酸序列。該等衍生物或子片段包括具有較少可有意為之(如藉由定點誘變)或可自發之修飾之核酸序列。術語「衍生物」進一步涵蓋相對於序列之缺失、添加及取代，只要啟動子保留「轉錄活性」或「勝任」以驅動(例如)編碼所關注抗原之可操作連接多肽之表現即可。 術語「增強子」表示在順式位置作用於啟動子之活性且因此刺激功能連結至此啟動子之基因或編碼序列之轉錄之多核苷酸序列。與啟動子不同，增強子之效應獨立於位置及定向，且因此其可位於轉錄單元之前方或後方，於內含子內或甚至於編碼區內。增強子可位於轉錄單元之鄰近區域中且可距啟動子相當大的距離。亦可與啟動子具有物理及功能重疊。熟習此項技術者將意識到來自多種來源之多種增強子(且保存在資料庫(例如基因庫)中，例如SV40增強子、CMV增強子、多瘤病毒增強子、腺病毒增強子)，該等增強子可用作獨立元件或在多核苷酸序列內選殖之元件(例如保存在ATCC處或來自商業及個別來源)。多種啟動子序列亦含有增強子序列，例如通常使用之CMV啟動子。人類CMV增強子係迄今所鑑別之最強增強子之一。可誘導增強子之一個實例係金屬硫蛋白增強子，該金屬硫蛋白增強子可藉由糖皮質激素或重金屬來刺激。 術語「互補核苷酸序列」闡述多核苷酸(例如DNA或RNA)之兩條配對鏈中之一條鏈。互補鏈之核苷酸序列映出其配對鏈之核苷酸序列，使得對於每一腺苷而言其含有胸腺嘧啶(或尿嘧啶(對於RNA))，對於每一鳥嘌呤而言含有胞嘧啶，且反之亦然。例如5’-GCATAC-3’之互補核苷酸序列為3’-CGTATG-5’或3’-CGUAUG-5’(對於RNA)。 本文所用術語「基因」、「所關注基因」具有相同含義且係指編碼所關注產物之任一長度之多核苷酸序列。基因可在編碼序列之前(5´非編碼或非轉譯序列)及之後(3´非編碼或非轉譯序列)進一步包含調節序列。所選序列可為全長或經截短、融合或加標籤基因，且可為cDNA、基因體DNA或DNA片段。通常應瞭解，編碼多肽或RNA之基因體DNA可包括非編碼區(即內含子)，該等非編碼區係自成熟信使RNA (mRNA)剪接且因此不存在於編碼同一多肽或RNA之cDNA中。其可為天然序列(亦即天然形式)，或可突變，或包含源於不同來源之序列或以其他方式修飾(若期望)。該等修飾包括密碼子最佳化以使所選宿主細胞中之密碼子使用最佳化或加標籤。此外，其可包括去除或添加順式作用位點，例如(隱蔽)剪接供體、接受體位點及分支點，多腺苷酸化信號、TATA盒、chi位點、核糖體進入位點、重複序列、二級結構(例如莖環)、用於轉錄因子或其他調節因子之結合位點、限制酶位點等以得到少量但非限制之實例。所選序列可編碼分泌型、細胞質、細胞核、膜結合型或細胞表面多肽。 藉由定義，「表位」係具有免疫學活性之抗原決定子，其意為在投與宿主時其能誘發體液(B細胞)及/或細胞類型(T細胞)之免疫反應。該等係分子上具有抗原性之特定化學基團或肽序列。抗體特異性地結合多肽上之特定抗原表位。表位之特定非限制性實例包括多肽中之四肽至五肽序列、多醣中之三醣苷至五醣苷序列。在動物中，大多數抗原將同時呈現若干或甚至許多的抗原決定子。此多肽亦可有資格作為免疫原性多肽且可如下進一步闡述來鑑別表位。 「所關注表位」可為獸醫病原體或毒素之抗原，或來自獸醫病原體或毒素之抗原，或引發關於病原體之反應之另一抗原或毒素，或來自引發關於病原體之反應之另一抗原或毒素，例如，非限制性實例：副黏液病毒(Paramyxovirus)抗原，例如犬瘟熱病毒(CDV)抗原(例如HA或F)、牛呼吸道融合病毒(BRSV)抗原、牛副流行性感冒病毒3 (bPIV3)；狂犬病病毒醣蛋白，例如，狂犬病病毒醣蛋白G；禽流行性感冒抗原，例如，火雞流行性感冒HA、雞/Pennsylvania/1/83流行性感冒抗原，例如核蛋白(NP)；牛白血病病毒抗原，例如，gp51,30包膜；新城雞瘟病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)抗原，例如，HN或F；貓白血病病毒抗原(FeLV)，例如，FeLV套膜蛋白；疱疹病毒醣蛋白，例如，來自貓疱疹病毒、馬疱疹病毒、牛疱疹病毒、偽狂犬病病毒或犬疱疹病毒(犬疱疹病毒醣蛋白gB、gC或gD)之醣蛋白；黃病毒抗原，例如，西尼羅病毒(West Nile virus)或蜱傳腦炎病毒抗原；免疫缺失病毒抗原，例如，貓免疫缺失病毒(FIV)抗原；小病毒抗原，例如犬小病毒VP2抗原；馬流行性感冒抗原；馬立克氏病(Marek's Disease)病毒抗原；痘病毒抗原，例如，雞痘病毒抗原；傳染性華氏囊病病毒抗原，例如，VP2、VP3、VP4；冠狀病毒抗原，例如來自豬冠狀病毒(TGEV、PEDV及德爾塔冠狀SPIKE Ags)、犬及/或貓、家禽(例如傳染性支氣管炎病毒(IBV))；或瘟疫病毒屬抗原，例如，牛病毒腹瀉病毒抗原。 如本文所用術語「所關注核苷酸序列」或「所關注序列」係較所關注基因更一般之術語，乃因其不一定包含基因但可包含基因或其他遺傳資訊之元件或部分，例如
ori
(複製起點)。所關注核苷酸序列可為任何DNA或RNA序列，與其包含編碼序列抑或不包含編碼序列無關。 「開放閱讀框」或「ORF」係指一段包含轉譯開始信號或起始密碼子(例如ATG或AUG)及終止密碼子且可潛在地轉譯為多肽序列之核酸序列(DNA或RNA)。 術語「轉錄」闡述細胞中mRNA之生物合成。 如本文所用術語「表現」係指宿主細胞內核酸序列之轉錄及/或轉譯。根據本發明之特定態樣，術語「表現」係指宿主細胞內異源及/或外源核酸序列之轉錄及/或轉譯。宿主細胞中期望產物之表現程度可基於存在於細胞中之相應RNA或mRNA之量或由所選序列編碼之期望多肽之量來測定。舉例而言，自所選序列轉錄之mRNA可藉由北方墨點(Northern blot)雜交、核糖核酸酶RNA保護、與細胞RNA之原位雜交或藉由RTqPCR (反轉錄，隨後定量PCR)來量化。自所選序列之蛋白質表現可藉由多種方法來量化，例如ELISA、西方墨點法、放射免疫分析、免疫沈澱、分析蛋白質之生物活性或蛋白質之免疫染色隨後FACS分析。 術語「表現盒」或「轉錄單元」或「表現單元」定義載體、構築體或多核苷酸序列內含有一或多個欲轉錄基因之區，其中編碼所轉錄基因之核苷酸序列以及含有含於表現盒內之調控元件之多核苷酸序列彼此可操作連接。其係自啟動子轉錄且轉錄係藉由至少一個多腺苷酸化信號終止。在一個特定態樣中，其係自一個單一啟動子轉錄。因此，不同基因至少轉錄連接。自每一轉錄單元(多順反子轉錄單元)可轉錄及表現一種以上蛋白質或產物。每一轉錄單元將包含該單元內所含有之任一所選序列之轉錄及轉譯所需要之調控元件。且每一轉錄單元可含有相同或不同的調控元件。舉例而言，每一轉錄單元可含有相同終止子，IRES元件或內含子可用於功能連接轉錄單元內之基因。載體或多核苷酸序列可含有一個以上轉錄單元。 術語「增加之表現」、「增加之效價或生產力」或「改良之表現或生產力」意指藉由與適宜對照相比(例如由cDNA編碼之蛋白質對照由含有內含子之基因編碼之蛋白質)，引入宿主細胞中之異源及/或外源序列(例如編碼治療性蛋白質之基因)之表現、合成或分泌增加。若本發明之細胞係根據本文所闡述之本發明方法來培育，且若此細胞之特異性生產力或效價具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍之增加，則存在增加之效價或生產力。若本發明之細胞係根據本文所闡述之本發明方法來培育，且若此細胞之特異性生產力或效價具有至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少3倍之增加，則亦存在增加之效價或生產力。若本發明細胞係根據本文所闡述之本發明方法來培育，且若此細胞之特異性生產力或效價具有至少1.2倍至5倍、較佳1.5倍至5倍、更佳2倍至5倍、尤佳3倍至5倍之增加，則亦存在特別增加之效價或生產力。「增加之表現」亦可意指更多的細胞實際表現所關注基因/序列。例如，表現可意指，在表現或具有可檢測轉基因表現之回收細胞數方面，相對於由另一啟動子實現之表現，本發明之新穎啟動子增加。增加之表現亦可意指基於每個細胞可檢測mRNA及/或蛋白質之含量之增加。 增加之表現、效價或生產力可藉由使用本發明之異源載體獲得。此可與其他方法(例如FACS輔助選擇含有一或多種螢光蛋白(例如GFP)或細胞表面標記物作為另一可選標記物之重組型宿主細胞)組合。亦可使用獲得增加之表現之其他方法及不同方法之組合，該等方法係基於(例如)用於處理染色質結構之順式-活性元件(例如LCR、UCOE、EASE、隔離子、S/MAR、STAR元件)之使用，基於(人工)轉錄因子之使用，用天然或合成試劑處理細胞以上調內源或異源及/或外源基因表現，改良mRNA或蛋白質之穩定性(半衰期)，改良mRNA轉譯之起始，藉由使用游離型質體(基於使用病毒序列作為複製起點，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV)來增加基因劑量，使用擴增促進序列或基於DNA多聯體之活體外擴增系統。 用於量測「增加之表現」之分析係基於LC-MS/MS之蛋白質量測，例如多反應監測(MRM)；基於抗體之檢測方法，例如西方墨點(Western blot)、斑點墨點或免疫擴散、流式細胞術；及間接免疫螢光(IFA)，及藉由血球凝集分析對生物活性之量測。 「啟動子活性」係藉由在各別啟動子之控制下量化所轉錄mRNA來間接量測。mRNA係相對於內源標準藉由RTqPCR來量化。 術語「病毒效價」係每體積病毒製備物傳染單位之量度。病毒效價係生物程序之終點且定義為平行實施之某一比例之測試在其下顯示效應之稀釋度(Reed及Muench, 1938)。特定而言，組織培養物感染劑量50/毫升(TCID50/ml)給出用病毒製備物之稀釋物平行接種之細胞培養物之數量之50%經感染之稀釋物。 「轉錄調控元件」通常包含位於欲表現基因序列上游之啟動子、轉錄起始及終止位點及多腺苷酸化信號。 術語「轉錄起始位點」係指構築體中對應於納入初級轉錄物(亦即mRNA前體)中之第一核酸之核酸。轉錄起始位點可與啟動子序列重疊。 「終止信號」或「終止子」或「多腺苷酸化信號」或「polyA」或「轉錄終止位點」或「轉錄終止元件」係導致在真核mRNA之3'末端之特定位點處之裂解及在經裂解3'末端處約100 - 200個腺嘌呤核苷酸之序列(polyA尾)之轉錄後納入，且因此導致RNA聚合酶終止轉錄的信號序列。多腺苷酸化信號包含在裂解位點上游約10-30個核苷酸之序列AATAAA及位於下游之序列。已知多種多腺苷酸化元件，例如tk polyA、SV40晚期及早期polyA、BGH polyA (闡述於(例如)美國專利第5,122,458號中)或倉鼠生長激素polyA。 「轉譯調控元件」包含針對欲表現之每一個別多肽之轉譯起始位點(AUG)、終止密碼子及polyA信號。在一些構築體中可包括內部核糖體進入位點(IRES)。為最佳化表現，可適當地去除、添加或改變欲表現之核酸序列之5'-及/或3'-未轉譯區，以消除任何潛在額外不適當的替代轉譯起始密碼子或可在轉錄或轉譯層面干擾或降低表現之其他序列。可將共有核糖體結合位點(Kozak序列)插入緊接開始密碼子之上游以增強轉譯及因此表現。增加此核糖體結合位點周圍之A/U含量可促進更有效的核糖體結合。 藉由定義，插入在宿主細胞中之每一多核苷酸序列或每一基因及由其編碼之各別蛋白質或RNA在來自不同(病毒)物種時稱作相對於宿主細胞之「外源」、「外源序列」、「外源基因」、「外源編碼序列」。因此，就CAdV載體而言，本發明之基於EHV-4之啟動子係外源的。因此，任何所關注非犬序列或基因(例如非犬抗原)係根據本發明之特定態樣之所關注外源序列或基因或抗原。 藉由定義，插入在宿主細胞中之每一多核苷酸序列或每一基因及由其編碼之各別蛋白或RNA稱為相對於宿主細胞之「異源」、「異源序列」、「異源基因」、「異源編碼序列」、「轉基因」或「異源蛋白」。即使欲引入之序列或欲引入之基因與宿主細胞之內源序列或內源基因相同，此亦適用。如本文關於所關注序列或基因(例如抗原)所使用，術語「異源」意味著該所關注序列或基因、特定而言該抗原係自其天然物種背景表現出來。 術語「非天然」意指在此背景下並非天然存在之任何所關注序列或基因(例如抗原)，例如來自不同物種之雜交序列或所關注序列或基因(例如抗原)，或由人工突變、插入、缺失或諸如此類引起之不為天然產物之所關注序列或基因(例如抗原)。 術語「重組」在本發明之整個說明書中可與術語「非天然」、「異源」及「外源」互換使用。因此，「重組」蛋白係自異源或外源多核苷酸序列表現之蛋白質。術語如關於病毒所使用之重組意指藉由人工處理病毒基因體而產生之病毒。包含異源或外源序列(例如外源抗原編碼序列)之病毒係重組型病毒。術語重組型病毒及術語非天然病毒可互換使用。 因此，術語「異源載體」意指包含異源或外源多核苷酸序列之載體。術語「重組載體」意指包含異源或重組多核苷酸序列之載體。 如本文所用術語「可操作連接」用於闡述調控元件與基因或其編碼區之間之連結。通常，基因表現係在一或多個調控元件之控制下進行，例如(但不限於)組成性或可誘導啟動子、組織特異性調控元件及增強子。認為基因或編碼區「可操作連接至(operably linked to或operatively linked to)」調控元件或與調控元件「可操作結合」，意味著該基因或編碼區受調控元件之控制或影響。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。 此外，在本闡述之範圍內，術語「功能連接(functional linking或functionally linked)」或「可操作連接」意味著兩個或更多個核酸序列或序列元件係以允許其以其預期方式起作用之方式經定位。舉例而言，若啟動子/增強子或終止子能在順式位置控制或調節所連接基因序列之轉錄，則其係功能連接至編碼基因序列。通常但不一定，功能連接之DNA序列係鄰接的，且在必要時聯結兩個多肽編碼區或在分泌信號肽之情形下係鄰接的且在閱讀框中。然而，儘管可操作連接之啟動子通常位於上游或可操作連接之終止子通常位於編碼序列之下游，但不一定與該編碼序列鄰接。增強子並非必須鄰接，只要其增加編碼序列之轉錄即可。為此，其可位於編碼序列之上游或下游且甚至可相距某一距離。若多腺苷酸化位點位於編碼序列之3´末端，則多腺苷酸化位點可操作連接至編碼序列，使得轉錄經由編碼序列繼續進行至多腺苷酸化信號中。連接係藉由業內已知之重組方法來實現，例如藉由在適宜限制位點或鈍端處連接或藉由使用融合PCR方法實現。若不存在適宜限制位點，則可根據習用實踐使用合成寡核苷酸連接體或適配體。 因此，術語啟動子序列之「功能片段或衍生物「意指，片段或衍生物仍實現啟動子活性。如何評價啟動子活性之功能分析為熟習此項技術者熟知(Bustin, S. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25(2): 169-193；Nolan, T. Rebecca E Hands, R.E.及Bustin S.A. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols 1: 1559-1582)。此一功能分析之實例性實施例包括(例如)啟動子動力學實驗。將感染攜載表現盒(其中啟動子或其片段引導報告基因轉基因之轉錄)之載體病毒之細胞培育不同時間。自在感染後不同時間收集之試樣製備總RNA。在藉由DNAse I消化破壞污染DNA之後，RNA發生逆轉錄。在添加反轉錄酶(RT)下處理一個複製試樣，在不添加RT下處理第二複製物以便展示污染DNA自RNA製備物之成功去除。純化所得cDNA且使用其作為習用PCR中之模板。僅在添加RT下處理之試樣應產生PCR產物。然後可將該等cDNA用於利用報導基因轉基因之引子之qPCR及利用病毒載體之必需基因(內部標準基因，其轉錄提供感染及複製之效率之內部標準)之引子之qPCR。使用內部標準基因之qPCR值正規化不同構築體與感染後時間之間之報導基因之qPCR值。此容許詮釋不同啟動子及其片段之啟動子活性。 如本文所用「序列同源性」係指測定兩個序列之相關性之方法。為測定序列同源性，最佳地比對兩個或更多個序列，且視需要引入空位。然而，與「序列一致性」相反，在測定序列同源性時，保守胺基酸取代可視為匹配。換言之，為獲得與參考序列具有95%序列同源性之多肽或多核苷酸，參考序列中之85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%之胺基酸殘基或核苷酸必須匹配或包含另一胺基酸或核苷酸之保守取代，或可將佔參考序列中之總胺基酸殘基或核苷酸(不包括保守取代)之最高15%、較佳地最高10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之數量的胺基酸或核苷酸插入參考序列中。較佳地，同系物序列包含至少50、甚至更佳地100、甚至更佳地250、甚至更佳地500個核苷酸之延伸體。 業內已知之「序列一致性」係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列、亦即參考序列與擬與參考序列進行比較之給定序列之間之關係。藉由在將序列最佳地比對以產生最高序列相似性程度之後比較給定序列與參考序列來測定序列一致性，如藉由該等序列串之間之匹配所測定。在該比對時，基於逐個位置來確定序列一致性，舉例而言，若在一個位置處核苷酸或胺基酸殘基一致，則該等序列在該位置處「一致」。然後將該等位置一致性之總數除以參考序列中之核苷酸或殘基之總數以得到序列一致性%。序列一致性可易於藉由已知方法來計算，包括(但不限於)闡述於以下文獻中之彼等：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.編輯，Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編輯，Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.及Griffin, H. G.編輯，Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編輯，M. Stockton Press, New York (1991)；及Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)，其教示內容以引用方式併入本文中。設計用於測定序列一致性之較佳方法以得到所測試序列之間之最大匹配。將測定序列一致性之方法編成測定給定序列間之序列一致性之公開獲得之電腦程式。該等程式之實例包括(但不限於) GCG程式包裝(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)。BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual, Altschul, S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)，其教示內容以引用方式併入本文中)。該等程式最佳地使用默認空位權重比對序列以便在給定序列與參考序列之間產生最高序列一致性程度。作為闡釋，對於多核苷酸具有與參考核苷酸序列具有至少(例如) 85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%「序列一致性」之核苷酸序列而言，預計給定多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，只是給定多核苷酸序列可包括最多15、較佳地最多10、甚至更佳地最多5個點突變/參考核苷酸序列之100個核苷酸。換言之，在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%一致性之核苷酸序列之多核苷酸中，參考序列中最高15%、較佳地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中全部核苷酸中最高15%、較佳地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%數量之核苷酸可插入參考序列中。參考序列之該等突變可發生在參考核苷酸序列之5’或3’末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各核苷酸之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。類似地，對於多肽具有與參考胺基酸序列具有至少(例如) 85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定胺基酸序列而言，預計多肽之給定胺基酸序列與參考序列一致，只是給定多肽序列可包含最高15、較佳地最高10、9、8、7、6、甚至更佳地最高5、4、3、2、1個胺基酸改變/參考胺基酸序列之100個胺基酸。換言之，為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%、較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定多肽序列，參考序列中最高15%、較佳地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代，或可將佔參考序列中之總胺基酸殘基數之最高15%、較佳地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%之數量的胺基酸插入參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。然而，在測定序列一致性時，並不包括保守取代作為匹配。 術語「序列一致性」或「一致性百分比」在本文中可互換使用。出於本發明目的，在本文中應明確，為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，出於最佳對比目的對比該等序列(舉例而言，可將空位引入第一胺基酸或核酸之序列中以用於與第二胺基或核酸序列進行最佳對比)。然後比較相應胺基酸或核苷酸位置之胺基酸或核苷酸殘基。在第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同之胺基酸或核苷酸殘基佔據時，則該等分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性%係該等序列所共用之一致位置數之函數(亦即，一致性% =一致位置數/總位置(亦即重疊位置)數×100)。較佳地，兩個序列具有相同長度。 可在兩個所比較序列之整個長度中或在兩個序列之片段中實施序列比較。通常，在兩個所比較序列之全長中實施比較。然而，可在(例如) 20、50、100或更多個鄰接胺基酸殘基之區中實施序列一致性。 熟習此項技術者應知曉，實際上可利用若干不同電腦程式來測定兩個序列之間之同源性。舉例而言，兩個序列之間之序列比較及一致性百分比之測定可使用數學算法來實現。在較佳實施例中，使用Needleman及Wunsch (J. Mol.Biol. (48): 444-453 (1970))算法(其已納入Accelrys GCG軟體包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/處獲得)中之GAP程式中)、使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6)來測定兩個胺基酸或核酸序列之間之百分比一致性。熟習此項技術者應瞭解，所有該等不同參數將產生略微不同之結果，但在使用不同算法時兩個序列之整體百分比一致性並不顯著改變。 可進一步使用本發明之蛋白質序列及核酸序列作為「詢問序列」來實施針對公共資料庫之檢索，以例如鑒定其他家族成員或相關序列。該等檢索可使用Altschul等人(1990) J. Mol.Biol. 215:403-10之BLASTN及BLASTP程式(2.0版)來實施。BLAST蛋白質檢索可使用BLASTP程式、評分=50、字長=3來實施，以獲得與本發明之蛋白質分子同源之胺基酸序列。25(17): 3389-3402。為獲得用於比較目的之空位化比對，可如Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402中所述利用空位化BLAST。在利用BLAST及空位化BLAST程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之默認參數。參見國家生物技術資訊中心之主頁http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
EHV-1 、 EHV-4 及 CAdV/ 重組型載體技術定義
術語「馬科動物」或「馬」(「equine」或「equin」)意指或屬馬科動物科，其包括馬、驢及斑馬，較佳地馬。。另外，術語「馬科動物」或「馬」(「equine」或「equin」)亦涵蓋馬科之成員之雜種(例如騾子、駃騠等)。 「疱疹病毒」或「疱疹病毒載體」係指係指疱疹病毒目疱疹病毒科中之物種。
。
術語「馬科動物疱疹病毒載體」或「馬科動物疱疹病毒」意指影響馬之疱疹病毒科之成員。迄今為止，已經鑑別了八種不同物種之馬科動物疱疹病毒，其中五種屬亞科α疱疹病毒(alphaherpesvirinae)亞科且三種屬丙型疱疹病毒亞科(gammaherpesvirinae)。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015年發佈EC 47, London, UK，2015年7月；電子郵件批准2016 (MSL #30) 術語「EHV-1」意指馬科動物疱疹病毒1，即疱疹病毒科之α疱疹病毒亞科屬中亞屬水痘病毒屬(
Varicellovirus
)之成員。EHV-1之非限制性參考序列可為(例如)野生型EHV-1毒株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)或RacH (Hübert, P. H., Birkenmaier, S., Rziha, H.-J.及Osterrieder, N. (1996), Alterations in the Equine Herpesvirus Type-1 (EHV-1) Strain RacH During Attenuation. Journal of Veterinary Medicine, 系列B, 43: 1–14)。 術語EHV-4意指馬科動物疱疹病毒4，即疱疹病毒科之α疱疹病毒亞科屬中亞屬水痘病毒屬之成員。 術語「CAdV」、「CAV」、「CAV-1」或「CAV-2」分別意指第1型或第2型犬腺病毒，腺病毒科中哺乳動物腺病毒屬(
Mastadenovirus
)之成員
。
然而，根據最新分類法(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015年發佈EC 47, London, UK, 2015年7月；電子郵件批准2016 (MSL編號30)，術語犬腺病毒(CAdV)現涵蓋兩個物種CAV-2及CAV-1。 「重組型CAdV載體」或「rCAdV」及/或「rCAdV載體」或「rCAdV」或「rCAdV2」係指包含至少一個編碼(例如)轉基因表現標記物(例如綠色螢光蛋白)之外源表現盒(即含有與啟動子、增強子及其他適宜調控元件可操作鏈接之編碼序列)且在較佳實施例中至少一個「所關注基因」及/或「所關注表位」之犬腺病毒。 可藉由熟習病毒學及分子生物學領域者已知之標準方法來產生rCAdV載體。然而，為有利於CAdV基因體之處理及載體之產生，本發明亦提供細菌穿梭載體，在一個非限制性實例中，含有編碼CAdV基因體之核酸之pBR322質體。另外，細菌人工染色體(「BAC」)亦可有利於細菌系統中CAdV之處理。
疫苗定義
「免疫原性或免疫組合物」係指包括至少一種抗原或其免疫原性部分之物質之組合物，其在宿主中引發細胞或抗體調介之對組合物之免疫反應的免疫學反應。 本文所用術語「抗原」在業內已眾所周知，且包括具有免疫原性之物質(亦即免疫原)以及誘導免疫學不反應性或無反應性(亦即身體之防禦機制對外來物質無反應)之物質。如本文所用術語「抗原」欲指含有或包含表位之全長蛋白質以及其肽片段。 如本文所用「免疫原性組合物」可指多肽或蛋白，例如引發本文所述免疫學反應之病毒表面蛋白。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指蛋白質或多肽之片段或截短及/或取代形式，其包括一或多個表位且由此引發本文所闡述之免疫學反應。一般而言，該等截短及/或取代之形式或片段將包含來自全長蛋白質之至少六個鄰接胺基酸。該等片段可使用任一數量之業內熟知之表位定位技術來鑑別。例如參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷(Glenn E. Morris編輯，1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。舉例而言，線性表位可藉由在固體載體上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白質分子之部分)且使肽與抗體反應同時肽仍附接至載體來測定。該等技術已為業內知曉及闡述，例如參見美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；及Geysen等人(1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類似地，藉由(例如)x射線結晶學及二維核磁共振且藉由測定胺基酸之空間構形來容易地鑑別構形表位。參見Epitope Mapping Protocols(見上文)。該定義內亦包括合成抗原，例如多表位、側接表位及其他重組或合成源抗原。例如參見Bergmann等人(1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann等人(1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol.75:402-408；及Gardner等人，(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998年6月28日至7月3日。(其教示及內容皆以引用方式併入本文中。) 本發明再進一步提供含有重組型CAdV病毒或載體及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑之「免疫原性組合物」或「疫苗組合物」。含有重組型CAdV病毒或載體(或其表現產物)之免疫原性組合物引發免疫學反應--局部或全身性。該反應可能(但不必需)具有保護性。疫苗組合物引發局部或全身性保護反應。因此，術語「免疫原性組合物」包括「疫苗組合物」 (在兩個前述術語可為保護性組合物時)。 如本文所用術語「疫苗」係指包含至少一種在動物中誘導免疫學反應之免疫學活性組分且可能但不一定包含一或多種增強活性組分之免疫學活性之額外組分的醫藥組合物。疫苗可另外包含醫藥組合物之其他典型組分。藉由區別，疫苗之免疫學活性組分可包含呈其原始形式之完整病毒粒子或所謂經修飾活疫苗(MLV)中之減毒粒子或藉由適當方法在所謂滅活疫苗(KV)中去活化之粒子。在另一形式中，疫苗之免疫學活性組分可包含生物體之適當元件(亞單位疫苗)，其中該等元件係藉由以下方式生成：藉由破壞整個粒子或含有該等粒子之生長培養物及視情況隨後之純化步驟以產生期望結構，或藉由合成方法，包括使用基於(例如)細菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種之適宜系統的適當處理加上視情況隨後之分離及純化程序，或藉由使用適宜醫藥組合物直接納入遺傳物質來誘導需要疫苗之動物中之合成過程(多核苷酸疫苗接種)。疫苗可包含一種或同時一種以上之上述元件。如在本發明之特定態樣中所使用，「疫苗」係指活疫苗或活病毒，亦稱為重組型疫苗。在本發明之另一特定態樣中，「疫苗」係指包括類病毒粒子(VLP)之去活化或滅活病毒。因此，疫苗可為亞單位疫苗或滅活(KV)或去活化疫苗。 「動物」意指哺乳動物、人類、鳥及諸如此類。動物可選自由以下組成之群：馬類(例如，馬(horse)、斑馬、驢)、犬(例如，狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼)、貓(例如，獅、老虎、家貓、野貓、其他大型貓科動物及其他貓(包括獵豹及山貓))、羊(例如，綿羊)、牛族(例如，牛、母牛、水牛)、豬(小豬)、禽(例如，雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀類、雀鷹、烏鴉、鴕鳥、鴯鶓及鶴鴕)、靈長類動物(例如，原猴、眼鏡猴、猴、長臂猿、人猿)及魚。術語「動物」亦包括所有發育階段之個別動物，包括胚胎及胎兒階段。術語「產食性動物」意指用於人類消費之非犬動物，例如牛、豬、馬、家禽、綿羊、魚及諸如此類，較佳產食性動物意指豬及牛，最佳豬。 非犬伴侶動物之實例包括貓物種。 為投與非犬動物，重組型CAdV提供在無產生性複製下表現之優點。犬腺病毒之複製限於犬物種且文獻中未報導在任何非犬物種(包括人)中造成產生性感染之CAdV2。此宿主限制為病毒傳遞至其他物種提供固有的安全性障壁且使得在獸醫應用中跨物種使用基於CAdV2之疫苗載體成為有吸引力的提議。因此，本發明包含藉由在宿主中投與或接種重組型CAdV2病毒或載體來擴增或表現蛋白質之方法，其中宿主不為犬或不為重組型病毒或載體之天然宿主，及/或在無產生性複製及/或具有有限複製週期下存在表現。 為投與犬動物，由於在狗中使用CAdV及尤其CAdV2作為牛痘毒株，故本發明提供用於引入其他所關注表位(例如，犬病原體或毒素之抗原)之方式。在rCAdV2載體中編碼之其他所關注表位之表現藉此提供藉由用牛痘重組型CAdV2對狗或小狗進行接種來引發對彼等所關注表位以及犬腺病毒之活體內反應的方式。其他所關注表位可為犬病原體(除腺病毒以外)之抗原，來自犬病原體(除腺病毒以外)之抗原(在狗或小狗中引發對犬病原體(除腺病毒以外)之反應之另一抗原)，或來自在狗或小狗中引發對犬病原體(除腺病毒以外)之反應之另一抗原。 因此，本發明提供重組型CAdV2可含有編碼來自犬病原體實例：狂犬病病毒、犬疱疹病毒、犬瘟熱病毒、犬小病毒等之任一抗原之所關注表位之異源DNA。本發明之實施例包括含有編碼一種以上蛋白質(例如，編碼兩種或更多種表位(例如犬病原體之抗原))之外源DNA之CAdV重組型。本發明亦設想含有CAdV重組型與其他抗原之組合之組合物。 為投與非犬動物，本發明提供引入所關注表位之方式，其中，所關注抗原性表位係源於諸如選自以下牛病原體之彼等之產食性動物病原體之抗原：牛病毒腹瀉病毒(BVDV)、副流行性感冒3病毒(PI-3)、傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)、牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛疱疹病毒(BHV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛腸病毒(BEV)、牛冠狀病毒(BCV)、牛狂犬病病毒(BR)、牛小病毒(BPV)、腺病毒星狀病毒、溶血性曼哈米亞桿菌(先前稱為溶血性巴氏桿菌)、敗血性巴氏桿菌、睡眠嗜血桿菌(綿羊嗜組織菌及阿古尼嗜血桿菌)、放線菌屬(棒狀桿菌屬)、化膿性放線菌、鸚鵡披衣菌、性病胚胎彎曲桿菌及胚胎胚胎彎曲桿菌(先前稱為腸道胚胎彎曲桿菌)、問號鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波蒙納鉤端螺旋體及感冒傷寒型鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體(哈德焦普拉基特諾鉤端螺旋體及牛哈德焦鉤端螺旋體)、流產布氏桿菌、豬布氏桿菌及地中海熱布氏桿菌、單核球增多性李氏菌、鸚鵡披衣菌、氣腫疽梭菌、敗血性梭菌、溶血性梭菌、諾維氏梭菌、索氏梭菌、產氣莢膜梭菌、破傷風性梭菌、牛莫拉菌、克雷伯氏菌屬、克雷伯氏肺炎菌、鼠傷寒沙門桿菌；新港沙門桿菌、鳥副結核分枝桿菌屬、小隱胞子蟲、人隱胞子蟲、金黃色葡萄球菌、壞乳鏈球菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、黴漿菌屬、牛黴漿菌、及尿素黴漿菌屬、胎兒三毛滴蟲、疣狀髮癬菌、鬚髮癬菌、沙凱斯維髮癬菌、犬新孢子蟲(先前稱為弓蟲)、雙芽巴貝蟲及牛巴貝蟲、牛肺蟲(肺蟲病)及其組合。為投與非犬動物，本發明提供引入所關注表位之方式，其中所關注抗原性表位係源於產食性動物病原體之抗原，例如選自豬病原體之群之彼等：沙門桿菌屬，具體而言鼠傷寒沙門桿菌、豬霍亂沙門桿菌；星狀病毒；輪狀病毒；可傳播胃腸炎病毒；短螺旋體屬，具體而言豬痢疾短螺旋體、多毛短螺旋體；梭菌屬，具體而言難養梭菌、A型、B型及C型產氣莢膜梭菌、諾維氏梭菌、敗血性梭菌、破傷風性梭菌；豬腸道小核糖核酸病毒；豬腸道杯狀病毒；呼吸道病原體，其包括：胸膜肺炎放線桿菌；支氣管敗血性博德氏菌；豬丹毒桿菌；副豬嗜血桿菌，具體而言亞型1、7及14；巴氏桿菌屬，具體而言多殺性巴氏桿菌；黴漿菌屬，具體而言豬肺炎黴漿菌、豬鼻黴漿菌；豬流行性感冒A病毒；PRRS病毒；豬環狀病毒；豬小病毒；偽狂犬病病毒；豬附紅血球體、分枝桿菌屬，具體而言鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、牛分枝桿菌；豬呼吸道冠狀病毒；豬冠狀病毒，具體而言TGEV、PEDV及德爾塔冠狀病毒；化膿性隱秘桿菌；豬腺病毒；古典豬瘟；豬巨細胞病毒；非洲豬瘟；或其他病原體，其包括大腸桿菌、鏈球菌屬，具體而言豬鏈球菌、豚鏈球菌、壞乳鏈球菌，較佳類馬鏈球菌亞屬；豬布氏桿菌，具體而言生物變型1、2及3；鉤端螺旋體屬，具體而言澳洲鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒性鉤端螺旋體、波蒙納鉤端螺旋體、出血黃疸性鉤端螺旋體、問號鉤端螺旋體、塔拉索夫鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、塞諾鉤端螺旋體；腦心肌炎病毒；血球凝集性腦脊髓炎病毒；日本腦炎病毒；西尼羅病毒；裡奧病毒；德國麻疹病毒屬；梅南高病毒；立百病毒；水皰性口炎病毒；豬水疱疹病毒；豬痘病毒；豬疱疹病毒；及豬葡萄球菌及其組合。 術語「DNA疫苗接種」或「多核苷酸疫苗接種」意指使用適宜醫藥組合物直接接種遺傳物質。 去活化之各種物理及化學方法為業內已知。術語「去活化」係指先前有毒或無毒之病毒或細菌經輻照(紫外線(UV)、X射線、電子束或γ輻射)、加熱或化學處理使該病毒或細菌去活化或殺死該病毒，同時保留其免疫原性。適宜失活劑包括β-丙內酯、二元或β-或乙醯基-次乙亞胺、戊二醛、臭氧及福馬林(formalin) (甲醛)。 對於藉由福馬林或甲醛去活化，通常將甲醛與水及甲醇混合以產生福馬林。添加甲醇可防止去活化過程中之降解或交叉反應。一個實施例使用約0.1%至1%之37%甲醛溶液來將病毒或細菌去活化。至關重要的是，調節福馬林之量以確保材料去活化，但不會多至發生高劑量之副效應。 更具體而言，術語「去活化」在病毒之情況下意味著病毒在活體內或活體外無法複製，且分別地，術語「去活化」在細菌之情況下意味著細菌在活體內或活體外無法再生。舉例而言，術語「去活化」可指已經在活體外繁殖且然後使用化學或物理方式將其去活化以使其不再能夠複製之病毒。在另一實例中，術語「去活化」可指細菌已繁殖且然後使用化學或物理方式進行去活化，從而產生細菌、細菌之片段或組分之懸浮液(例如產生可用作疫苗組分之細菌)。 如本文所用，術語「去活化」、「滅活」或「KV」可互換使用。 術語「活疫苗」係指包含活的生物體或複製勝任型病毒或病毒載體之疫苗。 「醫藥組合物」基本上由一或多種能夠改變其所投與之生物體或生物體中或上面存活之生物體之生理學(例如免疫學)功能之成分組成。該術語包括(但不限於)抗生素或抗寄生蟲劑以及通常用於實現某些其他目的(例如但不限於處理性狀、不孕性、穩定性、經腸或非經腸途徑(例如經口、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、皮內或其他適宜途徑)投與組合物之可行性、投與後耐受性或受控釋放性質)之其他成分。此一醫藥組合物之一個非限制性實例僅僅係用於展示目的給出，可如下所述來製備：將經感染細胞培養物之細胞培養物上清液與穩定劑(例如亞精胺及/或牛血清白蛋白(BSA))混合且隨後將混合物藉由其他方法進行凍乾或去水。在疫苗接種之前，然後將混合物在水溶液(例如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))或非水溶液(例如油乳液、基於鋁之佐劑)中再水化。 對於基於重組型病毒載體之疫苗，投與途徑可有利地為SC、IM、TD或ID。此投與可藉由帶針注射器或利用無針儀器進行。本發明之實施例可經口、經鼻骨間、經肛門、經陰道、經口、經胃內、非經腸、經皮下、經皮內、經肌內或經靜脈內投與。本發明組合物之實例包括用於經孔投與(例如，經口、經鼻、經肛門、經引導、經口、經胃內等投與)之液體製劑，例如懸浮液、糖漿或酏劑；及用於非經腸、經皮下、經皮內、經肌內或經靜脈內投與(例如，可注射投與)之製劑，例如無菌懸浮液或乳液。在該等組合物中，可將重組型CAdV2及/或抗原與適宜載劑、稀釋劑或賦形劑(例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖或諸如此類)混合。亦可將該等組合物凍乾。該等組合物可含有輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、佐劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、矯味劑、顏料及諸如此類，此端視投與途徑及期望製劑而定。 在一個態樣中，本發明係關於疫苗策略，該疫苗策略係基於「初免-加強」投與方案，其中初免-投與及加強-投與利用包含醫藥或獸醫上可接受之賦形劑、稀釋劑、佐劑或媒劑及本發明重組型CAdV之組合物。 初免-加強方案包含使用至少一種公用抗原及/或其變體或片段之至少一次初免投與及至少一次加強投與。初免投與中所用疫苗之性質與用作稍後加強疫苗之彼等可能不同。應進一步注意初免投與及加強投與可包含本發明之重組型CAdV。初免投與可包含一或多次投與。類似地，加強投與可包含一或多次投與。 本發明之另一態樣係關於用於根據本發明進行初免-加強疫苗接種之套組。該套組可包含至少兩個小瓶：第一小瓶，其含有用於根據本發明進行初免疫苗接種之疫苗，及第二小瓶，其含有用於根據本發明進行加強疫苗接種之疫苗。該套組可有利地含有其他用於進行其他初免疫苗接種或其他加強疫苗接種之第一或第二小瓶。 在一個實施例中，該套組可包含兩個小瓶，一個含有用於根據本發明進行初免疫苗接種之基於質體之疫苗，另一小瓶含有用於根據本發明進行加強疫苗接種之基於重組型病毒載體之疫苗。 如本文中所使用，「醫藥上或獸醫上可接受之載劑」包括任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。在一些較佳實施例及尤其包括凍乾之免疫原性組合物之彼等中，用於本發明之穩定劑包含用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。 在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。本文所用「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL)、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。具體而言，乳液可基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)型)；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(具體而言異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；酸或含有直鏈烷基之醇之酯，更具體而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，具體而言異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子表面活性劑，特定而言係以下之酯：山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸(其視情況經乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, 第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570 (1997)。實例性佐劑係由M. Powell及M. Newman編輯之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，Plenum Press, 1995之第147頁上闡述之SPT乳液及同一本書第183頁上闡述之乳液MF59。 佐劑之另一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸尤其與醣或多元醇之聚烯基醚交聯之聚合物。該等化合物以術語卡波姆(carbomer)為人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參照美國專利第2,909,462號，其闡述與具有至少3個、較佳地不超過8個羥基之多羥基化化合物交聯之該等丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團替代。較佳基團係含有2至4個碳原子之基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團可自身含有其他取代基，例如甲基。以名稱CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, USA)銷售之產品尤其適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳係使用CARBOPOL® 971P。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，尤其係共聚物EMA (Monsanto)，其係馬來酸酐與乙烯之共聚物。該等聚合物在水中之溶解產生酸性溶液，其將被中和、較佳地中和至生理pH以產生將引入免疫原性、免疫學或疫苗組合物本身之佐劑溶液。 其他適宜佐劑包括(但不限於)尤其RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(重組或其他)之熱不穩定腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽或其天然或重組細胞介素或其類似物或內源細胞介素釋放之刺激劑等。 預計佐劑可以每劑量約100 μg至約10 mg之量、較佳地以每劑量約100 μg至約10 mg之量、更佳地以每劑量約500 μg至約5 mg之量、甚至更佳地以每劑量約750 µg至約2.5 mg之劑量及最佳地以每劑量約1 mg之量添加。或者，以最終產物之體積計，佐劑可為約0.01%至50%之濃度，較佳為約2%至30%之濃度，更佳為約5%至25%之濃度，仍更佳為約7%至22%之濃度，且最佳為10%至20%之濃度。 「稀釋劑」可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。 「分離」意指自其天然狀態由「人手」改變，亦即若其在自然界中存在，則其已經改變或自其初始環境中取出，或兩者兼而有之。舉例而言，天然存在於活生物體中之多核苷酸或多肽並非「分離的」，但自其天然狀態之共存物質分離之相同多核苷酸或多肽係「分離的」，如本文所用之術語。 「減毒」意指降低病原體之毒性。在本發明中，「減毒」與「無毒」同義。在本發明中，減毒病毒係毒性已降低從而不會引起感染之臨床體徵但能夠在目標哺乳動物中誘導免疫反應者，但亦可指與感染非減毒病毒或病原體且未接受減毒病毒之動物之「對照組」相比在感染減毒病毒、尤其所主張之CAdV病毒載體之動物中臨床體徵之發生率或嚴重程度有所降低。在此上下文中，術語「降低(reduce/reduced)」意指與如上文所定義之對照組相比降低至少10%、較佳地25%、甚至更佳地50%、再更佳地60%、甚至更佳地70%、再更佳地80%、甚至更佳地90%且最佳地100%。因此，減毒之無毒病原體(例如所主張之減毒之病毒載體、尤其所主張之CAdV病毒載體)適於產生經修飾之活疫苗(MLV)或經修飾之活免疫原性組合物。 在本文中，「有效劑量」意指(但不限於)引起或能夠引發免疫反應且使得投與抗原之動物減少臨床症狀之量。 如本文中所使用，術語「有效量」在組合物之情況中意指能夠誘導免疫反應且降低或減輕動物中疾病之感染或事件之發生率或嚴重程度的免疫原性組合物的量。特別地，有效量係指每劑量之菌落形成單位(CFU)。或者，在療法之情況中，術語「有效量」係指足以減輕或改善疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重程度或持續時間、防止疾病或病症進展、引起疾病或病症消退、防止與疾病或病症相關之一或多種症狀之復發、發展、發作或進展，或增強或改良另一療法或治療劑之預防或治療之量。 「免疫反應」或「免疫學反應」意指(但不限於)對所關注之(免疫原性)組合物或疫苗發生細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，免疫或免疫學反應包括(但不限於)以下效應中之一或多者：產生或活化特異性針對所關注組合物或疫苗中所包含之一或多種抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，宿主將顯示治療性或保護性免疫學(記憶)反應，從而對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度降低。該保護將藉由症狀數量之減少、症狀嚴重程度之降低或無與病原體感染相關之一或多種症狀、病毒血症發作之延遲、病毒持久性降低、整體病毒負荷降低及/或病毒排出降低來證明。因此，本發明亦提供一種在宿主脊椎動物中「誘導免疫學反應」之方法，該方法包含向宿主投與包含重組型CAdV病毒或載體及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑之免疫原性或疫苗組合物。 「抵抗疾病」、「保護性免疫性」、「功能免疫性」、「臨床症狀之減少」、「誘導免疫學反應」、「中和抗體之誘導/產生及/或血清轉化」及類似片語意指抵抗抗原之抗體產生，及/或藉由投與本發明之一或多種治療性組合物或其組合而產生之針對疾病或病況之部分或完全反應，其導致較已暴露於疾病或感染之未經免疫個體所預計更不有害的效應。亦即，在接種疫苗之個體中，感染之有害效應之嚴重程度減輕。在接種疫苗之個體中，感染可經降低、減緩或可能完全預防。在本文中，若意指完全預防感染，則對其進行具體陳述。若未陳述完全預防，則該術語包括部分預防。 在本文中，「臨床體徵之發生率及/或嚴重程度之降低」或「臨床症狀之減少」意指(但不限於)與野生型感染相比，減少組中感染個體之數量、減少或消除展現感染之臨床體徵之個體之數量或降低一或多名個體中存在之任何臨床體徵之嚴重程度。舉例而言，其應指病原體負荷之任何減少、病原體脫落、病原體傳播減少或瘧疾之症狀之任何臨床體徵減少。較佳地，與未接受組合物且被感染之個體相比，接受本發明之治療性組合物之一或多名個體之該等臨床體徵降低至少10%。更佳地，接受本發明組合物之個體之臨床體徵減少至少20%、較佳地至少30%、更佳地至少40%且甚至更佳地至少50%。 術語「增加之保護」在本文中意指(但不限於)相對於未經疫苗接種之個體對照組，經疫苗接種之個體組之一或多種與由傳染原感染有關之臨床症狀在統計學上顯著減輕。術語「臨床症狀之統計學顯著減輕」意指(但不限於)經疫苗接種之個體組之至少一種臨床症狀的發生頻率較在攻擊傳染原後未經疫苗接種之對照組中低至少10%、較佳地20%、更佳地30%、甚至更佳地50%且甚至更佳地70%。 「長效保護」應指持續至少3週、但更佳地至少3個月、再更佳地至少6個月之改良之效能。在牲畜之情形下，最佳地，長效保護應持續直至動物出售用於肉類之平均年齡。 術語由病毒誘導之「病毒血症之降低」意指(但不限於)進入動物血流之病毒之降低，其中與未接受本發明組合物且可變得感染之動物相比，在接受該組合物之動物之血清中病毒血症程度(亦即病毒DNA或RNA拷貝之數量/mL血清或形成群落之噬斑之數量/公合血清)降低至少50%。更佳地，接受本發明組合物之動物之病毒血症程度降低至少90%、較佳地至少99.9%、更佳地至少99.99%且甚至更佳地至少99.999%。 如本文所用術語「病毒血症」具體地應理解為其中病毒粒子在動物、具體而言哺乳動物、鳥或昆蟲之血流中再生且循環之病況。 「安全性」係指在疫苗接種後，在經疫苗接種之動物中不存在不良後果，包括(但不限於)：基於細菌之疫苗潛在地逆轉成有毒、臨床上顯著之副效應，例如持久性、全身性疾病或在疫苗投與位點不可接受之發炎。 本文所用之術語「疫苗接種(vaccination或vaccinating)」或其變化形式意指(但不限於)包括投與本發明之免疫原性組合物之過程，在投與動物時，其引發或能夠引發(直接或間接)該動物之免疫反應。 在本發明之上下文中，「死亡率」係指由感染引起之死亡，且包括感染如此嚴重以致於將動物安樂死以防止痛苦並為其生命提供人道結局之情況。
調配物
投與組合物之個體較佳為動物，包括(但不限於)牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠及大鼠，最佳地哺乳動物係豬。 本發明之調配物包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。疫苗包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。調配物應適合投與方式。 免疫原性組合物(若需要)亦可含有極少量之潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉劑。口服調配物可包括標準載劑，例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。 較佳投與途徑包括(但不限於)鼻內、經口、皮內及肌內。期望在飲用水中、最佳以單一劑量投與。熟習此項技術者將認識到，本發明組合物亦可以一個、兩個或更多個劑量藉由其他投與途徑來投與。舉例而言，該等其他途徑包括皮下、皮內、腹膜內、皮內，且根據治療之期望持續時間及有效性，本發明組合物可以(例如)每日計一次或若干次、亦間歇地以不同劑量(例如約10
3
至10
8
TCID50 (參見上述病毒效價))投與若干天、若干週或若干月。在本發明之特定態樣中，劑量為約10
3
至10
8
TCID50，尤其對於活病毒/活疫苗而言。 若期望，該等組合物可存在於可含有一或多個含有活性成分之單位劑型之包裝或分配器裝置中。包裝可包含(例如)金屬或塑膠箔，例如泡罩包。包裝或分配器裝置可伴以投與、較佳投與哺乳動物、尤其豬之說明書。與該等容器相關的可為呈由調控醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之通知，該通知反映該機構對針對人類投與之製造、使用或銷售之批准。
序列綜述：
在本發明中特此詳述並揭示以下序列： 表1：
實例 本發明包括以下實例以展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表本發明者發現在實踐本發明中運行良好之技術，且因此可認為構成本發明實踐之較佳模式。然而，熟習此項技術者借助於本揭示內容應瞭解，可對所揭示特定實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。
實例 1 ： CAdV 病毒分離
CAdV2病毒最初係自患有喉氣管炎之狗之咽喉拭子分離且係在美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection；ATCC)MDCK細胞系CCL-34中作為第一次傳代獲得。在獲取之後使病毒傳代8次，且對第8次傳代進行等分且將其指定為種原病毒原(Master Seed Virus)。儲備CAdV-2種原病毒係Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.以參考基準CAdV-2、MSV批號001-dil、F: 11-24-98下產生。儲備CAdV-2種原病毒與Toronto毒株(基因庫登錄號U77082.1)密切相關。CAdV-2係以犬疫苗自Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.購得。 具感染力的純系DNA係整個CAdV-2基因體，該基因體經選殖至pBR322低拷貝大腸桿菌穿梭載體中。採用同源重組方法(Kremer, E.J.等人，Canine adenovirus vectors: an alternative for adenovirus-mediated gene transfer.J Virol, 2000. 74(1)：第505-12頁)來構築具感染力純系DNA。自儲備CAdV-2 MLV純化CAdV-2 DNA並將其在BJ5183大腸桿菌中與含有與CAdV-2反向末端重複同源之DNA的基於pBR322之載體重組。 圖1係代表完整具感染力純系DNA，馬-達二氏犬腎(Madine Darby canine kidney；MDCK)細胞經以線性化具感染力純系DNA轉染後可拯救CAdV-2。
實例 2 ： E3 缺失之插入 CADV 純系之生成
已成功地利用CAdV-2作為載體病毒疫苗用於動物。已知CAdV-2之E3結構域為非必需的(在組織培養物中病毒複製皆不需要E3開放閱讀框(open reading frames；ORF)(Fisher等人2002))，且以插入異源DNA而言是為合理性的靶標。 其中轉基因定位至E3結構域之基於CAdV-2之有效疫苗之實例包括犬瘟熱病毒(Fisher等人2002)、貓泛白血球減少症病毒(Yang等人2008)及貓(Hu等人，2007)、狗(Hu等人，2006)、小鼠(Li等人，2006)、浣熊、豬(Lui等人，2008)、臭鼬(Henderson等人，2009)及綿羊(Bouet-Cararo等人，2011)之狂犬病病毒。 圖2係CAdV-2之E3區之組織之示意圖。4146 bp NruI (bp 23932)/SalI (bp 28078)限制內核酸酶片段係利用顯示為H-A蛋白VIII、ORF1、ORF2及U外顯子之開放閱讀框(ORF)來闡釋。對於此DNA片段顯示了選擇性限制內核酸酶位點(NruI、DraIII、SspI及SalI)之位置且編號係相對於CAdV-2之密切相關之Toronto毒株(基因庫登錄號U77082.1)。 如Fischer等人(2002)所述，E3區之基因體組織在不同腺病毒之間僅寬鬆性地保守(Linne, T., Differences in the E3 regions of the canine adenovirus type 1 and type 2. Virus Res, 1992. 23(1-2):第119-33頁)，且因此，CAdV2 E3區非必需基因座之精確限制無法自其他病毒中之E3插入位點轉位。在第一構築體中，來自E3之整個ORF1及ORF2 DNA區段經缺失以最大化轉基因插入物之大小，然而具感染力純系DNA未能有利於rCAdV-2之拯救。發現此策略無意中缺失了延伸至5’ E3側翼DNA中之E3 ORF1 (不同閱讀框)中之六聯體相關蛋白VIII基因(H-A-PVIII)之最後五個密碼子(包括終止密碼子)，從而產生具有實質3’延伸之H-A PVIII基因(產生具有5個胺基酸缺失但隨後實質c末端添加之H-A PVIII)。 因此，重新設計了轉移質體，使得5’及3’ E3側接DNA含有E3 ORF1的前183 bp及ORF2的後47 bp，發現該等對於rCAdV-2拯救係足夠的。
實例 3 ： 用於生成 RCADV-2 具感染力純系 DNA 之同源重組
使用Rec+ BJ5183大腸桿菌中在線性化CAdV-2具感染力純系DNA與靶向E3之CAdV-2轉移質體/片段之間之同源重組(基於文獻中由Chartier等人(1996)及Kremer等人(2000)所闡述之方法)來生成具有定位至E3結構域之轉基因表現盒之rCAdV-2。如圖3中所闡釋，在E3結構域中含有獨特限制位點之具感染力純系與含有在轉基因表現盒之5’及3’之約500bp之CAdV-2側接DNA的轉移片段重組，以a)將轉基因表現盒靶向E3區且b)有效地缺失E3之所選部分。 自使用轉基因特異性PCR篩選鑑別之經擴增BJ5183純系分離DNA，並藉由瓊脂醣凝膠電泳來解析該等DNA以證實其在23.1Kb下或＞23.1Kb之遷移(成功HR產生約35kb之DNA物質，該DNA物質在0.7%瓊脂醣凝膠上作為超螺旋DNA類似於23.1 kb標記物遷移)。然後在Stbl2或XL-10 Gold大腸桿菌中轉變並擴增該等DNA用於更大規模的純化及使用，以在哺乳動物細胞中生成rCAdV-2。 圖3係NruI/SalI線性化具感染力純系DNA (天然CAdV-2序列)與涵蓋上述E3缺失及位於E3之剩餘部分間之一或多個獨特限制位點(指定MCS用於多選殖位點)之靶向E3之CAdV-2轉移片段之間的同源重組的示意性闡釋。具感染力純系DNA分別與左側及右側反向末端重複LITR及RITR鄰接。
實例 4 ： ∆E3 rCAdV-2 具感染力純系 DNA 之生成 E3 缺失之 rCAdV-2 ： ∆E3A 及 ∆E3B
使用重疊延伸PCR來生成編碼所選E3缺失及5’及3’側接序列之約500個鹼基之靶向E3之CAdV-2轉移片段，以有利於BJ5183大腸桿菌中之靶向同源重組(HR)(參見示意圖圖4及圖5)。如圖5A及B中所顯示，在「A」缺失(
∆
E3A)中，除E3 ORF1的前186個核苷酸及ORF2的後301個核苷酸以外的所有核苷酸皆缺失，而對於E3 「B」缺失(
∆
E3B)，保留了E3 ORF1之186個核苷酸及ORF2之83個核苷酸(對於5’及3’側翼參見SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。 具有
∆
E3A及
∆
E3B缺失之具感染力純系自經轉染MDCK及E1B-MDCK細胞成功地拯救，顯示特定的E3缺失支持病毒拯救。由於
∆
E3B構形涵蓋較大E3缺失，故其成為生成向前移動之攜載轉基因表現盒之rCAdV-2之選擇的設計。此較大缺失指示幾乎所有的E3區(例如，約82%之E3區)皆可缺失而不會不利地影響病毒拯救。
實例 5 ： E3 缺失 / 插入之構築 具有 CMV 啟動子之表現盒 HCMV-IE 及 CMV5 啟動子之生成：
藉由如先前所闡述之PCR使用引子對hCMV-IE 5’F (SEQ.ID NO:5) (5'- TTATTAATAGTAATCAATTACGGGG -3')/ hCMV-IE 3’ R (SEQ.ID NO:6) (5'- GCCACCGTACACGCCTACCGCCC -3')及BAC DNA EHV-gG (10 ng) (作為模板)來實施人類巨細胞病毒立即早期啟動子(hCMV-IE)(SEQ ID NO:3)之3'末端之擴增。隨後將所得DNA片段選殖至pCR™BluntII TOPO®載體(ThermoFisher Scientific)中並藉由利用限制酶Kpn-1及BamH-1消化進行切除，並進一步選殖至基於pUC18之質體穿梭載體中，用於進一步處理及構築CAdV轉移質體。使用分別具有5’- 3’ Spe-1及BamH-1限制位點之GENSCRIPT®基因合成產物來合成人類CMV5啟動子(SEQ ID NO:4)，並將其選殖至pUC57大腸桿菌穿梭載體中用於進一步處理及構築CAdV轉移質體。
CMVIE 及 CMV5 啟動子活性之比較：
文獻中之報導已顯示與CMVie啟動子相比，來自由CMV5啟動子驅動之哺乳動物轉基因表現盒之蛋白質表現更加穩健。CMV5啟動子與CMVie啟動子之不同之處在於其在CMVie轉錄開始位點之下游含有編碼具有由剪接供體及受體位點框入之腺病毒主要晚期增強子之5型人類腺病毒(HuAd5)腺病毒三聯前導序列之約560bp DNA(Massie等人，1995, Improved adenovirus vector provides herpes simplex virus ribonucleotide reductase R1 and R2 subunits very efficiently. Nature Biotechnology 13:602-608)。CMV5啟動子之使用顯示顯著增加293細胞中之蛋白質表現(Massie等人，1998, Inducible overexpression of a toxic protein by an adenovirus vector with a tetracycline-regulatable expression cassette. Journal of Virology 72 (3):2289-2296)。 與該等報導一致，藉由瞬時轉染含有CPV VP2之表現質體自由CMVie或CMV5驅動之盒之蛋白質表現的直接比較，展示與CMVie啟動子相比，自由CMV5驅動之哺乳動物轉基因表現盒之蛋白質表現更加穩健。如圖7中所顯示，藉由量化藉由自表現構築體瞬時表現之CPV VP2表現(如在經轉染MDCK細胞中藉由IFA所檢測)來實施啟動子強度之分析。在圖A中：顯示經由CMVie或CMV5啟動子驅動之CPV VP2表現質體轉染之MDCK細胞之CPV IFA。圖B：係經由CMVie或CMV5啟動子驅動之CPV VP2表現質體轉染之MDCK細胞之CPV VP2 ELISA之直方圖。圖C：係經由如所指示之CMVie或CMV5啟動子驅動之CPV VP2表現質體轉染之CPV VP2陽性MDCK細胞之Molecular Devices ImageXpress MicroXL量化之直方圖。結果指示，CMV5啟動子可指導轉基因之穩健表現，且自CMV5之表現在光學密度IFA及FITC陽性MDCK細胞之相對數量二者方面大於CMVie啟動子。因此，選擇CMV5啟動子來驅動CAdV-2表現盒之轉錄。然而，含有CMV5啟動子之rCAdV-2具感染力純系皆未引起rCAdV-2之拯救。 如表2中所顯示，儘管CMV5驅動VP2轉基因之穩健瞬時表現，但含有CMV5啟動子之rCAdV-2具感染力純系皆未引起rCAdV-2之拯救。 為直接解決CMV5啟動子序列是否可干擾rCAdV-2拯救，將含有CMV5啟動子、多選殖位點(MCS)及猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化(polyA)序列之DNA片段整合至CAdV-2基因體之E3區中。選殖至ΔE3B中之DNA之所有組分(DNA中將CMV5與CMVie區分開之約560bp(及MCS)除外)皆為先前拯救之rCAdV-2病毒之一部分。對拯救之嘗試係不成功的，此強烈表明CMV5啟動子干擾rCAdV-2之拯救。為支持此結論，設計交互實驗，其中使用同源重組來用基於CMVie之「可拯救」表現盒替代此具感染力純系中之CMV5 MCS SV40 polyA區。
含有插入 CAdV2 基因體之 ΔE3B 區中之 CMV-IE-EGF 表現盒之 rCAdV-2 ∆E3B/CMVie EGFP 之生成：
生成攜載增強型綠色螢光蛋白(EGFP, Clontech)表現盒(2.6 kb (SEQ ID NO.:7, CMVie EGFP))之rCAdV-2以有利於病毒拯救之評價並活體內評估所選細胞系及物種中之向性。簡言之，使用靶向ΔE3B之CAdV-2 CMVie EGFP轉移片段(CMVie驅動之EGFP ORF，之後為側接有在ORF1之位置183處結束(5’)且在CAdV-2 E3 ORF2之位置82處開始(3’)之約500 bp CAdV-2 DNA之SV40多腺苷酸化序列)進行同源重組以生成rCAdV-2
∆
E3B/CMVie EGFP。藉由檢測約35kb之DNA物質來評估成功的HR事件。實施PCR群落篩選來鑑別含有轉基因表現盒(正向P SEQ ID NO.:8；反向P SEQ ID NO.9)之純系。藉由瓊脂醣凝膠電泳對陽性純系進行可視化，其中陽性純系具有對應於EFG轉基因盒之約0.7 kb PCR產物。另外，藉由使用ILLUMINA® MiSeq測序儀、NextEr_XT庫製備方法及NexGene軟體(Softgenetic；版本2.3)及SEQUENCER®軟體(Genecodes；版本5.1)進行序列分析來證實適當的轉基因插入及序列。 rCAdV-2GFP之成功Pme-1消化產生兩種物質：約32.7 kb (rCAdV-2基因體)及約2.7 kb (PBR322片段)。使用LIPOFECTAMINE® 2000轉染試劑(ThermoFisher Scientific)達成MDCK及E1B-MDCK細胞之轉染。自經轉染之MDCK及E1B-MDCK細胞成功地拯救了rCAdV-2
∆
E3B/CMVie EGFP具感染力純系，如在經轉染細胞中藉由經由螢光之GFP信號所指示。自經轉染細胞上清液/溶解物收穫病毒並使其經受三個接續冷凍-解凍週期(-70℃/37℃)，過濾滅菌，且然後在MDCK及E1B-MDCK二者上傳代。然後經由螢光顯微術針對感染依賴性EGFF信號觀察到經感染細胞(未顯示數據)。 將CMVIE EGFP SV40 polyA轉基因表現盒成功地選殖至CAdV2之ΔE3B結構域中。成功地拯救了重組型病毒，且藉由感染後之螢光顯微鏡分析可檢測到EGFP。
自攜載 CMV5 啟動子之 rCAdV-2 ∆E3B 不可拯救的具感染力純系生成及拯救具有增強型綠色螢光蛋白 (EGFP) 表現盒之 rCAdV-2 ∆E3B ：
為支持CMV5啟動子抑制rCAdV-2拯救之結論(參見上文「使用CMV5啟動子進行轉基因表現」部分)，實施交互實驗，其中使用同源重組來利用基於CMVie之「可拯救」表現盒替代MCS-1具感染力純系中之CMV5 MCS SV40 polyA區。簡言之，使用上文之靶向E3之CAdV-2 CMVie EGFP轉基因轉移片段進行同源重組，以自具感染力純系MCS-1-5 (MCS-1-5含有CMV5啟動子、小的多選殖位點(MCS)及SV40多腺苷酸化序列)生成
∆
E3B rCAdV-2。經由電穿孔將經純化之約2.6 Kb之EGFP轉移片段及源於MCS-1-5之線性化rCAV-2具感染力純系DNA共轉變至BJ5183大腸桿菌細胞中，然後在具有50 μg/mL卡本西林(Carbenicillin)之LB-瓊脂板上選擇該等大腸桿菌細胞。實施PCR群落篩選來鑑別含有轉基因表現盒之純系。成功的同源重組產生約35Kb之DNA物質，該DNA物質作為超螺旋DNA在0.7%瓊脂醣凝膠上與23.1Kb之標記物DNA物質一起或較其稍快的運行。藉由瓊脂醣凝膠電泳對陽性純系進行可視化(圖4)，CAV-2 MCS-1-5主鏈具感染力純系DNA中之CMVie EGFP SV40 polyA表現盒之示意圖闡釋於圖8中。 使用LIPOFECTAMINE® 2000 CD及3000將PmeI所消化的rCAV-2 MCS-1-5 EGFP病毒轉染至MDCK細胞及E1B-MDCK細胞中。源於rCAdV-2 MCS-1-5具感染力純系DNA之rCAdV-2
∆
E3B/CMVie EGFP具感染力純系成功地有利於rCAdV-2自經轉染E1B-MDCK細胞之拯救，如在經轉染細胞中藉由經由螢光之GFP信號所指示(未顯示數據)。如在附錄VI (背景)中所假設，攜載源於CAdV-2 MCS-1主鏈之EGFP表現盒之rCAdV-2之拯救進一步支持rCAdV-2拯救之抑制具有CMV5依賴性而且此係侷限於CMV5中之560bp huAd5 DNA序列的結論。
含有插入 CAdV2 基因體之 ΔE3B 區中之 CMV-IE-VP2 表現盒之 rCAdV-2 ∆E3B/CMVie CPV VP2 ( 天然 ) 之生成：
生成攜載犬小病毒(CPV) VP2基因之rCAdV-2。簡言之，與上文類似，使用含有CMVie驅動之CPV VP2 ORF (SEQ ID NO.:10)之靶向ΔE3之CAdV-2轉移片段進行同源重組來生成含有VP2表現盒之
∆
E3B rCAdV-2 (參見圖9)。藉由PCR篩選來檢測含有成功轉基因整合之純系，其中藉由瓊脂醣凝膠電泳對1.7 kb PCR產物進行可視化。藉由使用ILLUMINA® MiSeq測序儀、NextEr_XT庫製備方法及NexGene軟體(Softgenetic；版本2.3)及SEQUENCER®軟體(Genecodes；版本5.1)進行序列分析來證實適當的轉基因插入及序列。 rCAdV-2GFP之成功Pme-1消化產生兩種物質：約32.7 kb (rCAdV-2基因體)及約2.7 kb (PBR322片段)。自經轉染MDCK及E1B-MDCK細胞成功地拯救了rCAdV-2
∆
E3B/CMVie CPV VP2具感染力純系，如藉由CAdV-2 IFA所檢測(未顯示數據)。儘管經感染細胞中之CPV VP2蛋白質表現不成功，如藉由針對VP2蛋白染色之免疫螢光抗體之缺乏所檢測，但藉由PCR在經純化病毒基因體中檢測到轉基因表現盒之存在。 使用自經感染細胞及上清液純化之rCAV-2 DNA之PCR分析來證實rCAV2ΔE3B/CMVie CPV VP2純系中CMVie CPV VP2 (n)轉基因表現盒之存在(圖10)。圖A，pCAV-2對照病毒；圖B，1號純系；圖C，2號純系。圖D，與CMVie CPV VP2 (n)轉移質體之對照反應。M為1Kb+ DNA條帶。圖E.轉基因表現盒特異性PCR反應之預計結果。反應1及2利用特異性針對CAV-2 H-A P VIII、U-外顯子(SEQ ID NO.:11, SEQ ID NO.:12)及CVP VP2 (SEQ ID NO.:13, SEQ ID NO.:14)之引子；反應3、4及5利用特異性針對CPV VP2 (參見圖E) (SEQ ID NO.:15- 20)之引子。反應7 (針對CAdV-2之陽性反應)使用CAV-2特異性H-A P VIII及U-外顯子引子(SEQ ID NO.:21, SEQ ID NO.:22)。 因此，儘管CMVIE CPV VP2 (n) SV40 polyA轉基因表現盒成功地選殖至CAdV2之ΔE3B結構域中，成功地拯救了重組型病毒，且證實了VP2序列之存在，但未檢測到VP2蛋白質表現。
含有插入 CAdV2 基因體之 ΔE3B 區中之 CMV-IE-VP2 表現盒之 rCAdV-2 ∆E3B/CMVie CPV VP2 ( 密碼子最佳化 ) 之生成：
藉由重疊延伸PCR生成靶向E3之CAdV-2 CMVie CPV VP2密碼子最佳化之(co)轉基因轉移片段(CMVie-驅動CPV VP2 ORF (co)，之後為側接有在ORF1 (5’)之位置183處結束且在CAdV-2 E3 ORF2 (3’)之位置82處開始之約500 bp CAdV-2 DNA之牛生長激素(BGH)多腺苷酸化序列) (SEQ.ID NO.:23)，並將其選殖至TOPO載體中用於存檔及擴增。該構築體用於同源重組以生成
∆
E3B rCAdV-2。 藉由PCR篩選檢測含有成功轉基因整合之純系，其中藉由瓊脂醣凝膠電泳對2.3 kb PCR產物進行可視化。藉由使用ILLUMINA® MiSeq測序儀、NextEr_XT庫製備方法及NexGene軟體(Softgenetic；版本2.3)及SEQUENCER®軟體(Genecodes；版本5.1)進行序列分析來證實適當的轉基因插入及序列。 自經轉染之MDCK及E1B-MDCK細胞成功地拯救了rCAdV-2
∆
E3B/CMVie CPV VP2 (co)具感染力純系，如藉由在P1感染之細胞上使用直接偶聯至異硫氰酸螢光黃(FITC)之抗CAdV-2抗體實施之CAdV-2 IFA所展示(未顯示數據)。為證實拯救病毒編碼CMVie CPV VP2 (co)轉基因表現盒，純化P2病毒rCAdV-2及P5 CAdV-2基因體。使用特異性針對CAdV-2基因體(六聯體相關蛋白VIII (H-A P VIII)及U-外顯子)之區之引子之提取DNA之PCR分析，採用CMVie啟動子及CPV VP2(未顯示數據)。PCR分析產生適當大小之PCR產物，指示經純化P2病毒基因體編碼CMVie CPV VP2 (co)轉基因表現盒。 採用使用抵抗CAdV2及CPV VP2之抗體之CMVie CPV VP2 (co) rCAdV感染之細胞的流式細胞術分析來證實經感染MDCK細胞之表現。簡言之，利用rCAdV-2及對照rCAdV-2以12孔格式感染懸浮液MDCK細胞並培育72h (37℃，5.0% CO
2
，以125 rpm，在增濕培育器中)。然後收集細胞，用PBS洗滌，且然後使用CYTOFIX/CYTOPERM™固定/滲透化套組(BD Biosciences，目錄號554714)，用CYTOFIX™固定溶液處理，隨後用CYTOPERM™滲透化溶液洗滌兩次。然後將細胞與FITC偶聯之抗CAdV-2或抗CPV VP2抗體(分別為抗CAV2抗體：VMRD，目錄號CJ-F-CAV-50X，及抗CPV VP2抗體：VMRD，目錄號CJ-F-CPV 50X)一起培育，用CYTOPERM™洗滌2次，並藉由流式細胞術使用BD Biosciences FACSCANTO™流式細胞術系統進行分析。 圖11顯示來自CMVie CPV VP2 (co) rCAdV感染之MDCK細胞之流式細胞分析之結果。圖A至圖F係存在於單一細胞中之信號之直方圖。用攜載BRSV F (co) (圖B及圖E)之rCAdV-2對照病毒感染懸浮液MDCK細胞或用攜載CPV VP2 (co)(圖C及圖F)表現盒之rCAV-2感染，且在感染後72h用FITC偶聯之抗CPV VP2 (圖A、圖B及圖C)或FITC偶聯之抗CAV2 (圖D、圖E及圖F)抗體染色。圖G係圖11中所觀察結果之概要及量化。用抗CAV-2染色之結果顯示大多數rCAV2-BRSV F (co)感染或rCAV2-CPV VP2 (co)感染之(圖1，分別圖E及圖F) MDCK細胞表現CAdV2蛋白，而未感染細胞(圖1，圖D)對於CAdV-2為有效地負性。用抗CPV VP2抗體染色(圖1，圖A、圖B及圖C)顯示僅rCAV2-CPV VP2感染之MDCK細胞(圖C)表現CPV VP2蛋白，但在利用抗CPV VP2抗體之未感染細胞及rCAV2-BRSV F感染之細胞中觀察到一些背景信號(分別圖A及圖B)。 因此，CMVie CPV VP2密碼子最佳化之(co)轉基因表現盒成功地選殖至CAdV2之ΔE3B結構域中。自經轉染MDCK細胞拯救了重組型病毒，且在經純化病毒基因體中檢測到轉基因表現盒。在經感染細胞中檢測到CPV VP2 mRNA(未顯示數據)，且藉由流式細胞分析證實了經感染細胞中CPV VP2之蛋白質表現，此與天然VP2表現盒相反。
具有插入 CAdV2 基因體之 ΔE3B 區中之密碼子最佳化之牛呼吸道融合病毒融合蛋白質表現盒之 rCAdV-2
Δ
E3B 之生成：
簡言之，使用含有CMVie驅動之CPV牛呼吸道融合病毒(BRSV)融合(F)蛋白ORF、之後側接有在ORF1 (5’)之位置183結束且在CAdV-2 E3 ORF2 (3’)之位置82開始之約500 bp CAdV-2 DNA之BGH多腺苷酸化序列的靶向E3之CAdV-2轉移片段進行同源重組以生成
∆
E3B rCAdV-2. (SEQ ID NO.:27)。將BRSV F基因之天然(n)型式及密碼子最佳化之(co)型式二者選殖至CAdV-2載體背景中，並成功地拯救了攜載轉基因之兩種型式之病毒。然而，僅BRSV F (co)基因用於下游應用。 自MDCK細胞成功地拯救了rCAdV-2
∆
E3B/CMVie BRSV F (CO)具感染力純系，如藉由經病毒上清液/細胞溶解物感染之細胞之CPE所指示。在經純化病毒基因體中檢測到轉基因表現盒之存在。自P3 rCAV2-BRSV F (co)病毒提取DNA且使用其作為模板進行PCR分析，以檢測病毒基因體中BRSV F (co)基因之存在。對轉基因進行測序以證實基因序列。 藉由流式細胞分析證實經感染細胞中BRSV F之表現(參見圖11)。
具有插入 CAdV2 基因體之 ΔE3B 區中之狂犬病病毒醣蛋白 (n) 表現盒之 rCAdV-2 ∆E3B 之生成：
簡言之，使用含有CMVie驅動之巴氏毒株狂犬病病毒醣蛋白(Pasteur Strain Rabies glycoprotein)(RabGP) ORF、之後側接有在ORF1 (5’)之位置183結束且在CAdV-2 E3 ORF2 (3’)之位置82開始之約500 bp CAdV-2 DNA之BGH多腺苷酸化序列的靶向E3之CAdV-2轉移片段進行同源重組以生成
∆
E3B rCAdV-2. (SEQ ID NO.:25)(參見圖13)。自基於浣熊痘之狂犬病疫苗(rRCNV-狂犬病G2疫苗，批號D015-054-)來PCR擴增天然巴氏狂犬病G基因。經擴增RabGP DNA之預計大小為約1.6Kb。 然後將RabGP片段連接至pUC18-B-Bf1b-CO片段中並將其轉變至TOP10大腸桿菌中。使用RabGP特異性引子實施針對RabGP DNA之PCR群落篩選(未顯示數據)。 用PmeI消化DNA以釋放轉移片段(約3.45 Kb)且用ScaI切割載體主鏈以有利於轉移片段之鑑別。經由電穿孔將經純化之約3.45Kb PmeI CMVie RabGP (n)轉基因(表現盒)轉移片段及線性化rCAV-2具感染力純系DNA共轉變至BJ5183大腸桿菌細胞中，然後在具有50 µg/mL胺苄青黴素(Ampicillin)之LB-瓊脂板上選擇該等大腸桿菌細胞。實施PCR群落篩選以鑑別含有轉基因表現盒之純系且藉由瓊脂醣凝膠電泳進行可視化(未顯示數據)。 使用LIPOFECTAMINE® 2000 CD將PmeI消化之HR純系DNA轉染至E1B-MDCK細胞中。自經轉染E1B-MDCK細胞成功地拯救了rCAdV-2
∆
E3B/CMVie RabGP具感染力純系，如藉由圖14中所顯示之CAdV-2 IFA所指示，藉由抗RabG及CAdV-2免疫螢光二者，使用直接偶聯至異硫氰酸螢光黃(FITC)之抗CAdV-2抗體之rCAV-2 RabGP P2病毒感染之EIB-MDCK細胞之CAdV-2 IFA證實了rCAdV-2拯救(圖B及圖C，感染後48小時及72小時)。 如在圖14、圖B及圖C中藉由螢光(CAV-2+及RabG+)細胞所指示，經rCAV-2 RabGP E2及E3病毒感染之E1B-MDCK細胞表現狂犬病G。然而，RabG+細胞數似乎顯著小於CAdV-2+細胞。 表2. BIVI生成之rCAdV-2具感染力純系之概要.
N/A =不適用。 NT = 未測試。 *=僅用轉染所觀察到之表現 如表2中所概述，已自經轉染MDCK或E1B-MDCK細胞生成許多不會有利於rCAdV-2之拯救之基於
∆
E3B之具感染力純系。該等包括CPV VP2及含有由CMV5啟動子驅動之轉基因表現盒之狂犬病G，含有狂犬病病毒醣蛋白G且其中核苷酸序列經密碼子最佳化之純系(與SAD P5/88毒株具有76%一致性)，及含有hMGFP (綠色) (Promega)及MCherry (紅色) (Clontech)螢光蛋白報導基因構築體之純系(未顯示數據)。 如在相當大小之插入物之間比較之此可變性不僅僅反映密碼子最佳化，乃因天然序列及密碼子最佳化之序列二者有利於攜載BRSV F及CPV VP2之rCAdV-2之拯救(參見上文表2)。實際上，攜載天然hMGFP及MCherry ORF之rCAdV-2具感染力純系亦不有利於rCAdV-2拯救(未顯示數據)。綜上所述，該等數據表明在CAdV-2載體平臺之情況下使用CMV啟動子係不可預知的，且啟動子之選擇係表現盒構築之重要考慮因素，乃因其可能顯著地影響rCAdV-2純系之拯救。
實例 6 ： 具有 EHV4 啟動子之表現盒 新穎馬衍生啟動子之鑑別及構築：
鑑別並分離來自4型馬疱疹病毒(EHV4)之新穎異源馬啟動子。兩種啟動子為人所關注；(1)在ORF70處之編碼醣蛋白G (gG)之600 bp之EHV-4 gG啟動子(4pgG600)(SEQ ID NO.:29)；及(2)在ORF42處之編碼主要衣殼蛋白(MCP)之600個鹼基對之EHV-4 MCP啟動子(4pMCP600) (SEQ ID NO.:30)。醣蛋白G基因(orf70)在複製週期中之早期及晚期時間期間具有活性(Colle等人1995，Drummer等人 1998)。主要衣殼蛋白係病毒粒子最豐富的組分之一，且為新合成之病毒DNA準備好進行包裝之後立即在細胞核中組裝衣殼所需。因此，其啟動子預計在病毒複製週期之早期及晚期期間具有活性。由於對CAdV主鏈之大小限制較敏感，故將EHV-4啟動子序列截短至其原始長度之約75%。具體而言，將600 bp 4pgG600啟動子截短至430 bp以生成啟動子片段p430 (SEQ ID NO.:31)，並將600 bp 4pMCP600啟動子截短至455 bp以生成啟動子片段p455 (SEQ ID NO.:32)。 rCAdV-2疫苗病毒感染之細胞生成類病毒顆粒(VLP)可為犬腺病毒(CAdV-2)疫苗效能之關鍵因素。儘管如上文所詳述可拯救含有CMVie驅動之CPV VP2表現盒之rCAdV-2，但使用習用CMVie啟動子無法達成rCAdV-2 CMVie CPV VP2感染之細胞中之實質VP2表現(用於VLP生成)。另外，無法拯救含有CMV5啟動子之rCAdV-2 VP2病毒。因此，感興趣的是使用能驅動所關注抗原之穩健、穩定、可再現表現且具有上文所鑑別特徵之新穎啟動子。
含有 EHV-4 P CPV VP2 (co) 之 CAdV-2 轉移質體之 BamHI 之生成： KpnI/ EHV-4 P DNA 之生成：
分別使用以下寡核苷酸對梯度PCR擴增EHV-4啟動子片段gG430及MCP455： gG430 F：TTTAAAGGTACCTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACC (SEQ ID NO.:33)； gG430 R：AAATTTGGATCCAACTGCAGCTTATCACAGCTTTACAGGTGG (SEQ ID NO.:34) MCP455 F：TTTAAAGGTACCACTGGTGGTAGCATATACTACCTTTATTTATACGC (SEQ ID NO.:35)； MCP455 R：AAATTTGGATCCGATCCTATGGTAGCGGTAAAACACCG (SEQ ID NO.:36)。 預計所擴增gG430及MCP455 DNA之大小分別為454bp及479 bp。 藉由用CMVie啟動子基於BamHI/KpnI的交換為EHV-4啟動子，使用用於ΔE3B處之成功整合及rCAV-2之拯救之先前製備之CAdV-2轉移質體(如上文所詳述)作為含有EHV-4啟動子之CPV VP2轉移質體之基礎。 使用兩種不同的密碼子最佳化之CPV VP2序列(指定為「去剪接」 (SEQ ID NO.:37)及「Gen0.95」 (SEQ ID NO.:38))來製備含有由CMVie驅動之表現盒之CAdV-2轉移質體。Gen0.95係使用Codon Adaptation Index (CAI) 0.95自Genscript獲得之密碼子最佳化之CPV VP2序列。用剪接位點查找算法(2013/2014 ©人類剪接查找器 -由Ghadi Raï設計；Inserm UMR_S910 - Aix Marseille Université, 27 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05)對Gen0.95之分析表明存在43個潛在剪接供體位點。製備89個核苷酸變化(5.07%序列變化，相對於Gen0.95)以消除40個基於犬物種不改變胺基酸序列或生成最不有利密碼子之剪接供體位點。 經由電穿孔將含有兩個上文VP2序列之經純化之約3.5Kb PmeI EHV-4 P CPV VP2 (co)轉移片段及線性化rCAV-2具感染力純系DNA共轉變至BJ5183大腸桿菌細胞中用於同源重組。在具有50 μg/mL胺苄青黴素之LB-瓊脂板上選擇完整純系。藉由PCR篩選、選擇及擴增來鑑別具有適當整合大小及定向之純系。 pCAV-2具感染力純系之成功PmeI消化產生約33.5 Kb (pCAV-2基因體)及約2.7 (pBR322片段) Kb之DNA物質。使用LIPOFECTAMINE® 3000將PmeI消化之具感染力純系轉染至E1B-MDCK及MDCK細胞中。自經轉染之細胞上清液/溶解物收穫第1代(P1)至第7代(P7)病毒(命名為pCAV2ΔE3B/pgG430-VP2 (去剪接) (SEQ ID NO.:39)、pCAV2ΔE3B/gG430-VP2 (Gen 0.95) (SEQ ID NO.:40)或pCAV2ΔE3B/p455 -VP2 (Gen0.95) (SEQ ID NO.:41))，使其經受三個接續冷凍-解凍週期(-70℃/37℃)，過濾滅菌，且然後在E1B-MDCK細胞上傳代。 用所選rCAdV-2感染AI-ST細胞進行針對CAdV-2及CPV VP2蛋白質表現之免疫螢光分析(IFA)。在感染後72h，用CYTOFIX/CYTOPERM™固定/滲透化套組(BD Biosciences，目錄號554714)固定細胞，用CYTOFIX™固定溶液處理，之後用CYTOPERM™滲透化溶液洗滌兩次。然後用FITC偶聯之抗CAdV-2或抗CPV VP2抗體(分別為抗CAdV2抗體(mAb)：VMRD，目錄號CJ-F-CAV-50X，及抗CPV VP2抗體：VMRD，目錄號CJ-F-CPV 50X)培育細胞，用CYTOPERM™洗滌2次並藉由流式細胞術使用BD Biosciences FACSCANTO™流式細胞術系統進行分析。 藉由IFA容易可視化CAdV-2及CPV VP2蛋白，且在相當大一部分經攜載CPV VP2之兩種不同核苷酸變體之rCAdV-2感染之AI-ST 2015細胞中藉由FC進行檢測(Despl及Gen0.95，在感染後48h及72h)。在組織培養上清液/溶解物(在冷凍/解凍後)中藉由斑點墨點鑑別實質CPV VP2蛋白(且極可能反映經組裝VLP之存在)。 圖19中之結果顯示藉由經感染AI-ST細胞之IFA (而非在經編碼非相關BRSV轉基因之rCAdV-2感染之細胞中)容易可視化CAV-2及CPV VP2蛋白，從而指示自由gG430及MCP455 EHV-4啟動子驅動之去剪接序列變體及Gen0.95 CPV VP2 (co)序列變體之穩健CPV VP2表現(參見圖19A)。在小於3%之經原始rCAdV-2 CMVie CPV VP2感染之細胞中檢測到CPV VP2表現(參見圖15)，從而指示可成功地拯救攜載由新穎EHV4衍生啟動子p430及p455驅動之CPV VP2表現盒之rCAdV-2。令人驚訝的是，如與病毒拯救不成功之在ΔE3B位置利用CMV5啟動子序列之CAdV載體相比，在14%至36%之經感染細胞中檢測到由gG430及MCP455 EHV-4啟動子驅動之CPV VP2表現(參見圖16)。 實施斑點墨點分析以分析經感染細胞中之轉基因表現。簡言之，用PBS連續稀釋來自經感染AI ST (對於rEHV-1)及E1B MDCK (對於rCAdV-2)細胞之經澄清(6000 ×
g
, 5 min)組織培養上清液/溶解物(冷凍/解凍)，之後將其添加至儀器中，並經由吸入將其吸附至PVDF。後續步驟為30分鐘暴露於存於TBST中5.0% BioRad印漬級封阻劑，1.0h暴露於1
o
抗體，用TBST洗滌三次，及1.0h暴露於過氧化酶偶聯之2
o
抗體(抗小鼠及抗豬，Jackson ImmunoResearch)，及經由TMB可視化。為進行量化，使用ImageJ軟體(Burger, W., Burge, M.J. (編輯), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York)分析斑點墨點。反轉影像色彩以扣除背景且記錄每一斑點之積分密度。值係指配為+及–指定，如下所示：「++++」 = ＞800000，「+++」 = 500000至800000，「++」 = 300000至499999，「+」 = 120000至299999，「+/-」= 80000至119999且「-」 = ＜80000。 如在圖17中看出，在來自由編碼CPV VP2之EHV-4啟動子驅動之表現盒之rCAdV-2感染之細胞的組織培養上清液/溶解物中觀察到強CPV VP2蛋白信號，而在來自經編碼非相關表現盒之rCAdV-2感染之細胞之試樣中未檢測到信號。該等結果顯示在組織培養上清液中鑑別出實質CPV VP2蛋白。該等結果極可能反映經組裝CPV VP2 VLP之存在。此與原始rCAdV-2 CMVie CPV VP2係相反的，在原始rCAdV-2 CMVie CPV VP2中斑點墨點分析顯示CMVie驅動之CPV VP2信號處於背景位準或低於背景位準且與來自陰性對照之上清液/溶解物(CAdV-2、rCAdV-2 CMVie BRSV F感染之細胞及來自未感染細胞之細胞培養上清液/溶解物)相當。 如在圖17中所顯示，在上清液中可識別出VP2蛋白，且因此，預計其呈免疫原性所需要之構形。重要的是，如上文所論述，在轉基因由CMV5啟動子序列所驅動之純系中未達成重組型CAdV-2之拯救。因此，本發明之新穎EHV-4衍生啟動子序列(例如p430及p455)不僅有利於轉基因表現，且亦支持病毒拯救之關鍵步驟。
含有 EHV-4 啟動子 CPV RabG (n) 之 CAdV-2 轉移質體之生成：
使用本發明之新穎EHV-4衍生之p455啟動子生成第二CAdV-2構築體。由於使用習用CMVie啟動子未觀察到經感染細胞之表現，故選擇了rCAdV-2 RabG(n)。 此實驗之目的係藉由量測rCAdV-2 p455 RabG (n)感染之AI-ST 2015細胞中EHV-4啟動子驅動之RabG蛋白質表現來證實新穎EHV-4啟動子在具有第二轉基因RabG (膜蛋白)之rCAdV-2之情況下之活性。 如上文所論述自經拯救rCAV-2 CMVie RabG (n) (SEQ ID NO.:25)分離RabG(n)序列。利用BamHI及SalI (分別5’及3’)限制內核酸酶切除包括在緊鄰ATG START密碼子5’之Kozak序列之1596 bp RabG (n)序列，並將其連接至具有gG430啟動子及MCP455啟動子之BamHI/SalI切割之rCAdV轉移片段中，然後將該等轉移片段轉變至TOP10大腸桿菌中。 經由電穿孔將經純化之約3.3Kb PmeI EHV-4 P RabG (n)轉移片段及線性化rCAV-2具感染力純系DNA共轉變至BJ5183大腸桿菌細胞中用於同源重組。在具有50 μg/mL卡本西林之LB-瓊脂板上選擇完整純系。實施PCR群落篩選以鑑別EHV-4 pG430/RabG (n) (SEQ ID NO.:42)及EHV-4 p455/RabG (n) (SEQ ID NO.:43)純系。利用特異性針對RabG DNA之引子篩選純系且經由瓊脂醣凝膠電泳進行可視化。預計DNA為1501 bp。 使用LIPOFECTAMINE® 3000將PmeI消化之具感染力純系轉染至E1B-MDCK及MDCK細胞中。自經轉染之細胞上清液/溶解物收穫第1至7代(P1-P7)病毒(命名為pCAV2ΔEB3/gG430或MCP455 RabG (n))，使其經受三個接續冷凍-解凍週期(-70℃/37℃)，過濾滅菌，且然後在E1B-MDCK細胞上傳代。 使用IFA及流式細胞術來評價rCAdV-2感染之AI-ST 2015細胞中EHV-4啟動子驅動之RabG之表現。用抗CAdV-2 FITC偶聯之豬多株抗體(VMRD)探測CAdV-2蛋白表現。用小鼠單株抗體(Novus)探測RabG蛋白表現。藉由IFA容易可視化CAdV-2及RabG蛋白且在經攜載RabG (n)之rCAdV-2感染之AI-ST 2015細胞中藉由FC進行檢測(在感染後72h)。 圖18中之結果指示，藉由流式細胞分析在由所選rCAdV-2及rEHV-1感染之AI-ST 2015細胞中容易檢測到CAV-2及RabG蛋白。該等結果展示由MCP455 EHV-4啟動子驅動之RabG之實質表現。相反，儘管在經rCAdV-2 p455 RabG感染之細胞中容易檢測到RabG(參見圖19B及C)，但在＜ 2.0%之經原始rCAdV-2 CMVie RabG感染之細胞中檢測到表現(參見圖18)。 總之，gG430及MCP455 RabG (n) SV40 polyA轉基因表現盒成功地選殖至CAdV-2之ΔE3B結構域中。自經轉染E1B-MDCK細胞拯救了重組型病毒，如在病毒感染之細胞中藉由CPE所指示。藉由IFA及流式細胞術證實了經感染之AI-ST 2015及BIVI 2011 MDCK細胞中藉由rCAdV-2之RabG轉基因之MCP455啟動子驅動之表現。
實例 7 ： 包含 rCAdV-CMV/CPV VP2 之醫藥組合物 ( 疫苗 ) 之製備：
犬小病毒(CPV)係高度傳染性病毒，其可端視毒力、宿主及環境因素而造成高發病率及死亡率。在過去30年裡，針對狗使用利用MLV及滅活病毒疫苗之有效疫苗程式已大大降低了死亡率。CPV係具有形成衣殼之兩種結構蛋白(VP1及VP2)之非包膜單鏈DNA病毒。已知VP2與病毒病原性及宿主免疫反應相關，且因此為用於在重組型CAdV2系統中納入及表現之選擇靶標。 此研究之目標係與MLV組合疫苗相比，對實驗rCAV2-CPV VP2疫苗之效能實施初步評估。MLV組合含有第2型犬腺病毒(CAV2)、犬瘟熱病毒(CDV)及犬小病毒(CPV)，該等病毒係以在所確立最小免疫劑量與如在目前產物中針對每一特定抗原確立之每一部分之釋放劑量之間的量進行摻和。 在此研究中，將rCAV2-CPV VP2以兩個相隔3週之劑量之方案投與6至7週齡仔犬，以便確定CAdV-CPV VP2載體疫苗是否提供抵抗CPV攻擊之保護。目前，由於MLV疫苗係針對CPV及ICH加以保護之黃金標準，故將測試組與投與含有CPV、CDV及CAdV2之MLV疫苗combo之兩個劑量(相隔3週)之方案之6-7週齡仔犬組進行比較。此組視為陽性對照組。第三組係投與PBS之兩個劑量(相隔3週)之方案作為攻擊對照。在第二次疫苗接種後約3週用CPV-2b攻擊狗以便評估效能。 將測試疫苗以在2個劑量(相隔3週)之方案中給出之1 ml皮下劑量投與十二(12)隻6週2天至7週2天齡之健康CAV2-血清陰性及CPV-血清陰性犬。將該十二(12)隻動物分成2個測試組，如下所示：第1組 – rCAV2-CPV VP2，以8.0 log/ml；第2組 – MLV組合(CAV2, CDV, CPV)。 將磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)以在2個相隔3週之劑量之方案中給出之1 ml皮下劑量投與六(6)隻6週2天至7週2天齡之健康CAV2血清陰性及CPV血清陰性犬之組。認為此組為第3組，且其用作該研究之攻擊對照。在22 DPV2用強毒CPV-2b經口鼻攻擊第1組至第3組中之所有動物。分析攻擊後之臨床病例數據(臨床體徵、發燒、淋巴球減少症、白血球減少症及糞便中CPV之檢測)。
疫苗調配
： 用0.01M PBS將rCAV2-CPV VP2組織培養儲備液稀釋至下文所闡述之目標劑量。未使用佐劑。調配MLV陽性對照並用SGGK穩定劑凍乾，其中combo中之每一抗原高於SOLOJEC®產品線之最小免疫劑量。疫苗之目標劑量如下所示： 表3：
攻擊材料：
在攻擊當天，藉由在36±2℃水浴中手動攪動小瓶使經冷凍CPV-2b攻擊材料之三個小瓶快速解凍。然後在細胞培養基中將該材料1:10稀釋至期望濃度。在製備及攻擊程序期間之所有時間，攻擊接種物皆保持在冰上。
疫苗抗原滴定： CAV2-CPV VP2
簡言之，製備疫苗之10倍連續稀釋液。在以2.0×10
5
個細胞/ml種植有馬丁-達比犬腎(Madin-Darby Canine Kidney，MDCK)細胞之96孔板中，將每一稀釋液以100微升/孔添加至5個孔中之每一者中。每一疫苗實施5個重複。將該等板在36 ± 1℃及5 ± 0.5% CO
2
下培育4±1天。在培育時段之後，固定該等板，僅針對載體進行染色並讀取。使用裡德及明奇法(Reed and Muench method)計算50%終點之效價。
陽性對照 (CPV-CDV-CAdV2)
簡言之，製備疫苗之10倍連續稀釋液。在種植有適當濃度細胞(CPV – MDCK，以2×10
5
個細胞/ml，CDV – VERO，以2×10
5
個細胞/ml，CAV2 – MDCK，以2×10
5
個細胞/ml)之96孔板中，將每一稀釋液以100微升/孔添加至5個孔中之每一者中。每一抗原部分實施5個重複。將該等板在36 ± 1℃及5 ± 0.5% CO
2
下培育3-6天。在培育時段之後，固定該等板，用直接FA偶聯物進行染色，並讀取。使用裡德及明奇法計算50%終點之效價。
血清
在0 DPV1開始，每週自每隻狗收集至多10 mL全血用於血清。特定時間點包括以下：0 DPV1、7 DPV1、14 DPV1、21 DPV1 / 0 DPV2、7 DPV2及14 DPV2。使血液凝結，以1,000-1,300 × g進行離心以分離血清並將其分配成至少2個等份試樣。將血清儲存在-20℃或更冷下直至評估抗體效價為止。 使用血清中和(SN)分析實施血清學分析。使用SN分析來量測針對CAV2、CPV-2b及CPV-2c之血清抗體效價。 簡言之，對於CAdV2血清學，將熱去活化血清之連續稀釋液與等體積之病毒懸浮液(50至300 FAID50)混合。將血清病毒混合物在36±1℃下培育1小時。然後用MDCK細胞(2 × 10
5
個細胞/ml，以0.1 ml/孔)對96孔微量滴定板進行接種。將板在增濕之5+0.5% CO
2
培育器中在36±1℃下培育5±1天。用冷丙酮將板固定15±5分鐘並藉由特異性免疫螢光檢測病毒。藉由免疫螢光未檢測到病毒指示SN抗體之存在。為測定SN抗體效價，使用裡德及明奇法計算50%中和終點。 表4 – CAV2 SN GMT值
簡言之，對於CPV-2b血清學，將熱去活化血清之連續稀釋液與等體積之病毒懸浮液(50至300 FAID50)混合。將血清病毒混合物在36±1℃下培育1小時。然後將狗腎(DKFD-00)細胞(2.5 × 10
5
個細胞/ml，以0.1 ml/孔)添加至96孔微量滴定板之所有孔中。將板在增濕之5±0.5% CO
2
培育器中在36±1℃下培育6±1天。用冷丙酮將板固定15±5分鐘並藉由特異性免疫螢光檢測病毒。藉由免疫螢光未檢測到病毒指示SN抗體之存在。為測定SN抗體效價，使用裡德及明奇法計算50%中和終點。 表5 – CPV-2b SN GMT值
簡言之，對於CPV-2c血清學，將熱去活化血清之連續稀釋液與等體積之病毒懸浮液(50至300 FAID50)混合。將血清-病毒混合物在36±1℃下培育1小時。然後用MDCK細胞(7 × 10
4
個細胞/ml，以0.1 ml/孔)對96孔微量滴定板進行接種。將板在增濕之5+0.5% CO
2
培育器中在36±1℃下培育5±1天。用冷丙酮將板固定15±5分鐘並藉由特異性免疫螢光檢測病毒。藉由免疫螢光未檢測到病毒指示SN抗體之存在。為測定SN抗體效價，使用裡德及明奇法計算50%中和終點。 表6 – CPV-2c SN GMT值
當針對CAdV2、CPV-2b及CPV-2c抗體彼此相比時，關於3個組注意到不同的抗體反應。 與MLV組相比，CAdV2-CPV VP2組在7 DPV1展現遠遠更強之CAdV2抗體反應，然而，截止至14 DPV1，各組之GMT值係類似的。截止至21 DPV1，兩個組之抗體效價減弱，此時對動物進行加強。在加強之後，兩個組之抗體含量激增且然後逐漸趨平，其中CAdV2-CPV VP2組以較MLV組更高之效價趨平。在整個研究過程中，陰性對照組針對CAdV2抗體保持陰性。 與2個疫苗接種組之CAdV2抗體反應相反，CAdV2-CPV VP2組之CPV抗體反應在第二次疫苗接種前係極小的，在該第二次疫苗接種時CPV抗體效價在7 DPV2激增且然後趨平直至用CPV攻擊為止。在攻擊CAdV2-CPV VP2組之後，抗體反應再次激增。MLV疫苗對第一次疫苗接種有充分反應，且另外對第二次疫苗接種有反應。在第二次疫苗接種後MLV組中之CPV抗體含量趨平且在研究之攻擊階段期間未顯示顯著增加。陰性對照動物在整個疫苗接種階段中對CPV抗體保持陰性，直至在攻擊時間後第一次出血為止，在該第一次出血時該等陰性對照動物展現顯著CPV抗體效價。
臨床觀察：
觀察所有動物且在-2DPC、-1DPC及0 DPC每日量取直腸溫度用於基線，精確至0.1度(華氏溫度(Fahrenheit))。在攻擊後，每日監測動物長達14天，其中獲取直腸溫度及臨床體徵之觀察。動物籠未經清潔，直至在完成觀察的那一天為止。 CPV之臨床體徵包括(但不限於)以下：(1)帶血糞便 –含有至少10%血液之特定糞便，通常與腹瀉及/或黏液相關；糞便通常為深紅色且具有獨特的強烈鐵味；(2)黏液樣糞便 –含有至少10%黏液之特定糞便可與腹瀉相關，且可或可不含血液。黏液樣糞便可或可不具有質地及/或形式；(3)腹瀉 – 水樣、無質地，扁平糊狀；(4)若直腸溫度
³
103.4°F且高於基線溫度至少1華氏度，則指示發熱。若溫度為99.5°F或更低且低於基線溫度至少1華氏度，則指示體溫過低。 在0DPC、7DPC及14 DPC將所有狗稱重(精確至0.1公斤(kg))，用於測定攻擊後之重量損失/增加。在體重記錄上收集所有重量。 對於臨床體徵，單次出現CPV感染之任何典型臨床體徵(包括在攻擊後之腹瀉、糞便中之黏液或糞便中之血液)定義動物為臨床體徵陽性。亦注意到厭食、抑鬱症/嗜睡及存在嘔吐可用作用於評價動物為小病毒感染陽性之支持性準則。 在此研究中在2 DPC，18隻動物中之四(4)隻展現腹瀉或嘔吐。該等臨床表現在3至4 DPC之典型CPV發作範圍之外且可能係由攻擊期間所使用之禁食及/或麻醉程序引起。其不被視為CPV感染之體徵。 rCAdV2-CPV VP2組(第1組)顯示在10 DPC之前無感染體徵，其中6隻動物中之1隻展現帶血、黏液性糞便達1天。應注意，該組中之1隻動物在2 DPC顯示嘔吐體徵，如先前所述此在CPV發作範圍之外，且因此不被視為感染之體徵。 在MLV組(第2組)中，6隻動物中之2隻在5及7 DPC展現臨床體徵，其中注意到12號狗在7 DPC具有黏液性糞便且13號狗在5及7 DPC具有腹瀉。亦應注意到此組中之3隻動物在2 DPC顯示嘔吐或腹瀉之體徵，如先前所陳述此在CPV發作範圍之外，且因此不被視為感染之體徵。 陰性對照組(第3組)中之所有狗在4 DPC開始皆展現一系列中度至嚴重臨床體徵(腹瀉、黏液樣糞便、脫水、嘔吐、厭食、帶血糞便)且推斷出在11 DPC有4隻動物死於CPV (3隻在7 DPC且1隻在8 DPC)。
發燒：
對於發燒，在攻擊後單次出現發燒(直腸溫度≥103.4°F且高於攻擊前基線至少1度)將動物歸類為陽性。 rCAdV2-CPV VP2測試組(第1組)之6隻動物中之3隻展現1次發燒；1隻在9 DPC及2隻在12 DPC。MLV組(第2組)中之6隻動物皆未展現發燒。在陰性對照組(第3組)中，6隻動物中之3隻在4DPC至5 DPC之範圍內顯示至少1次發燒(1隻動物顯示2次)。6隻動物中之2隻在7 DPC展現體溫過低。
重量：
為測定重量損失/增加，以每週為基礎，藉由扣除先前週之重量來評價每一個別動物之重量。 rCAdV2-CPV VP2測試組(第1組)及MLV測試組(第2組)中之動物在7或14 DPC皆未展現重量損失。陰性對照組(第3組)中之所有動物在7 DPC皆展現在0.1公斤至0.8公斤範圍內之重量損失。第3組中在14 DPC繼續測試之動物經歷自7 DPC之增重。
淋巴球減少症：
對於淋巴球減少症，在攻擊後單次出現淋巴球減少症(攻擊前基線之≥ 50%損失)將犬歸類為陽性。在此研究中，rCAdV2-CPV VP2測試組(第1組)包括6隻動物中之3隻具有至少1次淋巴球減少症，在9DPC至12 DPC之範圍內發作。MLV組(第2組)未展現淋巴球減少症之體徵。陰性對照組(第3組)中之所有動物皆具有至少1次淋巴球減少症，其中在4 DPC發作。
白血球減少症
：對於白血球減少症，在攻擊後單次出現白血球減少症(攻擊前基線之≥50%損失)將犬歸類為陽性。在此研究中，rCAdV2-CPV VP2測試組(第1組)及MLV組(第2組)未展現白血球減少症之體徵。陰性對照組(第3組)包括6隻動物中之5隻具有至少1次白血球減少症，其中在6 DPC發作。
自糞便試樣分離病毒：
對於CPV糞便病毒分離，在攻擊後在糞便中單次檢測到CPV病毒將犬歸類為陽性。將≤ 1.5 Log10FAID50/ml之CPV糞便病毒效價記錄為CPV糞便病毒分離陰性。將＞ 1.5 Log10FAID50/ml之所有其他記錄效價皆歸類為CPV糞便病毒檢測陽性。 在此研究中，rCAdV2-CPV VP2組(第1組)所包括6隻動物中之4隻在8DPC與14 DPC之間開始展現至少1天之病毒脫落。MLV組(第2組)未脫落可檢測量之活病毒。陰性對照組中之所有動物在3DPC或4 DPC開始且持續至9 DPC皆在糞便中脫落可檢測量之病毒。
結果之概述 ：
總而言之，在0 DPV1及21 DPV1用1.0 ml以下疫苗對6週2天至7週2天齡之犬進行疫苗接種：(第1組) rCAdV2-CPV VP2 = 8.0 log/ml；(第2組) MLV Combo - CAdV2 / CDV / CPV = 4.7 / 2.6 / 3.9 log /ml；(第3組).PBS對照。在22 DPV2用強毒CPV-2b經口鼻攻擊所有經疫苗接種之犬。 當在2個劑量之方案中以8.0 log/劑量給予時，rCAdV2-CPV VP2測試疫苗未滿足效能準則。三(3)隻狗展現發熱、糞便中CPV之脫落及淋巴球減少症，且1隻狗展現犬小病毒之確定性臨床體徵。第四隻狗僅展現CPV之脫落。疫苗在約10 DPC之前似乎提供初始保護，與陰性對照相比該疫苗延遲了感染之臨床體徵之發作。報告一隻疫苗接種者之角膜不明原因地完全混濁。
實例 8 ：包含 rCAdV-EHV-4 p430/RabG (N) 之醫藥組合物 ( 疫苗 ) 之製備： 包含 rCAdV-EHV-4 p430/RabG (N) 疫苗之 醫藥組合物 ( 疫苗 ) 之製備：
疫苗調配： 用0.01M PBS將rCAdV-EHV-4 pp430/RabG (N)組織培養儲備液稀釋至目標劑量。未使用佐劑。
用 rCAdV-EHV-4 P430/RabG (N) 對豬進行接種且評價血清學反應 ：
研究設計：經疫苗接種仔豬及對照組之年齡為4-8週齡，投藥(單一/兩個劑量)係以2 ml/劑量經肌內進行。 為研究rCAdV-EHV-4 P(GG430) RABG (N) C1作為載體疫苗在年幼仔豬中之性質，在疫苗接種-血清學研究中測試rCAdV-EHV-4 P(GG430) RABG (N) C1。 詳細地，在研究日0天及21天用rCAdV-EHV-4 p430/RabG (N) C1以6.7 log之劑量對仔豬疫苗接種兩次(兩次性疫苗接種，2× rCAdV)。未經疫苗接種之組用作陰性對照。
血清學：用於量測疫苗接種後血清轉化之分析
在來自經rCAdV-2 p430 RabG疫苗疫苗接種一次或兩次之動物之血清中測試疫苗接種後對CAdV-2中和抗體之誘導。經疫苗接種之動物顯示針對CAdV2之可檢測之病毒中和(VN)效價，而來自未經疫苗接種之組之血清沒有可檢測之CAdV-2中和抗體含量(表2.)。由堪薩斯州立大學(Kansas State University)之狂犬病實驗室在血清上實施之快速螢光灶抑制測試(RFFIT)顯示在12隻經疫苗接種動物中之3隻中可檢測到RFFIT效價，且在量測狂犬病中和抗體之對照組中未檢測到RFFIT效價。亦測試了藉由ELISA進行之總狂犬病抗體測試以及CAdV病毒脫落。 表7.
該等結果證實本發明之EHV-4啟動子在CAdV載體中之效用(藉由展示所關注轉基因之有效表現(藉由表現評估多少比例之疫苗病毒導致所關注轉基因在經感染細胞中表現))，以及病毒拯救，及轉基因在經疫苗接種動物中之免疫原性。利用具有由CMV啟動子驅動之表現盒之CAdV載體甚至無法評估表現。根據本發明，本文中所揭示及主張之所有組合物及方法皆可在無需過多實驗之情形下進行及執行。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可改變該等組合物及方法及本文所述方法之步驟或步驟之順序，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更特定而言，應明瞭，某些在化學及生理上均相關之試劑可替代本文所述試劑同時可達成相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代物及修改皆被視為涵蓋於由隨附申請專利範圍所界定的本發明精神、範圍及概念內。 參考文獻 以下參考文獻在其提供對本文所闡述之彼等補充之實例性程序或其他細節的程度上以引用方式特定地併入本文中。 1. Buonavoglia, C.及V. Martella, Canine respiratory viruses. Vet Res, 2007. 38(2)：第355-73頁。 2. Tham, K.M., G.W. Horner及R. Hunter, Isolation and identification of canine adenovirus type-2 from the upper respiratory tract of a dog. N Z Vet J, 1998. 46(3)：第102-5頁。 3. Hamelin, C., P. Jouvenne及R. Assaf, Association of a type-2 canine adenovirus with an outbreak of diarrhoeal disease among a large dog congregation. J Diarrhoeal Dis Res, 1985. 3(2)：第84-7頁。 4. Macartney, L., H.M. Cavanagh及N. 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