JP2019531724A - イヌアデノウイルスベクター - Google Patents

イヌアデノウイルスベクター Download PDF

Info

Publication number
JP2019531724A
JP2019531724A JP2019515518A JP2019515518A JP2019531724A JP 2019531724 A JP2019531724 A JP 2019531724A JP 2019515518 A JP2019515518 A JP 2019515518A JP 2019515518 A JP2019515518 A JP 2019515518A JP 2019531724 A JP2019531724 A JP 2019531724A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
virus
rcadv
vector
sequence
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2019515518A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6913747B2 (ja
JP2019531724A5 (ja
Inventor
アンドレアス ガレイ
アンドレアス ガレイ
コウクントララメシュ
ラメシュ コウクントラ
ロバート バリー マンデル
ロバート バリー マンデル
アリス ムント
アリス ムント
クリスティーナ レフメット
クリスティーナ レフメット
エリック マーティン ヴォーン
エリック マーティン ヴォーン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Publication of JP2019531724A publication Critical patent/JP2019531724A/ja
Publication of JP2019531724A5 publication Critical patent/JP2019531724A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6913747B2 publication Critical patent/JP6913747B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、ＣＡｄＶベクターワクチンの分野、特にそのようなベクターワクチン由来の標的抗原の発現に好適なプロモーターに関する。開示および特許請求されるのは、組換えイヌアデノウイルス、それらを作製する方法、それらの使用（免疫学的、免疫原性ワクチンもしくは治療用組成物における、または、ＤＮＡのクローニング、複製もしくは発現のためのベクターとして、ならびに該組成物およびベクターを使用する方法としての使用を含む）、それら由来の発現産物、および該発現産物の使用である。さらに、開示および特許請求されるのは、トランケートＥＨＶ４プロモーター、該プロモーターを含有する発現カセット、ならびに該プロモーターまたは発現カセットを含有する組換えウイルスおよびプラスミドである。

Description

配列表
本出願は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２１〜１．８２５に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．技術分野
本発明は、（ベクター）ワクチンの分野に関し、特にそのようなベクターワクチン由来の標的抗原の発現に好適な改良された発現カセットを有する組換えイヌアデノウイルス２型に特に関する。
Ｂ．関連技術の背景および説明
アデノウイルスは、組換えワクチン用のベクターとして広く調査されている（総説Bru, T., S. Salinas, and E.J. Kremer, An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. viruses, 2010. 2 (9): p. 2134-53参照）。詳細には遺伝子療法およびワクチン開発の分野で、ここ２０〜３０年間にわたって蓄積されたアデノウイルスに関する豊富な情報がある。アデノウイルスの、以下のいくつかの特徴から、遺伝子導入ツールとしてアデノウイルスは魅力的である：（１）アデノウイルスゲノムの構造は十分に特徴づけられている、（２）ウイルスＤＮＡの大部分は外来配列により置換することができる、（３）組換えバリアントが比較的安定している、（４）組換えウイルスが高力価で増殖することができる、（５）ヒト悪性腫瘍はアデノウイルスとは無関係である、および（６）ワクチンとしての弱毒野生型アデノウイルスの使用は安全である。
有効なベクターＣＡＶ−２ワクチンの公表された標的としては、ネコ（Hu, R.L., et al., Experimental immunization of cats with a recombinant rabies-canine adenovirus vaccine elicits a long-lasting neutralizing antibody response against rabies. Vaccine, 2007. 25 (29): p. 5301-7）、イヌ（Hu, R., et al., Prevention of rabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2 encoding the rabies virus glycoprotein. Microbes Infect, 2006. 8 (4): p. 1090-7）、マウス（Li, J., et al., A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice. Virology, 2006. 356 (1-2): p. 147-54）、アライグマ（Henderson, H., et al., Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine, 2009. 27 (51): p. 7194-7）、ヒツジ（Bouet-Cararo, C., et al., Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunization of sheep. Vaccine, 2011. 29 (6): p. 1304-10）、スカンク（Henderson, H., et al., Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine, 2009. 27 (51): p. 7194-7）、およびブタ（Liu, Y., et al., Efficacy and safety of a live canine adenovirus-vectored rabies virus vaccine in swine. Vaccine, 2008. 26 (42): p. 5368-72）の狂犬病、イヌジステンパー（Fischer, L., et al., Vaccination of puppies born to immune dams with a canine adenovirus-based vaccine protects against a canine distemper virus challenge. Vaccine, 2002. 20 (29-30): p. 3485-97）、およびネコ汎白血球減少症（Yang, S., et al., Complete protection of cats against feline panleukopenia virus challenge by a recombinant canine adenovirus type 2 expressing VP2 from FPV. Vaccine, 2008. 26 (11): p. 1482-7）が挙げられる。ＣＡＶ−２は、イヌ（Zhang, S., et al., Oral vaccination of dogs (Canis familiaris) with baits containing the recombinant rabies-canine adenovirus type-2 vaccine confers long-lasting immunity against rabies. Vaccine, 2008. 26 (3): p. 345-50）、狂犬病に対するアライグマおよびスカンク（Henderson, H., et al., 2009, Zhao et al. 2014. Experimental Oral Immunization of Ferret Badgers (Melogale moschata) with a Recombinant Canine Adenovirus Vaccine CAV-2-E3Δ-RGP and an Attenuated Rabies Virus SRV9. J. Wildlife Diseases 50 (2):374-377.）の経口ワクチン接種による有効性によって示されるように、経口ワクチンとして使用される可能性も示している。興味深いことに、複製可能なアデノウイルスベースのベクターは、ベクターに対する受動免疫にもかかわらず有効性を示しており（Gallichan, W.S., et al., Mucosal immunization with a recombinant adenovirus vector induces local and systemic immunity and protection from herpes simplex virus. Adv Exp Med Biol, 1995. 371B: p. 1581-5；Lubeck, M.D., et al., Immunogenicity of recombinant adenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees following 鼻腔内投与. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994. 10 (11): p. 1443-9；Wang, Y., et al., The use of an E1-deleted, 複製-defective adenovirus recombinant expressing the rabies virus glycoprotein for early vaccination of mice against rabies virus. J Virol, 1997. 71 (5): p. 3677-8）、これらが母体由来免疫を克服し得ることを示唆している（Papp, Z., L.A. Babiuk, and M.E. Baca-Estrada, The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine, 1999. 17 (7-8): p. 933-43；Babiuk, L.A. and S.K. Tikoo, Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. J Biotechnol, 2000. 83 (1-2): p. 105-13）。このことは、Ｆｉｓｃｈｅｒら（２００２）によってイヌジステンパーに関して確認された。しかし、既存の抗体は、免疫化の経口経路の使用を妨げる可能性がある（Wright, N., et al., High prevalence of antibodies against canine adenovirus (CAV) type 2 in domestic dog populations in South Africa precludes the use of CAV-based recombinant rabies vaccines. Vaccine, 2013. 31 (38): p. 4177-82）。
イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）は、通常、気道の不顕性から軽度の感染を引き起こし、一般的な蔓延している感染性気管気管支炎の原因の１つとみなされている（Buonavoglia, C. and V. Martella, Canine respiratory viruses. Vet Res, 2007. 38 (2): p. 355-73；Tham, K.M., G.W. Horner, and R. Hunter, Isolation and identification of canine adenovirus type-2 from the upper respiratory tract of a dog. N Z Vet J, 1998. 46 (3): p. 102-5）。ＣＡＶ−２はまた、腸炎のエピソードにも関与しており（Hamelin, C., P. Jouvenne, and R. Assaf, Association of a type-2 canine adenovirus with an outbreak of diarrheal disease among a large dog congregation. J Diarrhoeal Dis Res, 1985. 3 (2): p. 84-7；Macartney, L., H.M. Cavanagh, and N. Spibey, Isolation of canine adenovirus-2 from the feces of dogs with enteric disease and its unambiguous typing by restriction endonuclease mapping. Res Vet Sci, 1988. 44 (1): p. 9-14）、神経学的徴候を有するイヌの脳で検出されている（Benetka, V., et al., Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec, 2006. 158 (3): p. 91-4.）。いくつかのＣＡＶ２ベースのワクチンが開発され、子犬および成犬のワクチン接種に世界中で広く使用されている。改変生ＣＡＶ−２ワクチンは、イヌ集団におけるＣＡＶ−２の循環低下に極めて有効であることが証明された（Buonavoglia et al., 2007）。ＣＡＶ−２をワクチン接種されたイヌは、ＣＡＶ−１およびＣＡＶ−２の両方に対する免疫ができる（Appel, M., et al., Pathogenicity of low-virulence strains of two canine adenovirus types. Am J Vet Res, 1973. 34(4): p. 543-50；Appel, M., L.E. Carmichael, and D.S. Robson, Canine adenovirus type 2-induced immunity to two canine adenoviruses in pups with maternal antibody. Am J Vet Res, 1975. 36(08): p. 1199-202）。両方のイヌアデノウイルス型に対する子犬の免疫化にＣＡＶ−２を使用することによって、ＣＡＶ−１ワクチンで遭遇する安全性関連の副作用が消失した（Bittle, J.L., W.A. Grant, and F.W. Scott, Canine and feline immunization guidelines--1982. J Am Vet Med Assoc, 1982. 181(4): p. 332-5；Curtis, R. and K.C. Barnett, The 'blue eye' phenomenon. Vet Rec, 1983. 112(15): p. 347-53）。ワクチンとしてのＣＡＶ２の明白な安全性は、３０年間利用されてきた間に、イヌおよび人間を含む他の動物種でワクチン誘発およびワクチン関連合併症がないことによって十分に証明されている。さらに、野外血清学的調査からの結果は、多くの野生動物（キツネ、アライグマ、スカンクおよびマングース）が、ＣＡＶ２または抗原的に関連するウイルス感染に無症候性に曝露されていることを示している（Summer et al., 1988）。イヌアデノウイルス血清型２（ＣＡＶ２）のワクチン株は、それ故に、特にイヌのワクチン接種のための有効なベクターベースのワクチン候補を引き出すのに検討することができる安全な複製可能な宿主限定ウイルスの珍しい例を提供する。
イヌアデノウイルスはそれ故に、ベクターウイルスワクチンを開発するための多くの理想的な特徴を有する。上記に詳述したような安全および有効な使用に加えて、イヌアデノウイルスは：ウイルス病原体標的が防御を必要とし得る、ワクチンに対する体液性および細胞性免疫応答；幅広い潜在的な宿主域および組織向性を有する；非エンベロープウイルスであり、そのためエンベロープウイルスより安定である可能性が高い；高力価まで増殖することができ、十分に確立された作製プロトコルおよびアッセイが実施されている：複製可能なウイルスおよび複製欠損ウイルスの両方として使用することができる；ならびに比較的大量の異種ＤＮＡを有することができ、特にＣＡｄＶが「ｇｕｔｌｅｓｓ」である場合、約３０ｋｂの外来性ＤＮＡが挿入され得るが、該ウイルスは、次いでヘルパーウイルスの存在下でレスキューされなければならないことを含む、重要な特徴を提供する。
米国特許第６，０９０，３９３号（参照により本明細書に組み込まれている）においてＦｉｓｈｅｒらは、Ｅ１、Ｅ３内の非必須領域もしくは部分、および／または右ＩＴＲとＥ４ 転写単位の間のゲノムの右端に挿入された外来性ＤＮＡを有する組換えＣＡｄＶ２の使用を記載した。Ｅ３領域は、この領域の一部が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏいずれでも感染性ウイルス形成に必須ではないとして同定され（例えば、ＨＡＶおよびウシＡｄ３から得られたデータに基づき）、それ故に挿入領域として標的とされたため、組換え体の生成に使用された。Ｅ１領域が欠失されているアデノウイルスベクターは複製能力がなく、他の課題を抱えており、故に使用には好ましくなかった。
Ｆｉｓｈｅｒらは、マウスサイトメガロウイルスまたはヒトサイトメガロウイルスＭＣＭＶまたはＨＣＭＶに由来するトランケートプロモーター、例えば、ＨＣＭＶ−ＩＥまたはＭＣＭＶ−ＩＥの使用をさらに開示した。ｈＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、最先端の技術としておよび有望な上流の制御領域としてＦｉｓｈｅｒらによって選択され、組織培養における組換えタンパク質発現の最高レベルおよび最長持続と関連があると結論づけられた。ｈＣＭＶ−ＩＥプロモーターはまた、試験されたほとんど全ての細胞株で作動することが見出されたため、明らかな利点であるとみなされた。ＨＣＭＶ−ＩＥなどのプロモーターの一部の標的欠失を推進する背景は、プロモーターのサイズを縮小し、故にアデノウイルスのパッキング制限に対処することであった。Ｆｉｓｈｅｒらは、９１ｂｐのサイズを有するＨＣＭＶ−ＩＥの活性断片、または４６６ｂｐのサイズを有するＭＣＭＶ−ＩＥの活性断片、すなわち、約９１ｂｐのトランケートされた転写的に活性なＨＣＭＶ−ＩＥ、または約４６６ｂｐのトランケートされた転写的に活性なＭＣＭＶ−ＩＥを特に開示した。
Ｆｉｓｈｅｒらは、様々な組換えＣＡｄＶ２ベクター、例えば、ワクシニアウイルスＨ６（ｖＨ６）プロモーターと作動可能に連結されたＣＤＶヘマグルチニン（ｈａｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）または融合（Ｆ）タンパク質のポリヌクレオチドをコードする発現カセットの構築を記載しているが、Ｆｉｓｈｅｒらは、構築したＣＡｄＶ２ベクターのいずれからも強いＣＤＶ抗原発現を実証しなかった。代わりに、Ｆｉｓｈｅｒの‘３９３号特許は、Ｅ３挿入部位の一般的なヌクレオチドサイズの制限を、安定な発現に関する変数として開示したが、感染細胞におけるウイルスレスキューまたは異種タンパク質の発現に寄与するようなプロモーターの選択のいかなる可能性可変性についての観察および／または検討も一切なかった。Ｆｉｓｈｅｒら、２００２年の後続試験において（"Vaccination of puppies born to immune dams with a canine adenovirus-based vaccine protects against a canine distemper virus challenge" Vaccine 20 (2002) 3485-3497）、Ｆｉｓｈｅｒらは、ＣＤＶ ＨＡおよびＦ発現カセットが、ｈＣＭＶ ＩＥプロモーターの９１ｂｐ断片によって駆動されるベクターのＥ３領域に挿入されている、２つの組換えＣＡｄＶ２ウイルスの初めての構築および特性決定を報告した。Ｆｉｓｈｅｒらは、ＣＡＶ２複製の開始後のトランスジーン遺伝子の発現を促進するために、ｈＣＭＶＩＥ ５’ＵＴＲをｈＡｄ２ ＴＰＬでさらに置き換えた。まとめると、クローニング戦略の重点は、ＣＤＶ ＨＡおよびＦ ｃＤＮＡ両方の発現カセットのサイズを最小化することであった。さらに、該試験は、特定の挿入部位、欠失サイズ、挿入サイズ、および挿入方向による潜在的なウイルス回収問題を詳らかにした。その試験においてＦｉｓｈｅｒらは、正しい挿入を示す安定なクローンを回収することができ、免疫化後の免疫の誘導についてアッセイすることができた。ＣＤＶ ＨＡ全体をコードするｒＣＡｄＶ２およびｖＣＡ１７の混合物の血清陰性子犬への単回鼻腔内投与後、極めて高い全身のＣＤＶ ＳＮ力価（＞２．０ｌｏｇ１０）およびチャレンジ後のほぼ完全な防御が観察された。しかし、子犬はＨＡおよびＦ抗原を含有する２つのベクターの混合物で免疫されたため、著者らは、一方または両方のベクターが、免疫されたイヌにおいてＣＤＶ導入遺伝子を発現したかどうかについて結論づけることはできず、また個々の細胞集団において導入遺伝子の強い発現を決定的に実証することもなかった。
本明細書に記載された実験は、タンパク質の検出（ＩＦＡ、フローサイトメトリー、ドットブロット）により測定する場合、Ｅ３ゲノム遺伝子座で挿入されたカセットからの強い導入遺伝子発現は、複製可能なｒＣＡｄＶ−２ ＣＭＶ５駆動導入遺伝子発現カセットに感染した細胞では観察されなかったことを実証する。実際に、本明細書の実験は、ＣＭＶ５プロモーターを含む発現カセットを有するｒＣＡｄＶ−２ベクターがレスキューされ得ず、そのためタンパク質発現は感染細胞では測定され得なかったことを示している。これは、それらの発現カセットを含有する同じトランスファープラスミドによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの一過的なトランスフェクションが、タンパク質発現レベルに関してＣＭＶ５プロモーター活性はＣＭＶｉｅプロモーター活性より大きかったことを実証するという事実にもかかわらず、示されたのであった。故に、強い再現可能な導入遺伝子発現、および／またはウイルスレスキューの欠如から、ＣＡｄＶ２ベクター、特に複製が起きない宿主におけるＣＭＶ駆動発現カセットの有用性は極めて疑わしくなった。
したがって、非常に強力で組織特異的でないＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ（マウスサイトメガロウイルス）ＩＥプロモーター−エンハンサーは、ＣＡｄＶ２が複製する標的種における様々な研究活動および限られた有用性に十分に適合され得るが、これらは、他の種において使用するＣＡｄＶ２ベクターワクチンの構築のための有効なおよびまたは信頼性が高いプロモーターとはみなされなかった。必要なことは、様々な種において使用するワクチンの作製のための組換えＣＡｄＶ２ウイルスに関して、ＣＭＶプロモーターを、目的の抗原エピトープの安定した強い再現可能な発現を駆動することができる有効なプロモーターと置き換えることであった。
任意のそのような障害を避けるために、本発明は、特にベクターワクチンの文脈の中で、ならびに特にＣＡｄＶ−２ベクターの文脈の中での導入遺伝子発現のための新しい制御核酸配列／プロモーター配列を提供する。
したがって、上記の技術的問題の解決策は請求項に特徴づけられる記載および実施形態によって達成され、その異なる態様内の本発明は請求項に従って実施される。
本発明は、導入遺伝子発現のための新しい制御核酸配列／プロモーター配列、免疫原性組成物、ワクチン、および当技術分野の欠点を克服する関連方法を提供する。
ヘルペスウイルスを含む様々なベクター系での高レベルの導入遺伝子発現を駆動するために広く使用される確立されたプロモーター配列は、ＨＣＭＶ（Boshart et al., 1985; Foecking and Hofstetter 1986）またはマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ；Dorsch-Hasler et al., 1985）の最初期遺伝子のプロモーター配列、または例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターなど、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のような腫瘍ウイルスの強力なプロモーター、ならびに他多数（例えば、Kim et al., 1990）である。そのような強力なプロモーターは、様々な細胞培養系で自律的に機能するため、細胞生物学者に好まれた。ウイルス複製に関して、感染細胞は、ウイルス機能によってウイルス複製機構へと形質転換される。
しかし、改良されたベクターワクチンに関して、上記の自律的な強力なプロモーターはいずれも選択肢として見られていない。特にＣＭＶ由来プロモーターは、組換えＣＡｄＶ２ベクターワクチンにおける導入遺伝子発現の有効な再現可能な駆動因子ではなかった。
したがって、ＥＨＶ−１ β−およびγ−遺伝子のもののような、ウイルス複製に関して高い活性を有するプロモーターを提供する必要がある。内部相同組換えのリスクが起こることなく、したがって遺伝的不安定性なく、１つのベクター分子に２回同一のＤＮＡ配列を使用することはできないため、本発明は、ＥＨＶ−４の公表されたゲノム配列由来の新しい代替えのプロモーター配列を提供する（ウマヘルペスウイルス４株 ＮＳ８０５６７、完全ゲノム、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ０３００２７、Ｖｅｒｓｉｏｎ ＡＦ０３００２７．１ ＧＩ：２６０５９５０、１９９８年５月２１日）。ＥＨＶ−１遺伝子との遺伝子の配列同一性は５５〜８４％の範囲内である。
本発明は２つの新しいプロモーター：４ｐｇＧ６００および４ｐＭＣＰ６００、ならびにより短い長さのそれらの誘導体を提供し、それらは細胞培養において、または細胞培養のｒＣＡｄＶ−ＢＡＣ複製の背景において、一過的なトランスフェクション後に機能的であることが示される。
本発明は２つの新しいプロモーター：ｐ４３０およびｐ４５５を提供し、それらは細胞培養において、およびｐ４５５は、動物（ブタ）においてもｒＣＡｄＶ２複製の背景で機能的であることが示されている。ウイルス複製サイクル中の２つの新しいプロモーターの活性レベルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロモーター動態実験から推測されるように、非常に類似しているようである。
本発明によって提供された新しいプロモーター配列は、イヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）ベクター背景において効率的であることが示されている。
上記のように、ＣＭＶ５プロモーター配列が、Ｅ３領域に位置する発現カセットに存在した場合、組換えＣＡｄＶのレスキューは達成されなかった。これは、発現カセットのサイズが観察された実験的なゲノムサイズ制限を超えなかったため、配列特異的であるようである。対照的に、ｐ４３０およびｐ４５５などの本発明の新しいＥＨＶ−４由来プロモーター配列は、導入遺伝子発現を促進するだけでなく、ウイルスレスキューの重要なステップを妨げず、それ故に、先行技術のプロモーター配列を考えると有利である。
本発明は、先行技術につきものの問題を解決し、当技術の状態の明らかな進歩を提供する。
一般に、本発明は、ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターと作動可能に連結された少なくとも１つの異種ＤＮＡをコードする発現カセットを含む組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを提供する。
本発明は、ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターが、４ｐｇＧ６００（配列番号２９）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含み、前記プロモーター配列が異種抗原の発現をもたらす、ｒＣＡｄＶベクターにさらに関する。
特定の態様では、該プロモーター配列の機能的断片または誘導体は、少なくとも８０％、８５％の配列同一性、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％の配列同一性、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の配列同一性を有する。
特定の態様では、機能的断片は、４ｐｇＧ６００（配列番号２９）のトランケーション（truncation）またはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性は、全長にわたって少なくとも７２％である。
特定の態様では、機能的断片は、４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性は、全長にわたって少なくとも７８％である（またはより高い）。
さらなる特定の態様では、プロモーター４ｐｇＧ６００（配列番号２９）または４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）配列の機能的断片または誘導体は、５５０ヌクレオチド、好ましくは５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有する。
さらなる特定の態様では、ｒＣＡｄＶベクターは、４ｐｇＧ６００（配列番号２９）を含むウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターを含む。
さらなる特定の態様では、ｒＣＡｄＶベクターは、４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）を含むウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターを含む。
さらなる特定の態様では、ｒＣＡｄＶベクターは、４ｐＧ４３０（配列番号３１）を含むウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターを含む。
さらなる特定の態様では、ｒＣＡｄＶベクターは、ｇＭＣＰ４５５（配列番号３２）を含むウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターを含む。
本発明の特定の態様では、ｒＣＡｄＶベクターは、感染性ＣＡｄＶとしてパッケージされる。
本発明のさらに別の実施形態では、ｒＣＡｄＶベクターは、目的のエピトープ、生物学的応答調節因子、増殖因子、認識配列、治療用遺伝子、および融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む。
本発明の特定の態様では、異種ＤＮＡは、目的の抗原エピトープをコードする。
本発明のさらに別の実施形態では、目的の抗原エピトープは、イヌもしくはネコ病原体の抗原である。
本発明の特定の態様では、目的の抗原エピトープは、食品生産動物病原体に由来する抗原であり、より詳細には食品生産動物病原体は、ブタ、ウシ、ウマ、家禽、および／またはヒツジ動物に由来し、ならびにより詳細には食品生産動物病原体は、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、パラインフルエンザ３ウイルス（ＰＩ−３）、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）、ウシエンテロウイルス（ＢＥＶ）、ウシコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ）（ＢＣＶ）、ウシ狂犬病（ＢＲ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、アデノウイルス、アストロウイルス、マンヘミア・ヘモリチカ（以前はパスツレラ・ヘモリチカ）、パスツレラ・マルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス（ヒストフィルス・オビスおよびヘモフィルス・アグニ）、アクチノマイセス（コリネバクテリウム）、アクチノマイセス・ピオゲネス、クラミジア・シッタシ、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・フィタス・フィタス（以前はＣ・フィタス・インテスチナリス）、レプトスピラ・インテロガンス、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・グリッポチフォーサ、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリッポチフォーサ、レプトスピラ・ハージョ（レプトスピラ・ハージョプラジトノ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏｐｒａｊｉｔｎｏ）およびレプトスピラ・ハージョボビス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｖｉｓ））、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・スイスおよびブルセラ・メリテンシス、リステリア・モノサイトゲネス、クラミジア・シッタシ、クロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ヘモリチクム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニ、モラキセラ・ボビス、クレブシエラ属種、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモネラ・ティフィムリウム；サルモネラ・ニューポート、ヨーネ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、マイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、クリプトスポリジウム・ホミニス（Ｃｒｙｐｔｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・アガラクチア、大腸菌（エスケリキア・コリ）、マイコプラズマ属種、マイコプラズマ・ディスパー、およびウレアプラズマ属種、トリトリコモナス・フィータス、トリコフィトン・ベルコーズム、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・サルキソヴィー（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓａｒｋｉｓｏｖｉｉ）、ネオスポラ・カニナム（以前はトキソプラズマ・ゴンディ）、バベシア・ビゲミナおよびバベシア・ボビス、ディクチオカウルス・ヴィヴィパロウス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ）（肺虫症）、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の特定の態様では、目的の抗原エピトープは、食品生産動物病原体に由来する抗原であり、より詳細には食品生産動物病原体は、ブタ、ウシ、ウマ、家禽、および／またはヒツジ動物に由来し、ならびにより詳細には食品生産動物病原体は、サルモネラ属種、特にサルモネラ・ティフィムリウム、Ｓ．コレラスイス；アストロウイルス；ロタウイルス；伝染性胃腸炎ウイルス；ブラキスピラ属種、特にＢ．ヒオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ；クロストリジウム属種、特にＣ．ディフィシル、ウェルシュ菌（Ｃ．パーフリンゲンス）Ａ、ＢおよびＣ型、Ｃ．ノビイ、Ｃ．セプチカム、Ｃ．テタニ；ブタ腸管ピコルナウイルス；ブタ腸管カリシウイルス；アクチノバシラス・プルロニューモニエなどの呼吸器病原体；ボルデテラ・ブロンキセプティカ；エリシペロスリクス・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ヘモフィルス・パラスイス、特に亜型１、７および１４；パスツレラ属種、特にＰ．マルトシダ；マイコプラズマ属種．、特にＭ．ハイオニューモニエ、Ｍ．ヒオリニス；ブタインフルエンザウイルスＡ型 ；ＰＲＲＳウイルス；ブタサーコウイルス；ブタパルボウイルス；仮性狂犬病ウイルス；エペリスロゾーノシス・スイス（Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎｏｓｉｓ ｓｕｉｓ）、マイコバクテリウム属種、特にＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．ボビス；ブタ呼吸器コロナウイルス；ブタコロナウイルス、特にＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、およびデルタコロナウイルス；アルカノバクテリウム・ピオゲネス；ブタアデノウイルス；豚コレラ；ブタサイトメガロウイルス；アフリカ豚コレラ；または大腸菌（エスケリキア・コリ）、ストレプトコッカス属種、特にＳ．スイス、Ｓ．ポルシナス（Ｓ．ｐｏｒｃｉｎｕｓ）、Ｓ．ディスガラクティエ、好ましくは亜種エクイシミリス；ブルセラ・スイス、特に次亜種１、２および３型を含む他の病原体；レプトスピラ属種、特にＬ．オーストラリス、Ｌ．カニコーラ、Ｌ．グリッポチフォーサ、Ｌ．ポモナ、Ｌ．レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａｅ）、Ｌ．インターロガンス、Ｌ．タラソビ（Ｌ．ｔａｒａｓｓｏｖｉ）、Ｌ．ハージョ、Ｌ．セジュロ（Ｌ．ｓｅｊｒｏｅ）；脳心筋炎ウイルス；赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス；日本脳炎ウイルス；西ナイルウイルス；レオウイルス；ルブラウイルス；メナングルウイルス；ニパウイルス；水疱性口内炎ウイルス；ブタの水疱性発疹のウイルス：ブタポックスウイルス；ブタヘルペスウイルス；およびスタフィロコッカス・ヒカス、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明のさらなる実施形態では、目的の抗原エピトープは、モルビリウイルス抗原、狂犬病糖タンパク質、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質、免疫不全ウイルス抗原、パルボウイルス抗原、ポックスウイルス抗原からなる群から選択される。
本発明は、上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクター、および薬学的にまたは獣医学的に許容される、許容される担体または希釈剤を含む免疫原性またはワクチン組成物にさらに関する。
別の態様では、上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを含む免疫原性またはワクチン組成物は、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適である。
本発明は、（ａ）上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを含む組換えｒＣＡｄＶベクターを宿主細胞に導入するステップ、（ｂ）好適な条件下で感染細胞を培養するステップ、（ｃ）感染細胞および／またはベクターおよび／またはウイルス成分を回収するステップを含み、（ｄ）ステップ（ｃ）の回収物を精製するステップを含んでもよく、（ｅ）前記回収物を薬学的に許容される担体と混合するステップを含む、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するための、上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを含む免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法にさらに関する。
本発明は、上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを含むワクチンの免疫原性組成物の治療有効量を動物に投与するステップを含む、動物において病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候もしくは疾患を低減もしくは予防する方法、または動物において病原体の感染を処置もしくは予防する方法で使用するための方法にさらに関する。
上記の実施形態の方法のいずれかによる特定の態様では、免疫原性組成物は１回投与される。
上記の実施形態の方法のいずれかによる特定の態様では、免疫原性組成物は２回用量として投与される。
上記の実施形態の方法のいずれかによる特定の態様では、免疫原性組成物は、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内投与される。
上記の実施形態の方法のいずれかによる特定の態様では、免疫原性組成物は、同種および／または異種ウイルスチャレンジに対する防御をもたらす。
本発明は、上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを含む免疫原性組成物を動物に投与するステップを含む、動物において病原体によって引き起こされる臨床疾患に対する免疫性を前記動物に与える方法にさらに関し、これにより免疫原性組成物またはワクチンは、感染の臨床徴候を引き起こさないが、前記病原体の病原体型に対する免疫性を動物に与える免疫応答を誘導することができる。
上記の方法による本発明の特定の態様では、免疫原性組成物が１回投与され、または代わりに２回用量として投与される。
上記の方法による本発明の特定の態様では、免疫原性組成物は、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内投与される。
上記の方法による本発明の特定の態様では、免疫原性組成物は、同種および／または異種ウイルスチャレンジに対する防御をもたらす。
本発明は、（ａ）上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを含むワクチンを動物に投与することができるディスペンサー、および（ｂ）上記の実施形態のいずれかによる組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクターを含む免疫原性組成物またはワクチンを含み、（ｃ）指示リーフレットを含んでもよい、動物において病原体と関連する疾患に対して、動物にワクチン接種するための、および／または動物において病原体と関連するもしくは病原体によって引き起こされる１つもしくは複数の臨床徴候の発生率もしくは重症度を低減するためのキットにさらに関する。
本発明は、上記の実施形態の組換えイヌアデノウイルス２型（ｒＣＡｄＶ２）を発現する真核生物の宿主細胞株にさらに関する。
別の特定の態様では、宿主細胞株は、ＰＫ／ＷＲＬ細胞株、ＲＫ１３細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＳＴ細胞株、ＡＩ−ＳＴ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１、Ｓｆプラス細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、および／またはそれらの派生物からなる群から選択される哺乳動物細胞株または昆虫細胞株である。
さらに別の特定の態様では、宿主細胞株は、上記の実施形態の組換えイヌアデノウイルス２型（ｒＣＡｄＶ２）を発現する原核生物の宿主細胞株である。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるはずであるが、あらゆる潜在的な多義性がある場合には、本明細書で提供した定義は、任意の辞書の定義または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書では、特に言及しない限り、「または（or）」の使用は「および／または（and/or）」を意味する。さらに、用語「含む（including）」ならびに「含む（includes）」および「含まれる（included）」など他の形態の使用は限定されない。本明細書で参照した全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定のＤＮＡ、ポリペプチド配列またはプロセスのパラメーターに限定されず、当然変化し得るものと理解される。本明細書で使用する用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が特に明確に規定しない限り、複数の参照を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（an antigen）」という言及は２つまたはそれ以上の抗原の混合物を含み、「賦形剤（an excipient）」という言及は２つまたはそれ以上の賦形剤の混合物を含むなどである。
分子生物学定義
用語「ベクター」は、当技術分野で公知のように、遺伝材料を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体、または弱毒生ウイルスベクターを指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成されるまたはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養でも宿主動物でもウイルスベクターの複製に機能を持たない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の特定の態様に従って、ベクターは、遺伝材料の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクションのため、ワクチン、例えばＤＮＡワクチンとしての使用のため、または遺伝子発現目的のためなど、様々な態様のために使用され得る。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列によって導かれるように細胞におけるタンパク質の生合成を記載する用語である。特定の態様では、ベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである「発現ベクター」であってよい。
ベクターおよび発現のためにベクター（または組換え体）を作製および／または使用する方法は、特に、米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７号、第４，７２２，８４８号、第５，９４２，２３５号、第５，３６４，７７３号、第５，７６２，９３８号、第５，７７０，２１２号、第５，９４２，２３５号、第３８２，４２５号、ＰＣＴ国際公開第９４／１６７１６号、国際公開第９６／３９４９１号、国際公開第９５／３００１８号、Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al., U.S. Pat. No. 4,745,051(recombinant baculovirus)；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；ＥＰＡ０３７０５７３；米国特許出願第９２０，１９７号、１９８６年１０月１６日出願；欧州特許出願公開第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５，５９１，４３９号、第５，５５２，１４３号；国際公開第９８／００１６６号；両方とも１９９６年７月３日に出願された、許可された米国特許出願第０８／６７５，５５６号、および第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；および米国特許第５，５９１，６３９号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号、ならびに国際公開第９０／１１０９２号、国際公開第９３／１９１８３号、国際公開第９４／２１７９７号、国際公開第９５／１１３０７号、国際公開第９５／２０６６０号；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectorsに開示の方法によるまたは類似してよい。また、国際公開第９８／３３５１０号；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)；Sanford et al.,米国特許第４，９４５，０５０号；Fischbach et al. (Intracel)；国際公開第９０／０１５４３号；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)；Szoka et al.,米国特許第４，３９４，４４８号（生細胞にＤＮＡを挿入する方法）；McCormick et al.,米国特許第５，６７７，１７８号 （細胞変性ウイルスの使用）;および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）；ならびに本明細書で引用した他の文献も参照。
用語「ウイルスベクター」は宿主細胞にそれが入り込むと特定の生物活性、例えばベクターによって運ばれた導入遺伝子の発現をもたらすように、組換えＤＮＡ技術によって操作された遺伝子改変ウイルスを記載する。特定の態様では、導入遺伝子は抗原である。ウイルスベクターは標的細胞、組織、または生物において複製可能であってもなくてもよい。
ウイルスベクターの生成は、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) or K. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))に記載されるように、限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡシーケンシング、細胞培養へのトランスフェクションの標準的な技術を含む、当技術分野で周知の好適な遺伝子工学技術を使用して達成され得る。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムからの配列を組み込むことができる。配列は、それらの自然な形態に組み込まれることができ、または任意の方法で改変され、所望の活性を得ることができる。例えば、配列は、挿入、欠損または置換を含むことができる。さらに、配列は、目的の遺伝子の翻訳効率を高めて生きた生物におけるタンパク質発現を改善するように「コドン最適化」されてもよい。例えば、目的の遺伝子は、タンパク質のアミノ酸配列自体を変更することなく、特定のアミノ酸をコードするのに使用されるコドンを変更するために変異（またはｄｅ ｎｏｖｏ合成）されてもよい。稀なコドンが、宿主生物の遺伝子中のより豊富なコドンによって置き換えられてもよい。目的の遺伝子におけるコドンの最適化は、宿主細胞背景での遺伝子の機能性および／または発現を増加させる最良の方法となり得る。
ウイルスベクターは２つまたはそれ以上の目的のタンパク質のコード領域を含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、目的の第１のタンパク質のコード領域および目的の第２のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第１のタンパク質および目的の第２のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、目的の第３または第４のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第３および第４のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。１つのウイルスベクターによってコードされる目的の２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は異なり得る。例えば、２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は、少なくとも約２００アミノ酸であってよい。少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、またはそれ以上。
好ましいウイルスベクターは、イヌアデノウイルスのＣＡｄＶ２ベクターを含む。
本開示の特定の態様により、用語「ウイルスベクター」または代わりに「ウイルス構築物」は、ＣＡｄＶ−１およびＣＡｄＶ−２（イヌアデノウイルス）などのアデノウイルス科（ＡｄＶ）から選択されるウイルスに由来する組換えウイルス構築物を指す（van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Carstens, E.B., Estes, M.K., Lemon, S.M., Maniloff, J., Mayo, M.A., McGeoch, D.J., Pringle, C.R. and Wickner, R.B. (2000). Virus taxonomy. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego. 1162 pp参照）。
用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は交換可能に使用することができる。
用語「構築物」は、本明細書で使用する場合、人工的に生成されたプラスミド、ＢＡＣ、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
用語「プラスミド」は、細菌宿主細胞内の細菌染色体とは独立して複製される細胞質ＤＮＡを指す。本発明の特定の態様では、用語「プラスミド」および／または「トランスファープラスミド」および／または「導入断片」は、例えばウイルスベクターへの挿入のための発現カセットの構築に有用な組換えＤＮＡ技術のエレメントを指す。別の特定の態様では、用語「プラスミド」は、ＤＮＡワクチン接種目的のために有用なプラスミドを特定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能であり任意の核酸を指す。
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ＲＮＡ配列」または「ＤＮＡ配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびその断片および部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それらは一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表してよい。配列は、非コード配列、コード配列、または両方の混合であってよい。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製され得る。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も特別に含む。
用語「制御核酸」、「制御エレメント」および「発現調節エレメント」は交換可能に使用され、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に影響し得る核酸分子を指す。これらの用語は、プロモーター、プロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む、転写を促進または制御する全てのエレメントに広く使用され、全てのエレメントをカバーする。原核生物における例示的な制御エレメントは、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞において使用される制御エレメントは、限定はされないが、転写および翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ピコルナウイルス２Ａ配列等を含むことができ、コード配列の発現および／または宿主細胞におけるコードポリペプチドの産生を提供および／または制御する。
「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳの５’の遺伝子に非依存的に翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞において２つのシストロン（オープンリーディングフレーム）が単一の転写物から翻訳されるようにする配列を記載する。ＩＲＥＳは、そのすぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のための非依存的なリボソーム進入部位を提供する。ポリシストロニックであり得る、すなわちｍＲＮＡから順に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードする細菌ｍＲＮＡとは異なり、動物細胞のほとんどのｍＲＮＡは、モノシストロニックであり１つのポリペプチドのみの合成のためにコードする。真核細胞におけるポリシストロニック転写により、翻訳は翻訳開始部位の最も５’側から開始され、最初の終止コドンで終結され、転写物はリボソームから放出され、ｍＲＮＡにおいて最初にコードされたポリペプチドのみの翻訳をもたらす。真核細胞では、転写物の第２のまたは続くオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳを有するポリシストロニック転写は、その下流のオープンリーディングフレームの連続的な翻訳を可能にし、同じ転写物によってコードされた２つまたはそれ以上のポリペプチドを産生する。ＩＲＥＳは様々な長さであってよく、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ピコルナウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶまたはポリオウイルス（ＰＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）など、さまざまな起源由来であってよい。ベクター構築物における様々なＩＲＥＳ配列およびそれらの使用が記載され、当技術分野で周知されている。下流のコード配列は、下流の遺伝子の発現にネガティブに影響しないであろう任意の距離でＩＲＥＳの３’端に作動可能に連結されている。ＩＲＥＳと下流の遺伝子の始まりの間の最適なまたは許容的な距離は、距離を変化させ、距離の関数として発現を測定することによって容易に決定することができる。
用語「２ａ」または「２ａペプチド」は、短いオリゴペプチド配列を意味し、２ａおよび「２ａ様」と記載され、リボソームスキッピングとして定義されたプロセスによって、翻訳の際にタンパク質間の切断を媒介することができるリンカーとして機能する。そのような２ａおよび「２ａ様」配列（ピコナウイルス科および他のウイルスまたは細胞配列に由来する）は、複数の遺伝子配列を単一の遺伝子に鎖状につなぐために使用され、同じ細胞内でのそれらの共発現を確実にすることができる（Luke and Ryan, 2013参照）。
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許容し、遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列を意味する。典型的には、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域、遺伝子の転写開始部位の近位に位置する。転写の開始に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられることが多い。プロモーターの例としては、限定はされないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ウマ、ブタ、ウシおよびヒトを含む）などの動物、トリまたは昆虫由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑圧可能、および／または構成的であり得る。誘導性プロモーターは、温度の変化など、培養条件のいくつかの変化に応じてそれらの調節下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を開始する（Ptashne, 2014）。当業者に周知のプロモーターの例としては、例えば、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターが挙げられる。
本発明の文脈で、本明細書で使用する場合、用語プロモーターは、特に機能的断片、例えば、４ｐｇＧ６００（配列番号２９）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列を指し、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％（またはより高い）である。さらに、本発明の文脈で、本明細書で使用する場合、用語プロモーターは、特に機能的断片、例えば、４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列を指し、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％である（またはより高い）。最も好ましくは、「プロモーター」は、ｐ４３０（配列番号３１）またはｐ４５５（配列番号３２）を指す。用語「ｐ４３０」、「ｇＧ４３０」、および「４３０」は、明細書、図面、配列表等を通して同義的および交換可能に使用される。用語「ｐ４５５」、「ＭＣＰ４５５」および「４５５」は、明細書、図面、配列表等を通して同義的および交換可能に使用される。
ＥＨＶ−４プロモーターは、ウイルスによって提供されるトランス活性化タンパク質でトランス活性化された領域、およびトランケートされた転写的に活性なプロモーターが由来する完全長プロモーターの最小プロモーター領域を含む、好ましくはトランケートされた転写的に活性なプロモーターである。本明細書の目的のために、「プロモーター」は、最小プロモーターおよび上流の制御配列に対応するＤＮＡ配列の結合からなる。「最小プロモーター」は、ＣＡＰ部位プラスＴＡＴＡボックス（基本レベルの転写のための最小配列；未制御レベルの転写）からなり、「上流の制御配列」は、上流のエレメントおよび／またはエンハンサー配列からなる。さらに、用語「トランケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」は、完全長プロモーターが完全には存在しないこと、すなわち、完全長プロモーターのある程度の部分が除去されていることを示す。好ましい実施形態でのトランケートプロモーターは、ウマヘルペスウイルス４（本明細書では４ｐｇＧ６００（配列番号２９）、４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）と呼ばれるＥＨＶ−４ゲノム）に由来し、トランケートプロモーターは、それぞれ完全長配列に由来するｐｇＧ４３０（配列番号３１）またはｇＭＣＰ４５５（配列番号３２）である。
プロモーターは、例えば、それぞれウマ４ｐｇＧ６００（配列番号２９）、４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）による塩基対に基づく完全長プロモーターから、５％、１０％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、およびさらには９０％までのサイズの低減があるようにトランケートすることができる。実際に、本発明のトランケートプロモーターは、トランケートプロモーターが挿入されるウイルスまたは系によって提供されるトランス活性化タンパク質によりトランス活性化されるトランケーション内の任意の領域から基本的になってもよく、故に最小プロモーターである。
本発明のトランケートされた「転写的に活性な」または「コンピテントな」プロモーターは、ウマヘルペスウイルス４ゲノムに由来するトランケートされた転写的に活性な真核生物ヘルペスウイルスプロモーター、ＥＨＶ−４ ｇＧ４３０（配列番号３１）およびｇＭＣＰ４５５（配列番号３２）プロモーターを指す。「活性な」（または「コンピテントな」）により、トランケートされた転写的に活性なプロモーターは、完全長プロモーターの転写活性の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％を示すべきである。完全長プロモーターのヌクレオチドまたは部分もしくは領域の欠失は、図示されたものに加えて活性断片の生成に関する本明細書の教示から、過度な実験をすることなく行うことができる。
本発明の実施において有用なプロモーターは、したがって、十分なプロモーター活性およびそれ故にプロモーターとしての機能を維持し、誘導体またはサブ断片が由来する実際のまたは完全長のプロモーターのものと実質的に類似したプロモーター活性を有利には有する、完全長プロモーターの誘導体および／またはサブ断片を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「誘導体」または「サブ断片」は、野生型プロモーターと比較した場合、プロモーター配列が実質的に同等の機能を有するようにトランケーションおよび／または置換／欠失などの改変を有する核酸配列を指す。これらの誘導体またはサブ断片は、部位特異的変異誘発によるように故意であり得、または自然発生的であり得るわずかな改変を有する核酸配列を含む。プロモーターが、例えば、目的の抗原をコードする作動可能に連結されたポリペプチドの発現を駆動するのに「転写的に活性な」または「コンピテントな」ままである限り、用語「誘導体」は、配列に対する欠失、付加および置換をさらに企図する。
用語「エンハンサー」は、ｃｉｓ位置にあるポリヌクレオチド配列を意味し、プロモーターの活性に作用し、したがって、このプロモーターに機能的に結合した遺伝子またはコード配列の転写を刺激する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの効果は位置および方向に非依存的であり、したがってそれらは、イントロン内またはコード領域内でさえも転写ユニットの前または後に位置することができる。エンハンサーは、転写ユニットのすぐ近くとプロモーターからかなり距離のある位置の両方に位置し得る。プロモーターと物理的および機能的なオーバーラップを有することもできる。当業者は、様々な起源由来の（およびＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに寄託された、例えばＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）多くのエンハンサーを把握しており、それらは非依存的なエレメントまたはポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメントとして利用可能である（例えば、ＡＴＣＣに寄託され、または市販され、および個々の起源）。多くのプロモーター配列はまた、頻繁に使用されるＣＭＶプロモーターなどのエンハンサー配列も含有する。ヒトＣＭＶエンハンサーは、これまでに同定された最も強いエンハンサーの１つである。誘導性エンハンサーの１つの例は、メタロチオネインエンハンサーであり、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得る。
用語「相補的ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの２対の鎖の１つの鎖を記載する。相補的な鎖のヌクレオチド配列は、各アデノシンはチミン（またはＲＮＡの場合はウラシル）、各グアニンはシトシン、逆もまた同様になるように、その対の鎖のヌクレオチド配列を写す。例えば、５’−ＧＣＡＴＡＣ−３’の相補的ヌクレオチド配列は３’−ＣＧＴＡＴＧ−５’、またはＲＮＡの場合は３’−ＣＧＵＡＵＧ−５’である。
用語「遺伝子」、「目的の遺伝子」は、本明細書で使用する場合、同じ意味を有し、目的の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コード配列の前（５’非コードまたは非翻訳配列）および後（３’非コードまたは非翻訳配列）に制御配列をさらに含んでよい。選択された配列は全長またはトランケート、融合、またはタグ化遺伝子であってよく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡ断片であってよい。ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡは、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からスプライシングされ、したがって、同じポリペプチドまたはＲＮＡをコードするｃＤＮＡには存在しない、非コード領域（すなわち、イントロン）を含み得ることが通常理解される。それは、天然配列、すなわち自然発生的な形態であってよく、または変異され、または異なる起源由来の配列を含んでもよく、そうでなければ所望のように改変されてもよい。これらの改変は、選択された宿主細胞またはタグ付けにおけるコドン利用を最適化するコドン最適化を含む。さらに、それらは、例えば（潜在性の）スプライスドナー、アクセプター部位および枝分かれ点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム進入部位、繰り返し配列、二次構造（例えば、ステムループ）、転写因子または他の制御因子の結合部位、制限酵素部位等のｃｉｓ作用性部位の除去または付加を含み、限定はされないが、わずかな例を挙げることができる。選択された配列は、分泌、細胞質、核、膜結合または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。
定義により、「エピトープ」は、宿主に投与されると、体液性型（Ｂ細胞）および／または細胞性型（T細胞）の免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性な抗原決定基である。これらは、分子上の抗原性の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原エピトープを特異的に結合する。エピトープの特定の非限定的な例としては、ポリペプチド中のテトラペプチドからペンタペプチド配列、多糖類中のトリグリコシドからペンタグリコシド配列が挙げられる。動物では、ほとんどの抗原が、いくつかのまたはさらに多くの抗原決定基を同時に提示するであろう。そのようなポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドとして認めることもでき、エピトープはさらに記載されるように同定され得る。
「目的のエピトープ」は、例えば、非限定的な例：パラミクソウイルス抗原、例えば、ＨＡまたはＦのようなイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）抗原、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）抗原、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ｂＰＩＶ３）；狂犬病糖タンパク質、例えば、狂犬病糖タンパク質Ｇ；鳥インフルエンザ抗原、例えば、七面鳥インフルエンザＨＡ、核タンパク質（ＮＰ）のようなニワトリ／ペンシルバニア／１／８３インフルエンザ抗原；ウシ白血病ウイルス抗原、例えば、ｇｐ５１、３０エンベロープ；ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原、例えば、ＨＮまたはＦ；ネコ白血病ウイルス抗原（ＦｅＬＶ）、例えば、ＦｅＬＶエンベロープタンパク質；ヘルペスウイルス糖タンパク質、例えば、ネコヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、またはイヌヘルペスウイルス（イヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣまたはｇＤ）由来の糖タンパク質；フラビウイルス抗原、例えば、西ナイルウイルスまたはダニ媒介脳炎ウイルス抗原；免疫不全ウイルス抗原、例えば、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）抗原；パルボウイルス抗原、例えば、イヌパルボウイルスＶＰ２抗原；ウマインフルエンザ抗原；マレック病ウイルス抗原；ポックスウイルス抗原、例えば、鶏痘ウイルス抗原；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原、例えば、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４；コロナウイルス抗原、例えばブタコロナウイルス（ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶおよびデルタコロナＳＰＩＫＥ抗原）、イヌ、および／またはネコ、家禽（例えば伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ））由来のもの；またはペスチウイルス抗原、例えば、ウシウイルス性下痢症ウイルス抗原などの、獣医学的病原体または毒素の抗原、または獣医学的病原体もしくは毒素の抗原由来、または病原体に関して応答を誘発する別の抗原もしくは毒素、または病原体に関して応答を誘発する別の抗原または毒素由来であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「目的のヌクレオチド配列」または「目的の配列」は、必ずしも遺伝子を含まないが、遺伝子または他の遺伝情報のエレメントまたは部分、例えばｏｒｉ（複製オリジン）を含み得るため、目的の遺伝子より一般的な用語である。目的のヌクレオチド配列は、それがコード配列を含むかどうかに非依存的な任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得る。
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、翻訳開始シグナルまたはＡＴＧもしくはＡＵＧなどの開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列の長さを指す。
用語「転写」は、細胞でのｍＲＮＡの生合成を記載する。
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞内での核酸配列の転写および／または翻訳を指す。本発明の特定の態様に従って、用語「発現」は、宿主細胞内での異種および／または外来性核酸配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞における所望の産物の発現レベルは、細胞に存在する相当するＲＮＡまたはｍＲＮＡの量、または選択された配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡプロテクション、細胞内ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、またはＲＴｑＰＣＲ（逆転写後の定量的ＰＣＲ）によって定量され得る。選択された配列から発現されたタンパク質は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロットによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降によって、タンパク質の生物活性のアッセイによって、またはタンパク質の免疫染色後のＦＡＣＳ解析によって定量され得る。
用語「発現カセット」または「転写ユニット」または「発現ユニット」は、転写される１つまたは複数の遺伝子を含有するベクター、構築物またはポリヌクレオチド配列内の領域を定義し、転写される遺伝子をコードするヌクレオチド配列ならびに発現カセット内に含有される制御エレメントを含有するポリヌクレオチド配列が、互いに作動可能に連結されている。それらは、プロモーターから転写され、転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルによって終結される。１つの特定の態様では、それらは１つの単一のプロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子は少なくとも転写的に連結されている。１つより多くのタンパク質または産物は転写され、各転写ユニット（マルチシストロン転写ユニット）から発現される。各転写ユニットは、ユニット内に含有される任意の選択された配列の転写および翻訳に必要な制御エレメントを含むであろう。各転写ユニットは、同じまたは異なる制御エレメントを含有し得る。例えば、各転写ユニットは、同じターミネーターを含有してもよく、ＩＲＥＳエレメントまたはイントロンは、転写ユニット内での遺伝子の機能的な連結に使用され得る。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は１つより多くの転写ユニットを含有し得る。
用語「発現増加」、「力価または生産性増加」または「発現または生産性改善」により、好適な対照との比較、例えば、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質対イントロン含有遺伝子によってコードされるタンパク質による、宿主細胞に導入された異種および／または外来性配列、例えば治療タンパク質をコードする遺伝子の発現、合成または分泌の増加を意味する。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍または５倍増加した場合、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍または少なくとも１．５倍または少なくとも２倍または少なくとも３倍増加した場合も、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍〜５倍、好ましくは１．５倍〜５倍、より好ましくは２倍〜５倍、特に好ましくは３倍〜５倍増加した場合も、特別な力価または生産性増加がある。「発現増加」は、そのうえ、より多くの細胞が目的の遺伝子／配列を実際に発現することを意味し得る。例えば発現は、本発明の新しいプロモーターが、別のプロモーターによってもたらされた発現と比較して、検出可能な導入遺伝子発現を発現または有する回収細胞数の点で増加していることを意味し得る。発現増加は、細胞ごとに検出可能なｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの増加も意味し得る。
発現、力価または生産性増加は、本発明に記載の異種ベクターを使用することによって得ることができる。これは、追加の選択可能マーカーとして、１つまたは複数の蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）または細胞表面マーカーを含有する組換え宿主細胞のＦＡＣＳアシスト選択などの他の手法と組合せることができる。発現増加を得る他の方法、および使用することができる異なる方法の組合せも、例えばクロマチン構造（例えば、ＬＣＲ、ＵＣＯＥ、ＥＡＳＥ、アイソレーター、Ｓ／ＭＡＲｓ、ＳＴＡＲエレメント）の操作のためのｃｉｓ活性エレメントの使用、（人工）転写因子の使用、内在性または異種および／または外来性遺伝子発現を上方制御するための天然または合成剤による細胞の処置、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性（半減期）の改善、ｍＲＮＡ翻訳の開始の改善、エピソーム性プラスミドの使用による遺伝子用量の増加（複製オリジンとしてウイルス配列の使用に基づく、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＥＢＶ、またはＢＰＶ）、ＤＮＡコンカテマーに基づく増幅促進配列またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅システムの使用に基づく。
「発現増加」を測定するためのアッセイは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）などのＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのタンパク質測定；ウェスタンブロット、ドットブロット、または免疫拡散法、フローサイトメトリーなどの抗体ベースの検出方法；ならびに間接免疫蛍光（ＩＦＡ）、および赤血球凝集アッセイによる生物活性の測定である。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの調節下で転写されるｍＲＮＡの定量によって間接的に測定される。ｍＲＮＡは、内因性の標準と比較して、ＲＴｑＰＣＲによって定量される。
用語「ウイルス力価」は、ウイルス調製物の容積当たりの感染ユニットの測定である。ウイルス力価は、生物学的手順のエンドポイントであり、並行して行った試験の特定の割合で効果を示す希釈率として定義される（Reed and Muench, 1938）。特に、１ミリリットル当たりの組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、その希釈率で並行して接種された細胞培養の数の５０％が感染する、ウイルス調製物の希釈率を与える。
「転写制御エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、転写一次産物、すなわちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる最初の核酸に相当する構築物の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてよい。
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡ」または転写終結部位」または「転写終結エレメント」は、真核生物のｍＲＮＡの３’端の特異的部位での切断、および切断された３’端での約１００〜２００アデニンヌクレオチド（ポリＡテイル）の配列の転写後組込みを引き起こし、したがって、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは切断部位および下流に位置する配列の約１０〜３０ヌクレオチド上流に配列ＡＡＴＡＡＡを含む。ｔｋ ポリＡ、ＳＶ４０後期および初期ポリＡ、ＢＧＨ ポリＡ（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号に記載）またはハムスター増殖ホルモンポリＡ（国際公開第２０１００１０１０７号）など、様々なポリアデニル化エレメントが公知である。
「翻訳制御エレメント」は、発現される各個々のポリペプチドに翻訳開始部位（ＡＵＧ）、終止コドンおよびポリＡシグナルを含む。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、いくつかの構築物に含まれてよい。発現を最適化するため、発現される核酸配列の５’−および／または３’−非翻訳領域を除去、付加、または変更し、転写または翻訳のいずれかのレベルで、発現を干渉または減少させ得る、任意の潜在的に余分で不適切な代わりの翻訳開始コドンまたは他の配列を除外することが得策であり得る。コンセンサスリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列）は開始コドンのすぐ上流に挿入され、翻訳、したがって発現を増強することができる。このリボソーム結合部位周辺の増加Ａ／Ｕ含量は、さらにリボソーム結合により効果的である。
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、異なる（ウイルス）種に由来する場合、宿主細胞に対して、「外来性」、「外来性配列」、「外来性遺伝子」、「外来性コード配列」と呼ばれる。したがって、本発明のＥＨＶ−４ベースのプロモーターは、ＣＡｄＶベクターを考慮して外来性である。イヌではない抗原など、目的の任意のイヌではない配列または遺伝子は、したがって、目的の外来性配列もしくは遺伝子または本発明の特定の態様に記載の抗原である。
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、宿主細胞に対して、「異種、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種コード配列」、「導入遺伝子」または「異種タンパク質」と呼ばれる。これは、導入される配列または導入される遺伝子が、宿主細胞の内在性配列または内在性遺伝子と同一である場合でさえも適用する。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「異種」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原は、その天然種の背景の外で発現されることを意味する。
用語「非天然型」は、この文脈において天然には生じない抗原などの目的の任意の配列または遺伝子、例えば異なる種由来の抗原などの目的のハイブリッド配列もしくは配列もしくは遺伝子、または人工的な変異、挿入、欠損等により天然の産物ではない、抗原などの目的の配列もしくは遺伝子を意味する。
用語「組換え」は、本発明の明細書を通して、用語「非天然型」、「異種」および「外来性」と交換可能に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列のいずれかから発現されるタンパク質である。ウイルスに関して使用される場合、用語組換えは、ウイルスゲノムの人工的な操作によって産生されるウイルスを意味する。外来性抗原コード配列など、異種または外来性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。用語組換えウイルスおよび用語非天然型ウイルスは、交換可能に使用される。
したがって、用語「異種ベクター」は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。用語「組換えベクター」は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」は、制御エレメントと遺伝子またはそのコード領域の間の接続を記載するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つまたは複数の制御エレメント、例えば、限定はされないが、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的制御エレメント、およびエンハンサーの調節下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、制御エレメントと「作動可能に連結される（operably linked to）」または「作動可能に連結される（operatively linked to）」または「作動可能に関連する（operably associated with）」と言われ、遺伝子またはコード領域が制御エレメントによって調節または影響されることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。
さらに、本明細書の範囲内で、用語「機能的連結」、「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらが意図した方法で機能するように配置されることを意味する。例えば、ｃｉｓ位置で連結された遺伝子配列の転写を調節または調整することができる場合、ポロモーター／エンハンサーまたはターミネーターは、コード遺伝子配列に機能的に連結される。通常、必ずしもそうではないが、機能的に連結されたＤＮＡ配列は隣接し、２つのポリペプチドコード領域を合わせる必要がある場合または分泌シグナルペプチドの場合、隣接し、リーディングフレームである。しかしながら、作動可能に連結されたプロモーターは、通常、上流に位置し、作動可能に連結されたターミネーターは、通常、コード配列の下流に位置するが、必ずしもそれと隣接していない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加する限り、必ずしも隣接していない。このため、それらはコード配列の上流に位置することも、下流に位置することもあり、幾らか距離を隔てていることもある。ポリアデニル化部位は、コード配列を通ってポリアデニル化シグナルまで転写が進行するようにコード配列の３’端に位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。連結は、例えば、好適な制限部位もしくは平滑末端でのライゲーションにより、または融合ＰＣＲ法を使用することにより、当技術分野で公知の組換え方法によって達成される。合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターは、好適な制限部位が存在しない場合、従来の実行と一致して使用され得る。
したがって、プロモーター配列の、用語「機能的断片または誘導体」は、断片または誘導体が依然としてプロモーター活性が有効であることを意味する。プロモーター活性の評価方法の機能的アッセイは、当業者に周知である（Bustin, S. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25(2): 169-193; Nolan, T. Rebecca E Hands, R.E., and Bustin S.A. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols 1: 1559-1582）。そのような機能アッセイの例示的な実施形態としては、例えば、プロモーター動態実験が挙げられる。プロモーターまたはその断片がレポーター導入遺伝子の転写を導く発現カセットを有するベクターウイルスを感染させた細胞は、異なる時間インキュベートされる。全ＲＮＡは、感染後の異なる時間で回収された試料から調製される。ＤＮａｓｅＩ消化によるコンタミネートしたＤＮＡの破壊後、ＲＮＡは逆転写される。ＲＮＡ調製物からのコンタミネートしたＤＮＡの除去の成功を実証するため、１つの複製試料が逆転写酵素（ＲＴ）の添加によって処理され、２つ目の複製はＲＴの添加無しで処理される。生じるｃＤＮＡは精製され、従来のＰＣＲの鋳型として使用される。ＲＴの添加によって処理された試料のみがＰＣＲ産物を産生するはずである。これらのｃＤＮＡは、次いで、レポーター導入遺伝子のプライマーによるｑＰＣＲに、ウイルスベクターの必須遺伝子（内部標準遺伝子）のプライマーによるものと並行して使用することができ、その転写は、感染および複製の効率のための内部標準を提供する。レポーターのｑＰＣＲ値は、内部標準遺伝子のｑＰＣＲ値を使用して、異なる構築物および感染後の時間の間でノーマライズされる。これは、異なるプロモーターおよびその断片のプロモーター活性の解釈を可能にする。
「配列相同性」は、本明細書で使用する場合、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するため、２つまたはそれ以上の配列が最適にアラインされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、配列相同性を決定する場合には、保存的なアミノ酸置換は一致としてカウントされる。言い換えると、参照配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るため、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の参照配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドが一致しなければならず、別のアミノ酸またはヌクレオチドとの保存的な置換を含まなければならない、または、参照配列における、保存的な置換を含まない、全アミノ酸残基またはヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのアミノ酸またはヌクレオチドの数が、参照配列に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、少なくとも５０、さらにより好ましくは１００、さらにより好ましくは２５０、さらにより好ましくは５００ヌクレオチドのストレッチを含む。
当技術分野で公知のように、「配列同一性」は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち、参照配列と、参照配列と比較される所与の配列の間の関係を指す。配列同一性は、配列が最適にアラインされた後に所与の配列を参照配列と比較することによって決定され、そのような配列のストリング間の一致により決定されるように、最も高い程度の配列類似性を産生する。そのようなアライメントにより、配列同一性は、位置ごとに確認され、例えば配列は、その位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合、特定の位置で「同一」である。そのような位置同一性の総数は、次いで参照配列のヌクレオチドまたは残基の総数によって割られ、％配列同一性を与える。配列同一性は、限定はされないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものを含む公知の方法によって容易に算出することができ、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列間で最大の一致を与えるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する一般的に利用可能なコンピュータープログラムでコード化される。そのようなプログラムの例としては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に利用可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、その教示は参照により本明細書に組み込まれる）。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列の間に最高レベルの配列同一性を産生するため、デフォルトのギャップ重み付けを使用して配列を最適にアラインする。例として、参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチド当たり１５まで、好ましくは１０まで、さらにより好ましくは５までの点変異を含み得ることを除いて、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列のヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までが欠損または別のヌクレオチドによって置換され、参照配列の総ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのヌクレオチドの数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列、または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかのヌクレオチド中で個々に分散される。同様に、参照アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸当たり１５まで、好ましくは１０、９、８、７、６まで、さらにより好ましくは５、４、３、２、１までのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照アミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るため、参照配列のアミノ酸残基の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までが欠損または別のアミノ酸と置換され、参照配列のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までのアミノ酸の数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかの残基中で個々に分散される。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、配列同一性を決定する場合、保存的置換は一致として含まれない。
用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、本明細書において交換可能に使用される。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適な比較目的のためにアラインされることが本明細書において規定される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸または核酸の配列に導入され得る）。相当するアミノ酸またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸またはヌクレオチド残基が、次いで比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の相当する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置の総数（すなわちオーバーラップする位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって、または２つの配列の断片にわたって行われ得る。典型的には、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われる。しかしながら、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基の領域にわたって行われ得る。
当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータープログラムが利用可能であることを知っている。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数値計算用アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けならびに１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けのいずれかを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して決定される。当業者は、これら全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを使用する場合著しくは変更されないことを認識する。
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、「問い合わせ配列」としてさらに使用され、公共のデータベースに対して検索を実施し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され、本発明のタンパク質分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るため、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメーターが使用され得る。国立バイオテクノロジー情報センターのホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照。
ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、及びＣＡｄＶ／組換えベクター技術の定義
用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ、ロバ、およびシマウマを含み、好ましくはウマである、ウマ科を意味するまたはウマ科に属する。さらに、用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ科のメンバーのハイブリッドも包含する（例えば、ラバ、ケツテイ等）。
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
用語「ウマヘルペスウイルスベクター」または「ウマヘルペスウイルス」は、ウマに感染するヘルペスウイルス科のメンバーを意味する。これまでのところ、８つの異なる種のウマヘルペスウイルスが同定され、５つはアルファヘルペスウイルス亜科に属し、３つはガンマヘルペスウイルス科に属する。（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)
用語「ＥＨＶ−１」は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマヘルペスウイルス１型を意味する。ＥＨＶ−１の非限定的な参照配列は、例えば野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）またはＲａｃＨ（Hubert, P. H., Birkenmaier, S., Rziha, H.-J. and Osterrieder, N. (1996), Alterations in the Equine Herpesvirus Type-1 (EHV-1) Strain RacH During Attenuation. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 43: 1-14.）であろう。
用語ＥＨＶ−４は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマヘルペスウイルス４型を意味する。
用語「ＣＡｄＶ」、「ＣＡＶ」、「ＣＡＶ−１」または「ＣＡＶ−２」は、それぞれ、アデノウイルス科のマストアデノウイルス属のメンバー、イヌアデノウイルス１型または２型を意味する。しかしながら、より新しい分類学（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)によると、用語イヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）は現在、ＣＡＶ−２およびＣＡＶ−１の両方の種を包含する。
「組換えＣＡｄＶベクター」または「ｒＣＡｄＶ」および／または「ｒＣＡｄＶベクター」または「ｒＣＡｄＶ」または「ｒＣＡｄＶ２」は、例えば導入遺伝子発現マーカー（緑色蛍光タンパク質など）、ならびに好ましい実施形態では少なくとも１つの「目的の遺伝子」および／または「目的のエピトープ」をコードする、少なくとも１つの外来性発現カセット（すなわち、プロモーター、エンハンサー、および他の好適な制御エレメントと作動可能に連結したコード配列を含有する）を含むイヌアデノウイルスを指す。
ｒＣＡｄＶベクターは、ウイルス学および分子生物学の分野の当業者に公知の標準的な方法によって作製することができる。しかし、ＣＡｄＶゲノムの操作およびベクターの作製を促進するために、本発明は、ＣＡｄＶゲノムをコードする核酸を含有する細菌シャトルベクター、１つの非限定的な例ではｐＢＲ３２２プラスミドも提供する。さらに、細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）も、細菌系でのＣＡｄＶの操作を促進することができる。
ワクチンの定義
「免疫原性または免疫学的組成物」は、組成物に対する細胞または抗体媒介性免疫応答の宿主での免疫学的応答を引き出す少なくとも１つの抗原、またはその免疫原性部分を含む物質の組成物を指す。
本明細書で使用する用語「抗原」は、当技術分野で周知であり、免疫原性、すなわち免疫原である物質、ならびに免疫学的不応性、または免疫不応答、すなわち外来物質に対する体の防御機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、エピトープを含有するまたは含む、全長タンパク質ならびにそのペプチド断片を意味することが意図される。
本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」は、例えば、本明細書に記載のように免疫学的応答を引き出すウイルス表面タンパク質など、ポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。用語「免疫原性断片」または「免疫原性部分」は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって、本明細書に記載の免疫学的応答を引き出すタンパク質またはポリペプチドの断片またはトランケートおよび／または置換形態を指す。一般に、そのようなトランケートおよび／または置換形態、または断片は、全長タンパク質からの少なくとも６個の隣接するアミノ酸を含む。そのような断片は、当技術分野で周知のいくつかのエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey参照。例えば、線状エピトープは、タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時合成し、ペプチドが依然として支持体に結合しているうちに、ペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。そのような技術は公知であり、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715参照。同様に、構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴によるなどアミノ酸の空間的な構造を決定することにより容易に同定される。上記のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照。合成抗原も、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原の定義内に含まれる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998参照。（その教示および内容は全て本明細書に参照により組み込まれる。）
本発明は、組換えＣＡｄＶウイルスまたはベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含有する「免疫原性組成物」、または「ワクチン組成物」をさらに提供する。組換えＣＡｄＶウイルスまたはベクター（またはその発現産物）を含有する免疫原性組成物は、免疫学的応答--局所または全身を誘発する。応答は防御的であり得るが、防御的である必要はない。ワクチン組成物は、局所または全身の防御的応答を誘発する。したがって、用語「免疫原性組成物」は、「ワクチン組成物」を含む（２つの前の用語は防御的組成物であり得るため）。
本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、動物の免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの免疫学的活性成分、および可能だが必ずではない活性成分の免疫学的活性を増強する１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物を指す。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。区別すると、ワクチンの免疫学的活性成分は、いわゆる改変生ワクチン（ＭＬＶ）でのその元々の形態または弱毒化粒子のいずれかの完全なウイルス粒子、またはいわゆる死菌ワクチン（ＫＶ）での適切な方法によって不活性化された粒子を含み得る。別の形態では、ワクチンの免疫学的活性成分は、生物の適切なエレメント（サブユニットワクチン）を含んでよく、これらのエレメントは、粒子全体を破壊すること、またはそのような粒子を含有する増殖培地のいずれか、および任意選択により所望の構造を産生する続く精製ステップによって、または例えば細菌、昆虫、哺乳動物、もしくは他の種に基づく好適なシステムの使用による適切な操作を含む合成プロセスによって、さらに任意選択により続く単離および精製手順、または好適な医薬組成物（ポリヌクレオチドワクチン接種）を使用する遺伝材料の直接組込みによるワクチンを必要とする動物における合成プロセスの誘導によって生成される。ワクチンは、１つのまたは同時に１つより多くの上記のエレメントを含み得る。本発明の特定の態様内で使用される場合、「ワクチン」は生ワクチンまたは生ウイルスを指し、組換えワクチンとも呼ばれる。本発明の別の特定の態様では、「ワクチン」は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む不活性化または死菌ウイルスを指す。したがって、ワクチンは、サブユニットワクチンまたは死菌（ＫＶ）または不活性化ワクチンであってよい。
「動物」により、哺乳動物、ヒト、トリ等がが意図される。動物は、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ）、シマウマ、ロバ）、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（例えば、イヌ（ｄｏｇ）、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）（例えば、ライオン、トラ、イエネコ、野生のネコ、他の大型ネコ、ならびにチーターおよびオオヤマネコを含む他のネコ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）（例えば、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ウシ（ｃｏｗ）、バッファロー）、ブタ（ｓｗａｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））、トリ（ａｖｉａｎ）（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ）、霊長類（例えば、原猿類、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）、および魚からなる群から選択され得る。用語「動物」は、胚形成期および胎児期を含む全ての発生段階における個々の動物も含む。用語「食品生産動物」は、ウシ、ブタ、ウマ、家禽、ヒツジ、魚等などの、ヒトによる消費のために使用されるイヌ以外の動物を意味し、好ましくは食品生産動物は、ブタおよびウシ、最も好ましくはブタを意味する。
イヌ以外の伴侶動物の例はネコ種を含む。
イヌ以外の動物への投与のために、組換えＣＡｄＶは、増殖性複製を伴わない発現という利点を提供する。イヌアデノウイルスの複製はイヌ種に限られ、ヒトを含むイヌ以外のいずれの種においても増殖性感染を引き起こすＣＡｄＶ２の文献での報告はない。この宿主制限は、他の種へのウイルスの伝播に対する固有の安全バリアを提供し、いくつもの種において獣医学的用途でのＣＡｄＶ２ベースのワクチンベクターの使用を魅力的な提案にしている。したがって、本発明は、宿主に組換えＣＡｄＶ２ウイルスまたはベクターを投与または接種してタンパク質を増幅または発現させるための方法を包含する。これにより宿主はイヌではなく、または組換えウイルスもしくはベクターの天然の宿主ではなく、ならびに／または増殖性複製を伴わないおよび／もしくは複製サイクルが限られた形で発現が生じる。
ＣＡｄＶ、および特にＣＡｄＶ２は、イヌにおいてワクシニア株として使用されるため、イヌ動物への投与のために、本発明は、目的の追加のエピトープ、例えば、イヌ病原体または毒素の抗原を導入するための手段を提供する。それによりｒＣＡｄＶ２ベクターにコードされる目的の追加のエピトープの発現は、イヌまたは子イヌにワクシニア組換えＣＡｄＶ２を接種してそれらの目的のエピトープおよびイヌアデノウイルスに対する応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘発する手段を提供する。追加の目的のエピトープは、イヌ病原体（アデノウイルス以外の）の抗原、イヌ病原体（アデノウイルス以外の）の抗原由来、イヌまたは子イヌにおいてイヌ病原体（アデノウイルス以外の）に対する応答を誘発する別の抗原、またはイヌまたは子イヌにおいてイヌ病原体（アデノウイルス以外の）に対する応答を誘発する別の抗原由来であってもよい。
したがって、本発明は、組換えＣＡｄＶ２が、イヌ病原体例：狂犬病、イヌヘルペスウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス等の任意の抗原由来の目的のエピトープをコードする異種ＤＮＡを含有できることを提供する。本発明の実施形態は、１つを超えるタンパク質をコードする、例えば、イヌ病原体の抗原などの２つ以上のエピトープをコードする外来性ＤＮＡを含有するＣＡｄＶ組換え体を含む。本発明は、他の抗原と組み合わせてＣＡｄＶ組換え体を含有する組成物も想定する。
イヌ以外の動物への投与のために、本発明は、目的のエピトープを導入するための手段を提供し、目的の抗原エピトープは、ウシ病原体：ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、パラインフルエンザ３ウイルス（ＰＩ−３）、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）、ウシエンテロウイルス（ＢＥＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ウシ狂犬病（ＢＲ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、アデノウイルス、アストロウイルス、マンヘミア・ヘモリチカ（以前はパスツレラ・ヘモリチカ）、パスツレラ・マルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス（ヒストフィルス・オビスおよびヘモフィルス・アグニ）、アクチノマイセス（コリネバクテリウム）、アクチノマイセス・ピオゲネス、クラミジア・シッタシ、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・フィタス・フィタス（以前はＣ・フィタス・インテスチナリス）、レプトスピラ・インテロガンス、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・グリッポチフォーサ、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリッポチフォーサ、レプトスピラ・ハージョ（レプトスピラ・ハージョプラジトノおよびレプトスピラ・ハージョボビス）、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・スイスおよびブルセラ・メリテンシス、リステリア・モノサイトゲネス、クラミジア・シッタシ、クロストリジウム ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ヘモリチクム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニ、モラキセラ・ボビス、クレブシエラ属種、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモネラ・ティフィムリウム；サルモネラ・ニューポート、ヨーネ菌（マイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス）、トリ結核菌属種、クリプトスポリジウム・パルバム、クリプトスポリジウム・ホミニス、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・アガラクチア、大腸菌（エスケリキア・コリ）、マイコプラズマ属種、マイコプラズマ・ディスパー、およびウレアプラズマ属種、トリトリコモナス・フィータス、トリコフィトン・ベルコーズム、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・サルキソヴィー、ネオスポラ・カニナム（以前はトキソプラズマ・ゴンディ）、バベシア・ビゲミナおよびバベシア・ボビス、ディクチオカウルス・ヴィヴィパロウス（肺虫症）、ならびにそれらの組み合わせの群から選択されるもののような食品生産動物病原体に由来する抗原である。イヌ以外の動物への投与のために、本発明は、目的のエピトープを導入するための手段を提供し、目的の抗原エピトープは、ブタ病原体：サルモネラ属種、特にＳ．ティフィムリウム、Ｓ．コレラスイス；アストロウイルス；ロタウイルス；伝染性胃腸炎ウイルス；ブラキスピラ属種、特にＢ．ヒオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ；クロストリジウム属種、特にＣ．ディフィシル、ウェルシュ菌（Ｃ．パーフリンゲンス）Ａ、ＢおよびＣ型、Ｃ．ノビイ、Ｃ．セプチカム、Ｃ．テタニ；ブタ腸管ピコルナウイルス；ブタ腸管カリシウイルス；アクチノバシラス・プルロニューモニエを含む呼吸器病原体；ボルデテラ・ブロンキセプティカ；エリシペロスリクス・ルシオパシエ；ヘモフィルス・パラスイス、特に亜型１、７および１４；パスツレラ属種、特にＰ．マルトシダ；マイコプラズマ属種、特にＭ．ハイオニューモニエ、Ｍ．ヒオリニス；ブタインフルエンザウイルスＡ型；ＰＲＲＳウイルス；ブタサーコウイルス；ブタパルボウイルス；仮性狂犬病ウイルス；エペリスロゾーノシス・スイス、マイコバクテリウム属種、特にＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．ボビス；ブタ呼吸器コロナウイルス；ブタコロナウイルス、特にＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、およびデルタコロナウイルス；アルカノバクテリウム・ピオゲネス；ブタアデノウイルス；豚コレラ；ブタサイトメガロウイルス；アフリカ豚コレラ；または、大腸菌（エスケリキア・コリ）、ストレプトコッカス属種、特にＳ．スイス、Ｓ．ポルシナス、Ｓ．ディスガラクティエ、好ましくは亜種エクイシミリス；ブルセラ・スイス、特に次亜種１、２および３型；レプトスピラ属種、特にＬ．オーストラリス、Ｌ．カニコーラ、Ｌ．グリッポチフォーサ、Ｌ．ポモナ、Ｌ．イクテロヘモラジア、Ｌ．インターロガンス、Ｌ．タラソビ、Ｌ．ハージョ、Ｌ．セジュロ；脳心筋炎ウイルス；赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス；日本脳炎ウイルス；西ナイルウイルス；レオウイルス；ルブラウイルス；メナングルウイルス；ニパウイルス；水疱性口内炎ウイルス；ブタの水疱性発疹のウイルス：ブタポックスウイルス；ブタヘルペスウイルス；およびスタフィロコッカス・ヒカスを含む他の病原体、ならびにそれらの組み合わせの群から選択されるもののような食品生産動物病原体に由来する抗原である。
用語「ＤＮＡワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」は、好適な医薬組成物を使用する遺伝材料の直接接種を意味する。
不活性化の様々な物理的および化学的方法が当技術分野で公知である。用語「不活性化」は、照射（紫外線（ＵＶ）、Ｘ線、電子ビームまたはガンマ照射）、加熱、または化学的に処置され、その免疫原性を保持しながらそのようなウイルスまたは細菌を不活性化または死滅させた、以前は毒性だったまたは非毒性ウイルスまたは細菌を指す。好適な不活性化剤としては、ベータ−プロピオラクトン、バイナリーまたはベータまたはアセチルエチレンイミン、グルテルアルデヒド（gluteraldehyde）、オゾン、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）が挙げられる。
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活性化のため、ホルムアルデヒドを、典型的には水およびメチルアルコールと混合して、ホルマリンを作製する。メチルアルコールの添加により、活性化プロセス中の分解または交差反応を防ぐ。一実施形態では、３７％ホルムアルデヒド溶液の約０．１〜１％を使用して、ウイルスまたは細菌を不活性化する。材料は不活性化されるが、高用量による副作用が起こるほど多くないことを確実にするように、ホルマリンの量を調節することが重要である。
より詳細には、ウイルスの文脈における用語「不活性化」は、ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複製することができないことを意味し、細菌の文脈における用語「不活性化」は、細菌がｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できないことを意味する。例えば、用語「不活性化」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで繁殖し、次いでもはや複製できないように化学的または物理的な手段を使用して不活性化されたウイルスを指し得る。別の例では、用語「不活性化」は、繁殖し、次いでワクチンの成分として使用され得るバクテリンを生じるなど、細菌、細菌の断片または成分の懸濁液を生じる、化学的または物理的な手段を使用して不活性化された細菌を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「不活性化」、「死菌」または「ＫＶ」は交換可能に使用される。
用語「生ワクチン」は、生きた生物または複製可能なウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
「医薬組成物」は、それが投与される生物の、または住み着いている生物の、または生物上の生理学、例えば免疫学的機能を改変することができる１つまたは複数の成分から基本的になる。用語は、限定はされないが、抗生物質または駆虫薬、ならびに、例えば、限定はされないが、プロセシング特性、無菌性、安定性、経腸または非経口経路、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、または他の好適な経路を介して組成物を投与する可能性、投与後の耐性、または調節性放出特性などの特定の他の目的を達成するために一般に使用される他の構成成分を含む。そのような医薬組成物の１つの非限定的な例は、単に、実証目的のために挙げられ、以下のように調製され得る：感染細胞培養の細胞培養上澄み液は安定剤（例えば、スペルミジンおよび／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合され、混合物は続いて他の方法により凍結乾燥または脱水される。ワクチン接種の前に、混合物は次いで、水溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または非水性溶液（例えば、油エマルジョン、アルミニウムベースのアジュバント）中で再水和される。
組換えウイルスベクターベースのワクチンに関して、投与経路は、有利にはＳＣ、ＩＭ、ＴＤ、またはＩＤであり得る。この投与は、針を備えたまたは針なしシリンジ装置によってなされてもよい。本発明の実施形態は、経口（ｏｒａｌｌｙ）、鼻腔内、肛門、膣、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）、胃内、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与することができる。本発明の組成物の例としては、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤などの、開口部（例えば、経口（ｏｒａｌｌｙ）、鼻腔、肛門、膣、経口（ｐｅｒｏｒａｌｌｙ）、胃内等）投与用の液体調製物；および、滅菌懸濁液またはエマルジョンなどの、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射可能な投与）用の調製物が挙げられる。そのような組成物では、組換えＣＡｄＶ２および／または抗原は、滅菌水、生理食塩水、グルコース等などの好適な担体、希釈剤、または賦形剤と混合されていてもよい。組成物は凍結乾燥することもできる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化添加剤または増粘添加剤、保存剤、香味剤、着色料等などの補助物質を含有することができる。
１つの態様では本発明は、プライム投与およびブースト投与が、薬学的または獣医学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、またはビヒクル、および本発明の組換えＣＡｄＶを含む組成物を利用する、「プライムブースト」投与レジメンに基づくワクチン戦略に関する。
プライムブーストは、少なくとも１つの共通の抗原および／またはそのバリアントもしくは断片を用いる少なくとも１回のプライム投与および少なくとも１回のブースト投与を含む。プライム投与に使用されるワクチンは、後のブースターワクチンとして使用されるものと実際は異なっていてもよい。プライム投与およびブースト投与は両方とも、本発明の組換えＣＡｄＶを含んでもよいことがさらに留意される。プライム投与は、１回または複数回の投与を含んでもよい。同様に、ブースト投与は、１回または複数回の投与を含んでもよい。
本発明の別の態様は、本発明によるプライムブーストワクチン接種のためのキットに関する。キットは、少なくとも２つのバイアル、すなわち、本発明によるプライムワクチン接種のためのワクチンを含有する第１のバイアル、および本発明によるブーストワクチン接種のためのワクチンを含有する第２のバイアルを含んでもよい。キットは、追加のプライムワクチン接種または追加のブーストワクチン接種のための追加の第１のまたは第２のバイアルを有利には含有してもよい。
１つの実施形態では、キットは、一方が本発明によるプライムワクチン接種のためのプラスミドベースのワクチンを含有し、他方のバイアルが本発明によるブーストワクチン接種のための組換えウイルスベクターベースのワクチンを含有する、２つのバイアルを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「薬学的にまたは獣医学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。いくつかの好ましい実施形態、特に本発明での使用のための凍結乾燥免疫原性組成物、安定化剤を含むものは、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含有する。本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイドオイル；アルケンのオリゴマー化から生じるオイル、特にイソブテンまたはデセン；線状アルキル基を含有する酸のまたはアルコールのエステル、より具体的には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ−（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ−（カプリル酸／カプリン酸）またはプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸のエステルに基づき得る。オイルは乳化剤と組合せて使用され、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニド（例えば、無水マンニトールオレエート）のエステル、グリコールのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸の、エトキシル化されていてもよいエステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)参照。例示的なアジュバントは、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書籍の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルと架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は用語カルボマーで公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋したそのようなアクリルポリマーについて記載している米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体がメチルなどの他の置換基を含有し得る。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の名称で販売されている製品（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋されている。それらとしては、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーは、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）であり、これらは無水マレイン酸とエチレンのコポリマーである。これらのポリマーを水に溶解させることにより酸性溶液が生じ、これを、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、好ましくは生理的なｐＨまで中和する。
さらに好適なアジュバントとしては、多くの他のものもあり、限定はされないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌（エスケリキア・コリ）由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたは他の方法）、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４またはムラミルジペプチド、または天然に存在するもしくは組換えサイトカインもしくはその類似体または内在性サイトカイン放出の刺激薬が挙げられる。
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、好ましくは用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、より好ましくは用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量で、さらにより好ましくは用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加することができると予測される。あるいは、アジュバントは、最終製品の容積で約０．０１〜５０％の濃度、好ましくは約２％〜３０％の濃度、より好ましくは約５％〜２５％の濃度、なおさらに好ましくは約７％〜２２％の濃度、および最も好ましくは１０％〜２０％の濃度であってよい。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
「単離された」は、その天然の状態から「人間の手によって」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、その元々の環境から変更または取り出された、またはその両方であることを意味する。例えば、本明細書でその用語が用いられる場合、生きている生物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。
「弱毒化」は、病原体の毒性を低下させることを意味する。本発明では、「弱毒化」は「非病原性」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、感染の臨床徴候を引き起こさないが標的動物における免疫応答を誘導することはできるように毒性を低下させたものであるが、弱毒化ウイルス、特に請求項のようにＣＡｄＶウイルスベクターを感染させた動物における臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化していないウイルスまたは病原体を感染させ、弱毒化ウイルスを受けていない「対照群」の動物と比較して低下することも意味し得る。この場合、用語「低下する／低下した」は、上記で定義された対照群と比較して少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％、なおより好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、なおより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、および最も好ましくは１００％の低下を意味する。したがって、例えば請求項のように弱毒化ウイルスベクターなどの、弱毒化した非病原性病原体、特に請求項のようにＣＡｄＶウイルスベクターが、改変生ワクチン（ＭＬＶ）または改変生免疫原性組成物の生成に好適である。
本明細書では、「有効用量」は、限定はされないが、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、組成物の文脈では、動物において感染または付随する疾患の発生率を低下させるまたはその重症度を軽減する免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は、用量当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を指す。あるいは、療法の文脈では、用語「有効量」は、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のその症状の重症度または持続時間を低下または好転させるため、疾患または障害の前進を予防するため、疾患または障害の後退を引き起こすため、疾患または障害に付随する１つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を予防するため、または、別の療法または治療剤による予防もしくは処置を増強もしくは改善するために十分である療法の量を指す。
「免疫応答」または「免疫学的応答」は、限定はされないが、目的の（免疫原性）組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体により媒介される免疫応答の発生を意味する。通常、免疫応答または免疫学的応答は、限定はされないが、以下の作用の１つまたは複数を含む：目的の組成物またはワクチンに含まれる１つまたは複数の抗原を特異的に対象とする抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は治療的または防御的な免疫学的（記憶）応答のいずれかを示し、したがって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、および／または疾患の臨床的な重症度が低下する。そのような防御は、症状の数、症状の重症度の低下、もしくは病原体の感染に伴う症状の１つまたは複数の欠如、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルスの持続性の低下、全ウイルス負荷量の減少および／またはウイルス排泄の減少のいずれかによって実証される。したがって、本発明は、組換えＣＡｄＶウイルスまたはベクターおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む免疫原性またはワクチン組成物を宿主に投与するステップを含む、宿主脊椎動物において「免疫学的応答を誘導する」方法も提供する。
「疾患に対する防御」、「防御免疫」、「機能免疫」、「臨床症状の低減」、「免疫学的応答の誘導」、「中和抗体および／または血清変換の誘導／産生」、および同様の語句は、疾患または感染に曝露された免疫されていない対象において予測されるものよりも少ない有害作用をもたらす、抗原に対する抗体産生、および／または本発明の１つもしくは複数の治療用組成物もしくはそれらの組み合わせの投与によって生じる、疾患もしくは状態に対する部分的もしくは完全な応答をもたらすことを意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染が減少し得る、遅くなり得る、または場合により完全に予防され得る。本明細書では、感染の完全な予防を意味する場合には、明確に記載される。完全な予防と記載されていない場合、この用語は、部分的な予防を含む。
本明細書では、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低下」または「臨床症状の減少」は、限定はされないが、野生型感染と比較した、群内の感染した対象の数の減少、感染の臨床徴候を示す対象の数の減少もしくは排除、または１または複数の対象に存在する任意の臨床徴候の重症度の低下を意味する。例えば、病原体負荷量の減少、病原体の排出、病原体の伝染の減少、またはマラリアの任意の症候性の臨床徴候の減少のいずれかを指すべきである。好ましくは、本発明の治療用組成物を受けた１またはそれ以上の対象において、組成物を受けておらず感染する対象と比較して、これらの臨床徴候が少なくとも１０％減少する。より好ましくは、本発明の組成物を受けた対象において臨床徴候が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％減少する。
本明細書では、用語「防御の増大」は、限定はされないが、ワクチン接種された対象の群における感染因子による感染に付随する１つまたは複数の臨床症状が、ワクチン接種されていない対象の対照群に対して統計的に優位に減少することを意味する。用語「統計的に有意な臨床症状の減少」は、限定はされないが、感染因子によるチャレンジ後に、ワクチン接種された対象の群における少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、さらにより好ましくは５０％、およびさらにより好ましくは７０％低いことを意味する。
「長期にわたる防御」は、少なくとも３週間、より好ましくは少なくとも３ヵ月、なおより好ましくは少なくとも６ヵ月にわたって持続する「改善された有効性」を指す。家畜の場合、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
ウイルスによって誘導される、用語「ウイルス血症の減少」は、限定はされないが、動物の血流に入るウイルスの減少を意味し、ウイルス血症のレベル、すなわち血清ｍＬ当たりのウイルスＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数または血清デシリットル当たりのプラーク形成コロニーの数が、組成物を受けておらず、感染し得る動物と比較して少なくとも５０％、本発明の組成物を受けた動物の血清中で減少する。より好ましくは、ウイルス血症レベルは、本発明の組成物を受けた動物で、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９９９％減少する。
本明細書で使用する場合、用語「ウイルス血症」は、動物、特に哺乳動物、トリ、または昆虫の血流中でウイルス粒子が複製および／または循環する状態として特に理解される。
「安全性」は、ワクチン接種後にワクチン接種された動物において、限定はされないが、細菌ベースのワクチンの毒性への潜在的復帰、持続性の全身性疾病またはワクチン投与の部位における許容できない炎症などの臨床的に重大な副作用を含む有害な結果が存在しないことを指す。
用語「ワクチン接種（vaccination）」または「ワクチン接種すること（vaccinating）」またはその変形は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、動物に投与されると、動物における免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
「死亡率」とは、本発明の文脈では、感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
製剤
組成物を投与する対象は、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット、を含む動物であることが好ましく、最も好ましくは、哺乳動物はブタである。
本発明の製剤は、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は投与の形式に適したものであるべきである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
投与の好ましい経路としては、限定はされないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲料水での投与、最も好ましくは単回用量が望ましい。当業者は、本発明の組成物が、１用量、２用量、またはそれ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることを理解するであろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、所望の処置の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物は、１回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヵ月にわたって毎日、異なる投与量、例えば、約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０（上記のウイルス力価を参照）で投与することができる。本発明の特定の態様では、特に生ウイルス／生ワクチンに関して、投与量は約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０である。
組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在してよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与、好ましくは哺乳動物、特にブタに投与するための指示書が添付されていてよい。そのような容器に関しては、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で通知され、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関による認可を反映している。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組合せて参照することによってよりよく理解することができる。
ＣＡｄＶ２感染性クローンの生成の概略図である。（Ａ）介在ユニーク制限部位を含むウイルスゲノムの５’および３’末端をコードし、ｐＢＲ３２２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターにクローニングされた合成ＤＮＡ断片。ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（矢印）が、ｐＢＲ３２２ベクター骨格からのＣＡｄＶ−２ゲノムの切り出しを促進するためにＩＴＲの５’および３’末端で該構築物に操作された。（Ｂ）ＢＪ５１８３ ＲＥＣ+大腸菌における相同組換えによりベクターにクローニングされたｄｓＤＮＡ ＣＡｄＶ−２ゲノム。（Ｃ）成功したＨＲ組換えｒＣＡｄＶ−２感染性クローン。ＩＴＲ＝逆方向末端反復。 ＣＡｄＶ−２のＥ３領域の構成の概略図である。 線状化感染性クローンＤＮＡとＥ３標的化ＣＡｄＶ−２導入断片の間の相同組換えの概略図である。 ＣＡｄＶ−２骨格中のＢＩＶＩ生成Ｅ３欠失（ΔＥ３ＡおよびΔＥ３Ｂ）導入断片の概略図である。 ＢＩＶＩ生成Ｅ３欠失の概略図である。Ａ）Ｅ３ ＯＲＦの概略図と残りのＯＲＦ１および２ ＤＮＡの合計サイズならびに各々の量。Ｂ）ΔＥ３ＡおよびΔＥ３Ｂコンフィギュレーションに残っているＥ３ ＯＲＦ１およびＯＲＦ２ ＤＮＡの合計量を示すＣＡｄＶ−２ゲノムの概略図。「Ａ」欠失（ΔＥ３Ａ）では、Ｅ３ ＯＲＦ１の最初の１８６ヌクレオチドおよびＯＲＦ２の最後の３０１ヌクレオチドを除く全てが欠失されたが、Ｅ３「Ｂ」欠失（ΔＥ３Ｂ）については、Ｅ３ ＯＲＦ１の１８６ヌクレオチドおよびＯＲＦ２の８３ヌクレオチドが残っている。 発現カセットのＥ３欠失および挿入を示す図である。 トランスフェクトＭＤＣＫ細胞においてＩＦＡにより検出される、発現構築物からの一過的な発現によるＣＰＶ ＶＰ２発現の定量によるプロモーター強度の分析を示す図である。パネルＡ：ＣＭＶｉｅまたはＣＭＶ５プロモーターによって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現プラスミドをトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞のＣＰＶ ＩＦＡが示される。パネルＢ：示されているＣＭＶｉｅ、ＣＡＧ、またはＣＭＶ５プロモーターによって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現プラスミドをトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞のＣＰＶ ＶＰ２ ＥＬＩＳＡのヒストグラム。パネルＣ：示されているＣＭＶｉｅまたはＣＭＶ５プロモーターによって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現プラスミドをトランスフェクトされたＣＰＶ ＶＰ２陽性ＭＤＣＫ細胞のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｉｃｒｏＸＬ定量のヒストグラム。 ＣＡＶ−２ ＭＣＳ−１−５骨格中のＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰ ＳＶ４０ポリＡ発現カセットの概略図。挿入は、Ｅ３ ＯＲＦ１の最初の１８６ヌクレオチドおよび最後の８２ヌクレオチドを除く全てが欠失されているΔＥ３Ｂ ＯＲＦ２の中である。ＥＧＦＰ遺伝子の後にＳＶ４０ポリＡシグナルが続く。ＩＴＲ＝逆方向末端反復。 ＣＡＶ−２骨格中のＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｎ）ＳＶ４０ポリＡ発現カセットの概略図である。挿入は、Ｅ３ ＯＲＦ１の最初の１８６ヌクレオチドおよび最後の８２ヌクレオチドを除く全てが欠失されているΔＥ３Ｂ ＯＲＦ２の中である。ＶＰ２（ｎ）遺伝子の後にＳＶ４０ポリＡシグナルが続く。 感染細胞および上清からから精製されたｒＣＡＶ−２ ＤＮＡのＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲは、単離されたウイルスＤＮＡ由来のｒＣＡＶ２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２におけるＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｎ）導入遺伝子発現カセットの存在を検証するのに使用された。パネルＡ、ｐＣＡＶ−２対照ウイルス；パネルＢ、クローン＃１；パネルＣ、クローン＃２。パネルＤ、ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｎ）トランスファープラスミドによる対照反応。Ｍは１Ｋｂ＋ ＤＮＡラダーである。パネルＥ．導入遺伝子発現カセット特異的ＰＣＲ反応の予測結果。反応１および２は、ＣＡＶ−２ Ｈ−Ａ Ｐ ＶＩＩＩ、Ｕ−ｅｘｏｎおよびＣＶＰ ＶＰ２に特異的なプライマーを利用する；反応３、４および５は、ＣＰＶ ＶＰ２に特異的なプライマーを利用する（パネルＥを参照）。反応７（ＣＡｄＶ−２の陽性反応）は、ＣＡＶ−２特異的Ｈ−Ａ Ｐ ＶＩＩＩおよびＵ−ｅｘｏｎプライマーを使用する。 ｒＣＡＶ−２感染ＭＤＣＫ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。パネルＡ〜Ｆは、シグナル細胞に存在するシグナルのヒストグラムである。懸濁ＭＤＣＫ細胞は、ＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）（パネルＢおよびＥ）発現カセットを有するｒＣＡＶ−２対照ウイルスに感染させ、またはＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）（パネルＣおよびＦ）発現カセットを有するｒＣＡＶ−２に感染させ、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＰＶ ＶＰ２（パネルＡ、ＢおよびＣ）抗体またはＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＡＶ２（パネルＤ、ＥおよびＦ）抗体のいずれかで感染後７２時間染色された。パネルＧは、パネルＡ〜Ｆに示した結果のまとめおよび定量である。 ＣＡｄＶ−２骨格中のＣＭＶｉｅ ＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）ＢＧＨポリＡ発現カセットの概略図である。ＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）遺伝子の後にＢＧＨポリＡシグナルが続く。 ＣＡｄＶ−２骨格中のＣＭＶｉｅ ＲａｂＧＰ ＢＧＨポリＡ発現カセットの概略図である。ＲａｂＧＰ遺伝子の後にＢＧＨポリＡシグナルが続く。 ｒＣＡＶ−２ ＲａｂＧＰ Ｐ２ウイルス感染Ｅ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞のＣＡｄＶ−２特異的ＩＦＡを示す図である。感染Ｅ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞のＣＡｄＶ−２ ＩＦＡが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に直接コンジュゲートされた抗ＣＡｄＶ−２抗体、ならびにマウス抗ＲａｂＧモノクローナル抗体およびＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を用いて感染細胞後６０時間行われた。 ｒＣＡＶ−２ ＲａｂＧＰ Ｐ２ウイルス感染Ｅ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞のＣＡｄＶ−２特異的ＩＦＡを示す図である。感染Ｅ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞のＣＡｄＶ−２ ＩＦＡが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に直接コンジュゲートされた抗ＣＡｄＶ−２抗体、ならびにマウス抗ＲａｂＧモノクローナル抗体およびＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を用いて感染細胞後６０時間行われた。 ＣＡｄＶ２ ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２感染ＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞のフローサイトメトリー分析：感染後７２時間を示す図である。 新しいＥＨＶ−４プロモーターを有するｒＣＡｄＶ−２：感染ＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞のフローサイトメトリー分析：感染後４８時間を示す図である。 新しいＥＨＶ−４プロモーターを有するｒＣＡｄＶ−２：感染ＭＤＣＫ細胞におけるＣＰＶ ＶＰ２タンパク質発現のドットブロット分析を示す図である。一次抗体＝１／５０ 抗ＣＰＶ−ＦＩＴＣ ｍＡｂ（ＶＭＲＤ）；二次抗体＝１／１．０００ ヤギ−抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（ＪＩＲ）。（Ａ）元々のドットブロットデータ。（Ｂ）ドットブロットから作成された半定量的データ：定量のため、ドットブロットはＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析される（Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York）。画像カラーは、反転されバックグラウンドが引かれ、記録した各ドットの密度を統合する。値は、以下のように＋および−指定に割り当てられる。“＋＋＋＋”＝＞８０００００、“＋＋＋”＝５０００００〜８０００００、“＋＋”＝３０００００〜４９９９９９、“＋”＝１２００００〜２９９９９９、“＋／−“＝８００００〜１１９９９９および“−“=＜８００００。 ｒＣＡｄＶ−２感染性クローンによって感染されたＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞によるＲａｂＧタンパク質発現のフローサイトメトリー分析のまとめを示す図である。 ｒＣＡｄＶ−２ ｐ４３０およびｐ４５５（それぞれｇＧ４３０およびＭＣＰ４５５として示される）ＲａｂＧに感染させた細胞におけるＣＰＶ ＶＰ２の検出を示す図である。 ｒＣＡｄＶ−２ ｐ４５５（ＭＣＰ４５５として示される）ＲａｂＧに感染させた細胞におけるＲａｂＧの検出を示す図である。 ｒＣＡｄＶ−２ ｐ４５５（ＭＣＰ４５５と示される）ＲａｂＧに感染させた細胞におけるＣＡｄＶ−２およびＲａｂＧ両方の検出を示す図である。
配列概要：
以下の配列は、本発明において本明細書に詳細に記載され、開示される。
Figure 2019531724
Figure 2019531724
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の例に開示されている技法は本発明の実施において十分に機能することを本発明者らが発見した代表的な技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
（例１）
ＣＡｄＶウイルス単離
ＣＡｄＶ２ウイルスは、喉頭気管炎を有するイヌ由来の咽頭スワブから最初に単離し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ＭＤＣＫ細胞株ＣＣＬ−３４の第１継代として得た。ウイルスを取得後８回継代し、第８継代をアリコートし、マスターシードウイルスとして指定した。ストックＣＡｄＶ−２マスターシードウイルスは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ， Ｉｎｃ.において参照ＣＡｄＶ−２、ＭＳＶ Ｌｏｔ ＃００１−ｄｉｌ、Ｆ：１１−２４−９８下で作製した。ストックＣＡｄＶ−２マスターシードは、Ｔｏｒｏｎｔｏ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ７７０８２．１）と密接に関連している。ＣＡｄＶ−２は、イヌワクチンとしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ， Ｉｎｃ．から市販されている。
感染性クローンＤＮＡは、ｐＢＲ３２２低コピー大腸菌シャトルベクターにクローニングされた全ＣＡｄＶ−２ゲノムである。相同組換えアライグマ（Kremer, E.J., et al., Canine adenovirus vectors: an alternative for adenovirus-mediated gene transfer. J Virol, 2000. 74(1): p. 505-12.）を使用して、感染性クローンＤＮＡを構築した。ＣＡｄＶ−２ ＤＮＡをストックＣＡｄＶ−２ＭＬＶ）から精製し、ＣＡｄＶ−２逆方向末端反復に相同なＤＮＡを含有するｐＢＲ３２２ベースのベクターとの組換えをＢＪ５１８３大腸菌中において生じさせた。
完全な感染性クローンＤＮＡの提示のために、線状化感染性クローンＤＮＡ、図１をトランスフェクトしたＭａｄｉｎｅ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞からＣＡｄＶ−２をレスキューした。
（例２）
ｅ３欠失挿入ＣＡｄＶクローンの生成
ＣＡｄＶ−２は、動物用のベクターウイルスワクチンとして成功裡に利用されている。ＣＡｄＶ−２のＥ３ドメインは必須ではないことが公知であり（Ｅ３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はいずれも、組織培養でのウイルス複製に必要とされない（Fisher et al. 2002））、異種ＤＮＡの挿入のための論理的標的となる。
導入遺伝子がＥ３ドメインに局在化される有効なＣＡｄＶ−２ベースのワクチンの例としては、イヌジステンパーウイルス（Fisher et al. 2002）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（Yang et al. 2008）、およびネコの狂犬病（Hu et al., 2007）、イヌ（Hu et al., 2006）、マウス（Li et al., 2006）、アライグマ、ブタ（Lui et al., 2008）、スカンク（Henderson et al., 2009）およびヒツジ（Bouet-Cararo et al., 2011）が挙げられる。
図２は、ＣＡｄＶ−２のＥ３領域の構成の概略図である。４１４６ｂｐ ＮｒｕＩ（ｂｐ ２３９３２）／ＳａｌＩ（ｂｐ ２８０７８）制限エンドヌクレアーゼ断片が、Ｈ−Ａタンパク質ＶＩＩＩ、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、およびＵ Ｅｘｏｎとして示されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とともに図示される。選択制限エンドヌクレアーゼ部位（ＮｒｕＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＳｓｐＩおよびＳａｌＩ）の位置がこのＤＮＡ断片について示され、ナンバリングは、密接に関連するＣＡｄＶ−２のＴｏｒｏｎｔｏ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号 Ｕ７７０８２．１）と比較している。
Ｆｉｓｃｈｅｒら（２００２）によって述べられているように、Ｅ３領域のゲノム構成は、異なるアデノウイルス間で緩く保存されているに過ぎず（Linne, T., Differences in the E3 regions of the canine adenovirus type 1 and type 2. Virus Res, 1992. 23(1-2): p. 119-33）、したがって、ＣＡｄＶ２ Ｅ３領域非必須遺伝子座の正確な境界は、他のウイルスのＥ３挿入部位から置き換えることができない。第１の構築物では、Ｅ３由来の全ＯＲＦ１およびＯＲＦ２ ＤＮＡセグメントを欠失させて、導入遺伝子挿入サイズを最大化したが、感染性クローンＤＮＡはｒＣＡｄＶ−２のレスキューを促進しなかった。この戦略は、５’Ｅ３隣接ＤＮＡのＥ３ ＯＲＦ１（異なるリーディングフレーム）へと伸びるヘキソン関連タンパク質ＶＩＩＩ遺伝子（Ｈ−Ａ− ＰＶＩＩＩ）の最後の５個のコドン（終止コドンを含む）を不注意に欠失させ、実質的な３’伸長を有するＨ−Ａ ＰＶＩＩＩ遺伝子をもたらす（５個のアミノ酸欠失と、それに続く実質的なｃ末端付加を有するＨ−Ａ ＰＶＩＩＩをもたらし得る）ことが見出された。
故に、５’および３’Ｅ３隣接ＤＮＡがＥ３ ＯＲＦ１の最初の１８３ｂｐおよびＯＲＦ２の最後の４７ｂｐを含有するように、トランスファープラスミドをデザインし直した。これは、ｒＣＡｄＶ−２レスキューに十分であることが見出された。
（例３）
ｒＣＡｄＶ−２感染性クローンＤＮＡの生成のための相同組換え
Ｃｈａｒｔｉｅｒら（１９９６）およびＫｒｅｍｅｒら（２０００）による論文に記載された方法に基づく、線状化ＣＡｄＶ−２感染性クローンＤＮＡとＥ３標的化ＣＡｄＶ−２トランスファープラスミド／断片の間の、Ｒｅｃ＋ ＢＪ５１８３大腸菌における相同組換えを、導入遺伝子発現カセットがＥ３ドメインに局在化されたｒＣＡｄＶ−２の生成に使用した。図３に図示されるように、Ｅ３ドメインにユニーク制限部位を含有する感染性クローンは、ａ）Ｅ３領域に対する導入遺伝子発現カセットを標的とする、およびｂ）Ｅ３の選んだ部分を効果的に欠失させるように、導入遺伝子発現カセットの５’および３’両方に約５００ｂｐのＣＡｄＶ−２隣接ＤＮＡを含有する導入断片と再結合する。
導入遺伝子特異的PCRスクリーニングを用いて同定された拡大ＢＪ５１８３クローンからＤＮＡを単離し、これらのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離して、２３．１Ｋｂまたは＞２３．１Ｋｂでの移動を検証した（成功したＨＲは、スーパーコイルＤＮＡとして、０．７％アガロースゲルで２３．１ｋｂマーカーに同様に移動する約３５ｋｂのＤＮＡ種をもたらす）。これらのＤＮＡを次いで形質転換し、哺乳動物細胞におけるｒＣＡｄＶ−２の生成のための大規模精製および使用のために、Ｓｔｂｌ２またはＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ大腸菌のどちらかで拡大させた。
図３は、Ｅ３残りの部分の間に位置する上述のＥ３欠失およびユニーク制限部位（多重クローニング部位のＭＣＳと命名される）を包含する、ＮｒｕＩ／ＳａｌＩ線状化感染性クローンＤＮＡ（天然のＣＡｄＶ−２配列）とＥ３標的化ＣＡｄＶ−２導入断片の間の相同組換えの概略図である。感染性クローンＤＮＡは、左右逆方向末端反復、それぞれＬＩＴＲおよびＲＩＴＲに隣接されている。
（例４）
ΔＥ３ ｒＣＡｄＶ−２感染性クローンＤＮＡの生成
Ｅ３欠失ｒＣＡｄＶ−２：ΔＥ３ＡおよびΔＥ３Ｂ
オーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、選んだＥ３欠失ならびにＢＪ５１８３大腸菌における標的化相同組換え（ＨＲ）を促進するための約５００塩基の５’および３’隣接配列をコードする、ＣＡｄＶ−２Ｅ３標的化導入断片を生成した（概略図、図４および図５参照）。図５ＡおよびＢに見られるように、「Ａ」欠失（ΔＥ３Ａ）では、Ｅ３ ＯＲＦ１の最初の１８６ヌクレオチドおよびＯＲＦ２の最後の３０１ヌクレオチドを除く全てが欠失されたが、Ｅ３「Ｂ」欠失（ΔＥ３Ｂ）については、Ｅ３ ＯＲＦ１の１８６ヌクレオチドおよびＯＲＦ２の８３ヌクレオチドが残っている（５’および３’隣接については、配列番号１および配列番号２参照）。
ΔＥ３ＡおよびΔＥ３Ｂ欠失を有する両方の感染性クローンは、トランスフェクトＭＤＣＫおよびＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞から成功裡にレスキューされた。これは、特定のＥ３欠失が、ウイルスレスキューを支持することを示している。ΔＥ３Ｂコンフィギュレーションはより大きなＥ３欠失を包含するため、フォワードに進むｒＣＡｄＶ−２を有する導入遺伝子発現カセットの生成に最適なデザインになった。このより大きな欠失は、Ｅ３領域の実質的に全て、例えば、Ｅ３領域の約８２％が、ウイルスレスキューに悪影響を与えることなく欠失され得ることを示す。
（例５）
ＣＭＶプロモーターを含むＥ３欠失／挿入発現カセットの構築
ＨＣＭＶ−ＩＥおよびＣＭＶ５プロモーターの生成：
ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ｈＣＭＶ−ＩＥ）（配列番号３）の３’末端の増幅を、プライマー対ｈＣＭＶ−ＩＥ ５’Ｆ（配列番号５）（５’−ＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧ−３’）／ｈＣＭＶ−ＩＥ ３’Ｒ（配列番号６）（５’−ＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＡＣＧＣＣＴＡＣＣＧＣＣＣ−３’）およびテンプレートとしてのＢＡＣ ＤＮＡ ＥＨＶ−ｇＧ（１０ｎｇ）を用いて、以前に記載したようにＰＣＲによって実施した。得られたＤＮＡ断片を、その後、ｐＣＲ（商標）ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、制限酵素Ｋｐｎ−１およびＢａｍＨ−１による消化によって切り出し、ＣＡｄＶトランスファープラスミドのさらなる操作および構築のために、ｐＵＣ１８ベースのプラスミドシャトルベクターにさらにクローニングした。ヒトＣＭＶ５プロモーター（配列番号４）を、それぞれ５’−３’Ｓｐｅ−１およびＢａｍＨ−１制限部位を有するＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）遺伝子合成産物を用いて合成し、ＣＡｄＶトランスファープラスミドのさらなる操作および構築のために、ｐＵＣ５７大腸菌シャトルベクターにクローニングした。
ＣＭＶＩＥおよびＣＭＶ５プロモーター活性の比較：
文献での報告は、ＣＭＶｉｅプロモーターと対比してＣＭＶ５プロモーターによって駆動される哺乳動物導入遺伝子発現カセットからのより強いタンパク質発現を示している。ＣＭＶ５プロモーターは、ＣＭＶｉｅ転写開始部位の下流に、スプライスドナー部位およびアクセプター部位に挟まれたアデノウイルス主要後期エンハンサーとともにヒトアデノウイルス５型（ＨｕＡｄ５）アデノウイルストリパータイトリーダーをコードする約５６０ｂｐのＤＮＡを含有する点で、ＣＭＶｉｅプロモーターとは異なる（Massie et al., 1995, Improved adenovirus vector provides herpes simplex virus ribonucleotide reductase R1 and R2 subunits very efficiently. Nature Biotechnology 13:602-608）。ＣＭＶ５プロモーターの使用は、２９３個の細胞でタンパク質発現を実質的に増加させることが示された（Massie et al., 1998, Inducible overexpression of a toxic protein by an adenovirus vector with a tetracycline-regulatable expression cassette. Journal of Virology 72 (3):2289-2296）。
これらの報告と一致して、ＣＰＶ ＶＰ２を含有する発現プラスミドの一過的なトランスフェクションによる、ＣＭＶｉｅまたはＣＭＶ５のどちらかによって駆動されるカセットからのタンパク質発現の直接比較は、ＣＭＶｉｅプロモーターと対比してＣＭＶ５プロモーターによって駆動される哺乳動物導入遺伝子発現カセットからのより強いタンパク質発現を実証する。図７に示すように、トランスフェクトＭＤＣＫ細胞においてＩＦＡによって検出される、発現構築物からの一過的な発現によるＣＰＶ ＶＰ２発現の定量によるプロモーター強度の分析を実施した。パネルＡでは、ＣＭＶｉｅまたはＣＭＶ５プロモーターによって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現プラスミドをトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞のＣＰＶ ＩＦＡが示される。パネルＢは、ＣＭＶｉｅ、またはＣＭＶ５プロモーターによって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現プラスミドをトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞のＣＰＶ ＶＰ２ ＥＬＩＳＡのヒストグラムである。パネルＣは、示されているＣＭＶｉｅまたはＣＭＶ５プロモーターによって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＰＶ ＶＰ２陽性ＭＤＣＫ細胞のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｉｃｒｏＸＬ定量のヒストグラムである。結果は、ＣＭＶ５プロモーターが導入遺伝子の強い発現を指示できること、ならびに光学密度ＩＦＡおよびＦＩＴＣ陽性ＭＤＣＫ細胞の相対数のいずれに関しても、ＣＭＶ５からの発現はＣＭＶｉｅプロモーターより大きいことを示している。故にＣＭＶ５プロモーターが、ＣＡｄＶ−２発現カセットの転写を駆動するために選ばれた。しかし、ＣＭＶ５プロモーターを含有するｒＣＡｄＶ−２感染性クローンはいずれも、ｒＣＡｄＶ−２のレスキューをもたらさなかった。
表２に示すように、ＣＭＶ５は、ＶＰ２導入遺伝子の強い一過的な発現を駆動したが、ＣＭＶ５プロモーターを含有するｒＣＡｄＶ−２感染性クローンはいずれも、ｒＣＡｄＶ−２のレスキューをもたらさなかった。
ＣＭＶ５プロモーター配列がｒＣＡｄＶ−２レスキューを妨げている可能性があるかどうかを直接検討するために、ＣＭＶ５プロモーター、多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化（ポリＡ）配列を含有するＤＮＡ断片を、ＣＡｄＶ−２ゲノムのＥ３領域に組み込んだ。ＣＭＶ５をＣＭＶｉｅ（およびＭＣＳ）から区別するＤＮＡの約５６０ｂｐを除く、ΔＥ３ＢにクローニングしたＤＮＡの成分の全てが、以前にレスキューされたｒＣＡｄＶ−２ウイルスの一部である。レスキューの試みは成功せず、ＣＭＶ５プロモーターがｒＣＡｄＶ−２のレスキューを妨げることを強く示唆した。この結論を支持するために、相同組換えを使用して、この感染性クローン中のＣＭＶ５ ＭＣＳ ＳＶ４０ポリＡ領域を「レスキュー可能な」ＣＭＶｉｅベースの発現カセットと置き換える、対となる実験をデザインした。
ＣＡｄＶ２ゲノムのΔＥ３Ｂ領域に挿入されたＣＭＶ−ＩＥ−ＥＧＦ発現カセット発現カセットを含有するｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰの生成：
増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）発現カセット（２．６ｋｂ（配列番号７、ＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰ）を有するｒＣＡｄＶ−２を、ウイルスレスキューの評価を促進し、選んだ細胞株および種における向性をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために生成した。簡単には、ＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ標的化ＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰ導入断片（ＯＲＦ１（５’）の１８３位で終わりＣＡｄＶ−２Ｅ３ ＯＲＦ２（３’）の８２位で始まる約５００ｂｐ ＣＡｄＶ−２ＤＮＡに隣接された、ＣＭＶｉｅ駆動ＥＧＦＰ ＯＲＦとこれに続くＳＶ４０ポリアデニル化配列）を相同組換えに使用して、ｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰを生成した。成功したＨＲイベントを、約３５ｋｂのＤＮＡ種の検出によって評価した。ＰＣＲコロニースクリーニングを実施して、導入遺伝子発現カセットを含有するクローンを同定した（フォワードＰ 配列番号８、リバースＰ 配列番号９）。陽性クローンをアガロースゲル電気泳動によって可視化し、陽性クローンはＥＦＧ導入遺伝子カセットに対応する約０．７ｋｂ ＰＣＲ産物を有した。さらに、適切な導入遺伝子挿入および配列を、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＮｅｘｔＥｒ＿ＸＴライブラリー調製方法、ならびにＮｅｘＧｅｎｅソフトウェア（Ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃ、バージョン２．３）およびＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ、バージョン５．１）を用いた配列分析によって確認した。
ｒＣＡｄＶ−２ＧＦＰの成功したＰｍｅ−１消化は、２つの種、すなわち、約３２．７ｋｂ（ｒＣＡｄＶ−２ゲノム）および約２．７ｋｂ（ＰＢＲ３２２断片）をもたらした。ＭＤＣＫおよびＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて達成した。ｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰ感染性クローンを、トランスフェクト細胞で蛍光によるＧＦＰシグナルによって示されるように、トランスフェクトＭＤＣＫおよびＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞から成功裡にレスキューした。ウイルスをトランスフェクト細胞上清／ライセートから回収し、３回連続凍結解凍サイクル（−７０℃／３７℃）にかけ、フィルター滅菌し、それらをＭＤＣＫおよびＥ１Ｂ−ＭＤＣＫの両方に伝播した。感染細胞を、次いで感染依存的ＥＧＦＦシグナルについて蛍光顕微鏡法により観察した（データ不図示）。
ＣＭＶＩＥ ＥＧＦＰ ＳＶ４０ポリＡ導入遺伝子発現カセットは、ＣＡｄＶ２のΔＥ３Ｂドメインに成功裡にクローニングされた。組換えウイルスは成功裡にレスキューされ、ＥＧＦＰは感染後の蛍光顕微鏡分析によって検出することができた。
ＣＭＶ５プロモーターを有するｒＣＡｄＶ−２ ΔＥ３Ｂレスキュー不可能感染性クローンからの増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現カセットを有するｒＣＡｄＶ−２ ΔＥ３Ｂの生成およびレスキュー：
ＣＭＶ５プロモーターはｒＣＡｄＶ−２レスキューを阻害するという結論を支持するために（上記の「導入遺伝子発現のためのＣＭＶ５プロモーターの使用」セクション参照）、相同組換えを使用して、ＭＣＳ−１感染性クローン中のＣＭＶ５ ＭＣＳ ＳＶ４０ポリＡ領域を「レスキュー可能な」ＣＭＶｉｅベースの発現カセットと置き換える、対となる実験を行った。簡単には、上記のＣＡｄＶ−２Ｅ３標的化ＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰ導入遺伝子導入断片を相同組換えに使用して、感染性クローンＭＣＳ−１−５（ＭＣＳ−１−５はＣＭＶ５プロモーター、小さな多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する）からΔＥ３Ｂ ｒＣＡｄＶ−２を生成した。ＭＣＳ−１−５に由来する精製した約２．６Ｋｂ ＥＧＦＰ導入断片および線状化ｒＣＡＶ−２感染性クローンＤＮＡを、電気穿孔によりＢＪ５１８３大腸菌細胞に同時形質転換し、次いで５０ｍｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレートで選択した。ＰＣＲコロニースクリーニングを実施して、導入遺伝子発現カセットを含有するクローンを同定した。成功した相同組換えは、スーパーコイルＤＮＡとして、０．７％アガロースゲルで２３．１ＫｂマーカーＤＮＡ種とともに流れる、または２３．１ＫｂマーカーＤＮＡ種より幾分速く流れる約３５ＫｂのＤＮＡ種をもたらす。陽性クローンをアガロースゲル電気泳動によって可視化した（図４）。感染性クローンＤＮＡのＣＡＶ−２ ＭＣＳ−１−５骨格中のＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰ ＳＶ４０ポリＡ発現カセットの概略図を、図８に図示する。
ＰｍｅＩ消化ｒＣＡＶ−２ ＭＣＳ−１−５ ＥＧＦＰウイルスを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００ ＣＤおよび３０００を用いてＭＤＣＫ細胞およびＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。ｒＣＡｄＶ−２ ＭＣＳ−１−５感染性クローンＤＮＡに由来するｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＥＧＦＰ感染性クローンは、トランスフェクト細胞で蛍光によるＧＦＰシグナルによって示されるように、トランスフェクトＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞からのｒＣＡｄＶ−２のレスキューを成功裡に促進した（データ不図示）。補遺ＶＩ（バックグラウンド）において明らかなように、ＣＡｄＶ−２ＭＣＳ−１骨格に由来するＥＧＦＰ発現カセットを有するｒＣＡｄＶ−２のレスキューは、ｒＣＡｄＶ−２レスキューの阻害がＣＭＶ５依存性であり、ＣＭＶ５中の５６０ｂｐ ｈｕＡｄ５ ＤＮＡ配列に、さらに局在化される（ｍｏｒｅ ｓｏ ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）という結論をさらに支持する。
ＣＡｄＶ２ゲノムのΔＥ３Ｂ領域に挿入されたＣＭＶ−ＩＥ−ＶＰ２発現カセット発現カセットを含有するｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（天然）の生成：
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２遺伝子を有するｒＣＡｄＶ−２を生成した。簡単には、上記と同様に、ＣＭＶｉｅ駆動ＣＰＶ ＶＰ２ ＯＲＦ（配列番号１０）を含有するＣＡｄＶ−２ΔＥ３標的化導入断片を相同組換えに使用して、ＶＰ２発現カセットを含有するΔＥ３Ｂ ｒＣＡｄＶ−２を生成した（図９参照）。成功した導入遺伝子組み込みを含有するクローンをＰＣＲスクリーニングによって検出し、１．７ｋｂ ＰＣＲ 産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。適切な導入遺伝子挿入および配列を、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＮｅｘｔＥｒ＿ＸＴライブラリー調製方法、ならびにＮｅｘＧｅｎｅソフトウェア（Ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃ、バージョン２．３）およびＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ、バージョン５．１）を用いた配列分析によって確認した。
ｒＣＡｄＶ−２ＧＦＰの成功したＰｍｅ−１消化は、２つの種、すなわち、約３２．７ｋｂ（ｒＣＡｄＶ−２ゲノム）および約２．７ｋｂ（ＰＢＲ３２２断片）をもたらした。ｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２感染性クローンを、ＣＡｄＶ−２ＩＦＡによって検出されるように、トランスフェクトＭＤＣＫおよびＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞から成功裡にレスキューした（データ不図示）。ＶＰ２タンパク質に対する免疫蛍光抗体染色の欠如によって検出されるように、感染細胞中のＣＰＶ ＶＰ２タンパク質発現は成功しなかったが、導入遺伝子発現カセットの存在は、ＰＣＲによる精製ウイルスゲノムで検出された。
感染細胞および上清から精製したｒＣＡＶ−２ ＤＮＡのＰＣＲ分析を使用して、ｒＣＡＶ２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２クローンにおけるＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｎ）導入遺伝子発現カセットの存在を検証した（図１０）。パネルＡ、ｐＣＡＶ−２対照ウイルス；パネルＢ、クローン＃１；パネルＣ、クローン＃２。パネルＤ、ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｎ）トランスファープラスミドによる対照反応。Ｍは１Ｋｂ＋ ＤＮＡラダーである。パネルＥ．導入遺伝子発現カセット特異的ＰＣＲ反応の予測結果。反応１および２は、ＣＡＶ−２ Ｈ−Ａ Ｐ ＶＩＩＩ、Ｕ−ｅｘｏｎ（配列番号１１、配列番号１２）およびＣＶＰ ＶＰ２（配列番号１３、配列番号１４） に特異的なプライマーを利用する；反応３、４および５は、ＣＰＶ ＶＰ２に特異的なプライマーを利用する（参照パネルＥ）（配列番号１５〜２０）。反応７（ＣＡｄＶ−２の陽性反応）は、ＣＡＶ−２特異的Ｈ−Ａ Ｐ ＶＩＩＩおよびＵ−ｅｘｏｎプライマーを使用する（配列番号２１、配列番号２２）。
したがって、ＣＭＶＩＥ ＣＰＶ ＶＰ２（ｎ）ＳＶ４０ポリＡ導入遺伝子発現カセットは、ＣＡｄＶ２のΔＥ３Ｂドメインに成功裡にクローニングされ、組換えウイルスは成功裡にレスキューされ、ＶＰ２配列の存在は確認されたが、ＶＰ２タンパク質発現は検出できなかった。
ＣＡｄＶ２ゲノムのΔＥ３Ｂ領域に挿入されたＣＭＶ−ＩＥ−ＶＰ２発現カセットを含有する、ｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（コドン最適化された）の生成：
ＣＡｄＶ−２Ｅ３標的化ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２コドン最適化（ｃｏ）導入遺伝子導入断片（ＯＲＦ１（５’）の１８３位で終わり、ＣＡｄＶ−２Ｅ３ ＯＲＦ２（３’）の８２位で始まる約５００ｂｐ ＣＡｄＶ−２ＤＮＡに隣接された、ＣＭＶｉｅ駆動ＣＰＶ ＶＰ２ ＯＲＦ（ｃｏ）とこれに続くウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列））（配列番号２３）をオーバーラップ伸長ＰＣＲによって生成し、アーカイブおよび増幅のためにＴＯＰＯベクターにクローニングした。構築物を相同組換えに使用してΔＥ３Ｂ ｒＣＡｄＶ−２を生成した。
成功した導入遺伝子組み込みを含有するクローンをＰＣＲスクリーニングによって検出し、２．３ｋｂ ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。適切な導入遺伝子挿入および配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＮｅｘｔＥｒ＿ＸＴライブラリー調製方法、ならびにＮｅｘＧｅｎｅソフトウェア（Ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃ、バージョン２．３）およびＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ、バージョン５．１）を用いた配列分析によって確認した。
ｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）感染性クローンを、トランスフェクトＭＤＣＫおよびＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞から成功裡にレスキューし、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に直接コンジュゲートされた抗ＣＡｄＶ−２抗体を用いてＰ１感染細胞で実施したＣＡｄＶ−２ＩＦＡによって実証した（データ不図示）。レスキューウイルスが、ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）導入遺伝子発現カセットをコードすることを検証するために、Ｐ２ウイルスｒＣＡｄＶ−２ゲノムおよびＰ５ ＣＡｄＶ−２ゲノムを精製した。ＣＡｄＶ−２ゲノムの領域（ヘキソン関連タンパク質ＶＩＩＩ（Ｈ−Ａ Ｐ ＶＩＩＩ）およびＵ−ｅｘｏｎ）に特異的なプライマーを用いた抽出ＤＮＡのＰＣＲ分析は、ＣＭＶｉｅプロモーターおよびＣＰＶ ＶＰ２を使用した（データ不図示）。ＰＣＲ分析は正しいサイズのＰＣＲ産物をもたらし、精製Ｐ２ウイルスゲノムがＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）導入遺伝子発現カセットをコードすることを示した。
ＣＡｄＶ２およびＣＰＶ ＶＰ２に対する抗体を用いたＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）ｒＣＡｄＶ感染細胞のフローサイトメトリー分析を使用して、感染ＭＤＣＫ細胞の発現を検証した。簡単には、懸濁ＭＤＣＫ細胞を１２ウェルフォーマットでｒＣＡｄＶ−２および対照ｒＣＡｄＶ−２に感染させ、７２時間培養した（加湿インキュベーター中、１２５ｒｐｍで３７℃、５．０％ＣＯ2）。細胞を次いで採取し、ＰＢＳ、次いでＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ．＃５５４７１４）を用いて洗浄し、ＣＹＴＯＦＩＸ（商標）固定液と、これに続く２つのＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）透過処理溶液洗浄で処置した。細胞を次いで、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＡｄＶ−２または抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体（それぞれ、抗ＣＡＶ２抗体：ＶＭＲＤ、カタログ＃ＣＪ−Ｆ−ＣＡＶ−５０Ｘおよび抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体：ＶＭＲＤ、カタログ＃ＣＪ−Ｆ−ＣＰＶ ５０Ｘ）とインキュベートし、ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）で２×洗浄し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）フローサイトメトリーシステムを用いるフローサイトメトリーによって分析した。
図１１は、ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）ｒＣＡｄＶ感染ＭＤＣＫ細胞のフローサイトメトリー分析からの結果を示す。パネルＡ〜Ｆは、シグナル細胞に存在するシグナルのヒストグラムである。懸濁ＭＤＣＫ細胞を、ＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）（パネルＢおよびＥ）発現カセットを有するｒＣＡｄＶ−２対照ウイルスに感染させ、またはＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）（パネルＣおよびＦ）発現カセットを有するｒＣＡＶ−２に感染させ、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＰＶ ＶＰ２（パネルＡ、ＢおよびＣ）抗体またはＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＡＶ２（パネルＤ、ＥおよびＦ）抗体のいずれかで感染後７２時間に染色した。パネルＧは、図１１にみられる結果のまとめおよび定量である。抗ＣＡＶ−２による染色の結果は、ｒＣＡＶ２−ＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）またはｒＣＡＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）感染（図１、それぞれパネルＥおよびＦ）ＭＤＣＫ細胞のほとんどがＣＡｄＶ２タンパク質を発現するが、非感染細胞（図１、パネルＤ）は実質的にＣＡｄＶ−２陰性であることを示している。抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体による染色（図１、パネルＡ、ＢおよびＣ）は、いくらかのバックグラウンドシグナルが、抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体による非感染およびｒＣＡＶ２−ＢＲＳＶ Ｆ感染細胞（それぞれ、パネルＡおよびＢ）で観察されるものの、ｒＣＡＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２感染ＭＤＣＫ細胞（パネルＣ）のみがＣＰＶ ＶＰ２タンパク質を発現することを示している。
故に、ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２コドン最適化（ｃｏ）導入遺伝子発現カセットは、ＣＡｄＶ２のΔＥ３Ｂドメインに成功裡にクローニングされた。組換えウイルスは、トランスフェクトＭＤＣＫ細胞からレスキューされ、導入遺伝子発現カセットは、精製ウイルスゲノムで検出された。ＣＰＶ ＶＰ２ ｍＲＮＡが感染細胞で検出され（データ不図示）、感染細胞でのＣＰＶ ＶＰ２のタンパク質発現が、天然のＶＰ２発現カセットとは対照的にフローサイトメトリー分析によって確認された。
ＣＡｄＶ２ゲノムのΔＥ３Ｂ領域に挿入されたコドン最適化ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質発現カセットを有するｒＣＡｄＶ−２ ΔＥ３Ｂの生成：
簡単には、ＯＲＦ１（５’）の１８３位で終わり、ＣＡｄＶ−２Ｅ３ ＯＲＦ２（３’）の８２位で始まる約５００ｂｐ ＣＡｄＶ−２ＤＮＡに隣接された、ＣＭＶｉｅ駆動ＣＰＶウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパクＯＲＦとこれに続くＢＧＨポリアデニル化配列を含有するＣＡｄＶ−２Ｅ３標的化導入断片を相同組換えに使用して、ΔＥ３Ｂ ｒＣＡｄＶ−２を生成した（配列番号２７）。ＢＲＳＶ Ｆ遺伝子の天然（ｎ）およびコドン最適化（ｃｏ）バージョンの両方を、ＣＡｄＶ−２ベクターバックグラウンドにクローニングし、導入遺伝子の両方のバージョンを有するウイルスを成功裡にレスキューした。しかし、ＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）遺伝子のみを下流の適用に使用した。
ｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＢＲＳＶ Ｆ（ＣＯ）感染性クローンは、ウイルス上清／細胞ライセートに感染した細胞のＣＰＥによって示されるように、ＭＤＣＫ細胞から成功裡にレスキューされた。導入遺伝子発現カセットの存在は、精製ウイルスゲノムで検出された。ＤＮＡをＰ３ ｒＣＡＶ２−ＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）ウイルスから抽出し、ＰＣＲ分析のテンプレートとして使用して、ウイルスゲノム中のＢＲＳＶ Ｆ（ｃｏ）遺伝子の存在を検出した。導入遺伝子を配列決定して遺伝子配列を確認した。
感染細胞によるＢＲＳＶ Ｆの発現を、フローサイトメトリー分析によって確認した（図１１参照）。
ＣＡｄＶ２ゲノムのΔＥ３Ｂ領域に挿入された狂犬病糖タンパク質（ｎ）発現カセットを有するｒＣＡｄＶ−２ ΔＥ３Ｂの生成：
簡単には、ＯＲＦ１（５’）の１８３位で終わり、ＣＡｄＶ−２Ｅ３ ＯＲＦ２（３’）の８２位で始まる約５００ｂｐ ＣＡｄＶ−２ＤＮＡに隣接された、ＣＭＶｉｅ駆動パスツール株狂犬病糖タンパク質（ＲａｂＧＰ）ＯＲＦとこれに続くＢＧＨポリアデニル化配列を含有するＣＡｄＶ−２Ｅ３標的化導入断片を相同組換えに使用して、ΔＥ３Ｂ ｒＣＡｄＶ−２を生成した（配列番号２５）（参照図１３）。天然のパスツール狂犬病Ｇ遺伝子を、アライグマポックスベースの狂犬病ワクチン（ｒＲＣＮＶ狂犬病Ｇ２ワクチン）、Ｌｏｔ ＃Ｄ０１５−０５４−）からＰＣＲ増幅した。増幅ＲａｂＧＰ ＤＮＡの予測サイズは約１．６Ｋｂである。
ＲａｂＧＰ 断片を、次いでｐＵＣ１８−Ｂ−Ｂｆ１ｂ−ＣＯ断片にライゲートし、ＴＯＰ１０大腸菌に形質転換した。ＲａｂＧＰ ＤＮＡのＰＣＲコロニースクリーニングを、ＲａｂＧＰ特異的プライマーを用いて実施した（データ不図示）。
ＤＮＡを、導入断片（約３．４５Ｋｂ）を遊離させるＰｍｅＩ、およびベクター骨格を切断するＳｃａＩで消化して、導入断片の同定を促進した。精製した約３．４５Ｋｂ ＰｍｅＩ ＣＭＶｉｅ ＲａｂＧＰ（ｎ）導入遺伝子（発現カセット）導入断片、および線状化ｒＣＡＶ−２感染性クローンＤＮＡを、電気穿孔によりＢＪ５１８３大腸菌細胞に同時形質転換し、次いで５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートで選択した。ＰＣＲコロニースクリーニングを実施して、導入遺伝子発現カセットを含有するクローンを同定し、アガロースゲル電気泳動によって可視化した（データ不図示）。
ＰｍｅＩ消化ＨＲクローンＤＮＡを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００ ＣＤを用いてＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。ｒＣＡｄＶ−２ΔＥ３Ｂ／ＣＭＶｉｅ ＲａｂＧＰ感染性クローンを、図１４に示されたＣＡｄＶ−２ＩＦＡによって示されるように、トランスフェクトＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞から成功裡にレスキューし、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に直接コンジュゲートされた抗ＣＡｄＶ−２抗体を用いたｒＣＡＶ−２ ＲａｂＧＰ Ｐ２ウイルス感染ＥＩＢ-ＭＤＣＫ細胞のＣＡｄＶ−２ＩＦＡは、抗ＲａｂＧおよびＣＡｄＶ−２免疫蛍光（パネルＢおよびＣ、感染後４８および７２時間）の両方によるｒＣＡｄＶ−２レスキューを確認する。
図１４、パネルＢおよびＣの蛍光（ＣＡＶ−２＋およびＲａｂＧ＋）細胞によって示されるように、ｒＣＡＶ−２ ＲａｂＧＰ Ｅ２およびＥ３ウイルスに感染したＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞は狂犬病Ｇを発現した。しかし、ＲａｂＧ＋細胞数は、ＣＡｄＶ−２＋細胞よりかなり少ないようである。
Figure 2019531724
表２にまとめられているように、トランスフェクトＭＤＣＫまたはＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞からのｒＣＡｄＶ−２のレスキューを促進しなかった多くのΔＥ３Ｂベースの感染性クローンが生成された。これらには、ＣＰＶ ＶＰ２、およびＣＭＶ５プロモーターによって駆動される導入遺伝子発現カセットを含有する狂犬病Ｇ、ヌクレオチド配列がコドン最適化された狂犬病糖タンパク質Ｇを含有するクローン（ＳＡＤ Ｐ５／８８株との７６％同一性、およびクローンｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈＭＧＦＰ（緑色）（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＭＣｈｅｒｒｙ（赤色）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）蛍光タンパク質レポーター構築物（データ不図示）が含まれる。
天然および最適化されたコドン配列の両方が、ＢＲＳＶ ＦおよびＣＰＶ ＶＰ２を有するｒＣＡｄＶ−２のレスキューを促進したことから（上記表２参照）、同程度のサイズのインサート間で比較した場合、この変動性は単にコドン最適化の現れということではない。実際に、天然のｈＭＧＦＰおよびＭＣｈｅｒｒｙ ＯＲＦを有するｒＣＡｄＶ−２感染性クローンも、ｒＣＡｄＶ−２レスキューを促進しなかった（データ不図示）。まとめると、データは、ＣＡｄＶ−２ベクタープラットフォームの文脈でのＣＭＶプロモーターの使用は予測不可能であること、およびプロモーターの選択は、ｒＣＡｄＶ−２クローンのレスキューに大きな影響を与える可能性があるため、発現カセットの構築において重要な検討事項であることを示唆した。
（例６）
ＥＨＶ４プロモーターを有する発現カセット
新しいウマ由来プロモーターの同定および構築：
ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）由来の新規の異種のウマプロモーターを同定および単離した。２つのプロモーター：（１）糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）をコードするＯＲＦ７０の６００ｂｐ ＥＨＶ−４ ｇＧプロモーター（４ｐｇＧ６００）（配列番号２９）、および（２）主キャプシドタンパク質（ＭＣＰ）をコードするＯＲＦ４２の６００塩基対ＥＨＶ−４ ＭＣＰプロモーター（４ｐＭＣＰ６００）（配列番号３０）が対象となった。糖タンパク質Ｇ遺伝子（ｏｒｆ７０）は、複製サイクルの初期および後期に活性である（Colle et al. 1995、Drummer et al. 1998）。主キャプシドタンパク質は、ビリオンの最も豊富な構成成分の１つであり、新しく合成されたウイルスＤＮＡのパッケージングの準備ができるとすぐに細胞核でのキャプシドのアセンブリーに必要とされる。したがって、そのプロモーターは、ウイルス複製サイクルの初期および後期に活性であると予測される。ＣＡｄＶ骨格のサイズ制限を気にして、両方のＥＨＶ−４プロモーター配列をそれらの元々の長さのおよそ７５％にトランケートした。特に、６００ｂｐ ４ｐｇＧ６００プロモーターは、４３０ｂｐにトランケートしてプロモーター断片ｐ４３０（配列番号３１）を、６００ｂｐ ４ｐＭＣＰ６００プロモーターは、４５５ｂｐにトランケートしてプロモーター断片ｐ４５５（配列番号３２）を生成した。
ｒＣＡｄＶ−２ワクチンウイルス感染細胞によるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成は、イヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ−２）ワクチン有効性に重要な因子あり得る。上記に詳述したように、ＣＭＶｉｅ駆動ＣＰＶ ＶＰ２発現カセットを含有するｒＣＡｄＶ−２はレスキューすることができたが、ｒＣＡｄＶ−２ ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２感染細胞での実質的なＶＰ２発現（ＶＬＰ生成のための）は、従来のＣＭＶｉｅプロモーターを用いて達成することはできなかった。さらに、ＣＭＶ５プロモーターを含有するｒＣＡｄＶ−２ ＶＰ２ウイルスはレスキューすることができなかった。したがって、目的の抗原の強い安定な再現可能な発現を駆動できる上記の同定された特徴を有する新しいプロモーターを使用することが対象となった。
ＥＨＶ−４ Ｐ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）を含有するＣＡｄＶ−２トランスファープラスミドの生成ＢａｍＨＩ：ＫｐｎＩ／ＥＨＶ−４ Ｐ ＤＮＡの生成：
ＥＨＶ−４プロモーター断片ｇＧ４３０およびＭＣＰ４５５を、以下のオリゴヌクレオチド対、すなわち、それぞれ
ｇＧ４３０ Ｆ：ＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＣ（配列番号３３）；
ｇＧ４３０ Ｒ：ＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧ（配列番号３４）
ＭＣＰ４５５ Ｆ：ＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＣＧＣ（配列番号３５）；
ＭＣＰ４５５ Ｒ：ＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＡＡＡＣＡＣＣＧ（配列番号３６）を用いて勾配ＰＣＲ増幅した。
増幅されたｇＧ４３０およびＭＣＰ４５５ ＤＮＡの予測サイズは、それぞれ４５４および４７９ｂｐである。
ΔＥ３Ｂにおける成功した組み込みおよびｒＣＡＶ−２のレスキューに使用した、以前に調製したＣＡｄＶ−２トランスファープラスミド（上記に詳述した）を、ＣＭＶｉｅプロモーターとＥＨＶ−４プロモーターとのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩベースの交換によってＣＰＶ ＶＰ２トランスファープラスミドを含有するＥＨＶ−４プロモーターのベースとして使用した。
「非スプライシング」（配列番号３７）および「Ｇｅｎ０．９５」（配列番号３８）と命名された２つの異なるコドン最適化ＣＰＶ ＶＰ２配列を使用して、ＣＭＶｉｅによって駆動される発現カセットを含有するＣＡｄＶ−２トランスファープラスミドを調製した。Ｇｅｎ０．９５は、コドン適合指数（ＣＡＩ）０．９５を有するＧｅｎｓｃｒｉｐｔから入手したコドン最適化ＣＰＶ ＶＰ２配列である。スプライス部位ファインダーアルゴリズム（２０１３／２０１４（著作権）Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ−Ｇｈａｄｉ Ｒａｉ；Ｉｎｓｅｒｍ ＵＭＲ＿Ｓ９１０−Ａｉｘ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ、２７ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｊｅａｎ Ｍｏｕｌｉｎ、１３３８５ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ ０５によってデザインされた）によるＧｅｎ０．９５の分析は、４３個の潜在的なスプライスドナー部位の存在を示唆した。８９ヌクレオチド変化（Ｇｅｎ０．９５に対して５．０７％配列変化）を作成して、アミノ酸配列を変えない、またはイヌ種に基づく最も好ましくはコドンを生成する４０個のスプライスドナー部位を排除した。
上記の２つのＶＰ２配列を含有する精製した約３．５Ｋｂ ＰｍｅＩ ＥＨＶ−４ Ｐ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）導入断片、および線状化ｒＣＡＶ−２感染性クローンＤＮＡを、相同組換えのために電気穿孔によりＢＪ５１８３ 大腸菌細胞に同時形質転換した。インタクトなクローンを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートで選択した。適切な組み込みサイズおよび配向を有するクローンをＰＣＲスクリーニングによって同定し、選択し、拡大させた。
ｐＣＡＶ−２感染性クローンの成功したＰｍｅＩ消化は、約３３．５（ｐＣＡＶ−２ゲノム）および約２．７（ｐＢＲ３２２断片）ＫｂのＤＮＡ種をもたらす。ＰｍｅＩ消化感染性クローンを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００を用いてＥ１Ｂ−ＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。ｐＣＡＶ２ΔＥ３Ｂ／ｐｇＧ４３０−ＶＰ２（非スプライシング）（配列番号３９）、ｐＣＡＶ２ΔＥ３Ｂ／ｇＧ４３０−ＶＰ２（Ｇｅｎ０．９５）（配列番号４０）またはｐＣＡＶ２ΔＥ３Ｂ／ｐ４５５−ＶＰ２（Ｇｅｎ０．９５）（配列番号４１）と命名された継代１（Ｐ１）から継代７（Ｐ７）ウイルスを、３回連続凍結解凍サイクル（−７０℃／３７℃）にかけたトランスフェクト細胞上清／ライセートから回収し、フィルター滅菌し、次いでＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞に伝播した。
ＣＡｄＶ−２およびＣＰＶ ＶＰ２タンパク質発現に関する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のために、ＡＩ−ＳＴ細胞を選んだｒＣＡｄＶ−２に感染させた。感染７２時間後、細胞をＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ． ＃５５４７１４）で固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）固定液とそれに続く２つのＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）透過処理溶液洗浄で処置した。細胞を次いでＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＡｄＶ−２または抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体（それぞれ、抗ＣＡｄＶ２抗体（ｍＡｂ）：ＶＭＲＤ、カタログ＃ＣＪ−Ｆ−ＣＡＶ−５０Ｘおよび抗ＣＰＶ ＶＰ２抗体：ＶＭＲＤ、カタログ＃ＣＪ−Ｆ−ＣＰＶ ５０Ｘ）とインキュベートし、ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）で２×洗浄し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ系を用いてフローサイトメトリーによって分析した。
ＣＡｄＶ−２およびＣＰＶ ＶＰ２タンパク質は、ＣＰＶ ＶＰ２の２つの異なるヌクレオチドバリアントを有するｒＣＡｄＶ−２を感染させたＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞のかなりの割合において、ＩＦＡによって容易に可視化され、ＦＣによって検出される（ＤｅｓｐｌおよびＧｅｎ０．９５、感染後４８時間および７２時間）。かなりのＣＰＶ ＶＰ２タンパク質が、ドットブロットによって組織培養上澄み液／ライセート（凍結／解凍後）で同定された（アセンブルしたＶＬＰの存在を非常に反映しているようである）。
図１９の結果は、ＣＡＶ−２およびＣＰＶ ＶＰ２タンパク質が、感染ＡＩ−ＳＴ細胞のＩＦＡによって容易に可視化される（ただし、無関係のＢＲＳＶ導入遺伝子をコードするｒＣＡｄＶ−２に感染した細胞では可視化されない）ことを示す。これは、ｇＧ４３０およびＭＣＰ４５５ ＥＨＶ−４プロモーターの両方によって駆動された非スプライシングおよびＧｅｎ０．９５ ＣＰＶ ＶＰ２（ｃｏ）配列バリアントの両方からの強いＣＰＶ ＶＰ２発現を示している（図１９Ａ参照）。ＣＰＶ ＶＰ２発現は、元々のｒＣＡｄＶ−２ ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２に感染した細胞の３％未満で検出され（図１５参照）、新しいＥＨＶ４由来プロモーターｐ４３０およびｐ４５５によって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現カセットを有するｒＣＡｄＶ−２を成功裡にレスキューすることができたことを示した。驚くべきことに、ｇＧ４３０およびＭＣＰ４５５ ＥＨＶ−４プロモーターによって駆動されるＣＰＶ ＶＰ２発現は、ＣＭＶ５プロモーター配列がΔＥ３Ｂ位置で利用されたＣＡｄＶベクター（この場合、ウイルスレスキューは成功しなかった）と比較して、感染細胞の１４％〜３６％で検出された（図１６参照）。
感染細胞における導入遺伝子発現を分析するためにドットブロット分析を行なった。簡単には、感染ＡＩ ＳＴ（ｒＥＨＶ−１の）およびＥ１Ｂ ＭＤＣＫ（ｒＣＡｄＶ−２の）細胞由来の清澄化した（６０００×ｇ、５分）組織培養上清／ライセート（凍結／解凍）を装置への添加前にＰＢＳで段階希釈し、吸引によってＰＶＤＦに吸着させた。次のステップは、ＴＢＳＴ中の５．０％ ＢｉｏＲａｄ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｂｌｏｃｋｅｒに３０分暴露され、一次抗体に１．０時間暴露され、ＴＢＳＴで３回洗浄され、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート二次抗体（抗マウスおよび抗ブタ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に１．０時間暴露され、ＴＭＢによって可視化される。定量のため、ドットブロットは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析された（Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York）。画像カラーは、反転されてバックグラウンドを引き、記録された各ドットの密度を統合される。値は、以下のように＋および−表記で割り当てられる：「＋＋＋＋」＝＞８０００００、「＋＋＋」＝５０００００〜８０００００、「＋＋」＝３０００００〜４９９９９９、「＋」＝１２００００〜２９９９９９、「＋／−」＝８００００〜１１９９９９、および「−」＝＜８００００。
図１７に見られるように、強力なＣＰＶ ＶＰ２タンパク質シグナルが、ＣＰＶ ＶＰ２に対するＥＨＶ−４プロモーター駆動発現カセットをコードするｒＣＡｄＶ−２によって感染した細胞由来の組織培養上清／ライセートで観察されたが、無関係の発現カセットをコードするｒＣＡｄＶ−２に感染した細胞由来の試料ではシグナルは検出されなかった。これらの結果は、かなりのＣＰＶ ＶＰ２タンパク質が組織培養上清において同定されたことを示している。これらの結果は、アセンブルされたＣＰＶ ＶＰ２ ＶＬＰの存在を反映している可能性が極めて高い。これは、ＣＭＶｉｅ駆動ＣＰＶ ＶＰ２シグナルが、バックグラウンドレベル以下であり、陰性対照（ＣＡｄＶ−２、ｒＣＡｄＶ−２ ＣＭＶｉｅ ＢＲＳＶ Ｆ感染細胞および非感染細胞由来の細胞培養上清／ライセート）由来の上清／ライセートに匹敵することをドットブロット分析が示した、元々のｒＣＡｄＶ−２ ＣＭＶｉｅ ＣＰＶ ＶＰ２とは対照的であった。
図１７に見られるように、ＶＰ２タンパク質は上清で認識することができ、それ故に、免疫原性に必要なコンフォメーションにあると予測される。重要なことに、上記のように組換えＣＡｄＶ−２のレスキューは、導入遺伝子がＣＭＶ５プロモーター配列によって駆動されるクローンでは達成されなかった。したがって、本発明の新しいＥＨＶ−４由来プロモーター配列、例えばｐ４３０およびｐ４５５は、導入遺伝子の発現を促進するだけでなく、ウイルスレスキューの重要なステップも支持する。
ＥＨＶ−４プロモーターＣＰＶ ＲａｂＧ（ｎ）を含有するＣＡｄＶ−２トランスファープラスミドの生成：
第２のＣＡｄＶ−２構築物は、本発明の新しいＥＨＶ−４由来ｐ４５５プロモーターを使用して生成された。感染細胞による発現が従来のＣＭＶｉｅプロモーターを使用して観察されなかったため、ｒＣＡｄＶ−２ ＲａｂＧ（ｎ）が選択された。
この実験の目的は、ｒＣＡｄＶ−２ ｐ４５５ ＲａｂＧ（ｎ）−感染ＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞によるＥＨＶ−４プロモーター駆動ＲａｂＧタンパク質発現の測定によって、第２の導入遺伝子、ＲａｂＧ（膜タンパク質）を有するｒＣＡｄＶ−２に関して新しいＥＨＶ−４プロモーターの活性を確認することであった。
ＲａｂＧ（ｎ）配列を、上記に論じたようにレスキューされたｒＣＡＶ−２ ＣＭＶｉｅ ＲａｂＧ（ｎ）（配列番号２５）から単離した。ＡＴＧ開始コドンのすぐ５’側のＫｏｚａｋ配列を含む１５９６ｂｐ ＲａｂＧ（ｎ）配列を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（それぞれ５’および３’）制限エンドヌクレアーゼで切り出し、ｇＧ４３０プロモーターおよびＭＣＰ４５５プロモーターを含むＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ切断ｒＣＡｄＶ導入断片にライゲートし、次いでＴＯＰ１０大腸菌に形質転換した。
精製した約３．３Ｋｂ ＰｍｅＩ ＥＨＶ−４ Ｐ ＲａｂＧ（ｎ）導入断片および線状化ｒＣＡＶ−２感染性クローンＤＮＡを、相同組換えのために電気穿孔によりＢＪ５１８３大腸菌細胞に同時形質転換した。インタクトなクローンを５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレートで選択した。ＰＣＲコロニースクリーニングを実施して、ＥＨＶ−４ ｐＧ４３０／ＲａｂＧ（ｎ）（配列番号４２）およびＥＨＶ−４ ｐ４５５／ＲａｂＧ（ｎ）（配列番号４３）クローンを同定した。クローンをＲａｂＧ ＤＮＡに特異的なプライマーでスクリーニングし、アガロースゲル電気泳動によって可視化した。予測されたＤＮＡは１５０１ｂｐである。
ＰｍｅＩ消化感染性クローンを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００を用いてＥ１Ｂ−ＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。ｐＣＡＶ２ΔＥＢ３／ｇＧ４３０またはＭＣＰ４５５ ＲａｂＧ（ｎ）と命名された継代１〜７（Ｐ１〜Ｐ７）ウイルスを、３回連続凍結解凍サイクル（−７０℃／３７℃）にかけたトランスフェクト細胞上清／ライセートから回収し、フィルター滅菌し、次いでＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞に伝播した。
ＩＦＡおよびフローサイトメトリーは、ｒＣＡｄＶ−２感染ＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞におけるＲａｂＧのＥＨＶ−４プロモーター駆動発現を評価するために用いられた。ＣＡｄＶ−２タンパク質発現は、抗ＣＡｄＶ−２ ＦＩＴＣコンジュゲートブタポリクローナル抗体（ＶＭＲＤ）によってプローブされた。ＲａｂＧタンパク質発現は、マウスモノクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ）によってプローブされた。ＣＡｄＶ−２およびＲａｂＧタンパク質は、ＲａｂＧ（ｎ）を有するｒＣＡｄＶ−２を感染させたＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞において、ＩＦＡによって容易に可視化され、ＦＣによって検出される（感染後７２時間で）。
図１８の結果は、ＣＡＶ−２およびＲａｂＧタンパク質が、選んだｒＣＡｄＶ−２およびｒＥＨＶ−１によって感染したＡＩ−ＳＴ ２０１５細胞においてフローサイトメトリー分析により容易に検出されることを示している。これらの結果は、ＭＣＰ４５５ ＥＨＶ−４プロモーターによって駆動されるＲａｂＧのかなりの発現を実証するものである。対照的に、ＲａｂＧは、ｒＣＡｄＶ−２ ｐ４５５ ＲａｂＧに感染した細胞で容易に検出されるが（図１９ＢおよびＣ参照）、発現は、元々のｒＣＡｄＶ−２ ＣＭＶｉｅ ＲａｂＧに感染した細胞の＜２．０％で検出される（図１８参照）。
結論として、ｇＧ４３０およびＭＣＰ４５５ ＲａｂＧ（ｎ）ＳＶ４０ポリＡ導入遺伝子発現カセットは、ＣＡｄＶ−２のΔＥ３Ｂドメインに成功裡にクローニングされた。組換えウイルスは、ウイルス感染細胞におけるＣＰＥによって示されるようにトランスフェクトＥ１Ｂ−ＭＤＣＫ細胞からレスキューされた。感染ＡＩ−ＳＴ ２０１５およびＢＩＶＩ ２０１１ ＭＤＣＫ細胞におけるｒＣＡｄＶ−２によるＲａｂＧ導入遺伝子のＭＣＰ４５５プロモーター駆動発現が、ＩＦＡおよびフローサイトメトリーによって確認された。
（例７）
ｒＣＡｄＶ−ＣＭＶ／ＣＰＶ ＶＰ２を含む医薬組成物（ワクチン）の調製：
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、毒性、宿主、および環境因子によって高い罹患率および死亡率の原因となり得る高度に伝染性のウイルスである。過去３０年にわたって、ＭＬＶおよび死滅ウイルスワクチンを利用する、イヌのための有効なワクチンプログラムの使用は、死亡率を大幅に低下させた。ＣＰＶは、キャプシドを形成する２つの構造タンパク質（ＶＰ１およびＶＰ２）を有する非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＶＰ２は、ウイルス病原性および宿主免疫応答と関係していることが公知であり、したがって、組換えＣＡｄＶ２系における組み込みおよび発現のための本発明者らの最適な標的である。
この試験の目的は、ＭＬＶ混合ワクチンと比較した実験的ｒＣＡＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２ワクチンの有効性の予備的評価を実施することであった。ＭＬＶ混合は、確立された最小免疫量と、特定の抗原ごとに現在の製品で確立されているような各分画の放出用量の間のレベルでブレンドされたヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）を含有した。
この試験では、ＣＡｄＶ−ＣＰＶ ＶＰ２ベクターワクチンがＣＰＶチャレンジに対して防御を提供するかを決定するために、ｒＣＡＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２を３週間空けた２回投与レジメンで６〜７週齢の子犬に投与した。現在、ＭＬＶワクチンがＣＰＶおよびＩＣＨに対する防御のゴールドスタンダードであるため、試験群を、ＣＰＶ、ＣＤＶ、およびＣＡｄＶ２を含有するＭＬＶワクチンコンボの、３週間空けた２回投与レジメンを投与した６〜７週齢の子犬と比較した。この群を陽性対照群とみなした。第３の群は、チャレンジ対照としてＰＢＳの３週間空けた２回投与レジメンを投与した。有効性を評価するために、イヌを２回目のワクチン接種のおよそ３週間後にＣＰＶ−２ｂでチャレンジした。
試験ワクチンを、３週間空けた２回投与レジメンで与えられる１ｍｌ皮下用量として、６週２日齢〜７週２日齢の１２匹の健康なＣＡＶ２およびＣＰＶ血清陰性イヌに投与した。１２匹を以下の通り２つの試験群に分けた：群１ − ｒＣＡＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２＠８．０ｌｏｇ／ｍｌ；群２ − ＭＬＶ混合（ＣＡＶ２、ＣＤＶ、ＣＰＶ）。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、３週間空けた２回投与レジメンで与えられる１ｍｌ皮下用量として、６週２日齢〜７週２日齢の６匹の健康なＣＡＶ２およびＣＰＶ血清陰性イヌの群に投与した。この群は群３とみなされ、試験のチャレンジ対照としての役割を果たした。群１〜３の全ての動物を、２２ＤＰＶ２に毒性ＣＰＶ−２ｂで口と鼻にチャレンジした。チャレンジ後の臨床症例データ（臨床徴候、発熱、リンパ球減少症、白血球減少症および糞便中のＣＰＶの検出）を分析した。
ワクチン製剤：
ｒＣＡＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２組織培養ストックを、以下に述べる目標用量まで０．０１Ｍ ＰＢＳで希釈した。アジュバントは使用しなかった。ＭＬＶ陽性対照を製剤化し、ＳＧＧＫ安定剤とともに凍結乾燥した。コンボ中の各抗原は、ＳＯＬＯＪＥＣ（登録商標）製品ラインの最小免疫量より高かった。ワクチンの目標投与量は、以下の通りであった：
Figure 2019531724
チャレンジ材料：
チャレンジ当日、凍結ＣＰＶ−２ｂチャレンジ材料の３つのバイアルを、３６±２℃の水槽で手でバイアルを撹拌して急速解凍した。材料を次いで、細胞培養培地に所望の濃度まで１：１０希釈した。チャレンジ接種材料は、調製およびチャレンジ手順の間中常に氷上に残っていた。
ワクチン抗原滴定：ＣＡＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２
簡単には、ワクチンの１０倍段階希釈物を作成した。各希釈物を、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を２．０×１０５細胞／ｍｌで播種した９６ウェルプレート中５ウェルの各々に、１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加した。５回の再現をワクチンごとに実施した。プレートを３６±１°Ｃおよび５±０．５％ ＣＯ２、４±１日間インキュベートした。インキュベーション期間後、プレートを固定し、ベクターのみを染色し、読み取った。力価を、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ方法を用いて５０％エンドポイントについて計算した。
陽性対照（ＣＰＶ−ＣＤＶ−ＣＡｄＶ２）
簡単には、ワクチン１０倍段階希釈物を作成した。各希釈物を、適切な濃度の細胞（ＣＰＶ − ２×１０５細胞／ｍｌのＭＤＣＫ、ＣＤＶ − ２×１０５細胞／ｍｌのＶＥＲＯ、ＣＡＶ２ − ２×１０５細胞／ｍｌのＭＤＣＫ）を播種した９６ウェルプレート中５ウェルの各々に、１ウェル当たり１００マイクロリットルで添加した。５回の再現を抗原分画ごとに実施した。プレートを３６±１°Ｃおよび５±０．５％ＣＯ２、３〜６日間インキュベートした。インキュベーション期間後、プレートを固定し、直接ＦＡコンジュゲートで染色し、読み取った。力価を、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ方法を用いて５０％エンドポイントについて計算した。
血清
各イヌからの最大１０ｍＬの全血を、血清について０ ＤＰＶ１に開始して毎週採取した。特定の時点には、以下が含まれた：０ＤＰＶ１、７ＤＰＶ１、１４ＤＰＶ１、２１ＤＰＶ１／０ＤＰＶ２、７ＤＰＶ２、および１４ＤＰＶ２。血液を凝固させ、１，０００〜１，３００×ｇで遠心分離して血清を分離し、少なくとも２アリコートに分注した。血清は、抗体力価の評価まで−２０℃以下で保管した。
血清学的分析は、血清中和（ＳＮ）アッセイを用いて実施した。ＳＮアッセイを使用してＣＡＶ２、ＣＰＶ−２ｂ、およびＣＰＶ−２ｃに対する血清抗体力価を測定した。
ＣＡｄＶ２血清学的検査のために、簡単には、加熱不活性化血清の段階希釈物を等容量のウイルス懸濁液（５０〜３００ ＦＡＩＤ５０）と混合した。血清−ウイルス混合物を３６±１℃で１時間インキュベートした。９６ウェルマイクロタイタープレートに、次いでＭＤＣＫ細胞（０．１ｍｌ／ウェルで２×１０５細胞）を播種した。プレートを加湿５＋０．５％ＣＯ２インキュベーターで５±１日間、３６±１℃でインキュベートした。プレートを氷冷アセトンで１５±５分間固定し、ウイルスを特異的免疫蛍光によって検出した。免疫蛍光によるウイルスの検出がないことは、ＳＮ抗体の存在を示した。ＳＮ抗体力価の決定のために、５０％中和エンドポイントをＲｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ方法を用いて計算した。
Figure 2019531724
ＣＰＶ−２ｂ血清学的検査のために、簡単には、加熱不活性化血清の段階希釈物を等容量のウイルス懸濁液（５０〜３００ ＦＡＩＤ５０）と混合した。血清−ウイルス混合物を３６±１℃で１時間インキュベートした。イヌ腎臓（ＤＫＦＤ−００）細胞（０．１ｍｌ／ウェルで２×１０５細胞）を、次いで９６ウェルマイクロタイタープレートの全てのウェルに添加した。プレートを加湿５＋０．５％ＣＯ２インキュベーターで６±１日間、３６±１℃でインキュベートした。プレートを氷冷アセトンで１５±５分間固定し、ウイルスを特異的免疫蛍光によって検出した。免疫蛍光によるウイルスの検出がないことは、ＳＮ抗体の存在を示した。ＳＮ抗体力価の決定のために、５０％中和エンドポイントをＲｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ方法を用いて計算した。
Figure 2019531724
ＣＰＶ−２ｃ血清学的検査のために、簡単には、加熱不活性化血清の段階希釈物を等容量のウイルス懸濁液（５０〜３００ ＦＡＩＤ５０）と混合した。血清−ウイルス混合物を３６±１℃で１時間インキュベートした。９６ウェルマイクロタイタープレートに、次いでＭＤＣＫ細胞（０．１ｍｌ／ウェルで７×１０４細胞／ｍｌ）を播種した。プレートを加湿５＋０．５％ＣＯ２インキュベーターで５±１日間、３６±１℃でインキュベートした。プレートを氷冷アセトンで１５±５分間固定し、ウイルスを特異的免疫蛍光によって検出した。免疫蛍光によるウイルスの検出がないことは、ＳＮ抗体の存在を示した。ＳＮ抗体力価の決定のために、５０％中和エンドポイントをＲｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ方法を用いて計算した。
Figure 2019531724
ＣＡｄＶ２、ＣＰＶ−２ｂおよびＣＰＶ−２ｃ抗体について互いに比較した場合、明確な抗体応答が３群との関連で認められた。
ＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２群は、ＭＬＶ群と比較して７ＤＰＶ１にはるかに強力なＣＡｄＶ２抗体応答を示したが、１４ＤＰＶ１までにはこれらの群のＧＭＴ値は類似していた。両群の抗体力価は２１ＤＰＶ１までに漸減し、この時点で動物を追加免疫した。追加免疫後、両群の抗体レベルは急上昇し、次いで徐々に安定した。ＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２群はＭＬＶ群より高い力価で安定した。陰性対照群は、試験の過程を通じてＣＡｄＶ２抗体陰性のままであった。
２つのワクチン接種群のＣＡｄＶ２抗体応答とは対照的に、ＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２群のＣＰＶ抗体応答は２回目のワクチン接種まで最小であり、この時点でＣＰＶ抗体力価は７ＤＰＶ２に急上昇し、次いでＣＰＶによるチャレンジまで安定した。チャレンジ後ＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２群の抗体応答は再び急上昇した。ＭＬＶワクチンは１回目のワクチン接種に対して十分に応答し、２回目のワクチン接種に対してさらに応答した。ＭＬＶ群のＣＰＶ抗体レベルは２回目のワクチン接種後に安定し、試験のチャレンジ期中、有意な増加を示さなかった。陰性対照動物は、有意なＣＰＶ抗体力価を示したチャレンジ期後１回目の採決まで、ワクチン接種期を通じてＣＰＶ抗体陰性のままであった。
臨床的観察：
全ての動物を観察し、直腸温を−２、−１および０ＤＰＣにベースラインを小数第２位で四捨五入した度数（華氏）について毎日測定した。チャレンジ後、動物を最大１４日間、毎日モニタリングし、直腸温および臨床徴候の観察値を測定した。動物ケージは、その日の観察が終了するまで掃除しなかった。
ＣＰＶの臨床徴候には、限定はされないが、以下が含まれた：（１）血便−通常、下痢と関連する少なくとも１０％の血液を含有する特異的糞便および／または粘液；糞便は典型的には暗赤色色であり、独特の強力な鉄臭を有する、（２）粘液便−少なくとも１０％の粘液を含有する特異的糞便は下痢と関連する可能性があり、血液を含有する場合または含有しない場合がある。粘液便は、質感および／または形を有する場合または有さない場合がある、（３）下痢−水っぽい質感のない平たい水たまり、（４）直腸温が、＞１０３．４°Ｆおよびベースラインの体温より少なくとも華氏１度高ければ、発熱を示した。体温が、９９．５°Ｆ以下およびベースラインの体温より少なくとも華氏１度低ければ、低体温を示した。
全てのイヌを、チャレンジ後の体重減少／増加の決定のために、０、７および１４ＤＰＣに小数第２位で四捨五入したキログラム（ｋｇ）で体重測定した。全ての体重は体重記録に収集した。
臨床徴候に関して、チャレンジ後の下痢、粘液便、または血便を含むＣＰＶ感染に特有のいずれかの臨床徴候のシグナル発生は、動物を臨床徴候陽性として定義した。食欲不振、抑うつ/嗜眠、および嘔吐の存在も、動物をパルボウイルス感染陽性として評価するための補助的基準としての使用で知られている。
この試験では１８匹中４匹が、２ＤＰＣに下痢または嘔吐を示した。これらの臨床徴候は、３〜４ＤＰＣの典型的なＣＰＶ発症範囲外であり、チャレンジ中に使用された空腹および／または麻酔法による可能性がある。それらはＣＰＶ感染の徴候とはみなされない。
ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２群（群１）は、６匹中１匹が血性粘液便を１日間示した１０ＤＰＣまで、感染の徴候を示さなかった。この群の１匹が、以前に述べたようにＣＰＶ発症の範囲外である嘔吐の徴候を２ＤＰＣに示し、それ故に感染の徴候とはみなされないことが留意されるべきである。
ＭＬＶ群（群２）では６匹中２匹が、５および７ＤＰＣに臨床徴候を示し、イヌ＃１２は７ＤＰＣに粘液便が認められ、イヌ＃１３は５および７ＤＰＣに下痢があった。この群の３匹が、以前に述べたようにＣＰＶ発症の範囲外である嘔吐または下痢の徴候を２ＤＰＣに示し、それ故に感染の徴候とはみなされないことが留意されるべきである。
陰性対照群（群３）の全てのイヌが、４ＤＰＣに始まり１１ＤＰＣに終わる一連の中程度から重度の臨床徴候（下痢、粘液便、脱水、嘔吐、食欲不振、血便）を示し、４匹はＣＰＶで死亡した（７ＤＰＣに３匹、８ＤＰＣに１匹）。
発熱：発熱に関して、チャレンジ後の発熱のシグナル発生（≧１０３．４°Ｆおよびチャレンジ前のベースラインより少なくとも１度高い直腸温）により、動物を陽性として分類した。
ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２試験群（群１）は、６匹中３匹で１回の発熱；９ＤＰＣに１匹、１２ＤＰＣに２匹を示した。ＭＬＶ群（群２）の６匹は発熱を示さなかった。陰性対照群（群３）では、６匹中３匹が４〜５ＤＰＣにわたって少なくとも１回の発熱を示した（１匹は２回示した）。６匹中２匹は、７ＤＰＣに低体温を示した。
体重：体重減少／増加を週ベースで決定するために、個々の動物ごとの体重を、前の週からの体重を引いて評価した。
ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２試験群（群１）もＭＬＶ試験群（群２）も、７または１４ＤＰＣに体重減少を示した動物はいなかった。陰性対照群（群３）の全ての動物は、７ＤＰＣに０．１〜０．８キログラムにわたる体重減少を示した。１４ＤＰＣに群３で試験に残っている動物は、７ＤＰＣから体重増加を経験した。
リンパ球減少症：リンパ球減少症に関して、チャレンジ後のリンパ球減少症のシグナル発生（チャレンジ前のベースラインの≧５０％減少）により、イヌを陽性として分類した。この試験では、ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２試験群（群１）には、発症が９〜１２ＤＰＣにわたる少なくとも１回のリンパ球減少症にかかった６匹中３匹が含まれた。ＭＬＶ群（群２）はリンパ球減少症の徴候を示さなかった。陰性対照群（群３）の全ての動物は、少なくとも１回のリンパ球減少症にかかり、発症は４ＤＰＣであった。
白血球減少症：白血球減少症に関して、チャレンジ後の白血球減少症のシグナル発生（チャレンジ前のベースラインの≧５０％減少）により、イヌを陽性として分類した。この試験では、ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２試験群（群１）およびＭＬＶ群（群２）は、白血球減少症の徴候を示さなかった。陰性対照群（群３）には、少なくとも１回の白血球減少症にかかり、６ＤＰＣに発症した６匹中５匹が含まれた。
糞便試料からのウイルス単離：ＣＰＶ糞便中ウイルス単離に関して、チャレンジ後の糞便中のＣＰＶウイルスの検出のシグナル発生により、イヌを陽性として分類した。≦１．５Ｌｏｇ１０ＦＡＩＤ５０／ｍｌのＣＰＶ糞便中ウイルス力価を、ＣＰＶ糞便中ウイルス単離陰性として記録した。全ての他の記録された力価＞１．５Ｌｏｇ１０ＦＡＩＤ５０／ｍｌを、ＣＰＶ糞便中ウイルス検出陽性として分類した。
この試験では、ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２（群１）群には、８〜１４ＤＰＣに始まる少なくとも１日のウイルス排出を示した６匹中４匹が含まれた。ＭＬＶ群（群２）は、検出可能な量の生きたウイルスを排出しなかった。陰性対照群の全ての動物は、３または４ＤＰＣに始まり９ＤＰＣまで持続する検出可能な量のウイルスを糞便中に排出した。
結果のまとめ：
まとめると、イヌ、６週２日齢〜７週２日齢に、１．０ｍｌの以下のワクチンを０ＤＰＶ１および２１ＤＰＶ１にワクチン接種した：（群１）ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２＝８．０ｌｏｇ／ｍｌ、（群２）ＭＬＶコンボ− ＣＡｄＶ２／ＣＤＶ／ＣＰＶ＝４．７／２．６／３．９ｌｏｇ／ｍｌ、（群３）ＰＢＳ対照。全てのワクチン接種イヌを、２２ＤＰＶ２に毒性ＣＰＶ−２ｂで口と鼻にチャレンジした。
ｒＣＡｄＶ２−ＣＰＶ ＶＰ２試験ワクチンは、２回投与レジメンで１回投与当たり８．０ｌｏｇで与えた場合、有効性基準を満たさなかった。イヌ３匹は発熱、糞便へのＣＰＶ排出およびリンパ球減少症を示し、イヌ１匹はイヌパルボウイルス確定的な臨床徴候を示した。イヌ４匹はＣＰＶの排出のみを示した。ワクチンは、およそ１０ＤＰＣまで初期の防御を提供するようであった。これは、陰性対照と比較して感染の臨床徴候の発症遅延である。１つワクチン接種には、原因不明の完全な角膜混濁が報告された。
（例８）
ｒＣＡｄＶ−ＥＨＶ−４ ｐ４３０／ＲａｂＧ（ｎ）を含む医薬組成物（ワクチン）の調製：
ｒＣＡｄＶ−ＥＨＶ−４ ｐ４３０／ＲａｂＧ（ｎ）ワクチンを含む医薬組成物（ワクチン）の調製：
ワクチン製剤：
ｒＣＡｄＶ−ＥＨＶ−４ ｐｐ４３０／ＲａｂＧ（Ｎ）組織培養ストックを、目標用量まで０．０１Ｍ ＰＢＳで希釈した。アジュバントは使用しなかった。
ｒＣＡｄＶ−ＥＨＶ−４ Ｐ４３０／ＲａｂＧ（ｎ）を用いたブタの接種および血清学的応答の評価：
試験デザイン：４〜８週齢のワクチン接種子ブタ群および対照群、投与（単回／２回）は筋肉内に２ｍｌ／回であった。
ベクターワクチンとしての特性を若齢子ブタで調査するために、ｒＣＡｄＶ−ＥＨＶ−４ Ｐ（ＧＧ４３０）ＲＡＢＧ（Ｎ）Ｃ１をワクチン接種−血清学的検査試験で試験した。
詳細には、子ブタにｒＣＡｄＶ−ＥＨＶ−４ ｐ４３０／ＲａｂＧ（Ｎ）Ｃ１を試験０および２１日目に６．７ｌｏｇの用量で２回ワクチン接種した（２ショットワクチン接種、２×ｒＣＡｄＶ）。非ワクチン接種群は陰性対照としての役目を果たした。
血清学的検査：ワクチン接種後の血清転換を測定するためのアッセイ
ワクチン接種後のＣＡｄＶ−２中和抗体の導入を、ｒＣＡｄＶ−２ ｐ４３０ ＲａｂＧワクチンを１回または２回ワクチン接種された動物由来の血清で試験した。ワクチン接種動物は、ＣＡｄＶ２に対して検出可能なウイルス中和（ＶＮ）力価を示したが、非ワクチン接種群由来の血清は、検出可能なＣＡｄＶ−２中和抗体レベルがなかった（表２）。カンザス州立大学狂犬病研究所による血清で実施した迅速蛍光焦点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）は、ワクチン接種動物１２匹中３匹で検出可能なＲＦＦＩＴ力価を示し、狂犬病中和抗体を測定する対照群では検出可能なＲＦＦＩＴ力価はなかった。ＥＬＩＳＡによる全狂犬病抗体試験およびＣＡｄＶウイルス排出も試験した。
Figure 2019531724
これらの結果は、目的の導入遺伝子の有効な発現を実証することによる（ワクチンウイルスの何割が感染細胞での目的の導入遺伝子の発現をもたらすかの発現評価による）ＣＡｄＶベクターにおける本発明のＥＨＶ−４プロモーターの有用性、ならびにウイルスレスキュー、およびワクチン接種動物における導入遺伝子の免疫原性を確認するものである。発現評価は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される発現カセットを有するＣＡｄＶベクターでは可能でさえなかった。本明細書において開示され、特許請求されている組成物および方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載の組成物および方法ならびに方法のステップまたは一連のステップに、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、化学的にかつ生理的に関連する特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤を置換することができるが、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に明らかであるそのような同様の置換および修飾は全て、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の中にあるとみなされる。
（参考文献）
以下の参考文献は、それにより本明細書に記載のものを補足する例示的な処置上のまたは他の詳細が提供される限りでは、明確に参照により本明細書に組み込まれる。

Figure 2019531724

Figure 2019531724

Figure 2019531724

Figure 2019531724

Figure 2019531724

Figure 2019531724

Claims (36)

  1. ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターと作動可能に連結された少なくとも１つの異種ＤＮＡをコードする発現カセットを含む組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクター。
  2. ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターが、４ｐｇＧ６００（配列番号２９）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含み、前記プロモーター配列が異種抗原の発現をもたらす、請求項１のｒＣＡｄＶベクター。
  3. プロモーター配列の機能的断片または誘導体が、少なくとも８０％、８５％の配列同一性、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％の配列同一性、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の配列同一性を有する、請求項２のｒＣＡｄＶベクター。
  4. 機能的断片が、４ｐｇＧ６００（配列番号２９）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって少なくとも７２％である、請求項２のｒＣＡｄＶベクター。
  5. 機能的断片が、４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）のトランケーションまたその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって少なくとも７８％である（またはより高い）、請求項２のｒＣＡｄＶベクター。
  6. プロモーター配列の機能的断片または誘導体が、５５０ヌクレオチド、好ましくは５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項２のｒＣＡｄＶベクター。
  7. ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターが４ｐｇＧ６００（配列番号２９）を含む、請求項１のｒＣＡｄＶベクター。
  8. ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターが４ｐＭＣＰ６００（配列番号３０）を含む、請求項１のｒＣＡｄＶベクター。
  9. ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターがＧ４３０（配列番号３１）を含む、請求項１のｒＣＡｄＶベクター。
  10. ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ４）プロモーターがｇＭＣＰ４５５（配列番号３２）を含む、請求項１のｒＣＡｄＶベクター。
  11. 感染性ＣＡｄＶとしてパッケージされる、請求項１のｒＣＡｄＶベクター。
  12. 異種ＤＮＡが、目的のエピトープ、生物学的応答調節因子、増殖因子、認識配列、治療用遺伝子、および融合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１のｒＣＡｄＶベクター。
  13. 異種ＤＮＡが目的の抗原エピトープをコードする、請求項１２のｒＣＡｄＶベクター。
  14. 目的の抗原エピトープが、イヌまたはネコ病原体の抗原である、請求項１３のｒＣＡｄＶベクター。
  15. 目的の抗原エピトープが、食品生産動物病原体に由来する抗原である、請求項１３のｒＣＡｄＶベクター。
  16. 目的の抗原エピトープが、モルビリウイルス抗原、狂犬病糖タンパク質、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質、免疫不全ウイルス抗原、パルボウイルス抗原、ポックスウイルス抗原からなる群から選択される、請求項１４のｒＣＡｄＶベクター。
  17. 食品生産動物病原体が、ブタ、ウシ、ウマ、家禽、および／またはヒツジ動物に由来する、請求項１５のｒＣＡｄＶベクター。
  18. 食品生産動物病原体が、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、パラインフルエンザ３ウイルス（ＰＩ−３）、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）、ウシエンテロウイルス（ＢＥＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ウシ狂犬病（ＢＲ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、アデノウイルス、アストロウイルス、マンヘミア・ヘモリチカ（以前はパスツレラ・ヘモリチカ）、パスツレラ・マルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス（ヒストフィルス・オビスおよびヘモフィルス・アグニ）、アクチノマイセス（コリネバクテリウム）、アクチノマイセス・ピオゲネス、クラミジア・シッタシ、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・フィタス・フィタス（以前はＣ・フィタス・インテスチナリス）、レプトスピラ・インテロガンス、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・グリッポチフォーサ、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリッポチフォーサ、レプトスピラ・ハージョ（レプトスピラ・ハージョプラジトノおよびレプトスピラ・ハージョボビス）、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・スイスおよびブルセラ・メリテンシス、リステリア・モノサイトゲネス、クラミジア・シッタシ、クロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ヘモリチクム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニ、モラキセラ・ボビス、クレブシエラ属種、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモネラ・ティフィムリウム；サルモネラ・ニューポート、マイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス、クリプトスポリジウム・パルバム、クリプトスポリジウム・ホミニス、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・アガラクチア、大腸菌（エスケリキア・コリ）、マイコプラズマ属種、マイコプラズマ・ディスパー、およびウレアプラズマ属種、トリトリコモナス・フィータス、トリコフィトン・ベルコーズム、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・サルキソヴィー、ネオスポラ・カニナム（以前はトキソプラズマ・ゴンディ）、バベシア・ビゲミナおよびバベシア・ボビス、ディクチオカウルス・ヴィヴィパロウス（肺虫症）、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７のｒＣＡｄＶベクター。
  19. 食品生産動物病原体が、サルモネラ属種、特にＳ．ティフィムリウム、Ｓ．コレラスイス；アストロウイルス；ロタウイルス；伝染性胃腸炎ウイルス；ブラキスピラ属種、特にＢ．ヒオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ；クロストリジウム属種、特にＣ．ディフィシル、Ｃ．パーフリンゲンスＡ、ＢおよびＣ型、Ｃ．ノビイ、Ｃ．セプチカム、Ｃ．テタニ；ブタ腸管ピコルナウイルス；ブタ腸管カリシウイルス；アクチノバシラス・プルロニューモニエなどの呼吸器病原体；ボルデテラ・ブロンキセプティカ；エリシペロスリクス・ルシオパシエ；ヘモフィルス・パラスイス、特に亜型１、７および１４；パスツレラ属種、特にＰ．マルトシダ；マイコプラズマ属種、特にＭ．ハイオニューモニエ、Ｍ．ヒオリニス；ブタインフルエンザウイルスＡ型；ＰＲＲＳウイルス；ブタサーコウイルス；ブタパルボウイルス；仮性狂犬病ウイルス；エペリスロゾーノシス・スイス、マイコバクテリウム属種、特にＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．ボビス；ブタ呼吸器コロナウイルス；ブタコロナウイルス、特にＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、およびデルタコロナウイルス；アルカノバクテリウム・ピオゲネス；ブタアデノウイルス；豚コレラ；ブタサイトメガロウイルス；アフリカ豚コレラ；または、他の病原体、例えば、大腸菌（エスケリキア・コリ）、ストレプトコッカス属種、特にＳ．スイス、Ｓ．ポルシナス、Ｓ．ディスガラクティエ、好ましくは亜種エクイシミリス；ブルセラ・スイス、特に次亜種１、２および３型；レプトスピラ属種、特にＬ．オーストラリス、Ｌ．カニコーラ、Ｌ．グリッポチフォーサ、Ｌ．ポモナ、Ｌ．イクテロヘモラジア、Ｌ．インターロガンス、Ｌ．タラソビ、Ｌ．ハージョ、Ｌ．セジュロ；脳心筋炎ウイルス；赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス；日本脳炎ウイルス；西ナイルウイルス；レオウイルス；ルブラウイルス；メナングルウイルス；ニパウイルス；水疱性口内炎ウイルス；ブタの水疱性発疹のウイルス：ブタポックスウイルス；ブタヘルペスウイルス；およびスタフィロコッカス・ヒカスを含む他の病原体、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７のｒＣＡｄＶベクター。
  20. 請求項１から１９に記載の組換えイヌアデノウイルス（ｒＣＡｄＶ）ベクター、および薬学的または獣医学的に許容される、許容される担体または希釈剤を含む免疫原性またはワクチン組成物。
  21. 前記担体が経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適である、請求項２０の免疫原性またはワクチン組成物。
  22. ａ．請求項１から１９に記載の組換えｒＣＡｄＶベクターを宿主細胞に導入するステップ、
    ｂ．好適な条件下で感染細胞を培養するステップ、
    ｃ．感染細胞および／またはベクターおよび／またはウイルス成分を回収するステップ
    を含み、
    ｄ．ステップ（ｃ）の回収物を精製するステップ
    を含んでもよく、
    ｅ．前記回収物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
    を含む、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するための免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法。
  23. 好ましくは使用するための、請求項２０に記載のワクチンの免疫原性組成物の治療有効量を動物に投与するステップを含む、動物において病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候もしくは疾患を低減もしくは予防する方法、または動物において病原体の感染を処置もしくは予防する方法で使用するための方法。
  24. 免疫原性組成物が１回投与される、請求項２３の方法。
  25. 免疫原性組成物が２回用量として投与される、請求項２３の方法。
  26. 免疫原性組成物が、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内投与される、請求項２３の方法。
  27. 免疫原性組成物が、同種および／または異種ウイルスチャレンジに対する防御をもたらす、請求項２３の方法。
  28. 動物における病原体によって引き起こされる臨床疾患に対する免疫性を前記動物に与える方法であって、請求項２０に記載の免疫原性組成物を動物に投与するステップを含み、これにより、前記免疫原性組成物またはワクチンが感染の臨床徴候を引き起こさないが前記病原体の病原体型に対する免疫性を動物に与える免疫応答を誘導することができる、方法。
  29. 免疫原性組成物が１回投与される、請求項２８の方法。
  30. 免疫原性組成物が２回用量として投与される、請求項２９の方法。
  31. 免疫原性組成物が、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内投与される、請求項２８の方法。
  32. 免疫原性組成物が、同種および／または異種ウイルスチャレンジに対する防御をもたらす、請求項２８の方法。
  33. ａ．動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
    ｂ．請求項２０に記載の免疫原性組成物またはワクチン
    を含み、
    ｃ．指示リーフレット
    を含んでもよい、動物における病原体に関連する疾患に対して前記動物をワクチン接種するための、および／または、動物における病原体に関連するまたは病原体によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するための、キット。
  34. 請求項１から１９の組換えイヌアデノウイルス２型（ｒＣＡｄＶ２）を発現する真核生物の宿主細胞株。
  35. 前記宿主細胞株が、ＰＫ／ＷＲＬ細胞株、ＲＫ１３細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＳＴ細胞株、ＡＩ−ＳＴ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１、Ｓｆプラス細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、および／またはそれらの派生物からなる群から選択される哺乳動物細胞株または昆虫細胞株である、請求項３４の真核生物の宿主細胞株。
  36. 請求項１から１９の組換えイヌアデノウイルス２型（ｒＣＡｄＶ２）を発現する原核生物の宿主細胞株。
JP2019515518A 2016-09-20 2017-09-18 イヌアデノウイルスベクター Active JP6913747B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662397139P 2016-09-20 2016-09-20
US62/397,139 2016-09-20
PCT/US2017/051964 WO2018057441A1 (en) 2016-09-20 2017-09-18 Canine adenovirus vectors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019531724A true JP2019531724A (ja) 2019-11-07
JP2019531724A5 JP2019531724A5 (ja) 2021-01-07
JP6913747B2 JP6913747B2 (ja) 2021-08-04

Family

ID=59974885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019515518A Active JP6913747B2 (ja) 2016-09-20 2017-09-18 イヌアデノウイルスベクター

Country Status (18)

Country Link
US (1) US10329586B2 (ja)
EP (1) EP3515504B1 (ja)
JP (1) JP6913747B2 (ja)
KR (1) KR102618127B1 (ja)
CN (1) CN109715219B (ja)
AR (1) AR110632A1 (ja)
AU (1) AU2017332677B2 (ja)
BR (1) BR112019005511A2 (ja)
CA (1) CA3036386A1 (ja)
CL (1) CL2019000704A1 (ja)
EA (1) EA201990718A1 (ja)
ES (1) ES2956050T3 (ja)
HU (1) HUE064133T2 (ja)
MX (1) MX2019003158A (ja)
PH (1) PH12019500591A1 (ja)
TW (1) TW201823467A (ja)
UY (1) UY37405A (ja)
WO (1) WO2018057441A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019533438A (ja) * 2016-09-20 2019-11-21 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ 新しいプロモーター

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019003116A (es) 2016-09-20 2019-08-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nueva vacuna contra la gripe porcina.
MX2019003158A (es) 2016-09-20 2019-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vectores de adenovirus canino.
UY37406A (es) 2016-09-20 2018-03-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nuevo sitio de inserción orf70 de ehv
CN110004178A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 石河子大学 一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备的制备方法
BR102019017792A2 (pt) * 2019-08-27 2021-11-16 Fundação Oswaldo Cruz Receptáculo proteico, método para produção do receptáculo, método de identificação de patógenos ou de diagnóstico de doenças, e, uso do receptáculo
CN112593014A (zh) * 2020-12-31 2021-04-02 上海基灵生物科技有限公司 一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法
CN112680335A (zh) * 2021-02-04 2021-04-20 杭州遂曾生物技术有限公司 一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒
CN112961836B (zh) * 2021-02-25 2023-07-04 新疆农业大学 一株e种bev新强毒株及其分离方法与应用
CN115029462B (zh) * 2022-08-10 2022-11-08 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种动植物疫病的核酸标准物质、形貌模拟方法及其应用
CN117756949A (zh) * 2024-02-21 2024-03-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种正痘病毒属融合抗原及应用

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US382425A (en) 1888-05-08 Brandt
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US3857423A (en) 1971-12-27 1974-12-31 W Ronca Topical medicament kit with interlocking components
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
IE872748L (en) 1986-10-16 1988-04-16 Arjomari Europ Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0386185A1 (fr) 1988-07-29 1990-09-12 IntraCel Corporation Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
DE69032284T2 (de) 1989-03-21 1998-10-08 Vical, Inc., San Diego, Calif. Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5552143A (en) 1989-03-24 1996-09-03 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5616326A (en) 1990-01-25 1997-04-01 The University Court Of The University Of Glasgow Recombinant canine adenovirus 2 (CAV-2)
GB9001766D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Univ Court Of The University O Vaccines
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
JP3602530B2 (ja) 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US6193983B1 (en) 1992-06-01 2001-02-27 The University Of Melbourne Equine herpesvirus glycoproteins
US5741696A (en) 1992-08-07 1998-04-21 Syntro Corporation Recombinant equine herpesviruses
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
HU216871B (hu) 1993-07-13 1999-09-28 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Defektív adenovírusvektorok és génterápiai alkalmazásuk
FR2711670B1 (fr) 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
US5820868A (en) 1993-12-09 1998-10-13 Veterinary Infectious Disease Organization Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system
DE69536091D1 (de) 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
AU694519B2 (en) 1994-04-29 1998-07-23 Immuno Aktiengesellschaft Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
FR2725726B1 (fr) 1994-10-17 1997-01-03 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
FR2727689A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-07 Transgene Sa Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
FR2730504B1 (fr) 1995-02-13 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants
FR2731710B1 (fr) 1995-03-14 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique
WO1996029421A1 (en) 1995-03-23 1996-09-26 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vectors for gene delivery
FR2732357B1 (fr) 1995-03-31 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose
FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
US6090393A (en) * 1996-07-03 2000-07-18 Merial Recombinant canine adenoviruses, method for making and uses thereof
CA2259460C (en) * 1996-07-03 2007-03-13 Rhone Merieux, Inc. Recombinant canine adenovirus (cav) containing exogenous dna
JP2002512501A (ja) 1996-07-03 2002-04-23 メリアル インコーポレイテッド 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ）
US6156567A (en) * 1996-07-03 2000-12-05 Merial Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters
US6183752B1 (en) 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
DE19830141A1 (de) 1998-07-06 2000-01-13 Regine Heilbronn Rekombinante Herpesviren für die Erzeugung rekombinanter Adeno-Assoziierter-Viren
ATE316139T1 (de) 1998-07-31 2006-02-15 Akzo Nobel Nv Attenuierte pferdeherpesvirus
WO2000061770A2 (en) 1999-04-08 2000-10-19 Chiron Corporation Enhancement of the immune response for vaccine and gene therapy applications
EP1118670A1 (en) * 1999-12-07 2001-07-25 Genethon III Canine adenovirus vectors for the transfer of genes in targeted cells
EP1248851A2 (en) 1999-12-07 2002-10-16 Genethon III Canine adenovirus vectors for the transfer of genes in targeted cells
AR040601A1 (es) * 2002-07-19 2005-04-13 Boehringer Ingelheim Vetmed Mutantes ehv negativos de gm sin elementos heterologos
FR2845395B1 (fr) 2002-10-08 2008-05-30 Agronomique Inst Nat Rech Vecteurs adenoviraux recombinants et leurs applications
WO2007081336A1 (en) 2006-01-13 2007-07-19 Five Prime Therapeutics, Inc. Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins
BRPI0709282B8 (pt) 2006-03-29 2021-05-25 Merial Ltd vacina contra estreptococos
EP2062972A4 (en) 2006-09-13 2010-11-24 Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd NEW DOG VACCINE
US20110110892A1 (en) 2008-03-24 2011-05-12 President And Fellows Of Harvard College Vectors for delivering disease neutralizing agents
PT2310501E (pt) 2008-07-23 2013-07-18 Boehringer Ingelheim Pharma Novos elementos reguladores
US20130197612A1 (en) 2010-02-26 2013-08-01 Jack W. Lasersohn Electromagnetic Radiation Therapy
MX2019003158A (es) * 2016-09-20 2019-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vectores de adenovirus canino.
MX2019003116A (es) 2016-09-20 2019-08-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nueva vacuna contra la gripe porcina.
UY37406A (es) 2016-09-20 2018-03-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nuevo sitio de inserción orf70 de ehv
MX2019003160A (es) 2016-09-20 2019-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nuevos promotores.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019533438A (ja) * 2016-09-20 2019-11-21 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ 新しいプロモーター
US11261464B2 (en) 2016-09-20 2022-03-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Promoters

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017332677A1 (en) 2019-04-11
EP3515504B1 (en) 2023-07-12
JP6913747B2 (ja) 2021-08-04
AR110632A1 (es) 2019-04-17
AU2017332677B2 (en) 2024-01-11
ES2956050T3 (es) 2023-12-12
CL2019000704A1 (es) 2019-08-30
PH12019500591A1 (en) 2020-01-20
KR20190055183A (ko) 2019-05-22
CN109715219A (zh) 2019-05-03
EA201990718A1 (ru) 2019-10-31
KR102618127B1 (ko) 2023-12-27
BR112019005511A2 (pt) 2019-10-01
CN109715219B (zh) 2024-03-01
WO2018057441A1 (en) 2018-03-29
US10329586B2 (en) 2019-06-25
MX2019003158A (es) 2019-05-27
TW201823467A (zh) 2018-07-01
US20180080045A1 (en) 2018-03-22
EP3515504A1 (en) 2019-07-31
UY37405A (es) 2018-03-23
CA3036386A1 (en) 2018-03-29
HUE064133T2 (hu) 2024-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6913747B2 (ja) イヌアデノウイルスベクター
US10619169B2 (en) EHV insertion site ORF70
JP2019531723A (ja) 新規のブタインフルエンザワクチン
US11261464B2 (en) Promoters
US10905758B2 (en) Intranasal vector vaccine against porcine epidemic diarrhea
US11904010B2 (en) Recombinant virus capable of stably expressing target proteins
EP4076516A1 (en) Multivalent hvt vector vaccine
US11596681B2 (en) EHV insertion site UL43
EA044953B1 (ru) Векторы аденовируса собачьих
US11033616B2 (en) Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
RU2816428C9 (ru) Рекомбинантный вирус, способный к устойчивой экспрессии белков-мишеней

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190520

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200511

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200806

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20201009

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201111

A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20201111

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201124

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210224

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210524

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210610

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210712

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6913747

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150