ES2956050T3 - Vectores de adenovirus caninos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo de las vacunas con vectores CAdV, y especialmente a promotores adecuados para expresar antígenos diana de dichas vacunas con vectores. Se divulgan y reivindican adenovirus caninos recombinantes, métodos para producirlos, usos para ellos (incluso en composiciones inmunológicas, inmunogénicas, vacunales o terapéuticas, o, como vector para clonación, replicación o expresión de ADN y métodos para usar las composiciones y el vector), productos de expresión de ellos y usos de los productos de expresión. Además, se describen y reivindican promotores EHV4 truncados, casetes de expresión que contienen los promotores y virus y plásmidos recombinantes que contienen los promotores o casetes de expresión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores de adenovirus caninos

Antecedentes de la invención

A. Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las vacunas (vectoriales), y especialmente al adenovirus canino recombinante de tipo 2, en particular con casetes de expresión mejorados adecuados para expresar antígenos diana de dichas vacunas vectoriales.

B. Antecedentes y descripción de la técnica relacionada

Los adenovirus se han investigado ampliamente como vectores para vacunas recombinantes (véase la revisión Bru, T., S. Salinas, y E.J. Kremer, An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses, 2010. 2(9): p. 2134-53). En las dos últimas décadas se ha acumulado una gran cantidad de información sobre los adenovirus, especialmente en los campos de la terapia génica y el desarrollo de vacunas. Varias características de los adenovirus los hacen atractivos como herramientas de transferencia de genes: (1) la estructura del genoma adenoviral está bien caracterizada; (2) grandes porciones del ADN viral pueden ser sustituidas por secuencias extrañas; (3) las variantes recombinantes son relativamente estables, (4) el virus recombinante puede cultivarse a títulos elevados; (5) no hay ninguna neoplasia humana asociada al adenovirus; y (6) el uso del adenovirus atenuado de tipo salvaje como vacuna es seguro.

Entre los objetivos publicados para vacunas vectorizadas CAV-2 eficaces se incluye la vacuna contra la rabia para gatos (Hu, R.L., et al., Experimental immunization of cats with a recombinant rabies-canine adenovirus vaccine elicits a long-lasting neutralizing antibody response against rabies. Vaccine, 2007. 25(29): p. 5301-7), perros (Hu, R., et al., Prevention of rabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2 encoding the rabies virus glycoprotein. Microbes Infect, 2006. 8(4): p.1090-7), ratones (Li, J., et al., A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice. Virology, 2006. 356(1-2): p. 147-54), mapaches (Henderson, H., et al., Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine, 2009. 27(51): p. 7194-7), ovejas (Bouet-Cararo, C., et al., Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunization of sheep. Vaccine, 2011. 29(6): p. 1304-10), mofetas (Henderson, H., et al., Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine, 2009. 27(51): p. 7194-7) y porcino (Liu, Y, et al., Efficacy and safety of a live canine adenovirus-vectored rabies virus vaccine in swine. Vaccine, 2008. 26(42): p.

5368-72), moquillo canino (Fischer, L., et al., Vaccination of puppies born to immune dams with a canine adenovirusbased vaccine protects against a canine distemper virus challenge. Vaccine, 2002. 20(29-30): p. 3485-97), y panleucopenia felina (Yang, S., et al., Complete protection of cats against feline panleukopenia virus challenge by a recombinant canine adenovirus type 2 expressing VP2 from FPV. Vaccine, 2008. 26(11): p. 1482-7). CAV-2 también presenta el potencial de ser utilizado como una vacuna oral, como lo indica la eficacia de la vacunación oral de perros (Zhang, S., et al., Oral vaccination of dogs (Canis familiaris) with baits containing the recombinant rabiescanine adenovirus type-2 vaccine confers long-lasting immunity against rabies. Vaccine, 2008. 26(3): p. 345-50), mapaches y mofetas contra la rabia (Henderson, H., et al., 2009, Zhao et al. 2014. Experimental Oral Immunization of Ferret Badgers (Melogale moschata) with a Recombinant Canine Adenovirus Vaccine CAV-2-E3- RGP and an Attenuated Rabies Virus SRV9. J. Wildlife Diseases 50(2):374-377). Curiosamente, los vectores basados en adenovirus competentes en replicación han mostrado eficacia a pesar de la inmunidad pasiva contra el vector (Gallichan, W.S., et al., Mucosal immunization with a recombinant adenovirus vector induces local and systemic immunity and protection from herpes simplex virus. Adv Exp Med Biol, 1995. 371B: p. 1581-5; Lubeck, M.D., et al., Immunogenicity of recombinant adenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees following intranasal administration. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994. 10(11): p. 1443-9; Wang, Y, et al., The use of an E1-deleted, replication-defective adenovirus recombinant expressing the rabies virus glycoprotein for early vaccination of mice against rabies virus. J Virol, 1997. 71(5): p. 3677-8), lo que sugiere que podrían superar la inmunidad derivada de la madre (Papp, Z., L.A. Babiuk, y M.E. BacaEstrada, The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine, 1999. 17(7-8): p. 933-43; Babiuk, L.A. y S.K. Tikoo, Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. J Biotechnol, 2000. 83(1-2): p. 105-13). Esto fue confirmado para el moquillo canino por Fischer et al. (2002). Sin embargo, los anticuerpos preexistentes podrían impedir el uso de la vía oral de inmunización (Wright, N., et al., High prevalence of antibodies against canine adenovirus (CAV) type 2 in domestic dog populations in South Africa precludes the use of CAV-based recombinant rabies vaccines. Vaccine, 2013. 31(38): p. 4177-82).

El adenovirus canino de tipo 2 (CAV-2) suele causar una infección del tracto respiratorio de inaparente a leve y se considera una de las causas de la traqueobronquitis infecciosa común generalizada (Buonavoglia, C. y V. Martella, Canine respiratory viruses. Vet Res, 2007. 38(2): p. 355-73; Tham, K.M., G.W. Horner, and R. Hunter, Isolation and identification of canine adenovirus type-2 from the upper respiratory tract of a dog. N Z Vet J, 1998. 46(3): p. 102-5).

El CAV-2 también se ha implicado en episodios de enteritis (Hamelin, C., P Jouvenne, y R. Assaf, Association of a type-2 canine adenovirus with an outbreak of diarrheal disease among a large dog congregation. J Diarrhoeal Dis Res, 1985. 3(2): p. 84-7; Macartney, L., H.M. Cavanagh, and N. Spibey, Isolation of canine adenovirus-2 from the feces of dogs with enteric disease and its unambiguous typing by restriction endonuclease mapping. Res Vet Sci, 1988. 44(1): p. 9-14) y se ha detectado en el cerebro de perros con signos neurológicos (Benetka, V., et al., Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec, 2006. 158(3): p. 91-4.). Se han desarrollado varias vacunas basadas en CAV2 y se han utilizado ampliamente en todo el mundo para la vacunación de cachorros y perros adultos. Las vacunas vivas modificadas de CAV-2 demostraron ser muy eficaces para reducir la circulación de CAV-2 en las poblaciones caninas (Buonavoglia et al., 2007). Los perros vacunados con CAV-2 desarrollan inmunidad tanto contra CAV-1 como contra CAV-2(Appel, M., et al., Pathogenicity of low-virulence strains of two canine adenovirus types. Am J Vet Res, 1973. 34(4): p. 543-50; Appel, M., L.E. Carmichael, and D.S. Robson, Canine adenovirus type 2-induced immunity to two canine adenoviruses in pups with maternal antibody. Am J Vet Res, 1975. 36(08): p. 1199-202). El uso de CAV-2 para la inmunización de cachorros contra ambos tipos de adenovirus caninos ha eliminado los efectos secundarios relacionados con la seguridad encontrados con las vacunas CAV-1 (Bittle, J.L., W.A. Grant, and F.W. Scott, Canine and feline immunization guidelines--1982. J Am Vet Med Assoc, 1982. 181(4): p. 332-5; Curtis, R. and K.C. Barnett, The 'blue eye' phenomenon. Vet Rec, 1983. 112(15): p. 347-53). La aparente seguridad de CAV2 como vacuna ha quedado bien demostrada por la ausencia de complicaciones inducidas y asociadas a la vacuna en perros y otras especies animales, incluido el hombre, durante sus 30 años de utilidad. Además, los resultados de los estudios serológicos de campo indican que muchos animales salvajes (zorros, mapaches, mofetas y mangostas) están expuestos asintomáticamente al CAV2 o a una infección vírica antigénicamente relacionada (Summer et al., 1988). Una cepa vacunal de adenovirus canino de serotipo 2 (CAV2), por lo tanto, proporciona un ejemplo único de un virus seguro de replicación competente y huésped restringido que puede ser considerado para la derivación de una vacuna candidata eficaz basada en vectores para la vacunación, especialmente de perros.

Por lo tanto, el adenovirus canino posee muchas características ideales para el desarrollo de vacunas víricas vectorizadas. Además de su uso seguro y eficaz, como se ha detallado anteriormente, ofrece características importantes, entre ellas respuestas inmunes humorales y celulares a la vacuna, que los objetivos patógenos virales podrían requerir para la protección; tiene una amplia gama de huéspedes potenciales y tropismo tisular; no tiene envoltura, por lo que es probable que sea más estable que los virus con envoltura; puede crecer hasta títulos altos y existen protocolos de producción y ensayos bien establecidos; Puede utilizarse tanto como virus de replicación competente como de replicación deficiente; y puede transportar cantidades relativamente grandes de ADN heterólogo, en particular cuando el CAdV es “sin agallas” ~ 30 kb de ADN exógeno pueden ser insertados, sin embargo, el virus debe ser rescatado en presencia de virus ayudante.

Fisher et al., en la patente US N.° 6.090.393, describieron el uso de un CAdV2 recombinante, con ADN exógeno insertado en regiones o porciones no esenciales dentro de E1, E3 y/o el extremo derecho del genoma entre la ITR derecha y la unidad de transcripción E4. La región E3 se empleó para la generación del recombinante porque parte de esta región se identificó como no esencial tanto in vitro como in vivo para la formación de virus infecciosos (por ejemplo, basándose en datos derivados de VHA y Ad3 bovino) y, por lo tanto, se eligió como región de inserción. Los vectores de adenovirus que tienen una región E1 suprimida son incompetentes para la replicación y presentan otros problemas, por lo que no se prefirió su uso.

Fisher et al. divulgaron además el uso de promotores truncados derivados de citomegalovirus murino o citomegalovirus humano MCMV o HCMV, por ejemplo, HCMV-IE o MCMV-IE. El promotor hCMV-IE fue elegido por Fisher et al. como el estado de la técnica y como una región reguladora upstream prometedora, concluyendo que estaba asociado con el nivel más alto y la persistencia más larga de expresión de proteína recombinante en cultivo de tejidos. El promotor hCMV-IE también se consideró una clara ventaja porque se comprobó que funcionaba en casi todas las líneas celulares ensayadas. El ímpetu detrás de las deleciones dirigidas de porciones del promotor, como el HCMV-IE, era reducir el tamaño del promotor y así abordar las limitaciones de empaquetamiento de los adenovirus. Fisher et al. divulgaron específicamente un fragmento activo de la HCMV-IE con un tamaño de 91 pb o un fragmento activo de la MCMV-IE con un tamaño de 466 pb, es decir, una HCMV-IE transcripcionalmente activa truncada de aproximadamente 91 pb o una MCMV-IE transcripcionalmente activa truncada de aproximadamente 466 pb.

Aunque Fisher et al. describen la construcción de varios vectores CAdV2 recombinantes, por ejemplo, un casete de expresión que codifica un polinucleótido para una hemagluttanina (HA) o una proteína de fusión (F) del CDV unida operablemente al promotor H6 (vH6) del virus vaccinia, Fisher et al. no demostraron una expresión robusta del antígeno CDV a partir de ninguno de los vectores CAdV2 construidos. En su lugar, la Patente Fisher '393 divulgó las limitaciones generales del tamaño de los nucleótidos en los sitios de inserción E3 como variables para la expresión estable, sin observar y/o abordar nunca ninguna posibilidad de variabilidad en la elección de los promotores como contribución al rescate viral o a la expresión de proteínas heterólogas en células infectadas. En un estudio posterior de Fisher et al. 2002 (“Vaccination of puppies born to immune dams with a canine adenovirus-based vaccine protects against a canine distemper virus challenge” Vaccine 20 (2002) 3485-3497), informaron de la primera construcción y caracterización de dos virus CAdV2 recombinantes en los que los casetes de expresión HA y F del CDV se habían insertado en la región E3 del vector dirigido por un fragmento de 91 pb del promotor IE del hCMV. Además, sustituyeron la 5'UTR de hCMVIE por la TPL de hAd2 para facilitar la expresión del gen transgénico tras el inicio de la replicación de CAV2. En conjunto, el énfasis en la estrategia de clonación se puso en minimizar el tamaño de los casetes de expresión para los ADNc HA y F de CDV. Además, el estudio detallaba los posibles problemas de recuperación viral debidos al sitio específico de inserción, el tamaño de la deleción, el tamaño de la inserción y la orientación de la inserción. En ese estudio pudieron recuperar clones estables que demostraban una inserción correcta y pudieron ensayar la inducción de inmunidad tras la inmunización. Tras una única administración intranasal de la mezcla de rCAdV2 que codifica toda la HA del CDV y vCA17 a cachorros seronegativos, se observaron títulos sistémicos muy altos de SN del CDV (>2,0 log 10) y una protección casi completa tras la provocación. Sin embargo, dado que los cachorros fueron inmunizados con una mezcla de los dos vectores que contenían los antígenos HA y F, los autores no pudieron concluir si uno o ambos vectores expresaban los transgenes CDV en los perros inmunizados, ni tampoco demostraron de forma concluyente la expresión robusta del transgén en poblaciones celulares individuales.

Los experimentos aquí descritos demuestran que no se observó una expresión robusta del transgén a partir de casetes insertados en el locus genómico E3 en células infectadas con casetes de expresión del transgén rCAdV-2 CMV5 competentes para la replicación, tal y como se midió mediante la detección de proteínas (IFA, citometría de flujo, dot blot). De hecho, los experimentos aquí realizados muestran que los vectores rCAdV-2 con casetes de expresión con el promotor CMV5 no pudieron ser rescatados, por lo que no se pudo medir la expresión de proteínas en las células infectadas. Esto se produjo a pesar de que las transfecciones transitorias in vitro con los mismos plásmidos de transferencia que contenían esos casetes de expresión demostraron que la actividad del promotor CMV5 era mayor que la actividad del promotor CMVie en lo que respecta a los niveles de expresión proteica. Así pues, la ausencia de una expresión transgénica robusta y reproducible, y/o de rescate viral, hizo muy cuestionable la utilidad de los casetes de expresión impulsados por CMV en el vector CAdV2, especialmente en huéspedes en los que no se produce replicación.

Por lo tanto, aunque los promotores-acentuadores IE extremadamente fuertes y no específicos de tejido del HCMV y el MCMV (citomegalovirus del ratón) pueden ser muy adecuados para diversas actividades de investigación y para una utilidad limitada en las especies diana donde se replica el CAdV2, no se consideraron promotores eficaces ni fiables para la construcción de vacunas con vectores CAdV2 para su uso en otras especies. Lo que era necesario era sustituir los promotores CMV por promotores eficaces capaces de impulsar la expresión estable, robusta y reproducible de epítopos antigénicos de interés en el contexto del virus CAdV2 recombinante para la producción de vacunas para su uso en una variedad de especies.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN

La invención se define por las reivindicaciones y cualesquiera otros aspectos, consideraciones, configuraciones o formas de realización expuestos en el presente documento que no entren en el ámbito de las reivindicaciones son meramente informativos.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente invención proporciona un vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) que comprende un casete de expresión que codifica al menos un ADN heterólogo enlazado operablemente a un promotor de herpesvirus equino-4 (EHV4), en el que el promotor de herpesvirus equino-4 (EHV4) comprende SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO.

32 o las secuencias nucleotídicas complementarias de las mismas o un derivado funcional de las mismas o las secuencias nucleotídicas complementarias de las mismas, en el que dicha secuencia promotora conduce a la expresión de un antígeno heterólogo, en el que el derivado funcional de la secuencia promotora tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32.

Se divulgan nuevas secuencias reguladoras de ácido nucleico / secuencias promotoras para la expresión de transgenes, composiciones inmunogénicas, vacunas y métodos relacionados que superan las deficiencias de la técnica.

Las secuencias promotoras establecidas que se utilizan ampliamente para impulsar altos niveles de expresión de transgenes en diversos sistemas de vectores, incluidos los herpesvirus, son las secuencias promotoras de genes tempranos inmediatos de HCMV (Boshart et al., 1985; Foecking y Hofstetter 1986) o el citomegalovirus del ratón (MCMV; Dorsch-Hasler et al., 1985) o promotores fuertes de virus oncogénicos como el virus simio 40 (SV40), por ejemplo, el promotor del antígeno T grande del SV40 y muchos más (por ejemplo, Kim et al., 1990). Los biólogos celulares prefieren estos promotores potentes porque funcionan de forma autónoma en varios sistemas de cultivo celular. En el contexto de la replicación vírica, una célula infectada se transforma mediante funciones víricas en una máquina de replicación vírica.

Sin embargo, en el caso de las vacunas vectoriales mejoradas, ninguno de los promotores fuertes autónomos descritos anteriormente se considera una opción; en particular, los promotores derivados del CMV no fueron impulsores eficaces y reproducibles de la expresión de transgenes en las vacunas vectoriales recombinantes de CAdV2.

Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar promotores con alta actividad en el contexto de la replicación viral como los de los genes p- y - de e HV-1. Se divulgan nuevas secuencias promotoras alternativas derivadas de la secuencia genómica publicada de EHV-4 (herpesvirus equino 4 cepa NS80567, genoma completo, Accession AF030027, Version AF030027.1 GI:2605950, fecha 21 de mayo de 1998). La identidad de secuencia de los genes con los genes del EHV-1 oscila entre el 55 y el 84 %.

Se divulgan dos nuevos promotores: 4μgG600 y 4μMCP600, y derivados de longitudes más cortas de los mismos, que han demostrado ser funcionales tras transfección transitoria en cultivos celulares o en el fondo de replicación rCAdV-BAC en cultivos celulares.

Se dan a conocer dos nuevos promotores: p430 y p455, que han demostrado ser funcionales en el contexto de la replicación del rCAdV2 en cultivos celulares y, en el caso del p455, también en animales (cerdos). Los niveles de actividad de los dos nuevos promotores durante el ciclo de replicación viral parecen ser muy similares, según se deduce de experimentos cinéticos de promotores in vitro.

Se ha demostrado que las nuevas secuencias promotoras son eficientes en el fondo del vector adenovirus canino (CAdV).

Como ya se ha comentado, el rescate del CAdV recombinante no se conseguía cuando la secuencia promotora CMV5 estaba presente en los casetes de expresión situados en la región E3. Esto parece ser específico de la secuencia, ya que el tamaño de los casetes de expresión no había superado las limitaciones experimentales de tamaño del genoma observadas. Por el contrario, las nuevas secuencias promotoras derivadas de EHV-4 de la presente divulgación, como p430 y p455, no sólo facilitan la expresión del transgén, sino que además no interfieren con el paso crucial del rescate viral y son, por tanto, ventajosas en vista de las secuencias promotoras del arte previo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención resuelve los problemas inherentes a la técnica anterior y proporciona un avance claro en el estado de la técnica.

En general, la presente divulgación proporciona un vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) que comprende un casete de expresión que codifica al menos un ADN heterólogo enlazado operablemente a un promotor de herpesvirus equino-4 (EHV4).

La presente divulgación se refiere además a un vector rCAdV, en el que el promotor del herpesvirus equino-4 (EHV4) comprende 4μgG600 (SEQ ID NO: 29) o 4μMCP600 (SEQ ID NO: 30) o las secuencias nucleotídicas complementarias de los mismos o un fragmento funcional o un derivado funcional de los mismos o las secuencias nucleotídicas complementarias de los mismos, en el que dicha secuencia promotora conduce a la expresión de un antígeno heterólogo.

Se da a conocer que el fragmento funcional o derivado de la secuencia promotora tiene al menos un 80 %, 85 % de identidad de secuencia, preferentemente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % de identidad de secuencia, más preferentemente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 % de identidad de secuencia.

Se divulga que el fragmento funcional es un truncamiento de 4μgG600 (SEQ ID NO: 29) o la secuencia de nucleótidos complementaria del mismo, preferentemente la identidad de secuencia es de al menos 72 % en toda su longitud.

Se divulga que el fragmento funcional es un truncamiento de 4μMCP600 (SEQ ID NO: 30) o la secuencia complementaria de nucleótidos de la misma, preferentemente la identidad de secuencia es de al menos el 78 % en toda su longitud (o superior).

Se divulga además que el fragmento funcional o derivado de la secuencia promotora 4μgG600 (SEQ ID NO: 29) o 4μMCP600 (SEQ ID NO: 30) tiene una longitud de 550 nucleótidos, preferentemente 500, 490, 480, 470, 460, 455, 450, 445, 440, 435, 434, 433, 432, 431,430 nucleótidos, más preferentemente 455 o 430 nucleótidos.

Se divulga además que el vector rCAdV comprende el promotor del herpesvirus equino 4 (EHV4) que comprende 4μgG600 (SEQ ID NO: 29).

Se divulga además que el vector rCAdV comprende el promotor del herpesvirus equino-4 (EHV4) que comprende 4μMCP600 (SEQ ID NO: 30).

Se describe además que el vector rCAdV comprende el promotor del herpesvirus equino 4 (EHV4) 4pG430 (SEQ ID NO: 31).

Se describe además que el vector rCAdV comprende el promotor del herpesvirus equino 4 (EHV4) gMCP455 (SEQ ID NO: 32).

El vector rCAdV se empaqueta como un CAdV infeccioso.

Se divulga que el vector rCAdV comprende un ADN heterólogo que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un epítopo de interés, un modulador de respuesta biológica, un factor de crecimiento, una secuencia de reconocimiento, un gen terapéutico y una proteína de fusión.

El ADN heterólogo codifica un epítopo antigénico de interés.

El epítopo antigénico de interés es un antígeno de un patógeno canino o felino.

Se divulga que el epítopo antigénico de interés es un antígeno derivado de un patógeno animal productor de alimentos, más específicamente en el que el patógeno animal productor de alimentos se deriva de animales porcinos, bovinos, equinos, aves de corral y/u ovinos; y más específicamente, en el que el patógeno animal productor de alimentos se selecciona del grupo que consiste en: Virus de la diarrea vírica bovina (VDVB), Virus de la Parainfluenza-3 (PI-3), Virus de la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina (IBR), Virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV), Herpesvirus bovino (BHV), Rotavirus bovino (BRV), Enterovirus bovino (BEV), Coronovirus bovino (BCV), Rabia bovina (BR), Parvovirus bovino (BPV), Astrovirus adenovirus, Mannheimia haemolytica (antes Pasteurella haemolytica), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus (Histophilus ovis y Haemophilus agni), Actinomyces (Corynebacterium), Actinomyces pyogenes, Chlamydia psittaci, Campylobacter fetus venerealis y Campylobacter fetus fetus (antes C fetus intestinalis ), Leptospira interrogans, Leptospira hardjo, Leptospira pomona y Leptospira grippotyphosa, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo (Leptospira hardjoprajitno y Leptospira hardjo-bovis), Brucella abortus, Brucella suis y Brucella melitensis, Listeria monocytogenes, Chlamydia psittaci, Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Moraxella bovis, Klebsiella spp, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium; Salmonella newport, Mycobacterium avium paratuberculosis, Cryptsporidium parvum, Cryptsporidium hominis, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Mycoplasma spp, Mycoplasma dispar y Ureaplasma spp. , Tritrichomonas foetus, Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton sarkisovii, Neospora caninum (antes Toxoplasma gondii), Babesia bigemina y Babesia bovis,Dictyocaulus viviparous (enfermedad del gusano pulmonar), y combinaciones de los mismos.

Se divulga que el epítopo antigénico de interés es un antígeno derivado de un patógeno animal productor de alimentos, más específicamente en el que el patógeno animal productor de alimentos se deriva de animales porcinos, bovinos, equinos, aves de corral y/u ovinos; y más específicamente, en el que el patógeno animal productor de alimentos se selecciona del grupo que consiste en: Salmonella spp., en particular S. typhimurium S. choleraesuis; Astrovirus; Rotavirus; Virus de la gastroenteritis transmisible; Brachyspira spp., en particular B. hyodysenteriae, B. pilosicoli; Clostridium spp, en particular C. difficile, C. perfringens tipos A, B y C, C. novyi, C. septicum, C. tetani; picornavirus entéricos porcinos; calicivirus entéricos porcinos; patógenos respiratorios, que incluyen: Actinobacillus pleuropneumonia; Bordetella bronchiseptica; Erysipelothrix rhsiopathiae; Haemophilus parasuis, en particular los subtipos 1, 7 y 14; Pasteurella spp., en particular P. multocida; Mycoplasma spp, en particular M. hyopneumoniae, M. hyorhinis; virus de la gripe porcina A; virus del PRRS; circovirus porcino; parvovirus porcino; virus de la seudorabia; Eperythrozoonosis suis, Mycobacterium spp, en particular M. avium, M. intracellulare, M. bovis; Coronavirus respiratorio porcino; Coronavirus porcino, en particular TGEV, PEDV y Coronavirus delta; Arcanobacterium pyogenes; Adenovirus porcino; Peste porcina clásica; Citomegalovirus porcino; Peste porcina africana; u otros patógenos, como Escherichia coli, Streptococcus spp.., en particular S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, preferentemente subsp. equisimilis; Brucella suis, en particular biovares 1, 2 y 3; Leptospira spp, en particular L. australis, L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi, L. hardjo, L. sejroe; virus de la encefalomiocarditis; virus de la encefalomielitis hemaglutinante; virus de la encefalitis japonesa; virus del Nilo Occidental; reovirus; rubulavirus; virus Menangle; virus Nipah; virus de la estomatitis vesicular; virus del exantema vesicular porcino; virus de la viruela porcina; virus del herpes porcino; y Staphylococcus hyicus, y combinaciones de los mismos.

Se divulga que el epítopo antigénico de interés se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de Morbillivirus, una glicoproteína de rabia, proteína de envoltura de virus de Leucemia Felina (FeLV), un antígeno de virus de inmunodeficiencia, un antígeno de parvovirus, un antígeno de poxvirus.

La presente divulgación se refiere además a una composición inmunogénica o vacunal que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) divulgado anteriormente, y un portador o diluyente farmacéutico o veterinario aceptable.

Se divulga que las composiciones inmunogénicas o vacunales que comprenden el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) según lo divulgado anteriormente son adecuadas para aplicación oral, intradérmica, intramuscular o intranasal.

La presente divulgación se refiere además a un método de producción de una composición inmunogénica o vacuna que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) como se ha divulgado anteriormente para reducir la incidencia o la gravedad de uno o más signos clínicos asociados con o causados por una infección, que comprende las siguientes etapas: (a) introducir en una célula huésped un vector de rCAdV recombinante que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) como se ha desvelado anteriormente ; (b) cultivar las células infectadas en condiciones adecuadas; (c) cosechar células infectadas y/o componentes de vector y/o virus; (d) opcionalmente purificar la cosecha de la etapa (c); y (e) mezclar dicha cosecha con un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación se refiere además a un método para reducir o prevenir los signos clínicos o la enfermedad causados por una infección con un patógeno en un animal o para su uso en un método para tratar o prevenir una infección con un patógeno en un animal que comprende el paso de administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición inmunogénica de vacuna que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) como se ha divulgado anteriormente.

Se divulga que en los métodos según lo divulgado anteriormente, la composición inmunogénica se administra una vez.

En los métodos descritos anteriormente, la composición inmunogénica se administra en dos dosis.

En los métodos descritos anteriormente, la composición inmunogénica se administra por vía oral, intradérmica, intramuscular o intranasal.

Se divulga que en los métodos divulgados anteriormente, la composición inmunogénica protege contra un desafío viral homólogo y/o heterólogo.

La presente divulgación se refiere además a un método de inmunización de un animal contra una enfermedad clínica causada por un patógeno en dicho animal, que comprende el paso de administrar al animal la composición inmunogénica que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) como se ha divulgado anteriormente, por lo que la composición inmunogénica o vacuna no causa signos clínicos de infección, pero es capaz de inducir una respuesta inmune que inmuniza al animal contra formas patógenas de dicho patógeno.

En un aspecto específico de la divulgación según el método anterior, la composición inmunogénica se administra una vez, o alternativamente como dos dosis.

En un aspecto específico de la divulgación según el método anterior, la composición inmunogénica se administra por vía oral, intradérmica, intramuscular o intranasal.

En un aspecto específico de la divulgación según el método anterior, la composición inmunogénica protege contra un desafío viral homólogo y/o heterólogo.

La presente divulgación se refiere además a un kit para vacunar a un animal, contra una enfermedad asociada con y/o reducir la incidencia o la gravedad de uno o más signos clínicos asociados con o causados por un patógeno en un animal que comprende: (a) un dispensador capaz de administrar a un animal una vacuna que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) como se ha desvelado anteriormente; y (b) la composición inmunogénica o vacuna que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) como se ha desvelado anteriormente, y (c) opcionalmente un prospecto de instrucciones.

La presente divulgación se refiere además a una línea celular huésped eucariota que expresa el adenovirus canino recombinante de tipo 2 (rCAdV2) como se ha divulgado anteriormente.

Se divulga que la línea celular huésped es una línea celular de mamífero o una línea celular de insecto seleccionada del grupo que consiste en una línea celular PK/WRL, una línea celular RK13, una línea celular MDBK, una línea celular ST, una línea celular AI-ST, una línea celular VERO, una línea celular Sf9, una línea celular Sf21, una línea celular Sf plus, una línea celular MDCK, y/o derivados de las mismas.

Se divulga que la línea celular huéspeda es una línea celular huésped procariota que expresa el adenovirus canino recombinante de tipo 2 (rCAdV2) como se ha divulgado anteriormente.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por un experto en la materia a la que pertenece esta invención en el momento de su presentación. El significado y el alcance de los términos deben ser claros; sin embargo, en caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones aquí proporcionadas prevalecen sobre cualquier diccionario o definición extrínseca. Además, salvo que el contexto exija lo contrario, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán los singulares. En el presente documento, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique lo contrario. Además, el uso de la expresión “que incluye”, así como otras formas como “incluye” e “incluido”, no es limitante.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de virología, biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante, química de proteínas e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris y S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

Debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente formas de realización particulares de la invención y no pretende ser limitativa. Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “un antígeno” incluye una mezcla de dos o más antígenos, la referencia a “un excipiente” incluye mezclas de dos o más excipientes, y similares.

Definiciones de biología molecular

El término “vector”, tal como se conoce en la técnica, se refiere a una construcción polinucleotídica, normalmente un plásmido o un cromosoma artificial bacteriano, o vectores virales vivos atenuados utilizados para transmitir material genético a una célula huésped. Los vectores pueden ser, por ejemplo, bacterias, virus, fagos, cromosomas artificiales bacterianos, cósmidos o plásmidos. Un vector puede estar compuesto o contener ADN o ARN. En algunas formas de realización, un vector está compuesto de ADN. En algunas formas de realización, un vector es un virus infeccioso. Un vector viral de este tipo contiene un genoma viral que ha sido manipulado de manera que porta un gen extraño que no tiene ninguna función en la replicación del vector viral ni en cultivo celular ni en un animal huésped. Según aspectos específicos de la presente divulgación, un vector puede utilizarse para diversos aspectos, como la mera transmisión de material genético, para la transfección de células u organismos huéspedes, para su uso como vacunas, por ejemplo vacunas de ADN o para fines de expresión génica. La expresión génica es un término que describe la biosíntesis de una proteína en una célula dirigida por una secuencia polinucleotídica específica denominada gen. En un aspecto específico, un vector puede ser un “vector de expresión”, que es un vector capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por uno o más genes portados por el vector cuando está presente en el entorno apropiado.

Los vectores y métodos para fabricar y/o utilizar vectores (o recombinantes) para la expresión pueden ser por o análogos a los métodos divulgados en: patentes US Nros. 4.603.112, 4.769.330, 5.174.993, 5.505.941, 5.338.683, 5.494.807, 4.722.848, 5.942.235, 5.364.773, 5.762.938, 5.770.212, 5.942.235, 382.425, publicaciones PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, “Applications of pox virus vectors to vaccination: An update”, PNAS USA 93: 11349-11353, octubre de 1996; Moss, “Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety”, PNAS USA 93: 11341-11348, octubre de 1996; Smith et al., patente U.S. N.° 4,745,051(baculovirus recombinante); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, “Baculovirus Expression Protocols” (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., “Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, pp.

156-2165; Pennock et al., “Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, “Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0370573; solicitud U.S. N.° 920,197, presentada el 16 de octubre de 1986; publicación de patente EP N.° 265785; patente U.S. N.° 4.769.331 (herpesvirus recombinante); Roizman, “The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,” PNAS USA 93:11307-11312, octubre de 1996; Andreansky et al., “The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,” PNAS USA 93: 11313­ 11318, octubre de 1996; Robertson et al., “Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”, PNAS USA 93: 11334-11340, octubre de 1996; Frolov et al., “Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications”, PNAS USA 93: 11371-11377, octubre de 1996; Smith et al., patente U.S. 65, 3068-3075-1991; patentes U.S. Nros.

5.591.439, 5.552.143; WO 98/00166; solicitudes US autorizada con números de serie 08/675,556, y 08/675,566 ambas presentadas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante); Grunhaus et al., 1992, “Adenovirus as cloning vectors,” Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, abril, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; y McClements et al., “ Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”, PNAS USA 93., octubre de 1996: 11414-11420, octubre de 1996; y patentes U.S. Nros. 5.591.639, 5.589.466, y 5.580.859, así como WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660; Tang et al., Nature, y Furth et al., Analytical Biochemistry, relativos a vectores de expresión de ADN, entre otros. Véase también WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (sistema de expresión lentiviral); Sanford et al., patente U.S. N° 4.945.050; Fischbach et al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (sistemas de vectores de ADN); Szoka et al., patente U.S. N.° 4.394.448 (método de inserción de ADN en células vivas); McCormick et al., patente U.S. N.° 5.677.178 (uso de virus citopáticos); y patente U.S. N.° 5.928.913 (vectores para el suministro de genes); así como otros documentos citados en el presente documento.

El término “vector viral” describe un virus modificado genéticamente que ha sido manipulado mediante la técnica del ADN recombinante de manera que su entrada en una célula huésped dé lugar a una actividad biológica específica, por ejemplo, la expresión de un transgén portado por el vector. En un aspecto específico, el transgén es un antígeno. Un vector viral puede o no ser competente para la replicación en la célula, tejido u organismo diana.

La generación de un vector viral puede llevarse a cabo utilizando cualquier técnica de ingeniería genética adecuada conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación, las técnicas estándar de digestión con endonucleasas de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos, secuenciación de ADN, transfección en cultivos celulares, por ejemplo como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y (1989)) o K. Maramorosch y H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. Londres, Reino Unido (2014)).

Un vector viral puede incorporar secuencias del genoma de cualquier organismo conocido. Las secuencias pueden incorporarse en su forma nativa o pueden modificarse de cualquier manera para obtener una actividad deseada. Por ejemplo, las secuencias pueden incluir inserciones, deleciones o sustituciones. Además, las secuencias pueden “optimizarse con codones” para mejorar la expresión de la proteína en el organismo vivo mediante el aumento de la eficiencia traslacional del gen de interés. Por ejemplo, un gen de interés puede mutarse (o sintetizarse de novo) para cambiar los codones utilizados para codificar determinados aminoácidos, sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la propia proteína. Los codones raros pueden sustituirse por codones más abundantes en los genes del organismo huésped. La optimización de codones en el gen de interés puede ser la mejor manera de aumentar la funcionalidad y/o expresión del gen en el fondo de la célula huésped.

Un vector viral puede incluir regiones codificantes para dos o más proteínas de interés. Por ejemplo, el vector viral puede incluir la región codificante para una primera proteína de interés y la región codificante para una segunda proteína de interés. La primera proteína de interés y la segunda proteína de interés pueden ser iguales o diferentes. En algunas formas de realización, el vector viral puede incluir la(s) región(es) codificante(s) para una tercera o cuarta proteína de interés. La tercera y la cuarta proteína de interés pueden ser iguales o diferentes. La longitud total de las dos o más proteínas de interés codificadas por un vector viral puede variar. Por ejemplo, la longitud total de las dos o más proteínas puede ser de al menos aproximadamente 200 aminoácidos. Al menos aproximadamente 250 aminoácidos, al menos aproximadamente 300 aminoácidos, al menos aproximadamente 350 aminoácidos, al menos aproximadamente 400 aminoácidos, al menos aproximadamente 450 aminoácidos, al menos aproximadamente 500 aminoácidos, al menos aproximadamente 550 aminoácidos, al menos aproximadamente 600 aminoácidos, al menos aproximadamente 650 aminoácidos, al menos aproximadamente 700 aminoácidos, al menos aproximadamente 750 aminoácidos, al menos aproximadamente 800 aminoácidos, o mayor.

Los vectores virales preferidos incluyen vectores adenovirales caninos CAdV2.

Según aspectos específicos de la presente divulgación, el término “vector viral” o alternativamente “construcción viral” se refiere a una construcción viral recombinante derivada de un virus, que se selecciona de la familia de Adenoviridae (AdV) como CAdV-1 y CAdV-2 (Adenovirus canino), (véase van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Carstens, E.B., Estes, M.K., Lemon, S.M., Maniloff, J., Mayo, M.A., McGeoch, D.J., Pringle, C.R. y Wickner, R.B. (2000). Virus taxonomy. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego. 1162 pp).

Los términos “vector viral” y “constructo viral” pueden utilizarse indistintamente.

El término “constructo”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un ácido nucleico recombinante como un plásmido, un BAC o un virus recombinante que se ha generado artificialmente.

El término “plásmido” se refiere al ADN citoplasmático que se replica independientemente del cromosoma bacteriano dentro de una célula huésped bacteriana. En un aspecto específico de la presente divulgación, el término “plásmido” y/o “plásmido de transferencia” y/o “fragmento de transferencia” se refiere a un elemento de tecnología de ADN recombinante útil para la construcción de, por ejemplo, un casete de expresión para su inserción en un vector viral. En otro aspecto específico, el término “plásmido” puede utilizarse para especificar un plásmido útil para fines de vacunación con ADN.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “ácido nucleico” y “polinucleótido” son intercambiables y se refieren a cualquier ácido nucleico.

Los términos “ácido nucleico”, “secuencia de ácido nucleico”, “secuencia de nucleótidos”, “polinucleótido”, “secuencia de polinucleótidos”, “secuencia de ARN” o “secuencia de ADN” utilizados en el presente documento se refieren a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido y a fragmentos y porciones de los mismos y a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que pueden ser de cadena simple o doble y representar la cadena sentido o antisentido. La secuencia puede ser una secuencia no codificante, una secuencia codificante o una mezcla de ambas. Las secuencias de ácido nucleico de la presente divulgación pueden prepararse mediante técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los términos “ácido nucleico” y “polinucleótido” también incluyen específicamente ácidos nucleicos compuestos de bases distintas de las cinco bases biológicas (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo).

Los términos “ácido nucleico regulador”, “elemento regulador” y “elemento de control de la expresión” se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas de ácido nucleico que pueden influir en la expresión de una secuencia codificante enlazada operablemente en un organismo huésped concreto. Estos términos se utilizan en sentido amplio y abarcan todos los elementos que promueven o regulan la transcripción, incluidos los promotores, las secuencias promotoras, los elementos centrales necesarios para la interacción básica de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, los elementos aguas arriba, los potenciadores y los elementos de respuesta. Los elementos reguladores ejemplares en procariotas incluyen promotores, secuencias operadoras y sitios de unión a ribosomas. Los elementos reguladores que se utilizan en células eucariotas pueden incluir, sin limitación, secuencias de control transcripcional y traslacional, como promotores, potenciadores, señales de empalme, señales de poliadenilación, terminadores, señales de degradación de proteínas, sitios de entrada del ribosoma interno (IRES), secuencias picomaviridales 2A, y similares, que proporcionan y/o regulan la expresión de una secuencia codificante y/o la producción de un polipéptido codificado en una célula huésped.

Un “sitio interno de entrada al ribosoma” o “IRES” describe una secuencia que promueve funcionalmente la iniciación de la traducción independiente del gen 5' del IRES y permite que dos cistrones (marcos de lectura abiertos) se traduzcan a partir de un único transcrito en una célula animal. El IRES proporciona un sitio de entrada ribosómica independiente para la traducción del marco de lectura abierto inmediatamente aguas abajo del mismo. A diferencia de los ARNm bacterianos, que pueden ser policistrónicos, es decir, codificar varios polipéptidos diferentes que se traducen secuencialmente a partir de los ARNm, la mayoría de los ARNm de las células animales son monocistrónicos y codifican la síntesis de un solo polipéptido. Con un transcrito policistrónico en una célula eucariota, la traducción se iniciaría a partir del sitio de iniciación de la traducción 5'most, terminaría en el primer codón de parada, y el transcrito se liberaría del ribosoma, dando lugar a la traducción de sólo el primer polipéptido codificado en el ARNm. En una célula eucariota, un transcrito policistrónico con un IRES enlazado operablemente al segundo o posterior marco abierto de lectura del transcrito permite la traducción secuencial de ese marco abierto de lectura aguas abajo para producir los dos o más polipéptidos codificados por el mismo transcrito. El IRES puede ser de longitud variable y de diversas fuentes, por ejemplo, el virus de la encefalomiocarditis (EMCV), picornavirus (por ejemplo, el virus de la fiebre aftosa, FMDV o el virus de la polio (PV), o el virus de la hepatitis C (HCV). Se han descrito varias secuencias IRES y su uso en la construcción de vectores, y son bien conocidas en la técnica. La secuencia codificadora descendente se une de forma operativa al extremo 3' del IRES a cualquier distancia que no afecte negativamente a la expresión del gen descendente. La distancia óptima o permisible entre el IRES y el inicio del gen corriente abajo puede determinarse fácilmente variando la distancia y midiendo la expresión en función de la distancia.

El término “2a” o “péptido 2a” hace referencia a secuencias oligopéptidas cortas, descritas como 2a y '2a-like', que sirven como enlazadores capaces de mediar en una escisión cotraduccional entre proteínas mediante un proceso definido como ribosomalskipping. Tales secuencias 2a y '2a-like' (de Picornaviridae y otros virus o secuencias celulares) pueden utilizarse para concatenar múltiples secuencias génicas en un único gen, asegurando su coexpresión dentro de la misma célula (véase Luke y Ryan, 2013).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “promotor” o “secuencia promotora” hace referencia a una secuencia de nucleótidos que permite la unión de la ARN polimerasa y dirige la transcripción de un gen.

Normalmente, un promotor está situado en la región no codificante 5' de un gen, proximal al sitio de inicio transcripcional del gen. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción se caracterizan a menudo por secuencias de nucleótidos consenso. Ejemplos de promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores de bacterias, levaduras, plantas, virus y animales como mamíferos (incluyendo caballos, cerdos, vacas y humanos), aves o insectos. Un promotor puede ser inducible, reprimible y/o constitutivo. Los promotores inducibles inician mayores niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, como un cambio de temperatura (Ptashne, 2014). Ejemplos de promotores bien conocidos por el experto en la materia son, por ejemplo, SV40 large T, HCMV y MCMV immediate early gene 1, promotor del factor de elongación alfa humano, promotor del poliedro de baculovirus.

Tal como se utiliza en el presente documento en el contexto de la presente divulgación, el término promotor se refiere especialmente a un fragmento funcional, por ejemplo, un truncamiento de 4μgG600 (SEQ ID NO: 29) o la secuencia de nucleótidos complementaria del mismo, preferentemente la identidad de secuencia es (al menos) del 72 % en toda la longitud (o superior). Además, tal como se utiliza en el presente documento en el contexto de la presente divulgación, el término promotor se refiere especialmente a un fragmento funcional, por ejemplo, un truncamiento de 4μMCP600 (SEQ ID NO: 30) o la secuencia de nucleótidos complementaria del mismo, preferentemente la identidad de secuencia es (al menos) del 78 % en toda su longitud (o superior). Más preferentemente, “promotor” se refiere a p430 (SEQ ID NO: 31) o p455 (SEQ ID NO: 32). Los términos “p430”, “gG 430” y “430” se utilizan como sinónimos e indistintamente a lo largo de la especificación, figuras, listado de secuencias, etc. Los términos “p455”, “MCP 455” y “455” se utilizan como sinónimos e intercambiables en toda la especificación, figuras, listado de secuencias, etc.

Los promotores de EHV-4 son preferentemente promotores transcripcionalmente activos truncados que comprenden una región transactivada con una proteína transactivadora proporcionada por el virus y la región promotora mínima del promotor de longitud completa del que se deriva el promotor transcripcionalmente activo truncado. A efectos de la presente especificación, un “promotor” se compone de una asociación de secuencias de ADN correspondientes al promotor mínimo y secuencias reguladoras aguas arriba; un “promotor mínimo” se compone del sitio CAP más la caja TATA (secuencias mínimas para el nivel básico de transcripción; nivel no regulado de transcripción); y, las “secuencias reguladoras aguas arriba” se componen del elemento o elementos aguas arriba y/o secuencia o secuencias potenciadoras. Además, el término “truncado” indica que el promotor de longitud completa no está completamente presente, es decir, que se ha eliminado alguna porción del promotor de longitud completa. Los promotores truncados en formas de realización preferidas se derivan del genoma del virus del herpes equino-4 (EHV-4) denominado en el presente documento 4μgG600 (SEQ ID NO: 29), 4μMCP600 (SEQ ID NO: 30), los promotores truncados son μgG430 (SEQ ID NO: 31) o gMCP455 (SEQ ID NO: 32), derivados de las secuencias de longitud completa respectivamente.

El promotor puede truncarse de modo que haya una reducción de tamaño del 5 %, 10 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 40 %, 45 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % e incluso hasta del 90 % con respecto a un promotor de longitud completa basado en pares de bases; por ejemplo, con los promotores equinos 4μgG600 (SEQ ID NO. :29), 4μMCP600 (SEQ ID NO: 30), respectivamente. De hecho, un promotor truncado de la divulgación puede consistir esencialmente en cualquier región dentro del truncamiento que sea transactivada por una proteína transactivadora proporcionada por un virus o sistema en el que se inserte el promotor truncado, y por tanto es un promotor mínimo.

Un promotor truncado “transcripcionalmente activo” o “competente” de la presente divulgación se refiere a los promotores truncados de herpesvirus eucarióticos transcripcionalmente activos derivados del genoma del herpesvirus equino 4: los promotores EHV-4 gG430 (SEQ ID NO: 31) y gMCP455 (SEQ ID NO: 32). Por “activo” (o “competente”), el promotor truncado transcripcionalmente activo debe mostrar al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 %, y más preferentemente al menos el 95 % de la actividad transcripcional del promotor de longitud completa. La supresión de nucleótidos o de porciones o de regiones del promotor de longitud completa se puede realizar a partir de las enseñanzas del presente documento, sin experimentación indebida, para la generación de fragmentos activos además de los ejemplificados.

Por consiguiente, un promotor útil en la práctica de la divulgación puede incluir derivados y/o subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y, por lo tanto, funcionan como un promotor, y que ventajosamente pueden tener una actividad promotora que es sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa del que se deriva el derivado o subfragmento. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “derivado” o “subfragmento” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que tiene modificaciones tales como truncamientos y/o sustituciones/eliminaciones tales que la secuencia promotora tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el promotor de tipo salvaje. Estos derivados o subfragmentos incluyen secuencias de ácido nucleico que tienen modificaciones menores que pueden ser deliberadas, como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término “derivados” contempla además supresiones, adiciones y sustituciones de la secuencia, siempre que el promotor siga siendo “transcripcionalmente activo” o “competente” para impulsar la expresión del polipéptido enlazado operablemente que codifica un antígeno de interés, por ejemplo.

El término “potenciador” denota una secuencia polinucleotídica que en la localización cis actúa sobre la actividad de un promotor y estimula así la transcripción de un gen o secuencia codificante conectada funcionalmente a este promotor. A diferencia de los promotores, el efecto de los potenciadores es independiente de la posición y la orientación, por lo que pueden situarse delante o detrás de una unidad de transcripción, dentro de un intrón o incluso dentro de la región codificante. El potenciador puede estar situado tanto en las inmediaciones de la unidad de transcripción como a una distancia considerable del promotor. También es posible que exista un solapamiento físico y funcional con el promotor. El experto conocerá una serie de potenciadores de diversas fuentes (y depositados en bancos de datos como GenBank, por ejemplo, potenciadores de SV40, potenciadores de CMV, potenciadores de polioma, potenciadores de adenovirus) que están disponibles como elementos independientes o elementos clonados dentro de secuencias de polinucleótidos (por ejemplo, depositados en el ATC^c o de fuentes comerciales e individuales). Algunas secuencias promotoras también contienen secuencias potenciadoras, como el promotor del CMV, de uso frecuente. El potenciador del CMV humano es uno de los más potentes identificados hasta la fecha. Un ejemplo de potenciador inducible es el potenciador de la metalotioneína, que puede ser estimulado por glucocorticoides o metales pesados.

El término “secuencias de nucleótidos complementarias” describe una cadena de las dos cadenas emparejadas de polinucleótidos como ADN o ARN. La secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria refleja la secuencia de nucleótidos de su cadena emparejada, de forma que por cada adenosina contiene una timina (o uracilo para el ARN), por cada guanina una citosina, y viceversa. La secuencia de nucleótidos complementaria de, por ejemplo, 5'-GCATAC-3' es 3-CGTATG-5' o, para el ARN, 3-CGUAUG- 5'.

Los términos “gen”, “gen de interés”, tal como se utilizan aquí, tienen el mismo significado y se refieren a una secuencia polinucleotídica de cualquier longitud que codifica un producto de interés. El gen puede comprender además secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificantes o no traducidas) y siguen (secuencias 3' no codificantes o no traducidas) a la secuencia codificante. La secuencia seleccionada puede ser de longitud completa o truncada, un gen de fusión o marcado, y puede ser un ADNc, un ADN genómico o un fragmento de ADN. En general, se entiende que el ADN genómico que codifica para un polipéptido o ARN puede incluir regiones no codificantes (es decir, intrones) que se empalman a partir del ARN mensajero maduro (ARNm) y, por lo tanto, no están presentes en el ADNc que codifica para el mismo polipéptido o ARN. Puede ser la secuencia nativa, es decir, la(s) forma(s) natural(es), o puede estar mutada, o comprender secuencias derivadas de fuentes diferentes o modificadas de otro modo según se desee. Estas modificaciones incluyen optimizaciones de codones para optimizar el uso de codones en la célula huésped seleccionada o el etiquetado. Además, pueden incluir la eliminación o adición de sitios de acción cis, como donantes de empalme (crípticos), sitios aceptores y puntos de bifurcación, señales de poliadenilación, cajas TATA, sitios chi, sitios de entrada ribosómica, secuencias repetidas, estructuras secundarias (por ejemplo, bucles de tallo), sitios de unión para factores de transcripción u otros factores reguladores, sitios de enzimas de restricción, etc., por citar sólo algunos ejemplos no limitativos. La secuencia seleccionada puede codificar un polipéptido secretado, citoplasmático, nuclear, de membrana o de superficie celular.

Por definición, un “epítopo” es un determinante antigénico inmunológicamente activo en el sentido de que, una vez administrado al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral (células B) y/o celular (células T). Se trata de grupos químicos o secuencias peptídicas particulares de una molécula que son antigénicos. Un anticuerpo se une específicamente a un epítopo antigénico concreto de un polipéptido. Ejemplos específicos y no limitantes de un epítopo incluyen una secuencia de tetra- a pentapéptido en un polipéptido, una secuencia de tri- a pentaglicósido en un polisacárido. En el animal, la mayoría de los antígenos presentarán varios o incluso muchos determinantes antigénicos simultáneamente. Un polipéptido de este tipo también puede calificarse de polipéptido inmunogénico y el epítopo puede identificarse como se describe más adelante.

Un “epítopo de interés” puede ser un antígeno de un patógeno o toxina veterinarios, o de un antígeno de un patógeno o toxina veterinarios, o de otro antígeno o toxina que provoque una respuesta con respecto al patógeno, o de otro antígeno o toxina que provoque una respuesta con respecto al patógeno, como, a título de ejemplo no limitativo: un antígeno de Paramyxovirus, por ejemplo, un antígeno de moquillo canino, por ejemplo, un antígeno de moquillo canino. por ejemplo, un antígeno del virus del moquillo canino (VDC) como HA o F, un antígeno del virus respiratorio sincitial bovino (VRSB), el virus de la parainfluenza bovina 3 (bPIV3); una glicoproteína de la rabia, por ejemplo, glicoproteína G de la rabia; un antígeno de la gripe aviar, por ejemplo, HA de la gripe del pavo, antígeno de la gripe del pollo/Pennsylvania/1/83 como una nucleoproteína (NP); un antígeno del virus de la leucemia bovina, por ejemplo, envoltura de gp51,30; un antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), por ejemplo, HN o F; un antígeno del virus de la leucemia felina (FeLV), por ejemplo, proteína de envoltura del FeLV; una glicoproteína de herpesvirus, por ejemplo, una glicoproteína de herpesvirus felino, herpesvirus equino, herpesvirus bovino, virus de la pseudorrabia o herpesvirus canino (glicoproteína gB, gC o gD del herpesvirus canino); un antígeno de flavivirus, por ejemplo, un antígeno del virus del Nilo Occidental o del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas; un antígeno del virus de la inmunodeficiencia, por ejemplo, un antígeno del virus de la inmunodeficiencia felina (VIF); un antígeno del parvovirus, por ejemplo, antígeno VP2 del parvovirus canino; antígeno de la gripe equina; antígeno del virus de la enfermedad de Marek; antígeno del poxvirus, por ejemplo, antígeno del virus de la viruela aviar; antígeno del virus de la bursitis infecciosa, por ejemplo, VP2, VP3, VP4; un antígeno de coronavirus, por ejemplo, de coronavirus porcino (TGEV, PEDV y delta corona SPIKE Ags), canino, y/o felino, aviar (por ejemplo, virus de la bronquitis infecciosa (IBV)); o un antígeno de Pestivirus, por ejemplo, antígeno del virus de la diarrea viral bovina.

El término “secuencia de nucleótidos de interés” o “secuencia de interés”, tal como se utiliza en el presente documento, es un término más general que gen de interés, ya que no comprende necesariamente un gen, sino que puede comprender elementos o partes de un gen u otra información genética, por ejemplo, ori (origen de replicación). Una secuencia de nucleótidos de interés puede ser cualquier secuencia de ADN o ARN independientemente de si comprende una secuencia codificante o no.

“Marco de lectura abierto” u “ORF” se refiere a una longitud de secuencia de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, que comprende una señal de inicio de traducción o codón de iniciación, como un ATG o AUG, y un codón de terminación y puede ser potencialmente traducida a una secuencia polipeptídica.

El término “transcripción” describe la biosíntesis de ARNm en una célula.

El término “expresión” se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de ácido nucleico en una célula huésped. Según aspectos específicos de la presente divulgación, el término “expresión” se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga y/o exógena dentro de una célula huésped. El nivel de expresión de un producto deseado en una célula huésped puede determinarse en función de la cantidad de ARN o ARNm correspondiente presente en la célula, o de la cantidad del polipéptido deseado codificado por la secuencia seleccionada. Por ejemplo, el ARNm transcrito a partir de una secuencia seleccionada puede cuantificarse mediante hibridación Northern blot, protección de ARN con ribonucleasas, hibridación in situ con ARN celular o mediante RTqPCR (transcripción inversa seguida de PCR cuantitativa). Las proteínas expresadas a partir de una secuencia seleccionada pueden cuantificarse por diversos métodos, por ejemplo, por ELISA, por Western blotting, por radioinmunoensayos, por inmunoprecipitación, por ensayo de la actividad biológica de la proteína, o por inmunotinción de la proteína seguida de análisis FACS.

El término “casete de expresión” o “unidad de transcripción” o “unidad de expresión” define una región dentro de un vector, construcción o secuencia polinucleotídica que contiene uno o más genes a transcribir, en la que las secuencias nucleotídicas que codifican el gen o genes transcritos, así como las secuencias polinucleotídicas que contienen los elementos reguladores contenidos dentro de un casete de expresión, están unidas operablemente entre sí. Se transcriben a partir de un promotor y la transcripción se termina con al menos una señal de poliadenilación. En un aspecto específico, se transcriben a partir de un único promotor. Como resultado, los diferentes genes están al menos vinculados transcripcionalmente. Puede transcribirse y expresarse más de una proteína o producto a partir de cada unidad de transcripción (unidad de transcripción multicistrónica). Cada unidad de transcripción comprenderá los elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción de cualquiera de las secuencias seleccionadas que estén contenidas dentro de la unidad. Y cada unidad de transcripción puede contener los mismos o diferentes elementos reguladores. Por ejemplo, cada unidad de transcripción puede contener el mismo terminador, elemento IRES o se pueden utilizar intrones para el enlace funcional de los genes dentro de una unidad de transcripción. Un vector o secuencia polinucleotídica puede contener más de una unidad de transcripción.

Por “expresión aumentada”, “título o productividad aumentados” o “expresión o productividad mejoradas” se entiende el aumento de la expresión, síntesis o secreción de una secuencia heteróloga y/o exógena introducida en una célula huésped, por ejemplo de un gen que codifica una proteína terapéutica, en comparación con un control adecuado, por ejemplo una proteína codificada por un ADNc frente a una proteína codificada por un gen que contiene intrones. Existe un aumento del título o la productividad si una célula según la divulgación se cultiva según un método según la divulgación aquí descrita, y si esta célula tiene al menos un aumento de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces en la productividad específica o título. También se produce un aumento del título o de la productividad si una célula según la divulgación se cultiva de acuerdo con un método según la divulgación aquí descrita, y si esta célula tiene al menos 1,2 veces o al menos 1,5 veces o al menos dos veces o al menos tres veces más de productividad específica o título. También hay en particular un aumento del título o de la productividad si una célula según la divulgación se cultiva según un método según la divulgación aquí descrita, y si esta célula tiene al menos un aumento de 1,2 veces a cinco veces, preferentemente de 1,5 veces a cinco veces, más preferentemente de -dos veces a cinco veces particularmente preferentemente un aumento de tres veces a cinco veces de la productividad específica o del título. “Aumento de la expresión” puede significar también que más células expresan realmente el gen/secuencia de interés. Por ejemplo, expresión puede significar que los nuevos promotores de la presente divulgación se incrementa en relación con la expresión efectuada por otro promotor en términos del número de células recuperadas que expresan o tienen expresión detectable del transgén. El aumento de la expresión también puede significar un aumento del nivel de ARNm y/o proteína detectable por célula.

Puede obtenerse una mayor expresión, título o productividad utilizando un vector heterólogo según la divulgación. Esto puede combinarse con otros enfoques, como una selección asistida por FACS de células huésped recombinantes que contengan, como marcador seleccionable adicional, una o más proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) o un marcador de superficie celular. Otros métodos para obtener una expresión aumentada, y también puede utilizarse una combinación de diferentes métodos, se basan, por ejemplo, en el uso de elementos cis-activos para manipular la estructura de la cromatina (por ejemplo, LCR, UCOE, EASE, aisladores, S/MAR, elementos STAR), en el uso de factores de transcripción (artificiales), en el tratamiento de las células con agentes naturales o sintéticos para aumentar la expresión génica endógena o heteróloga y/o exógena, en la mejora de la estabilidad (vida media) del ARNm o de la proteína, en la mejora del inicio de la traducción del ARNm, en el aumento de la dosis génica mediante el uso de plásmidos episomales (basados en el uso de secuencias virales como orígenes de replicación, por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, EBV o BPV), el uso de secuencias que promueven la amplificación o sistemas de amplificación in vitro basados en concámeros de ADN.

Un ensayo para medir la “expresión aumentada” son las mediciones de proteínas basadas en LC-MS/MS, como la monitorización de reacciones múltiples (MRM); los métodos de detección basados en anticuerpos, como Western blot, dot blot o inmunodifusión, citometría de flujo e inmunofluorescencia indirecta (IFA), y las mediciones de la actividad biológica mediante ensayo de hemaglutinación.

La “actividad promotora” se mide indirectamente mediante la cuantificación del ARNm transcrito bajo el control del promotor respectivo. El ARNm se cuantifica mediante RTqPCR en relación con un estándar endógeno.

El término “título viral” es una medida de unidades infecciosas por volumen de una preparación de virus. El título viral es un punto final en un procedimiento biológico y se define como la dilución en la que una cierta proporción de pruebas realizadas en paralelo muestran un efecto (Reed y Muench, 1938). Concretamente, la dosis infecciosa de cultivo tisular cincuenta por mililitro (DICT50/ml) da la dilución de una preparación vírica a la que se infectan el 50 % de una serie de cultivos celulares inoculados en paralelo con esa dilución.

“Elementos reguladores de la transcripción” comprenden normalmente un promotor aguas arriba de la secuencia génica que debe expresarse, sitios de iniciación y terminación de la transcripción y una señal de poliadenilación. El término “sitio de iniciación de la transcripción” se refiere a un ácido nucleico del constructo correspondiente al primer ácido nucleico incorporado en el transcrito primario, es decir, el precursor de ARNm. El sitio de iniciación de la transcripción puede solaparse con las secuencias promotoras.

La “señal de terminación” o “terminador” o “señal de poliadenilación” o “poliA” o “sitio de terminación de la transcripción” o “elemento de terminación de la transcripción” es una secuencia de señal que provoca la escisión en un sitio específico en el extremo 3' del ARNm eucariota y la incorporación postranscripcional de una secuencia de aproximadamente 100 - 200 nucleótidos de adenina (cola de poliA) en el extremo 3' escindido, y por lo tanto provoca que la ARN polimerasa termine la transcripción. La señal de poliadenilación comprende la secuencia AATAAa unos 10-30 nucleótidos aguas arriba del sitio de corte y una secuencia situada aguas abajo. Se conocen varios elementos de poliadenilación, como tk poly A, SV40 late y early polyA, BGH polyA (descritos, por ejemplo, en la patente U.S. N.° 5,122,458) o poliA de hormona de crecimiento de hámster (W02010010107).

Los “elementos reguladores de la traducción” comprenden un sitio de iniciación de la traducción (AUG), un codón de parada y una señal polyA para cada polipéptido individual a expresar. En algunos constructos, puede incluirse un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Con el fin de optimizar la expresión, puede ser aconsejable eliminar, añadir o alterar las regiones 5'- y/o 3'- no traducidas de la secuencia de ácido nucleico a expresar para eliminar cualquier codón alternativo de iniciación de la traducción potencialmente extra inapropiado u otras secuencias que puedan interferir o reducir la expresión, ya sea a nivel de transcripción o de traducción. Los sitios de unión al ribosoma de consenso (secuencia Kozak) pueden insertarse inmediatamente aguas arriba del codón de inicio para mejorar la traducción y, por tanto, la expresión. Un mayor contenido de A/U alrededor de este sitio de unión al ribosoma favorece una unión al ribosoma más eficiente.

Por definición, toda secuencia polinucleotídica o todo gen insertado en una célula huésped y la respectiva proteína o ARN codificados por ella se denominan “exógenos”, “secuencia exógena”, “gen exógeno”, “secuencia codificante exógena”, con respecto a la célula huésped, cuando proceden de una especie (de virus) diferente. En consecuencia, los promotores basados en EHV-4 de la presente divulgación son exógenos en vista del vector CAdV. Cualquier secuencia o gen de interés no canino, como un antígeno no canino, es por tanto una secuencia o gen de interés o antígeno exógeno según un aspecto específico de la presente divulgación.

Por definición, toda secuencia polinucleotídica o todo gen insertado en una célula huésped y la respectiva proteína o ARN codificados por ella se denominan “heterólogos”, “secuencia heteróloga”, “gen heterólogo”, “secuencia codificante heteróloga”, “transgén” o “proteína heteróloga” con respecto a la célula huésped. Esto se aplica incluso si la secuencia que se va a introducir o el gen que se va a introducir es idéntico a una secuencia endógena o a un gen endógeno de la célula huésped. Tal como se utiliza aquí con respecto a una secuencia o gen de interés, como un antígeno, el término “heterólogo” significa que dicha secuencia o gen de interés, específicamente dicho antígeno, se expresa fuera de su contexto de especie natural.

El término “de origen no natural” significa cualquier secuencia o gen de interés, como un antígeno, que no se produce en este contexto de forma natural, como una secuencia híbrida o una secuencia o gen de interés, como un antígeno de una especie diferente, o secuencia o gen de interés, como un antígeno, que no es un producto de la naturaleza debido a mutación artificial, inserción, deleción o similares.

El término “recombinante” se utiliza de forma intercambiable con los términos “de origen no natural”, “heterólogo” y “exógeno” en toda la especificación de la presente divulgación. Así, una proteína “recombinante” es una proteína expresada a partir de una secuencia polinucleotídica heteróloga o exógena. El término recombinante, utilizado con respecto a un virus, significa un virus producido por manipulación artificial del genoma viral. Un virus que comprende una secuencia heteróloga o exógena, como una secuencia exógena codificadora de antígeno, es un virus recombinante. El término virus recombinante y el término virus no natural se utilizan indistintamente.

Así, el término “vector heterólogo” significa un vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga o exógena. El término “vector recombinante” se refiere a un vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga o recombinante.

En el presente documento, el término “enlazado operablemente” se utiliza para describir la conexión entre los elementos reguladores y un gen o su región codificante. Típicamente, la expresión génica está bajo el control de uno o más elementos reguladores, por ejemplo, sin limitación, promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores específicos de tejido y potenciadores. Se dice que un gen o región codificante está “operativamente ligado a” u “operativamente vinculado a” o “operativamente asociado con” los elementos reguladores, lo que significa que el gen o región codificante está controlado o influenciado por el elemento regulador. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante.

Además, en el ámbito de la presente descripción, los términos “enlace funcional”, “enlace funcional” o “enlace operable” significan que dos o más secuencias de ácido nucleico o elementos de secuencia están colocados de manera que les permite funcionar de la forma prevista. Por ejemplo, un promotor/ potenciador o terminador está funcionalmente ligado a una secuencia génica codificante si es capaz de controlar o modular la transcripción de la secuencia génica ligada en la posición cis. Generalmente, pero no necesariamente, las secuencias de ADN que están vinculadas funcionalmente son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de polipéptidos o en el caso de un péptido señal de secreción, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, aunque un promotor vinculado operablemente se encuentra generalmente aguas arriba o un terminador vinculado operablemente se encuentra generalmente aguas abajo de la secuencia codificante, no es necesariamente contiguo a ella. Los potenciadores no tienen por qué ser contiguos siempre que aumenten la transcripción de la secuencia codificante. Para ello, pueden situarse aguas arriba o aguas abajo de la secuencia codificante e incluso a cierta distancia. Un sitio de poliadenilación está operativamente ligado a una secuencia codificante si está situado en el extremo 3' de la secuencia codificante de forma que la transcripción proceda a través de la secuencia codificante hacia la señal de poliadenilación. El enlace se realiza mediante métodos recombinantes conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante ligadura en sitios de restricción adecuados o extremos romos o utilizando la metodología de PCR de fusión. Los enlazadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos pueden utilizarse de acuerdo con la práctica convencional si no se dispone de sitios de restricción adecuados.

Por consiguiente, el término “fragmento o derivado funcional”" de una secuencia promotora significa que el fragmento o derivado sigue teniendo efecto sobre la actividad promotora. Los ensayos funcionales para evaluar la actividad promotora son bien conocidos por los expertos en la técnica (Bustin, S. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25(2): 169-193; Nolan, T Rebecca E Hands, R.E., y Bustin S.A. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols 1: 1559-1582). Una realización ejemplar de tal ensayo funcional incluye, por ejemplo, un experimento cinético de promotor. Las células infectadas con virus vector portadores de casetes de expresión en los que un promotor o fragmento del mismo dirige la transcripción de un transgén informador se incuban durante diferentes tiempos. Se prepara ARN total a partir de muestras recogidas en diferentes momentos tras la infección. Tras destruir el ADN contaminante mediante digestión con DNasa I, se transcribe el ARN en sentido inverso. Una muestra replicada se procesa con adición de transcriptasa inversa (RT), la segunda replicada se procesa sin adición de RT para demostrar la eliminación satisfactoria del ADN contaminante de la preparación de ARN. El ADNc resultante se purifica y se utiliza como molde en una PCR convencional. Solo las muestras procesadas con la adición de RT producirán un producto de PCR. Estos ADNc pueden utilizarse entonces para qPCR con cebadores para el transgén reportero y en paralelo con cebadores para un gen esencial del vector viral (gen estándar interno), cuya transcripción proporciona un estándar interno para la eficiencia de la infección y replicación. Los valores de qPCR del reportero se normalizan entre las diferentes construcciones y tiempos tras la infección utilizando los valores de qPCR del gen estándar interno. Esto permite una interpretación de las actividades promotoras de diferentes promotores y fragmentos de los mismos.

“Homología de secuencia”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un método para determinar el parentesco de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, dos o más secuencias se alinean de forma óptima, y se introducen huecos si es necesario. Sin embargo, a diferencia de la “identidad de secuencia”, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se cuentan como una coincidencia al determinar la homología de secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido que tenga un 95 % de homología de secuencia con una secuencia de referencia, el 85 %, preferentemente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, aún más preferentemente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99. 9 % de los residuos de aminoácidos o nucleótidos de la secuencia de referencia deben coincidir o comprender una sustitución conservativa con otro aminoácido o nucleótido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de aminoácidos o nucleótidos de hasta el 15 %, preferentemente hasta el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, aún más preferentemente hasta el 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,1 % del total de residuos de aminoácidos o nucleótidos, sin incluir sustituciones conservativas, de la secuencia de referencia. Preferentemente, la secuencia homóloga comprende al menos un tramo de 50, aún más preferido de 100, aún más preferido de 250, aún más preferido de 500 nucleótidos.

“Identidad de secuencia”, tal como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, a saber, una secuencia de referencia y una secuencia dada que debe compararse con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia después de que las secuencias se hayan alineado óptimamente para producir el mayor grado de similitud de secuencia, determinado por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. Tras la alineación, la identidad de secuencia se determina posición por posición, por ejemplo, las secuencias son “idénticas” en una posición concreta si en esa posición los nucleótidos o los residuos de aminoácidos son idénticos. El número total de tales identidades de posición se divide entonces por el número total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia para obtener el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SⁱA^m J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencias están diseñados para ofrecer la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencias están codificados en programas informáticos de acceso público que determinan la identidad de secuencias entre secuencias dadas. Ejemplos de estos programas son, entre otros, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa B^lASTX está disponible públicamente en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Estos programas alinean las secuencias de forma óptima utilizando pesos de separación predeterminados con el fin de producir el mayor nivel de identidad de secuencia entre las secuencias dadas y las de referencia. A título ilustrativo, por polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 85 %, preferentemente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, aún más preferentemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99 %. 9 % de “identidad de secuencia” con una secuencia de nucleótidos de referencia, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polinucleótidos dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, incluso más preferentemente hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tenga al menos un 85 %, preferentemente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, aún más preferentemente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 % de identidad relativa a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 15 %, preferentemente un 10 %, un 9 %, un 8 %, un 7 %, un 6 %, aún más preferentemente un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, un 1 %, un 0,1 % de los nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia pueden presentar hasta 15, preferentemente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, aún más preferentemente el 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,1 % del total de nucleótidos de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Análogamente, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tiene al menos, por ejemplo, 85 %, preferentemente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, aún más preferentemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se pretende que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polipéptido dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, 9, 8, 7, 6, incluso más preferentemente hasta 5, 4, 3, 2, 1 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia polipeptídica dada que tenga al menos 85 %, preferentemente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, aún más preferentemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15 %, preferentemente hasta 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, aún más preferentemente hasta 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de los residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia pueden suprimirse o sustituirse por otro aminoácido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de aminoácidos de hasta el 15 %, preferentemente de hasta el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, aún más preferentemente de hasta el 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % del número total de residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre dichas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Sin embargo, las sustituciones conservadoras no se incluyen como coincidencia al determinar la identidad de secuencia.

Los términos “identidad de secuencia” o “porcentaje de identidad” se utilizan indistintamente en el presente documento. Se define aquí que para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de un primer aminoácido o ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o nucleótidos correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad=número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones solapadas) x 100). Preferentemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.

La comparación de secuencias puede realizarse sobre la longitud total de las dos secuencias comparadas o sobre fragmentos de las dos secuencias. Típicamente, la comparación se llevará a cabo sobre la longitud completa de las dos secuencias comparadas. Sin embargo, la identidad de secuencia puede llevarse a cabo sobre una región de, por ejemplo, veinte, cincuenta, cien o más residuos de aminoácidos contiguos.

Los expertos saben que existen varios programas informáticos para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático. En una forma de realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se determina utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software Gc G de Accelrys (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), utilizando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y una ponderación de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje global de identidad de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.

Las secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos de la presente invención pueden utilizarse además como una “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse utilizando los programas BLASTN y BLASTP (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTP, score=50, wordlength=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteicas de la invención. Para obtener alineaciones separadas con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25(17): 3389-3402. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTp y BLASTN). Véase la página web del National Center for Biotechnology Information en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. EHV-1, EHV-4 y CAdV/ tecnología de vectores recombinantes

Definiciones

El término “équido” o “equino” o “equino” significa de o perteneciente a la familia Equidae, que incluye los caballos, asnos y cebras, preferentemente caballos. Además, el término “équido” o “equino” o “equino” abarca también los híbridos de miembros de la familia Equidae (por ejemplo, mulas, burdéganos, etc.).

Un “herpesvirus” o “herpesvirus vector” se refiere a una especie de la familia Herpesviridae del orden Herpesvirales. El término “équido herpesvirus vector” o “équido herpesvirus” designa a un miembro de la familia Herpesviridae que afecta a los caballos. Hasta la fecha se han identificado ocho especies diferentes de herpesvirus de équidos, cinco pertenecientes a la subfamilia alphaherpesvirinae y tres a la gammaherpesvirinae. (http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, Londres, Reino Unido, julio de 2015; ratificación por correo electrónico en 2016 (MSL #30)

El término “EHV-1” significa herpesvirus de équidos 1, miembro del subgénero Varicellovirus del género Alphaherpesvirinae en la familia Herpesviridae. Una secuencia de referencia no limitante para el EHV-1 sería, por ejemplo, la cepa ab4 de tipo salvaje del EHV-1 (número de acceso al Genbank AY665713.1) o la RacH (Hübert, P H., Birkenmaier, S., Rziha, H.-J. y Osterrieder, N. (1996), Alterations in the Equine Herpesvirus Type-1 (EHV-1) Strain RacH During Attenuation. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 43: 1-14).

El término “EHV-4” significa herpesvirus de équidos 4, miembro del subgénero Varicellovirus del género Alphaherpesvirinae en la familia Herpesviridae.

Los términos “CAdV”, “CAV”, “CAV-1” o “CAV-2” significan adenovirus canino tipo-1 o tipo-2, respectivamente, miembro del género Mastadenovirus, en la familia Adenoviridae. Sin embargo, según la taxonomía más reciente (http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30) el término adenovirus canino (CAdV) ahora abarca ambas especies CAV-2 y CAV-1. Un “vector CAdV recombinante” o “rCAdV” y/o “vector rCAdV” o “rCAdV” o “rCAdV2” se refiere a un adenovirus canino que comprende al menos un casete de expresión exógena (es decir. que contiene secuencias codificantes en enlace operable con promotores, potenciadores y otros elementos reguladores adecuados), como la codificación de un marcador de expresión transgénica (como la proteína verde fluorescente), y en formas de realización preferidas al menos un “gen de interés” y/o “epítopo de interés”.

El vector rCAdV puede producirse por métodos estándar conocidos por las personas con conocimientos ordinarios en el campo de la virología y la biología molecular. Sin embargo, para facilitar la manipulación del genoma del CAdV y la producción del vector, la divulgación también proporciona un vector lanzadera bacteriano, en un ejemplo no limitante el plásmido BR322, que contiene el ácido nucleico que codifica el genoma del CAdV. Además, un cromosoma artificial bacteriano (“BAC”), también puede facilitar la manipulación del CAdV en un sistema bacteriano. Definiciones de vacuna

Una “composición inmunogénica o inmunológica” se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno, o porción inmunogénica del mismo, que provoca una respuesta inmunológica en el huésped de una respuesta inmune celular o mediada por anticuerpos a la composición.

El término “antígeno” utilizado en el presente documento es bien conocido en la técnica e incluye sustancias que son inmunógenas, es decir, inmunógenos, así como sustancias que inducen la falta de respuesta inmunológica, o anergia, es decir, una falta de reacciones por parte de los mecanismos de defensa del cuerpo a sustancias extrañas. En el presente documento, el término “antígeno” se refiere a proteínas de longitud completa, así como a fragmentos peptídicos de las mismas que contienen o comprenden un epítopo.

El término “composición inmunogénica” puede referirse a un polipéptido o una proteína, como por ejemplo una proteína de superficie vírica, que provoca una respuesta inmunológica tal como se describe en el presente documento. El término “fragmento inmunogénico” o “porción inmunogénica” se refiere a un fragmento o forma truncada y/o sustituida de una proteína o polipéptido que incluye uno o más epítopos y, por lo tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita en el presente documento. En general, dichas formas truncadas y/o sustituidas, o fragmentos, comprenderán al menos seis aminoácidos contiguos de una proteína de longitud completa. Tales fragmentos pueden identificarse utilizando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse sintetizando simultáneamente grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas y descritas en la técnica, véase, por ejemplo, patente US N.° 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; y Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Del mismo modo, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase Epitope Mapping Protocols, supra. Los antígenos sintéticos también se incluyen en la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Véase, por ejemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; and Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998.

La divulgación proporciona además una “composición inmunogénica”, o “composición de vacuna” que contiene el virus CAdV recombinante o vector, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Una composición inmunogénica que contiene el virus o vector CAdV recombinante (o un producto de expresión del mismo) provoca una respuesta inmunológica, local o sistémica. La respuesta puede ser protectora, aunque no necesariamente. Una composición vacunal provoca una respuesta protectora local o sistémica. Por consiguiente, el término “composición inmunogénica” incluye una “composición vacunal” (ya que los dos términos anteriores pueden ser composiciones protectoras).

El término “vacuna”, tal como se utiliza aquí, se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un componente inmunológicamente activo que induce una respuesta inmunológica en un animal y, posiblemente pero no necesariamente, uno o más componentes adicionales que potencian la actividad inmunológica del componente activo. Una vacuna puede comprender además otros componentes típicos de las composiciones farmacéuticas. A modo de distinción, el componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender partículas víricas completas en su forma original o como partículas atenuadas en una denominada vacuna viva modificada (MLV) o partículas inactivadas por métodos apropiados en una denominada vacuna muerta (KV). En otra forma, el componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender elementos apropiados de los organismos (vacunas de subunidades) en las que estos elementos se generan destruyendo la partícula entera o los cultivos de crecimiento que contienen dichas partículas y, opcionalmente, los pasos de purificación subsiguientes que producen la(s) estructura(s) deseada(s), o mediante procesos sintéticos que incluyan una manipulación apropiada mediante el uso de un sistema adecuado basado, por ejemplo, en bacterias, insectos, mamíferos u otras especies más, opcionalmente, procedimientos posteriores de aislamiento y purificación, o mediante la inducción de los procesos sintéticos en el animal que necesita una vacuna mediante la incorporación directa de material genético utilizando composiciones farmacéuticas adecuadas (vacunación polinucleotídica). Una vacuna puede comprender uno o simultáneamente más de uno de los elementos descritos con anterioridad. Tal como se utiliza en aspectos específicos de la presente divulgación, “vacuna” se refiere a una vacuna viva o virus vivo, también denominada vacuna recombinante. En otro aspecto específico de la presente divulgación, “vacuna” se refiere a un virus inactivado o muerto, incluidas las partículas similares a virus (VLP). Así, una vacuna puede ser una vacuna de subunidades o una vacuna inactivada o muerta (KV).

Por “animal” se entiende mamíferos, humanos, aves y similares. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equinos (por ejemplo, caballo, cebra, burro), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros grandes felinos y otros felinos, incluidos guepardos y linces), ovinos (por ejemplo, ovejas), bovinos (por ejemplo, vacas, búfalos), porcinos (cerdos), aviares (por ejemplo, pollos, patos, gansos, pavos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emúes y casuarios), primates (por ejemplo, prosimios, tarseros, monos, gibones, simios) y peces. El término “animal” también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluidas las etapas embrionarias y fetales. El término “animal destinado a la producción de alimentos” designa a los animales no caninos que se utilizan para el consumo humano, como los bovinos, porcinos, equinos, aves de corral, peces ovinos y similares; preferentemente, por animal destinado a la producción de alimentos se entienden los porcinos y bovinos, más preferentemente los porcinos.

Entre los ejemplos de animales de compañía no caninos se incluyen las especies felinas.

Para la administración a animales no caninos, el CAdV recombinante ofrece la ventaja de la expresión sin replicación productiva. La replicación del adenovirus canino se limita a la especie canina y no hay informes en la literatura de que el CAdV2 cause una infección productiva en ninguna especie no canina, incluido el hombre. Esta restricción de huésped proporciona una barrera de seguridad inherente a la transmisión del virus a otras especies y hace que el uso de vectores de vacunas basados en CAdV2 en aplicaciones veterinarias entre especies sea una propuesta atractiva. Por lo tanto, la divulgación comprende métodos para amplificar o expresar una proteína administrando o inoculando un huésped con un virus o vector CAdV2 recombinante, por lo que el huésped no es un canino o no es un huésped natural del virus o vector recombinante, y/o hay expresión sin replicación productiva y/o con un ciclo replicativo limitado.

Para la administración a animales caninos, dado que CAdV, y especialmente CAdV2, se utiliza como cepas vacunales en perros, la presente divulgación proporciona un medio para introducir epítopo(s) adicional(es) de interés, por ejemplo, antígeno(s) de un patógeno(s) o toxina(s) canino(s). La expresión de epítopos de interés adicionales codificados en el vector rCAdV2 proporciona un medio para provocar respuestas in vivo a esos epítopos de interés, así como al adenovirus canino, inoculando a un perro o cachorro con el CAdV2 recombinante vacunal. El epítopo o epítopos adicionales de interés pueden ser un antígeno de un patógeno canino (distinto del adenovirus), de un antígeno de un patógeno canino (distinto del adenovirus), otro antígeno que provoque una respuesta en perros o cachorros al patógeno canino (distinto del adenovirus), o de otro antígeno que provoque una respuesta en perros o cachorros al patógeno canino (distinto del adenovirus).

En consecuencia, la presente divulgación establece que el CAdV2 recombinante puede contener ADN heterólogo que codifica un epítopo de interés de cualquier antígeno de un patógeno canino, por ejemplo: rabia, herpesvirus canino, virus del moquillo canino, parvovirus canino, etc. Las formas de realización de la divulgación incluyen recombinantes de CAdV que contienen ADN exógeno que codifica para más de una proteína, por ejemplo, que codifica para dos o más epítopos como antígenos de patógenos caninos. La divulgación también contempla composiciones que contengan recombinantes del CAdV en combinación con otros antígenos.

Para la administración a animales no caninos, la presente divulgación proporciona un medio para introducir un epítopo de interés en el que el epítopo antigénico de interés es un antígeno derivado de un patógeno animal productor de alimentos como los seleccionados del grupo de patógenos bovinos: Virus de la diarrea viral bovina (VDVB), Virus de la Parainfluenza-3 (PI-3), Virus de la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina (IBR), Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV), Herpesvirus bovino (BHV), Rotavirus bovino (BRV), Enterovirus bovino (BEV), Coronovirus bovino (BCV), Rabia bovina (BR), Parvovirus bovino (BPV), Astrovirus adenovirus, Mannheimia haemolytica (antes Pasteurella haemolytica), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus (Histophilus ovis y Haemophilus agni), Actinomyces (Corynebacterium), Actinomyces pyogenes, Chlamydia psittaci, Campylobacter fetus venerealis y Campylobacter fetus fetus (antes C fetus intestinalis ), Leptospira interrogans,Leptospira hardjo, Leptospira pomona y Leptospira grippotyphosa, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo (Leptospira hardjoprajitno y Leptospira hardjo-bovis), Brucella abortus, Brucella suis y Brucella melitensis, Listeria monocytogenes, Chlamydia psittaci, Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Moraxella bovis, Klebsiella spp, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium; Salmonella newport, Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis, Cryptsporidium parvum, Cryptsporidium hominis, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Mycoplasma spp, Mycoplasma dispar y Ureaplasma spp, Tritrichomonas foetus, Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton sarkisovii, Neospora caninum (antes Toxoplasma gondii), Babesia bigemina y Babesia bovis,Dictyocaulus viviparous (enfermedad del gusano pulmonar), y combinaciones de los mismos. Para la administración a animales no caninos, la presente divulgación proporciona un medio para introducir un epítopo de interés en el que el epítopo antigénico de interés es un antígeno derivado de un patógeno animal productor de alimentos como los seleccionados del grupo de patógenos porcinos: Salmonella spp., en particular S. typhimurium S. choleraesuis; Astrovirus; Rotavirus; Virus de la gastroenteritis transmisible; Brachyspira spp., en particular B. hyodysenteriae, B. pilosicoli; Clostridium spp, en particular C. difficile, C. perfringens tipos A, B y C, C. novyi, C. septicum, C. tetani; picornavirus entéricos porcinos; calicivirus entéricos porcinos; patógenos respiratorios, que incluyen: Actinobacillus pleuropneumonia; Bordetella bronchiseptica; Erysipelothrix rhsiopathiae; Haemophilus parasuis, en particular los subtipos 1, 7 y 14; Pasteurella spp., en particular P. multocida; Mycoplasma spp, en particular M. hyopneumoniae, M. hyorhinis; virus de la gripe porcina A; virus del PRRS; circovirus porcino; parvovirus porcino; virus de la seudorabia; Eperythrozoonosis suis, Mycobacterium spp, en particular M. avium, M. intracellulare, M. bovis; Coronavirus respiratorio porcino; Coronavirus porcino, en particular TGEV, PEDV y Coronavirus delta; Arcanobacterium pyogenes; Adenovirus porcino; Peste porcina clásica; Citomegalovirus porcino; Peste porcina africana; u otros patógenos, como Escherichia coli, Streptococcus spp.., en particular S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, preferentemente subsp. equisimilis; Brucella suis, en particular biovares 1, 2 y 3; Leptospira spp, en particular L. australis, L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi, L. hardjo, L. sejroe; virus de la encefalomiocarditis; virus de la encefalomielitis hemaglutinante; virus de la encefalitis japonesa; virus del Nilo Occidental; reovirus; rubulavirus; virus Menangle; virus Nipah; virus de la estomatitis vesicular; virus del exantema vesicular porcino; virus de la viruela porcina; virus del herpes porcino; y Staphylococcus hyicus, y combinaciones de los mismos.

Por “vacunación con ADN” o “vacunación con polinucleótidos” se entiende la inoculación directa de material genético mediante composiciones farmacéuticas adecuadas.

En la técnica se conocen varios métodos físicos y químicos de inactivación. El término “inactivado” se refiere a un virus o bacteria previamente virulento o no virulento que ha sido irradiado (radiación ultravioleta [UV], rayos X, haz de electrones o radiación gamma), calentado o tratado químicamente para inactivar o matar dicho virus o bacteria conservando su inmunogenicidad. Los agentes inactivadores adecuados incluyen beta-propiolactona, beta- o acetiletilenimina, glutaraldehído, ozono y formalina (formaldehído).

Para la inactivación mediante formalina o formaldehído, el formaldehído suele mezclarse con agua y alcohol metílico para crear formalina. La adición de alcohol metílico evita la degradación o la reacción cruzada durante el proceso de inactivación. Una realización utiliza aproximadamente del 0,1 al 1 % de una solución al 37 % de formaldehído para inactivar el virus o la bacteria. Es fundamental ajustar la cantidad de formalina para garantizar la inactivación del material, pero no tanto como para que se produzcan efectos secundarios por una dosis elevada.

Más concretamente, el término “inactivado” en el contexto de un virus significa que el virus es incapaz de replicarse in vivo o in vitro y, respectivamente, el término “inactivado” en el contexto de una bacteria significa que la bacteria es incapaz de reproducirse in vivo o in vitro. Por ejemplo, el término “inactivado” puede referirse a un virus que ha sido propagado in vitro, y que luego ha sido inactivado utilizando medios químicos o físicos para que ya no sea capaz de replicarse. En otro ejemplo, el término “inactivado” puede referirse a una bacteria que se ha propagado y luego se ha inactivado por medios químicos o físicos dando lugar a una suspensión de la bacteria, fragmentos o componentes de la bacteria, como dando lugar a una bacterina que puede utilizarse como componente de una vacuna.

En el presente documento, los términos “inactivado”, “muerto” o “KV” se utilizan indistintamente.

El término “vacuna viva” se refiere a una vacuna que comprende un organismo vivo o un virus o vector viral competente para la replicación.

Una “composición farmacéutica” consiste esencialmente en uno o más ingredientes capaces de modificar las funciones fisiológicas, por ejemplo inmunológicas, del organismo al que se administra, o de organismos que viven en o sobre el organismo. El término incluye, pero no se limita a, antibióticos o antiparasitarios, así como otros constituyentes comúnmente utilizados para lograr otros objetivos, tales como, pero no limitados a, características de procesamiento, esterilidad, estabilidad, viabilidad para administrar la composición vía enteral o parenteral, como oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica u otra vía adecuada, tolerancia tras la administración o propiedades de liberación controlada. Un ejemplo no limitativo de tal composición farmacéutica, dado únicamente a efectos de demostración, podría prepararse como sigue: el sobrenadante de un cultivo celular infectado se mezcla con un estabilizador (por ejemplo, espermidina y/o albúmina de suero bovino (BSA) y la mezcla se liofiliza o deshidrata posteriormente por otros métodos. Antes de la vacunación, la mezcla se rehidrata en soluciones acuosas (por ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato [PBS]) o no acuosas (por ejemplo, emulsión oleosa, adyuvante a base de aluminio).

Para las vacunas basadas en vectores virales recombinantes, las vías de administración pueden ser ventajosamente SC, IM, TD o ID. Esta administración puede realizarse mediante una jeringa con aguja o con un aparato sin aguja. Las formas de realización de la divulgación pueden administrarse por vía oral, interna, anal, vaginal, peroral, intragástrica, parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa. Ejemplos de composiciones de la divulgación incluyen preparaciones líquidas para administración por orificio, por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, etc., como suspensiones, jarabes o elixires; y, preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable) como suspensiones o emulsiones estériles. En dichas composiciones, el CAdV2 recombinante y/o los antígenos pueden mezclarse con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones también pueden liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, adyuvantes, aditivos gelificantes o mejoradores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una estrategia de vacuna, que se basa en un régimen de administración de “primo-refuerzo”, en el que la administración de primo-refuerzo y la administración de refuerzo utilizan una composición que comprende un excipiente, diluyente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable y el CAdV recombinante de la presente divulgación.

Un régimen de administración primaria y de refuerzo comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo utilizando al menos un antígeno común y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administración de cebado puede ser de naturaleza diferente a las utilizadas como vacuna de refuerzo posterior. Cabe señalar además que tanto la administración primaria como la de refuerzo pueden comprender el CAdV recombinante de la presente divulgación. La administración primaria puede incluir una o más administraciones. Del mismo modo, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un kit para la vacunación de primo-refuerzo según la presente divulgación. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna para la primovacunación según la presente divulgación, y un segundo vial que contiene una vacuna para la vacunación de refuerzo según la presente divulgación. El kit puede contener ventajosamente viales adicionales, primero o segundo, para primovacunaciones adicionales o vacunaciones de refuerzo adicionales.

En una forma de realización, el kit puede comprender dos viales, uno que contenga una vacuna basada en plásmido para la primovacunación según la presente divulgación, y el otro vial que contenga una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunación de refuerzo según la presente divulgación.

Tal como se utiliza en el presente documento, “portador farmacéutico o veterinario aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción y similares. En algunas formas de realización preferidas, y especialmente aquellas que incluyen composiciones inmunogénicas liofilizadas, los agentes estabilizantes para uso en la presente divulgación incluyen estabilizantes para liofilización.

En algunas formas de realización, la composición inmunogénica de la presente divulgación contiene un adyuvante. Los “adyuvantes”, tal como se usan en el presente documento, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión puede basarse en particular en aceite de parafina líquida ligera (tipo Farmacopea Europea); aceite isoprenoide como el escualano o el escualeno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contengan un grupo alquilo lineal, en particular aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos ramificados o de alcoholes, en particular ésteres de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulgentes para formar la emulsión. Los emulgentes son preferentemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de mannida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, opcionalmente etoxilados, y bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.StewartTuN, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Algunos adyuvantes ejemplares son la emulsión SPT descrita en la página 147 de “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” editado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de este mismo libro.

Otro ejemplo de adyuvante es un compuesto elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenílico. Los compuestos adyuvantes más ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulados, especialmente con polialqueniléteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, N° 2, junio de 1996). Las personas expertas en la materia también pueden consultar la patente estadounidense n° 2.909.462 que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, siendo sustituidos los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener a su vez otros sustituyentes, como el metilo. Los productos vendidos bajo el nombre CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Están reticulados con una sacarosa alílica o con pentaeritritol alílico. Entre ellos, pueden mencionarse Carbopol 974P, 934P y 971P. Lo más preferido es el uso de CARBOPOL® 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo, se encuentran los copolímeros EMA (Monsanto), que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferentemente a pH fisiológico, para dar la solución adyuvante en la que se incorporará la composición inmunogénica, inmunológica o vacunal propiamente dicha.

Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímero de bloque (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), lípido monofosforil A, adyuvante lípido-amina Avridine, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o no), toxina del cólera, IMS 1314 o muramil dipéptido, o citoquinas naturales o recombinantes o análogos de las mismas o estimulantes de la liberación de citoquinas endógenas, entre muchos otros.

Se espera que un adyuvante pueda añadirse en una cantidad de aproximadamente 100 |jg a aproximadamente 10 mg por dosis, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 10 mg por dosis, más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 500 jg a aproximadamente 5 mg por dosis, incluso más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 750 jg a aproximadamente 2,5 mg por dosis, y lo más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis. Alternativamente, el adyuvante puede estar en una concentración de aproximadamente 0,01 a 50 %, preferentemente en una concentración de aproximadamente 2 % a 30 %, más preferentemente en una concentración de aproximadamente 5 % a 25 %, aún más preferentemente en una concentración de aproximadamente 7 % a 22 %, y más preferentemente en una concentración de 10 % a 20 % por volumen del producto final.

Los “diluyentes” pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiamintetracético, entre otros.

“Aislado” significa alterado “por la mano del hombre” con respecto a su estado natural, es decir, si se encuentra en la naturaleza, ha sido modificado o retirado de su entorno original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, tal como se emplea el término en el presente documento.

“Atenuación” significa reducir la virulencia de un patógeno. En la presente divulgación, “atenuación” es sinónimo de “avirulento”. En la presente divulgación, un virus atenuado es aquel en el que la virulencia se ha reducido de modo que no causa signos clínicos de infección pero es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en el animal diana, pero también puede significar que los signos clínicos se reducen en incidencia o gravedad en animales infectados con el virus atenuado, especialmente el vector viral CAdV según la reivindicación, en comparación con un “grupo de control” de animales infectados con virus o patógeno no atenuado y que no reciben el virus atenuado. En este contexto, el término “reducir/reducido” significa una reducción de al menos el 10 %, preferentemente el 25 %, aún más preferentemente el 50 %, aún más preferentemente el 60 %, aún más preferentemente el 70 %, aún más preferentemente el 80 %, aún más preferentemente el 90 % y más preferentemente el 100 % en comparación con el grupo de control definido anteriormente. Por lo tanto, un patógeno atenuado, avirulento, como por ejemplo un vector viral atenuado como se reivindica, especialmente el vector viral CAdV como se reivindica, es adecuado para la generación de una vacuna viva modificada (MLV) o una composición inmunogénica viva modificada.

En el presente documento, “dosis eficaz” significa, pero no se limita a, una cantidad de antígeno que provoca, o es capaz de provocar, una respuesta inmunitaria que produce una reducción de los síntomas clínicos en un animal al que se administra el antígeno.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “cantidad eficaz” significa, en el contexto de una composición, una cantidad de una composición inmunogénica capaz de inducir una respuesta inmunitaria que reduzca la incidencia o disminuya la gravedad de la infección o de la enfermedad en un animal. En particular, una cantidad eficaz se refiere a unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis. Alternativamente, en el contexto de una terapia, el término “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o mejorar la gravedad o duración de una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas de los mismos, prevenir el avance de una enfermedad o trastorno, causar la regresión de una enfermedad o trastorno, prevenir la recurrencia, desarrollo, aparición o progresión de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno, o potenciar o mejorar la profilaxis o el tratamiento de otra terapia o agente terapéutico.

Por “respuesta inmunitaria” o “respuesta inmunológica” se entiende, aunque no exclusivamente, el desarrollo de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a la composición (inmunogénica) o vacuna de interés. Por lo general, una respuesta inmunitaria o inmunológica incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora (memoria), de modo que aumentará la resistencia a nuevas infecciones y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción del número de síntomas, la gravedad de los síntomas o la ausencia de uno o más de los síntomas asociados con la infección del patógeno, un retraso en el inicio de la viremia, una reducción de la persistencia viral, una reducción de la carga viral global y/o una reducción de la excreción viral. Por lo tanto, la divulgación también proporciona un método para “inducir una respuesta inmunológica” en un vertebrado huésped que comprende administrar al huésped una composición inmunogénica o de vacuna que comprende el virus o vector CAdV recombinante y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Por “protección contra la enfermedad”, “inmunidad protectora”, “inmunidad funcional”, “reducción de los síntomas clínicos”, “inducción de una respuesta inmunológica”, “inducción/producción de anticuerpos neutralizantes y/o conversión sérica”, y frases similares, se entiende la producción de anticuerpos contra el antígeno, y/o el resultado de una respuesta parcial o completa contra una enfermedad o afección generada por la administración de una o más composiciones terapéuticas de la divulgación, o una combinación de las mismas, que da lugar a menos efectos deletéreos de los que cabría esperar en un sujeto no inmunizado que ha estado expuesto a la enfermedad o infección. Es decir, la gravedad de los efectos nocivos de la infección disminuye en un sujeto vacunado. La infección puede reducirse, ralentizarse o, posiblemente, prevenirse por completo en un sujeto vacunado. En el presente documento, cuando se hace referencia a la prevención completa de la infección, se indica específicamente. Si no se indica la prevención completa, el término incluye la prevención parcial.

En el presente documento, “reducción de la incidencia y/o gravedad de los signos clínicos” o “reducción de los síntomas clínicos” significa, pero no se limita a, reducir el número de sujetos infectados en un grupo, reducir o eliminar el número de sujetos que presentan signos clínicos de infección, o reducir la gravedad de cualquier signo clínico que esté presente en uno o más sujetos, en comparación con la infección de tipo salvaje. Por ejemplo, debe referirse a cualquier reducción de la carga de patógenos, la eliminación de patógenos, la reducción de la transmisión de patógenos o la reducción de cualquier signo clínico sintomático de malaria. Preferentemente, estos signos clínicos se reducen en uno o más sujetos que reciben la composición terapéutica de la presente divulgación en al menos un 10 % en comparación con sujetos que no reciben la composición y que se infectan. Más preferentemente, los signos clínicos se reducen en los sujetos que reciben una composición de la presente divulgación en al menos un 20 %, preferentemente en al menos un 30 %, más preferentemente en al menos un 40 %, e incluso más preferentemente en al menos un 50 %.

El término “mayor protección” en el presente documento significa, pero no se limita a, una reducción estadísticamente significativa de uno o más síntomas clínicos que están asociados con la infección por un agente infeccioso en un grupo de sujetos vacunados frente a un grupo de sujetos de control no vacunados. El término “reducción estadísticamente significativa de los síntomas clínicos” significa, pero no se limita a, que la frecuencia en la incidencia de al menos un síntoma clínico en el grupo de sujetos vacunados es al menos un 10 %, preferentemente un 20 %, más preferentemente un 30 %, aún más preferentemente un 50 %, y aún más preferentemente un 70 % menor que en el grupo de control no vacunado tras la provocación del agente infeccioso.

Por “protección duradera” se entenderá una “eficacia mejorada” que persista durante al menos 3 semanas, pero más preferentemente durante al menos 3 meses, y aún más preferentemente durante al menos 6 meses. En el caso del ganado, es preferible que la protección duradera persista hasta la edad media a la que los animales se comercializan para carne.

El término “reducción de la viremia” inducida por un virus significa, pero no se limita a, la reducción del virus que entra en el torrente sanguíneo de un animal, en el que el nivel de viremia, es decir, el número de copias de ADN o ARN del virus por mL de suero sanguíneo o el número de colonias formadoras de placas por decilitro de suero sanguíneo, se reduce en el suero sanguíneo de los animales que reciben la composición de la presente divulgación en al menos un 50 % en comparación con los animales que no reciben la composición y pueden infectarse. Más preferentemente, el nivel de viremia se reduce en los animales que reciben la composición de la presente divulgación en al menos un 90 %, preferentemente en al menos un 99,9 %, más preferentemente en al menos un 99,99 %, e incluso más preferentemente en al menos un 99,999 %.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “viremia” se entiende particularmente como una condición en la que las partículas de virus se reproducen y circulan en el torrente sanguíneo de un animal, en particular de un mamífero, un ave o un insecto.

“Seguridad” se refiere a la ausencia de consecuencias adversas en un animal vacunado tras la vacunación, incluyendo pero sin limitarse a: reversión potencial de una vacuna basada en una bacteria a virulencia, efectos secundarios clínicamente significativos como enfermedad sistémica persistente o inflamación inaceptable en el lugar de administración de la vacuna.

Los términos “vacunación” o “vacunar” o sus variantes, tal como se utilizan en el presente documento, significan, pero no se limitan a, un proceso que incluye la administración de una composición inmunogénica de la divulgación que, cuando se administra a un animal, provoca, o es capaz de provocar -directa o indirectamente-, una respuesta inmunitaria en dicho animal.

“Mortalidad” se refiere a la muerte causada por una infección, e incluye la situación en la que la infección es tan grave que se aplica la eutanasia a un animal para evitarle sufrimiento y proporcionarle un final humanitario a su vida. Formulaciones

El sujeto al que se administra la composición es preferentemente un animal, incluyendo pero sin limitarse a bovinos, caballos, ovejas, cerdos, aves de corral (por ejemplo, pollos), cabras, gatos, perros, hámsteres, ratones y ratas, siendo más preferible que el mamífero sea un cerdo.

Las formulaciones de la divulgación comprenden una cantidad inmunizante eficaz de una o más composiciones inmunogénicas y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas comprenden una cantidad inmunizante eficaz de una o más composiciones inmunogénicas y un vehículo fisiológicamente aceptable. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

La composición inmunogénica, si se desea, también puede contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. La composición inmunogénica puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo. La formulación oral puede incluir portadores estándar tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

Las vías de administración preferidas son, entre otras, intranasal, oral, intradérmica e intramuscular. Es deseable la administración en agua potable, preferentemente en una sola dosis. El experto reconocerá que las composiciones de la divulgación también pueden administrarse en una, dos o más dosis, así como por otras vías de administración. Por ejemplo, tales otras vías incluyen subcutánea, intracutánea, intraperitoneal, intracutánea, y dependiendo de la duración deseada y la eficacia del tratamiento, las composiciones según la divulgación pueden administrarse una vez o varias veces, también de forma intermitente, por ejemplo diariamente durante varios días, semanas o meses y en diferentes dosis tales como aproximadamente 103 a 108 TCID50 (véase el título viral anterior). En un aspecto específico de la presente divulgación, la dosis es de aproximadamente 103 a 108 DICT50, especialmente para virus vivos / vacuna viva.

Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contengan el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, como un blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración, preferentemente para su administración a un mamífero, especialmente un cerdo. Asociado a dicho(s) envase(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas presentadas en el presente documento.

FIG. 1. Dibujo esquemático de la generación de un clon infeccioso de CAdV2. (A) Fragmento de ADN sintetizado que codifica los extremos 5' y 3' del genoma viral con un sitio de restricción único intermedio y clonado en el vector lanzadera pBR322 E. coli. Los sitios de la endonucleasa de restricción Pmel (flechas) se diseñaron en la construcción en los extremos 5' y 3' de los ITR para facilitar la escisión del genoma del CAdV-2 de la columna vertebral del vector pBR322. (B) B. Clonación del genoma dsDNA CAdV- 2 en el vector mediante recombinación homóloga en BJ5183 REC+ E. coli. (C) Clon infeccioso HR-recombinante rCAdV-2 exitoso. ITR = repetición terminal invertida.

FIG. 2. Esquema de la organización de la región E3 del CAdV-2.

FIG. 3. Ilustración esquemática de la recombinación homóloga entre el ADN de un clon infeccioso linealizado y un fragmento de transferencia del CAdV-2 dirigido a E3.

FIG. 4. Esquema de los fragmentos de transferencia con deleción E3 (E3A y E3B) generados por BIVI en el esqueleto del CAdV-2.

FIG. 5. Esquema de las deleciones E3 generadas por BIVI. A) Esquema de los ORF E3 con los tamaños totales combinados de los ADN ORF1 y 2 restantes y las cantidades de cada uno. B) Esquema del genoma del CAdV-2 indicando la cantidad total de ADN E3 ORF1 y ORF2 restante en las configuraciones E3A y E3B. En la deleción “A” (E3A) se eliminaron todos los nucleótidos de E3 ORF1 menos los primeros 186 y los últimos 301 nucleótidos de ORF2, mientras que en la deleción E3 “B” (E3B) quedan 186 nucleótidos de E3 O^r F1 y 83 nucleótidos de ORF2. FIG. 6. Deleción E3 e inserción de casetes de expresión.

FIG. 7. Se realizó un análisis de la fuerza del promotor mediante la cuantificación de la expresión de CPV VP2 por expresión transitoria de las construcciones de expresión detectada por IFA en células MDCK transfectadas. Panel A: Se muestra la IFA de CPV de células MDCK transfectadas con plásmidos de expresión de CPV VP2 dirigidos por los promotores CMVie o CMV5. Panel B: Histograma de CPV VP2 ELISA de células MDCK transfectadas con plásmidos de expresión de CPV VP2 dirigidos por los promotores CMVie, CAG o CMV5 según se indica. Panel C: Histograma de la cuantificación ImageXpress MicroXL de Molecular Devices de células MDCK positivas para CPV VP2 transfectadas con plásmidos de expresión de CPV VP2 dirigidos por los promotores CMVie o CMV5 según se indica. FIG. 8: Esquema del casete de expresión CMVie EGFP SV40 poli A en la estructura CAV-2 MCS-1-5. La inserción se realiza en el E3B de la célula CMVie. La inserción se realiza en el E3B ORF2, donde se eliminan todos los nucleótidos excepto los primeros 186 nucleótidos del E3 ORF1 y los últimos 82 nucleótidos. El gen EGFP va seguido de una señal SV40 poli A. ITR = repetición terminal invertida.

FIG. 9: Esquema del casete de expresión CMVie CPV VP2 (n) SV40 polyA en la columna vertebral CAV-2. La inserción se produce en el ORF2 E3B, donde se eliminan todos los nucleótidos excepto los primeros 186 nucleótidos del ORF1 E3 y los últimos 82 nucleótidos. El gen VP2 (n) va seguido de una señal SV40 poli A.

FIG. 10: Análisis por PCR del ADN del rCAV-2 purificado a partir de células infectadas y sobrenadantes. Se utilizó la PCR para verificar la presencia del casete de expresión del transgén CMVie CPV VP2 (n) en rCAV2E3B/CMVie CPV VP2 a partir de ADN vírico aislado. Panel A, virus de control pCAV-2; Panel B, clon #1; Panel C, clon #2. Panel D, reacciones de control con plásmido de transferencia CMVie CPV VP2 (n). M es 1Kb+ de escalera de ADN. Panel E. Resultados esperados de las reacciones PCR específicas del casete de expresión transgénica. Las reacciones 1 y 2 utilizan cebadores específicos para CAV-2 H-A P VIII, el exón U y CVP VP2; las reacciones 3, 4 y 5 utilizan cebadores específicos para CPV VP2 (véase el panel E). La reacción 7 (reacción positiva para CAdV-2) utiliza los cebadores específicos para CAV-2 H-A P VIII y el exón U.

FIG. 11. Análisis citométrico de flujo de células MDCK infectadas con rCAV-2. Los paneles A - F son histogramas de la señal presente en células individuales. Las células MDCK en suspensión se infectaron con el virus de control rCAV-2 que portaba el BRSV F (co) (paneles B y E) o se infectaron con rCAV-2 que portaba los casetes de expresión CPV VP2 (co) (paneles C y F) y se tiñeron 72 h después de la infección con anticuerpos anti-CPV VP2 conjugados con FITC (paneles A, B y C) o anticuerpos antiCAV2 conjugados con FITC (paneles D, E y F). El panel G es un resumen y cuantificación de los resultados mostrados en los paneles A-F.

FIG. 12. Esquema del casete de expresión CMVie BRSV F (co) BGH polyA en el esqueleto CAdV-2. El gen BRSV F (co) va seguido de una señal BGH poly A.

FIG. 13. Esquema del casete de expresión CMVie RabGP BGH polyA en el esqueleto CAdV-2. El gen RabGP va seguido de una señal BGH poly A.

FIG. 14. IFA específica del CAdV-2 de células E1B-MDCK infectadas con el virus rCAV-2 RabGP P2. Las IFA de CAdV-2 de células E1BMDCK infectadas se realizaron 60 h después de la infección de las células utilizando anticuerpos anti-CAdV-2 directamente conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anticuerpos monoclonales de ratón anti-RabG y de cabra anti-ratón conjugados con FITC.

FIG. 15: Análisis citométrico de flujo de células AI-ST 2015 infectadas con CAdV2 CMVie CPV VP2: 72h posinfección FIG. 16: rCAdV-2 con nuevos promotores EHV-4: Análisis citométrico de flujo de células AI-ST 2015 infectadas: 48h posinfección

FIG. 17: rCAdV-2 con nuevos promotores EHV-4: Análisis Dot Blot de la expresión de la proteína CPV VP2 en células MDCK infectadas. 1° = 1/50 a-CPV-FITC mAb (VMRD); 2° = 1/1.000 IgG-peroxidasa de cabra-ratón (JIR). (A) Datos originales de dot blot. (B) Datos semicuantitativos generados a partir de dot blot: Para la cuantificación, los dot blots se analizan mediante el software ImageJ (Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York). Los colores de la imagen se invierten para sustraer el fondo y la densidad integrada de cada punto registrado. A los valores se les asignan las designaciones y - siguientes: “++++” = >800000, “+++” = 500000 a 800000, “++” = 300000 a 499999, “+” = 120000 a 299999, “+/-” = 80000 a 119999 y “-” = <80000. FIG. 18: Detección de RabG en células infectadas con rCAdV-2 p455 RabG: la expresión se detecta en < 1 % de las células infectadas con rCAdV-2 CMVie RabG original.

FIG. 18. Resumen del análisis citométrico de flujo de las proteínas RabG expresadas por células AI-ST 2015 infectadas por clones infecciosos de rCAdV-2.

FIG. 19A: Detección de CPV VP2 en células infectadas con rCAdV-2 p430 y p455 (denotados como gG430 y MCP455, respectivamente) RabG.

FIG. 19B: Detección de RabG en células infectadas con rCAdV-2 p455 (denominado MCP455) RabG.

FIG. 19C: Detección tanto de CAdV-2 como de RabG en células infectadas con rCAdV-2 p455 (denotado como MCP455) RabG.

Resumen de secuencias:

Las siguientes secuencias se detallan y divulgan por el presente documento en la presente invención:

TABLA 1:

continuación

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar formas de realización preferidas de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las formas de realización específicas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Ejemplo 1:

Aislamiento del virus CAdV

El virus CAdV2 se aisló originalmente de un frotis faríngeo de un perro con laringotraqueitis y se obtuvo como primer pasaje en la línea celular MDCK CCL-34 de la American Type Culture Collection (ATCC). El virus se pasó 8 veces después de su adquisición, y el octavo pasaje se alicuotó y se designó como el Master Seed Virus. La cepa del CAdV-2 Master Seed Virus se produjo en Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. bajo la referencia CAdV-2, ^m S^v Lot #001-dil, F: 11-24-98. La cepa CAdV-2 Master Seed está estrechamente relacionada con la cepa Toronto (Genbank Accession Number U77082.1).CAdV-2 está disponible comercialmente en Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. como vacuna canina.

El ADN del clon infeccioso es el genoma completo del CAdV-2 clonado en el vector lanzadera pBR322 de baja copia de E. coli. Un enfoque de recombinación homóloga (Kremer, E.J., et al., Canine adenovirus vectors: an alternative for adenovirus-mediated gene transfer. J Virol, 2000. 74(1): p. 505-12.) se empleó para construir los ADN de clones infecciosos. El ADN del CAdV-2 se purificó a partir del stock de CAdV-2 MLV) y se recombinó en BJ5183 E. coli con un vector basado en pBR322 que contenía a Dn homólogo al de las repeticiones terminales invertidas del CAdV-2. El CAdV-2 se rescató de células de riñón canino Madine Darby (MDCK) transfectadas con ADN de clon infeccioso linealizado Figura 1 para una representación del ADN de clon infeccioso completo.

Ejemplo 2:

Generación de clones de CAdV con inserción E3 suprimida

El CAdV-2 se ha utilizado con éxito como vacuna vírica vectorizada para animales. Se sabe que el dominio E3 del CAdV-2 no es esencial (ninguno de los marcos de lectura abierta (o Rf ) E3 es necesario para la replicación viral en cultivo de tejidos (Fisher et al. 2002) y presentan una diana lógica para la inserción de ADN heterólogo.

Entre los ejemplos de vacunas eficaces basadas en el CAdV-2 en las que los transgenes se localizan en el dominio E3 se incluyen el virus del moquillo canino (Fisher et al. 2002), el virus de la panleucopenia felina (Yang et al. 2008), y la rabia para gatos (Hu et al., 2007), perros (Hu et al., 2006) ratones (Li et al., 2006), mapaches, cerdos (Lui et al., 2008), mofetas (Henderson et al., 2009) y ovejas (Bouet-Cararo et al., 2011).

La Figura 2 es un esquema de la organización de la región E3 del CAdV-2. El fragmento de la endonucleasa de restricción NruI (pb 23932)/SalI (pb 28078) de 4146 pb se ilustra con marcos de lectura abiertos (ORFs) mostrados como la Proteína VIII H-A, ORF1, ORF2, y el Exón U. Las posiciones de los sitios de endonucleasas de restricción seleccionadas (NruI, DraIII, SspI y SalI) se muestran para este fragmento de ADN y la numeración es relativa a la cepa Toronto (número de acceso Genbank U77082.1) de CAdV-2 estrechamente relacionada.

Como señalaron Fischer et al. (2002), la organización genómica de las regiones E3 sólo se conserva vagamente entre los diferentes adenovirus (Linne, T., Differences in the E3 regions of the canine adenovirus type 1 and type 2. Virus Res, 1992. 23(1-2): p. 119-33), y por lo tanto, los límites precisos de los loci no esenciales de la región E3 del CAdV2 no pueden transponerse a partir de sitios de inserción E3 en otros virus. En una primera construcción se suprimió todo el segmento de ADN ORF1 y ORF2 de E3 para maximizar el tamaño de las inserciones del transgén, sin embargo, los ADNs clonados infecciosos no facilitaron el rescate de rCAdV-2. Se descubrió que esta estrategia suprimía inadvertidamente los últimos cinco codones (incluido el codón de parada) del gen de la proteína VIII asociada a hexones (H-A- PVIII) que se extiende al ORF1 del E3 (marco de lectura diferente) en el ADN 5' del flanco E3, lo que dio lugar a un gen H-A PVIII con una extensión 3' sustancial (podría dar lugar a un H-A PVIII con una supresión de 5 aminoácidos seguida de una adición c-terminal sustancial).

Así pues, los plásmidos de transferencia se rediseñaron de modo que los ADNs de flanqueo E35' y 3' contuvieran los primeros 183 pb del ORF E31 y los últimos 47 pb del ORF2, que resultaron ser suficientes para el rescate de rCAdV-2.

Ejemplo 3:

Recombinación homóloga para la generación de ADNs de clones infecciosos de rCAdV-2

Recombinación homóloga en Rec+ BJ5183 E. coli entre ADNs de clones infecciosos de CAdV-2 linealizados y plásmidos/fragmentos de transferencia de CAdV-2 dirigidos a E3, basada en métodos descritos en artículos de Chartier et al. (1996) and Kremer et al. (2000), para la generación de rCAdV-2 con casetes de expresión de transgenes localizados en el dominio E3. Como se ilustra en la Figura 3, un clon infeccioso que contiene un sitio de restricción único en el dominio E3 se recombina con un fragmento de transferencia que contiene ~500 pb de ADN que flanquea al CAdV-2 tanto 5'como 3'a los casetes de expresión del transgén para a) dirigir el casete de expresión del transgén a la región E3 y b) eliminar eficazmente partes seleccionadas de E3.

El ADN se aisló a partir de clones BJ5183 expandidos identificados mediante una prueba de PCR transgénica específica, y estos ADN se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar su migración a o >23,1 Kb (el éxito de la RH da lugar a especies de ADN de ~ 35 kb que, como ADN superenrollado, migra de forma similar al marcador de 23,1 kb en un gel de agarosa al 0,7 %). A continuación, estos ADN se transformaron y expandieron en E. coli Stbl2 o XL-10 Gold para su purificación a mayor escala y su uso para la generación de rCAdV-2 en células de mamífero.

La FIG. 3 es una ilustración esquemática de la recombinación homóloga entre un ADN de clon infeccioso linealizado por NruI/SalI (secuencia nativa de CAdV-2) y un fragmento de transferencia de CAdV-2 dirigido a E3 que abarca la deleción de E3 antes mencionada y un sitio o sitios de restricción únicos (designados MCS para sitio de clonación múltiple) situados entre las porciones restantes de E3. El ADN del clon infeccioso está bordeado por las repeticiones terminales invertidas izquierda y derecha, LITR y RITR, respectivamente.

Ejemplo 4:

Generación de ADN de clones infecciosos E3 rCAdV-2

E3-deleted rCAdV-2: E3A y E3B

Se empleó la PCR de extensión solapada para generar fragmentos de transferencia dirigidos a E3 del CAdV-2 que codifican deleciones E3 seleccionadas y -500 bases de secuencia flanqueante 5' y 3' para facilitar la recombinación homóloga dirigida (HR) en BJ5183 E. coli. (Véanse los esquemas de las Figuras 4 y 5). Como se muestra en las figuras 5A y B, en la deleción “A” (E3A) se eliminaron todos los nucleótidos del ORF1 E3 excepto los primeros 186 y los últimos 301 nucleótidos del ORF2, mientras que en la deleción “B” (E3B) quedaron 186 nucleótidos del ORF1 e3 y 83 nucleótidos del ORF2 (véase SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 para los flancos 5' y 3').

Ambos clones infecciosos que albergaban las deleciones E3A y E3B fueron rescatados con éxito de células MDCK y E1B-MDCK transfectadas, lo que indica que las deleciones E3 específicas favorecen el rescate viral. Dado que la configuración E3B abarca una deleción E3 mayor, se convirtió en el diseño de elección para la generación de casetes de expresión de transgenes portadores de rCAdV-2 en el futuro. Esta mayor deleción indica que prácticamente toda la región E3, por ejemplo, alrededor del 82 % de la región E3 puede delecionarse sin afectar negativamente al rescate viral.

Ejemplo 5:

Construcción de casetes de expresión de deleción/inserción E3 con promotores CMV

Generación de promotores HCMV-IE y CMV5:

La amplificación del extremo 3' del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV-IE)(SEQ ID NO:3) se realizó por PCR como se describió previamente, usando el par de cebadores hCMV-IE 5'F (SEQ ID NO:5) (5'- TTATTAATAGTAATCAATTACGGGG -3')/ hCMV-IE 3' R (SEQ ID NO:6) (5'- GCCACCGTACACGCCTACCGCCC -3') y ADN BAC EHV-gG (10 ng) como plantilla. El fragmento de ADN resultante se clonó posteriormente en el vector pCR™BluntII TOPO® (ThermoFisher Scientific) y se extirpó mediante digestión con las enzimas de restricción Kpn-1 y BamH-1 y se clonó además en un vector lanzadera de plásmidos basado en pUC18 para su posterior manipulación y construcción de los plásmidos de transferencia CAdV. El promotor CMV5 humano (SEQ ID NO:4) se sintetizó utilizando productos de síntesis génica GENSCRIPTO con sitios de restricción 5'- 3' Spe-1 y BamH-1, respectivamente, y se clonó en el vector lanzadera pUC57 de E. coli para su posterior manipulación y construcción de los plásmidos de transferencia CAdV.

Comparación de la actividad promotora de CMVIE y CMV5:

Los informes publicados han demostrado una expresión proteica más robusta a partir de casetes de expresión de transgenes de mamíferos dirigidos por los promotores CMV5 frente a los CMVie. El promotor CMV5 difiere del promotor CMVie en que contiene, aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción CMVie, ~560 pb de ADN que codifica un líder tripartito de adenovirus humano tipo 5 (HuAd5) con el potenciador tardío mayor de adenovirus entre corchetes por sitios donantes y aceptores de empalme (Massie et al., 1995, Improved adenovirus vector provides herpes simplex virus ribonucleotide reductase R1 and R2 subunits very efficiently. Nature Biotechnology 13:602-608). Se demostró que el uso del promotor CMV5 aumentaba sustancialmente la expresión de la proteína en células 293 (Massie et al., 1998, Inducible overexpression of a toxic protein by an adenovirus vector with a tetracyclineregulatable expression cassette. Journal of Virology 72 (3):2289-2296).

En consonancia con estos informes, las comparaciones directas de la expresión de proteínas a partir de casetes impulsados por CMVie o CMV5 mediante transfección transitoria de plásmidos de expresión que contienen CPV VP2, demuestran una expresión de proteínas más robusta a partir de casetes de expresión de transgenes de mamíferos impulsados por los promotores CMV5 frente a CMVie. Según lo mostrado en la FIG. 7, se realizó un análisis de la fuerza del promotor mediante la cuantificación de la expresión de CPV VP2 por expresión transitoria a partir de las construcciones de expresión detectadas por IFA en células MDCK transfectadas. En el panel A: Se muestra la IFA de CPV de células MDCK transfectadas con plásmidos de expresión de CPV VP2 dirigidos por los promotores CMVie o CMV5. Panel B: es un histograma de CPV VP2 ELISA de células MDCK transfectadas con plásmidos de expresión de CPV VP2 dirigidos por los promotores CMVie, o CMV5. Panel C: es un histograma de la cuantificación ImageXpress MicroXL de Molecular Devices de células MDCK CPV VP2-positivas transfectadas con plásmidos de expresión de CPV VP2 dirigidos por los promotores CMVie o CMV5 según se indica. Los resultados indican que el promotor CMV5 puede dirigir la expresión robusta del transgén, y la expresión del CMV5 es mayor tanto en términos de densidad óptica IFA como del número relativo de células MDCK FIT^c positivas que el promotor CMVie. Por lo tanto, se eligió el promotor CMV5 para dirigir la transcripción de los casetes de expresión del CAdV-2. Sin embargo, ninguno de los casetes rCAdV-2 fue transgénico. Sin embargo, ninguno de los clones infecciosos de rCAdV-2 que contienen el promotor CMV5 ha conducido al rescate de rCAdV-2.

Como se muestra en la Tabla 2, mientras que el CMV5 impulsó la expresión transitoria robusta del transgén VP2, ninguno de los clones infecciosos de rCAdV-2 que contenían el promotor CMV5 han conducido al rescate de rCAdV-2.

Para abordar directamente si la secuencia promotora CMV5 podría estar interfiriendo en el rescate de rCAdV-2, se integró en la región E3 del genoma de CAdV-2 un fragmento de ADN que contenía el promotor CMV5, un sitio de clonación múltiple (MCS) y la secuencia de poliadenilación (poliA) del virus simio 40 (SV40). Todos los componentes del ADN clonado en E3B, excepto los ~560 pb de ADN que distinguen el CMV5 del CMVie (y el MCS) forman parte de virus rCAdV-2 previamente rescatados. Los intentos de rescate no tuvieron éxito, lo que sugiere fuertemente que el promotor del CMV5 interfiere con el rescate del rCAdV-2. Para corroborar esta conclusión, se diseñó un experimento recíproco en el que se utilizó la recombinación homóloga para sustituir la región CMV5 MCS SV40 polyA en este clon infeccioso por un casete de expresión “rescatable” basado en CMVie.

Generación de rCAdV-2E3B/CMVie EGFP, que contiene un casete de expresión CMV-IE-EGF insertado en la región E3B del genoma CAdV2:

Se generó un rCAdV-2 portador de un casete de expresión de proteína verde fluorescente mejorada (EGFP, Clontech) (2,6 kb (SEQ ID NO: 7, CMVie EGFP) para facilitar la evaluación del rescate viral y evaluar el tropismo en líneas celulares y especies seleccionadas in vivo. En resumen, se utilizó un fragmento de transferencia CAdV-2 E3B-targeting CMVie EGFP (ORF EGFP dirigido por CMVie seguido de una secuencia de poliadenilación SV40 flanqueada por ~500 pb de ADN CAdV-2 que termina en la posición 183 del ORF1 (5') y comienza en la posición 82 del O^r F2 E3 de CAdV-2 (3')), para recombinación homóloga para generar rCAdV- 2E3B/CMVie EGFP. El éxito de los eventos HR se evaluó mediante la detección de una especie de ADN de ~35kb. Se realizaron cribas de colonias por PCR para identificar los clones que contenían el casete de expresión del transgén (Forward P SEQ ID NO: 8; Reverse P SEQ ID NO 9). Los clones positivos se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, en la que un clon positivo tenía un producto de PCR de ~0,7 kb correspondiente al casete transgénico EFG. Además, se confirmó la correcta inserción y secuencia del transgén mediante el análisis de la secuencia utilizando un secuenciador ILLUMINA® MiSeq, métodos de preparación de bibliotecas NextEr_XT y los programas NexGene (Softgenetic; versión 2.3) y SEQUENCER® (Genecodes; versión 5.1).

La digestión Pme-1 satisfactoria del rCAdV-2GFP produjo dos especies: una de ~32,7 kb (genoma del rCAdV-2) y otra de ~2,7 kb (fragmento PBR322). La transfección de células MDCK y E1B-MDCK se consiguió utilizando el reactivo de transfección LIPOFECTAMINE® 2000 (ThermoFisher Scientific). Los clones infecciosos de rCAdV-2E3B/CMVie EGFP se rescataron con éxito de las células MDCK y E1B-MDCK transfectadas, como indicaba la señal de GFP mediante fluorescencia en las células transfectadas. Los virus se cosecharon a partir de sobrenadantes/lisados celulares transfectados y se sometieron a tres ciclos sucesivos de congelacióndescongelación (-70°C/37°C), se esterilizaron por filtración y se pasaron tanto a MDCK como a E1B-MDCK. A continuación, se observó la señal EGFF dependiente de la infección en las células infectadas mediante microscopia de fluorescencia (datos no mostrados).

El casete de expresión del transgén CMVIE EGFP SV40 polyA se clonó con éxito en el dominio E3B del CAdV2. El virus recombinante fue rescatado con éxito, y la EGFP fue detectable mediante análisis microscópico fluorescente posinfección.

Generación y rescate de rCAdV-2 E3B con un casete de expresión de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) a partir del clon infeccioso no rescatable rCAdV-2 E3B que porta el promotor CMV5:

Para apoyar la conclusión de que el promotor CMV5 inhibe el rescate de rCAdV-2 (véase la sección “Uso del promotor CMV5 para la expresión de transgenes”, más arriba), se llevó a cabo un experimento recíproco en el que se utilizó la recombinación homóloga para sustituir la región poliA CMV5 MCS SV40 en el clon infeccioso MCS-1 por un casete de expresión “rescatable” basado en CMVie. En resumen, el fragmento de transferencia transgénica de CAdV-2 E3-targeting CMVie EGFP anterior, se utilizó para la recombinación homóloga para generar un E3B rCAdV-2 a partir del clon infeccioso MCS-1-5 (MCS-1-5 contiene el promotor CMV5, un pequeño sitio de clonación múltiple (MCS) y una secuencia de poliadenilación SV40). Un fragmento de transferencia de EGFP purificado de ~2,6 Kb y ADN de clon infeccioso de rCAV-2 linealizado derivado de MCS-1-5, se co-transformaron mediante electroporación en células E. coli BJ5183 que luego se seleccionaron en placas LB-agar con 50 g/mL de Carbenicilina. Se realizaron cribas de colonias por PCR para identificar clones que contuvieran el casete de expresión del transgén. La recombinación homóloga exitosa da lugar a especies de ADN de ~35Kb que, como ADN superenrollado, corre con o algo más rápido que la especie de ADN marcador de 23,1Kb en un gel de agarosa al 0,7 %. Los clones positivos se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (FIG. 4). Un esquema del casete de expresión CMVie EGFP SV40 polyA en el backbone CAV-2 MCS-1-5 el ADN clon infeccioso se ilustra en la FIG. 8.

El virus rCAV-2 MCS-1-5 EGFP digerido por PmeI se transfectó en células MDCK y E1B-MDCK utilizando LIPOFECTAMINE® 2000 CD y 3000. Los clones infecciosos rCAdV-2E3B/CMVie EGFP derivados del ADN del clon infeccioso rCAdV-2 MCS- 1-5 facilitaron con éxito el rescate del rCAdV-2 de las células E1B-MDCK transfectadas, como indicaba la señal GFP mediante fluorescencia en las células transfectadas (datos no mostrados). Como se postuló en el Apéndice VI (Antecedentes), el rescate de rCAdV-2 portando el casete de expresión EGFP derivado del esqueleto MCS-1 de CAdV-2 apoya aún más la conclusión de que la inhibición del rescate de rCAdV-2 es dependiente de CMV5, y más aún está localizada en la secuencia de ADN huAd5 de 560 pb en CMV5.

Generación de rCAdV-2E3B/CMVie CPV VP2 (nativo), que contiene un casete de expresión CMV-IE-VP2 insertado en la región E3B del genoma de CAdV2:

Se generó un rCAdV-2 portador del gen VP2 del parvovirus canino (CPV). En resumen, de forma similar a lo anterior, se utilizó un fragmento de transferencia de CAdV-2 dirigido a E3 que contenía un ORF de VP2 de CPV dirigido a CMVie (SEQ ID NO: 10) para recombinación homóloga con el fin de generar un rCAdV-2 E3B que contenía el casete de expresión de VP2 (Ver FIG. 9). Los clones que contenían la integración exitosa del transgén se detectaron mediante un cribado por PCR, en el que se visualizó un producto de PCR de 1,7 kb mediante electroforesis en gel de agarosa. La inserción y la secuencia correctas del transgén se confirmaron mediante análisis de secuencias utilizando un secuenciador ILLUMINA® MiSeq, métodos de preparación de bibliotecas NextEr_XT y los programas NexGene (Softgenetic; versión 2.3) y SEQUENCER® (Genecodes; versión 5.1).

La digestión Pme-1 exitosa del rCAdV-2GFP produjo dos especies: una de ~32,7 kb (genoma del rCAdV-2) y otra de ~2,7 kb (fragmento PBR322). Los clones infecciosos de CPV VP2 del rCAdV-2E3B/CMVie se rescataron con éxito de las células MDCK y E1B-MDCK transfectadas, tal y como se detectó mediante CAdV-2 IF As (datos no mostrados). Aunque la expresión de la proteína CPV VP2 en las células infectadas no tuvo éxito, como se detectó por la falta de tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos contra la proteína VP2, se detectó la presencia del casete de expresión transgénica en genomas virales purificados mediante PCR.

El análisis por PCR del ADN rCAV-2 purificado a partir de células infectadas y sobrenadantes se utilizó para verificar la presencia del casete de expresión del transgén CMVie CPV VP2 (n) en clones rCAV2E3B/CMVie c Pv VP2 (FIG.

10). Panel A, virus de control pCAV-2; Panel B, clon #1; Panel C, clon #2. Panel D, reacciones de control con plásmido de transferencia CMVie CPV VP2 (n). M es 1Kb+ de escalera de ADN. Panel E. Resultados esperados de las reacciones PCR específicas de los casetes de expresión transgénica. Las reacciones 1 y 2 utilizan cebadores específicos para CAV-2 H-A P VIII, el exón U (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12).y CVP VP2 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID n O: 14); las reacciones 3, 4 y 5 utilizan cebadores específicos para CPV VP2 (ver Panel E) (SEQ ID NO:15- 20). La reacción 7 (reacción positiva para CAdV-2) utiliza los cebadores específicos para CAV-2 H-A P VIII y el exón U (SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22).

Por lo tanto, aunque el casete de expresión del transgén CMVIE CPV VP2 (n) SV40 polyA se clonó con éxito en el dominio E3B del CAdV2, el virus recombinante se rescató con éxito y se confirmó la presencia de la secuencia VP2, la expresión de la proteína VP2 no fue detectable.

Generación de rCAdV-2E3B/CMVie CPV VP2 (codón optimizado), que contiene un casete de expresión CMV-IE-VP2 insertado en la región E3B del genoma CAdV2:

Un fragmento de transferencia transgénica (ORF (co) del CPV VP2 dirigido al E3 del CAdV-2 CMVie optimizado para el codón (co) [ORF (co) del CPV VP2 dirigido al CMVie seguido de una secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) flanqueada por ~500 pb de ADN del CAdV-2 que termina en la posición 183 del ORF1 (5') y comienza en la posición 82 del Or F2 del E3 del CAdV-2 (3')] (SEQ. ID NO.:23), se generó mediante PCR de extensión solapada y se clonó en un vector TOPO para su archivo y amplificación. El constructo se utilizó para recombinación homóloga con el fin de generar un E3B rCAdV-2.

Los clones que contenían la integración exitosa del transgén se detectaron mediante un cribado por PCR, en el que se visualizó un producto de PCR de 2,3 kb mediante electroforesis en gel de agarosa. La inserción y la secuencia correctas del transgén se confirmaron mediante análisis de secuencias utilizando un secuenciador ILLUMINA® MiSeq, métodos de preparación de bibliotecas NextEr_XT y los programas NexGene (Softgenetic; versión 2.3) y SEQUENCER® (Genecodes; versión 5.1).

Los clones infecciosos rCAdV-2E3B/CMVie CPV VP2 (co) se rescataron con éxito de células MDCK y E1B-MDCK transfectadas, lo que se demostró mediante IFA de CAdV-2 realizada en células infectadas con P1 utilizando anticuerpos anti-CAdV-2 directamente conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (datos no mostrados). Para verificar que el virus rescatado codifica el casete de expresión del transgén CMVie CPV VP2 (co), se purificaron los genomas del virus P2 rCAdV-2 y P5 CAdV-2. Se realizaron análisis por PCR de los ADN extraídos utilizando cebadores específicos para regiones del genoma CAdV-2 (proteína VIII asociada a hexón (H-A P VIII) y el exón U), el promotor CMVie y CPV VP2. (datos no mostrados) El análisis PCR arrojó productos PCR de tamaño correcto indicando que los genomas virales P2 purificados codificaban el casete de expresión del transgén CMVie CPV VP2 (co).

Para verificar la expresión de las células MDCK infectadas se empleó el análisis citométrico de flujo de las células infectadas con CMVie CPV VP2 (co) rCAdV utilizando anticuerpos contra CAdV2 y CPV VP2. Brevemente, se infectaron células MDCK en suspensión con rCAdV-2 y rCAdV-2 de control en un formato de 12 pocillos y se cultivaron durante 72h (37 °C, 5,0 % de CO₂ a 125 rpm en una incubadora humidificada). A continuación, se recogieron las células, se lavaron con PBS y, utilizando un kit de fijación/permeabilización CYTOFIX/CYTOPERM™ (BD Biosciences, Cat. #554714), se trataron con la solución de fijación CYTOFIX™ seguida de dos lavados con la solución de permeabilización CYTOPERM™. A continuación, las células se incubaron con anticuerpos anti-CAdV-2 o anti-CPV VP2 conjugados con FITC (anticuerpo Anti-CAV2: VMRD, Catálogo # CJ-F-CAV-50X y anticuerpo Anti-CPV VP2: VMRD, N° de catálogo CJ-FCPV 50X, respectivamente), se lavaron 2X con CYTOP^e R^m ™ y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un sistema de citometría de flujo FACSCANTO™ de BD Biosciences.

La FIG. 11 muestra los resultados del análisis por citometría de flujo de células MDCK infectadas con CMVie CPV VP2 (co) rCAdV. Los paneles A - F son histogramas de la señal presente en células individuales. Las células MDCK en suspensión se infectaron con el virus de control rCAdV-2 portador del BRSV F (co) (Paneles B y E) o se infectaron con rCAV-2 portador de los casetes de expresión CPV VP2 (co) (Paneles C y F) y se tiñeron 72 h después de la infección con anticuerpos anti-CPV VP2 conjugados con FITC (Paneles A, B y C) o anticuerpos anti-CAV2 conjugados con FITC (Paneles D, E y F). El panel G es un resumen y cuantificación de los resultados vistos en la FIG. 11. Los resultados de la tinción con anti-CAV-2 muestran que la mayoría de las células MDCK infectadas con rCAV2-BRSV F (co)- o rCAV2- CPV VP2 (co)-(Fig. 1, Paneles E y F, respectivamente) expresan proteínas CAdV2, mientras que las células no infectadas (Fig. 1, Panel D) son efectivamente negativas para CAdV-2. La tinción con anticuerpos anti-CPV VP2 (Fig. 1, Paneles A, B y C) muestra que sólo las células MDCK infectadas con rCAV2-CPV VP2 (Panel C) expresan proteínas CPV VP2, aunque se observa alguna señal de fondo en las células no infectadas y en las infectadas con rCAV2-BRSV F con los anticuerpos anti-CPV VP2 (Paneles A y B, respectivamente).

Así pues, el casete de expresión del transgén CPV VP2 de CMVie con codón optimizado (co) se clonó con éxito en el dominio E3B de CAdV2. El virus recombinante fue rescatado de células MDCK transfectadas, y el casete de expresión del transgén fue detectado en genomas virales purificados. Se detectó ARNm de VP2 de CPV en células infectadas (datos no mostrados), y la expresión proteica de VP2 de CPV en células infectadas se confirmó mediante análisis de citometría de flujo, en contraste con el casete de expresión de VP2 nativo.

Generación de rCAdV-2E3B con un casete de expresión de proteína de fusión de virus respiratorio sincitial bovino optimizado en codones insertado en la región E3B del genoma de CAdV2:

En resumen, se utilizó un fragmento de transferencia dirigido a E3 del CAdV-2 que contenía un ORF de proteína de fusión (F) del virus respiratorio sincitial bovino (BRSV) dirigido por CMVie seguido de una secuencia de poliadenilación BGH flanqueada por ~500 pb de ADN del CAdV-2 que terminaba en la posición 183 del ORF1 (5') y empezaba en la posición 82 del ORF2 E3 del CAdV-2 (3') para recombinación homóloga con el fin de generar un E3B rCAdV-2. (SEQ ID NO: 27). Tanto la versión nativa (n) como la versión con codón optimizado (co) del gen F del BRSV se clonaron en el fondo del vector CAdV-2, y los virus portadores de ambas versiones del transgén se rescataron con éxito. Sin embargo, sólo se utilizó el gen BRSV F (co) para aplicaciones posteriores.

Los clones infecciosos de BRSV F (CO) rCAdV-2E3B/CMVie se rescataron con éxito de células MDCK, como indicaba el CPE de células infectadas con sobrenadantes virales/lisados celulares. Se detectó la presencia del casete de expresión del transgén en genomas virales purificados. Se extrajo ADN del virus P3 rCAV2-BRSV F (co) y se utilizó como molde para el análisis por PCR con el fin de detectar la presencia del gen BRSV F (co) en el genoma del virus. El transgén se secuenció para confirmar la secuencia del gen.

La expresión del BRSV F por las células infectadas se confirmó mediante un análisis de citometría de flujo (véase la FIG. 11).

Generación de rCAdV-2 E3B con un casete de expresión de glicoproteína de la rabia (n) insertado en la región E3B del genoma de CAdV2:

En resumen, se utilizó un fragmento de transferencia dirigido al E3 del CAdV-2 que contenía un ORF de la glicoproteína de la rabia de la cepa Pasteur (RabGP) dirigido por CMVie seguido de una secuencia de poliadenilación BGH flanqueada por ~500 pb de ADN del CAdV-2 que terminaba en la posición 183 del ORF1 (5') y empezaba en la posición 82 del ORF2 del E3 del CAdV-2 (3') para recombinación homóloga con el fin de generar un E3B rCAdV-2. (SEQ ID NO: 25) (Ver FIG. 13) El gen nativo Pasteur Rabies G se amplificó por PCR a partir de una vacuna antirrábica basada en Raccoonpox (rRCNV-Rabies G2 Vaccine), Lote #D0l5-054-). El tamaño esperado del ADN RabGP amplificado es de ~1,6Kb.

A continuación, el fragmento RabGP se ligó al fragmento pUC18-B-Bflb-CO y se transformó en TOP10 E.coli. Se realizó un cribado de colonias por PCR para ADN RabGP utilizando cebadores específicos de RabGP (datos no mostrados).

Los ADN se digirieron con PmeI para liberar los fragmentos de transferencia (~3,45 Kb) y con ScaI para cortar la columna vertebral del vector y facilitar la identificación de los fragmentos de transferencia. Los fragmentos de transferencia del transgén (casete de expresión) CMVie RabGP (n) de ~3,45 Kb purificados con PmeI y los ADNs del clon infeccioso rCAV-2 linealizado se co-transformaron mediante electroporación en células E. coli BJ5183 que luego se seleccionaron en placas LB-agar con 50 mg/mL de Ampicilina. Se realizaron cribas de colonias por PCR para identificar los clones que contenían el casete de expresión del transgén y se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (datos no mostrados).

Los ADN de clones HR digeridos por PmeI se transfectaron en células E1B-MDCK utilizando LIPOFECTAMINE® 2000 CD. Los clones infecciosos de rCAdV-2E3B/CMVie RabGP se rescataron con éxito de las células E1B-MDCK transfectadas, como indican las IFAs de CAdV-2 mostradas en la FIG. 14, una IFA de CAdV-2 de células EIB-MDCK infectadas con el virus rCAV-2 RabGP P2 utilizando anticuerpos anti-CAdV-2 directamente conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) confirma el rescate de rCAdV-2 tanto por inmunofluorescencia antiRabG como CAdV-2 (Paneles B y C, 48 y 72 horas después de la infección).

Como indican las células fluorescentes (CAV-2+ y RabG+) en las Figuras 14, Paneles B y C, las células E1B-MDCK infectadas con los virus rCAV-2 RabGP E2 y ^e3 expresan la rabia G. Sin embargo, el número de células RabG+ parece sustancialmente menor que el de células CAdV-2+.

TABLA 2. R m n ^ l l n ^ inf i r A V-2 n r r BIVI.

Como se resume en la Tabla 2, se han generado muchos clones infecciosos basados en E3B que no facilitaron el rescate de rCAdV-2 a partir de células MDCK o E1B-MDCK transfectadas. Entre ellos se incluyen CPV VP2 y Rabies G que contienen casetes de expresión de transgenes dirigidos por el promotor CMV5, clones que contienen la glicoproteína G de la rabia en los que la secuencia de nucleótidos se optimizó mediante codones (76 % de identidad con la cepa SAD P5/88) y clones que contienen las construcciones de proteínas fluorescentes informadoras hMGFP (verde) (Promega) y MCherry (rojo) (Clontech) (datos no mostrados).

Esta variabilidad comparada entre insertos de tamaño comparable no es simplemente un reflejo de la optimización de codones, ya que tanto las secuencias nativas como las optimizadas facilitaron el rescate de rCAdV-2 portador de BRSV F y CPV VP2 (véase más arriba, Tabla 2). De hecho, los clones infecciosos de rCAdV-2 portadores de ORFs nativos hMGFP y MCherry tampoco facilitaron el rescate de rCAdV-2 (datos no mostrados). En conjunto, los datos sugieren que el uso de promotores CMV en el contexto de la plataforma de vectores CAdV-2 es impredecible y que la elección del promotor es una consideración importante en la construcción del casete de expresión, ya que puede afectar significativamente al rescate de clones rCAdV-2.

Ejemplo 6:

Casetes de expresión con promotores EHV4

Identificación y construcción de nuevos promotores derivados de equinos:

Se identificaron y aislaron nuevos promotores equinos heterólogos del herpesvirus equino de tipo 4 (EHV4). Dos promotores fueron de interés: (1) el promotor gG de 600 pb del EHV-4 (4μgG600) (SEQ ID NO: 29) en el ORF70 que codifica la glicoproteína G (gG); y (2) el promotor MCP de 600 pares de bases del EHV-4 (4μMCP600) (SEQ ID NO: 30) en el ORF42 que codifica la proteína de la cápside mayor (MCP). El gen de la glicoproteína G (orf70) está activo durante las fases temprana y tardía del ciclo de replicación (Colle et al. 1995, Drummer et al. 1998). La proteína mayor de la cápside es uno de los constituyentes más abundantes del virión y es necesaria para el ensamblaje de las cápsides en el núcleo celular tan pronto como el ADN viral recién sintetizado está listo para su empaquetamiento. Por lo tanto, se espera que su promotor esté activo tanto al principio como al final del ciclo de replicación viral. Sensibles a la limitación de tamaño del esqueleto del CAdV, ambas secuencias promotoras del EHV-4 se truncaron hasta aproximadamente el 75 % de su longitud original. En particular, el promotor 4μgG600 de 600 pb se truncó a 430 pb para generar el fragmento promotor p430 (SEQ ID NO: 31), y el promotor 4μMCP600 de 600 pb se truncó a 455 pb para generar el fragmento promotor p455 (SEQ ID NO: 32).

La generación de partículas similares a virus (VLPs) por células infectadas con el virus vacunal rCAdV-2 puede ser un factor crítico para la eficacia de la vacuna contra el adenovirus canino (CAdV-2). Si bien el rCAdV-2 que contiene un casete de expresión de CPV VP2 impulsado por CMVie pudo ser rescatado, como se detalló anteriormente, no se pudo lograr una expresión sustancial de VP2 (para la generación de VLP) en células infectadas con CPV VP2 de rCAdV-2 CMVie utilizando el promotor CMVie convencional. Además, el virus rCAdV-2 VP2 que contiene el promotor CMV5 no pudo ser rescatado. Por lo tanto, era de interés utilizar nuevos promotores con las características identificadas anteriormente capaces de impulsar la expresión robusta, estable y reproducible de antígenos de interés.

Generación BamHI de plásmidos de transferencia CAdV-2 que contienen EHV-4 P CPV VP2 (co): Generación de ADN Kpnl/EHV-4 P:

Los fragmentos de los promotores del EHV-4 gG430 y MCP455 se amplificaron por PCR en gradiente a partir de los siguientes pares de oligonucleótidos:

gG430 F: TTTAAAGGTACCTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACC (SEQ ID NO: 33);

gG430 R: AAATTTGGATCCAACTGCAGCTTATCACAGCTTTACAGGTGG (SEQ ID NO: 34)

MCP455 F: TTTAAAGGTACCACTGGTGGTAGCATATACTACCTTTATTTATACGC (SEQ ID NO: 35);

MCP455 R: AAATTTGGATCCGATCCTATGGTAGCGGTAAAACACCG, (SEQ ID NO: 36), respectivamente.

Los tamaños esperados de los ADN gG430 y MCP455 amplificados son 454 y 479 pb, respectivamente.

Los plásmidos de transferencia de CAdV-2 preparados previamente y utilizados para la integración satisfactoria en el E3B y el rescate de rCAV-2 (como se ha detallado anteriormente) se utilizaron como base del plásmido de transferencia de VP2 de CPV con promotor de EHV-4 mediante un intercambio basado en BamHI/KpnI del promotor de CMVie con los promotores de EHV-4.

Se utilizaron dos secuencias diferentes de CPV VP2 con codón optimizado, designadas “Despliced” (SEQ ID NO: 37) y “Gen0.95” (SEQ ID NO: 38) para preparar plásmidos de transferencia CAdV-2 que contenían casetes de expresión dirigidos por el CMVie. Gen0.95 es una secuencia CPV VP2 optimizada para el codón obtenida de Genscript con un Índice de Adaptación al Codón (CAI) de 0,95. El análisis de Gen0.95 con un algoritmo buscador de sitios de empalme (2013/2014 © Human Splicing Finder - Diseñado por Ghadi Raí; Inserm UMR_S910 - Aix Marseille Université, 27 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05) sugirió la presencia de 43 sitios potenciales donantes de empalme. Se realizaron 89 cambios de nucleótidos (5,07 % de cambio de secuencia frente a Gen0.95) para eliminar 40 sitios donantes de empalme que no alteraban la secuencia de aminoácidos ni generaban codones menos favorables según la especie canina.

Los fragmentos de transferencia PmeI EHV-4 P CPV VP2 (co) purificados de ~3,5Kb, que contenían las dos secuencias VP2 anteriores, y el ADN del clon infeccioso rCAV-2 linealizado se co-transformaron mediante electroporación en células E. coli BJ5183 para recombinación homóloga. Los clones intactos se seleccionaron en placas LB-agar con 50 mg/mL de ampicilina. Los clones con el tamaño y la orientación de integración adecuados se identificaron mediante PCR, se seleccionaron y se expandieron.

La digestión PmeI exitosa de los clones infecciosos de pCAV-2 produjo especies de ADN de ~33,5 (genoma de pCAV-2) y ~2,7 (fragmento de pBR322) Kb. Los clones infecciosos digeridos por PmeI se transfectaron en células E1B-MDCK y MDCK utilizando LIPOFECTAMINE® 3000. Los virus de paso 1 (P1) a paso 7 (P7), designados pCAV2E3B/μgG430-VP2 (Despliced) (SEQ ID NO: 39), pCAV2E3B/gG430-VP2 (Gen 0.95) (SEQ ID NO: 40) o pCAV2E3B/p455 -VP2 (Gen 0.95) (SEQ ID NO: 41), se cosecharon a partir de supematantes/lisados celulares transfectados, se sometieron a tres ciclos sucesivos de congelación-descongelación (-70°C/37°C), se esterilizaron por filtración y se pasaron a células E1B-MDCK.

Las células AI-ST se infectaron con rCAdV-2 seleccionado para ensayos de inmunofluorescencia (IFA) para la expresión de proteínas CAdV-2 y CPV VP2. 72 h después de la infección, las células se fijaron con el kit de fijación/permeabilización CYTOFIX/CYTOPERM™ (BD Biosciences, Cat. #554714), se trataron con la solución de fijación CYTOFIX™ seguida de dos lavados con la solución de permeabilización CYTOPERM™. A continuación, las células se incubaron con anticuerpos anti-CAdV-2 o anti-CPV VP2 conjugados con FITC (Anticuerpo (mAb) anti-CAdV2: VMRD, Catálogo # CJ-F-CAV-50X y anticuerpo Anti-CPV VP2: VMRD, N° de catálogo CJ-FCPV 50X, respectivamente), se lavaron 2X con CYTOPERM™ y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un sistema de citometría de flujo FACSCANTO™ de BD Biosciences.

Las proteínas CAdV-2 y CPV VP2 se visualizan fácilmente por IFI y se detectan por FC en una proporción sustancial de células AI-ST 2015 infectadas con rCAdV-2 portadoras de dos variantes nucleotídicas diferentes de CPV VP2 (Desμl y Gen0.95, a las 48 y 72h posinfección). Se identificó una cantidad sustancial de proteína CPV VP2 en los sobrenadantes/lisados de cultivos de tejidos (después de congelación/descongelación) mediante Dot Blot (y muy probablemente refleja la presencia de VLPs ensambladas).

Los resultados de la FIG. 19 muestran que las proteínas CAV-2 y CPV VP2 se visualizan fácilmente por IF A de células AI-ST infectadas (pero no en células infectadas con rCAdV-2 que codifica el transgén BRSV no relevante), lo que indica una expresión robusta de CPV VP2 tanto de variantes de secuencia Despliced como Gen0.95 CPV VP2 (co) impulsadas por los promotores gG430 y MCP455 EHV-4 (ver FIG. 19A). La expresión de CPV VP2 se detectó en menos del 3 % de las células infectadas con rCAdV-2 CMVie CPV VP2 original (véase la FIG. 15), lo que indica que el rCAdV-2 portador de casetes de expresión de CPV VP2 dirigidos por los nuevos promotores derivados de EHV4 p430 y p455 podía rescatarse con éxito. Sorprendentemente, la expresión de CPV VP2 dirigida por los promotores gG430 y MCP455 de EHV-4 se detectó en el 14 % al 36 % de las células infectadas (véase la FIG. 16), en comparación con los vectores CAdV en los que se utilizaron secuencias promotoras CMV5 en la localización E3B, en cuyo caso el rescate viral no tuvo éxito.

Para analizar la expresión del transgén en las células infectadas, se realizó un análisis Dot blot. Brevemente, los sobrenadantes/lisados (congelación/descongelación) de cultivos tisulares clarificados (6000 x g, 5 min) de células AI ST infectadas (para rEHV-1) y E1B MDCK (para rCAdV- 2) se diluyeron en serie con PBS antes de añadirlos al aparato y se adsorbieron a PVDF mediante aspiración. Los pasos posteriores son una exposición de 30 minutos al 5,0 % de BioRad Blotting Grade Blocker en TBST, una exposición de 1,0 h a anticuerpos de 1°, tres lavados con TBST y una exposición de 1,0 h a anticuerpos de 2° conjugados con peroxidasa (anti-ratón y anti-cerdo, Jackson ImmunoResearch) y visualización mediante TMB. Para la cuantificación, los dot blots se analizaron mediante el software ImageJ (Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York). Los colores de la imagen se invierten para sustraer el fondo y la densidad integrada de cada punto registrado. A los valores se les asignan las designaciones y - siguientes: “++++” = >800000, “+++” = 500000 a 800000, “++” = 300000 a 499999, “+” = 120000 a 299999, “+/-” = 80000 a 119999 y “-” = <80000.

Como puede verse en la FIG. 17, se observó una fuerte señal de proteína CPV VP2 en sobrenadantes/lisados de cultivo tisular de células infectadas por rCAdV-2 que codifican casetes de expresión impulsados por promotores EHV-4 para CPV VP2, mientras que no se detectó señal en muestras de células infectadas con rCAdV-2 que codifican un casete de expresión no relevante. Estos resultados muestran que se identificó una cantidad sustancial de proteína VP2 del CPV en sobrenadantes de cultivos de tejidos. Es muy probable que estos resultados reflejen la presencia de VLPs VP2 de CPV ensambladas. Esto contrasta con el CPV VP2 original rCAdV-2 CMVie, en el que el análisis dot blot mostró que la señal CPV VP2 impulsada por CMVie estaba en niveles de fondo o por debajo de ellos, y en niveles comparables con los sobrenadantes/lisados de los controles negativos (células infectadas con CAdV-2, rCAdV-2 CMVie BRSV F y sobrenadantes/lisados de cultivo celular de células no infectadas).

Según lo mostrado en la FIG. 17, la proteína VP2 puede ser reconocida en el sobrenadante y, por lo tanto, se espera que esté en la conformación requerida para ser inmunogénica. Es importante destacar que, como se ha comentado anteriormente, el rescate del CAdV-2 recombinante no se consiguió en clones en los que el transgén estaba dirigido por secuencias promotoras CMV5. Así, las nuevas secuencias promotoras derivadas de EHV-4 de la presente invención, como p430 y p455, no sólo facilitan la expresión del transgén, sino que también apoyan el paso crucial del rescate viral.

Generación de plásmidos de transferencia CAdV-2 que contienen promotores EHV-4 CPVRabG (n):

Se generó una segunda construcción CAdV-2 utilizando el nuevo promotor p455 derivado de EHV-4 de la presente invención. Se eligió el rCAdV-2 RabG(n) porque no se observó la expresión por células infectadas utilizando el promotor CMVie convencional.

El objetivo de este experimento era confirmar la actividad del nuevo promotor EHV-4 en el contexto de rCAdV-2 con un segundo transgén, RabG (una proteína de membrana) mediante la medición de la expresión de la proteína RabG impulsada por el promotor EHV-4 en células AI-ST 2015 infectadas con rCAdV-2 p455 RabG(n).

La secuencia RabG(n) se aisló a partir de RabG (n) de CMVie rCAdV-2 rescatada (SEQ ID NO: 25) como se ha comentado anteriormente. Una secuencia RabG (n) de 1596 pb que incluye una secuencia Kozak inmediatamente 5' al codón ATG START se extirpó con las endonucleasas de restricción BamHI y Sail (5' y 3', respectivamente), y se ligó a fragmentos de transferencia rCAdV cortados con BamHI/SalI con el promotor gG430 y los promotores MCP455 que luego se transformaron en E. coli TOP10.

Los fragmentos de transferencia PmeI EHV-4 P RabG (n) purificados de ~3,3Kb y el ADN del clon infeccioso rCAV-2 linealizado se co-transformaron mediante electroporación en células E. coli BJ5183 para recombinación homóloga. Los clones intactos se seleccionaron en placas LB-agar con 50 mg/mL de carbenicilina. Se realizaron cribas de colonias por PCR para identificar clones EHV-4 pG430/RabG (n) (SEQ ID NO: 42) y EHV-4 p455/RabG (n) (SEQ ID NO: 43). Los clones se analizaron con cebadores específicos para el ADN RabG y se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADN esperado es de 1501 pb.

Los clones infecciosos digeridos por PmeI se transfectaron en células E1B-MDCK y MDCK utilizando LIPOFECT AMINE® 3000. Los virus de los pasajes 1-7 (P1-P7), designados pCAV2EB3/gG430 o MCP455 RabG (n), se cosecharon a partir de supemantes/lisados celulares transfectados sometidos a tres ciclos sucesivos de congelación-descongelación (-70 °C/37 °C), se esterilizaron por filtración y se pasaron a células E1B-MDCK.

Se emplearon IFA y citometría de flujo para evaluar la expresión de RabG impulsada por el promotor del EHV-4 en células AI-ST 2015 infectadas con rCAdV-2. La expresión de la proteína CAdV-2 se sondeó con anticuerpos policlonales porcinos anti-CAdV-2 conjugados con FITC (VMRD). La expresión de la proteína RabG se comprobó con anticuerpos monoclonales de ratón (Novus). Las proteínas CAdV-2 y RabG se visualizan fácilmente por IFA y se detectan por FC en células AI-ST 2015 infectadas con rCAdV-2 portador de RabG (n) (a las 72h post-infección). Los resultados de la FIG. 18 indican que las proteínas CAV-2 y RabG se detectan fácilmente en células AI-ST 2015 infectadas por rCAdV-2 y rEHV-1 seleccionados mediante análisis de citometría de flujo. Estos resultados demuestran una expresión sustancial de RabG impulsada por el promotor MCP455 EHV-4. Por el contrario, mientras que RabG se detecta fácilmente en células infectadas con rCAdV-2 p455 RabG (véase FIG. 19B y C), la expresión se detecta en < 2,0 % de las células infectadas con RabG CMVie rCAdV-2 original (véase FIG. 18).

En conclusión, los casetes de expresión de los transgenes gG430 y MCP455 RabG (n) SV40 polyA se clonaron con éxito en el dominio E3B del CAdV-2. El virus recombinante se rescató de las células E1B-MDCK transfectadas, como indica el CPE en las células infectadas por el virus. La expresión impulsada por el promotor MCP455 del transgén RabG por rCAdV-2 en células MD^c K AI-ST 2015 y BⁱV ⁱ 2011 infectadas se confirmó mediante IFA y citometría de flujo.

Ejemplo 7:

Preparación de composiciones farmacéuticas (vacunas) que comprenden rCAdV-CMV/CPV VP2:

El parvovirus canino (CPV) es un virus altamente contagioso que puede causar una alta morbilidad y mortalidad dependiendo de la virulencia, el huésped y los factores ambientales. En los últimos 30 años, el uso de un programa de vacunación eficaz para perros que utiliza vacunas MLV y de virus muertos ha reducido en gran medida la tasa de mortalidad. El CPV es un virus de ADN monocatenario no envuelto con dos proteínas estructurales (VP1 y VP2) que forman la cápside. Se sabe que la VP2 está implicada en la patogenicidad del virus y en la respuesta inmunitaria del huésped, por lo que es nuestra diana de elección para la incorporación y expresión en el sistema CAdV2 recombinante.

El objetivo de este estudio era realizar una evaluación preliminar de la eficacia de una vacuna experimental rCAV2-CPV VP2 en comparación con una vacuna combinada MLV. La combinación MLV contenía adenovirus canino tipo 2 (CAV2), virus del moquillo canino (CDV) y parvovirus canino (CPV) mezclados a un nivel entre la dosis inmunizante mínima establecida y la dosis de liberación de cada fracción establecida en los productos actuales para cada antígeno en particular.

En este estudio, se administró rCAV2-CPV VP2 en un régimen de dos dosis, con un intervalo de tres semanas, a cachorros de 6-7 semanas de edad, con el fin de determinar si la vacuna vectorial CAdV-CPV VP2 proporcionaba protección frente a la provocación por CPV. En la actualidad, dado que las vacunas MLV son el estándar de oro para la protección frente al CPV y la ICH, el grupo de prueba se comparó con un grupo de cachorros de 6-7 semanas a los que se administró un régimen de dos dosis, con tres semanas de intervalo, de una combinación de vacunas MLV que contenía CPV, CDV y CAdV2. Este grupo se consideró el grupo de control positivo. A un tercer grupo se le administró un régimen de dos dosis, con un intervalo de tres semanas, de PBS como controles de desafío. Los perros fueron desafiados con CPV-2b aproximadamente tres semanas después de la segunda vacunación para evaluar la eficacia.

Las vacunas de prueba se administraron a doce (12) caninos sanos, CAV2- y CPV-sero-negativos de 6 semanas 2 días a 7 semanas 2 días de edad, como una dosis subcutánea de 1 ml, administrada en un régimen de 2 dosis, con un intervalo de 3 semanas. Los doce (12) animales se dividieron en 2 grupos de prueba como sigue: Grupo 1 -rCAV2-CPV VP2 @ 8,0 logs/ml; Grupo 2 - Combinación MLV (CAV2, CDV, CPV).

Se administró solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un grupo de seis (6) caninos sanos, seronegativos para CAV2 y CPV, de 6 semanas 2 días a 7 semanas 2 días de edad, como dosis subcutánea de 1 ml, administrada en un régimen de 2 dosis, con un intervalo de 3 semanas. Este grupo se consideró Grupo 3, y sirvió como control de desafío para el estudio. Todos los animales de los Grupos 1-3 fueron desafiados por vía oro-nasal con CPV-2b virulento el 22 DPV2. Se analizaron los datos clínicos posteriores a la provocación (signos clínicos, pirexia, linfopenia, leucopenia y detección de CPV en heces).

Formulación de la vacuna:

La cepa de cultivo tisular VP2 rCAV2-CPV se diluyó con PBS 0,01M hasta la dosis objetivo indicada a continuación. No se utilizaron adyuvantes. El control positivo m Lv se formuló y liofilizó con un estabilizador SGGK en el que cada uno de los antígenos del combo era superior a la dosis inmunizante mínima para la línea de productos SOLOJEC®. Las dosis objetivo para las vacunas fueron las siguientes:

Tabla 3:

Material de provocación:

El día de la provocación, se descongelaron rápidamente tres viales del material de provocación CPV-2b congelado agitando manualmente los viales en un baño de agua a 36±2 °C. A continuación, el material se diluyó 1:10 en medio de cultivo celular hasta alcanzar la concentración deseada. El inóculo de provocación permaneció en hielo en todo momento durante los procedimientos de preparación y provocación.

Titulación del antígeno de la vacuna: CAV2-CPV VP2

Brevemente, se hicieron diluciones seriadas diez veces de la vacuna. Cada dilución se añadió a cada uno de los 5 pocillos a 100 microlitros por pocillo en placas de 96 pocillos sembradas con células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) a 2,0x105 células/ml. Se realizaron cinco réplicas para cada vacuna. Las placas se incubaron a 36 ± 1°C y 5 ± 0,5 % CO₂ durante 4±1 días. Tras el periodo de incubación, se fijaron las placas, se tiñeron solo para el vector y se leyeron. Los títulos se calcularon para el punto final del 50 % utilizando el método de Reed y Muench.

Control positivo (CPV-CDV-CAdV2)

Brevemente, se hicieron diluciones seriadas diez veces de la vacuna. Cada dilución se añadió a cada uno de los 5 pocillos a 100 microlitros por pocillo en placas de 96 pocillos sembradas con la concentración apropiada de células (CPV - MDCK a 2x105 células/ml, CDV - VERO a 2x105 células/ml, CAV2 - MDCK a 2x105 células/ml). Se realizaron cinco repeticiones para cada fracción de antígeno. Las placas se incubaron a 36 ± 1 °C y 5 ± 0,5 % de CO₂ durante 3-6 días. Tras el periodo de incubación, las placas se fijaron, se tiñeron con un conjugado directo de FA y se leyeron. Los títulos se calcularon para el punto final del 50 % utilizando el método de Reed y Muench.

Sueros

Se recogieron semanalmente hasta 10 mL de sangre total de cada perro para suero a partir del 0 DPV1. Los puntos temporales específicos incluyeron los siguientes: 0 DPV1, 7 DP^v 1, 14 DPV1, 21 DPV1 / 0 DPV2, 7 DP^v 2, y 14 DPV2. Se dejó coagular la sangre, se centrifugó a 1.000-1.300 x g para separar los sueros y se dispensó en al menos 2 alícuotas. Los sueros se almacenaron a -20°C o más fríos hasta que se evaluó el título de anticuerpos. El análisis serológico se realizó mediante un ensayo de neutralización del suero (SN). El ensayo SN se utilizó para medir los títulos de anticuerpos séricos frente a CAV2, CPV-2b y CPV-2c.

Brevemente, para la serología de CAdV2, se mezclaron diluciones seriadas de sueros inactivados por calor con volúmenes iguales de una suspensión viral (50 a 300 FAID50). La mezcla de suero y virus se incubó a 36±1°C durante una hora. A continuación, se sembraron las placas de microtitulación de 96 pocillos con células MDCK (2 x 105 células/ml a 0,1 ml/pocillo). Las placas se incubaron a 36±1°C en una incubadora humidificado con 5+0,5 % de CO₂ durante 5±1 días. Las placas se fijaron con acetona fría durante 15±5 minutos y el virus se detectó mediante inmunofluorescencia específica. La no detección del virus por inmunofluorescencia indicó la presencia de anticuerpos SN. Para determinar los títulos de anticuerpos SN, se calcularon los puntos finales de neutralización al 50 % utilizando el método de Reed y Muench.

Tabla 4 - Valores de CAV2 SN GMT

Brevemente, para la serología de CPV-2b, se mezclaron diluciones seriadas de sueros inactivados por calor con volúmenes iguales de una suspensión viral (50 a 300 FAID50). La mezcla de suero y virus se incubó a 36±1°C durante una hora. A continuación, se añadieron células de riñón de perro (DKFD-00) (2,5 x 105 células/ml a 0,1 ml/pocillo) a todos los pocilios de la placa de microtitulación de 96 pocilios. Las placas se incubaron a 36±1°C en un incubador humidificado con 5±0,5 % de CO₂ durante 6±1 días. Las placas se fijaron con acetona fría durante 15±5 minutos y el virus se detectó mediante inmunofluorescencia específica. La no detección del virus por inmunofluorescencia indicó la presencia de anticuerpos SN. Para determinar los títulos de anticuerpos SN, se calcularon los puntos finales de neutralización al 50 % utilizando el método de Reed y Muench.

Tabla 5 - CPV-2b SN Valores GMT

Brevemente, para la serología de CPV-2c, se mezclaron diluciones seriadas de sueros inactivados por calor con volúmenes iguales de una suspensión viral (50 a 300 FAID50). La mezcla de suero y virus se incubó a 36±1°C durante una hora. A continuación, se sembraron las placas de microtitulación de 96 pocillos con células MDCK (7 x 104 células/ml a 0,1 ml/pocillo). Las placas se incubaron a 36±1°C en una incubadora humidificado con 5+0,5 % de CO₂ durante 5±1 días. Las placas se fijaron con acetona fría durante 15±5 minutos y el virus se detectó mediante inmunofluorescencia específica. La no detección del virus por inmunofluorescencia indicó la presencia de anticuerpos SN. Para determinar los títulos de anticuerpos SN, se calcularon los puntos finales de neutralización al 50 % utilizando el método de Reed y Muench.

Tabla 6 - CPV-2c SN Valores GMT

Se observó una respuesta de anticuerpos distinta en relación con los 3 grupos cuando se compararon entre sí para los anticuerpos CAdV2, CPV-2b y CPV-2c.

El grupo CAdV2-CPV VP2 mostró una respuesta de anticuerpos CAdV2 mucho más fuerte a los 7 DPV1 en comparación con el grupo MLV, sin embargo, a los 14 DPV1 los valores GMT de los grupos eran similares. Los títulos de anticuerpos de ambos grupos disminuyeron a los 21 DPV1, momento en el que los animales fueron reforzados. Después del refuerzo, los niveles de anticuerpos de ambos grupos aumentaron y luego se estabilizaron gradualmente, con el grupo CAdV2-CPV VP2 estabilizándose a un título más alto que el grupo MLV. El grupo de control negativo permaneció negativo para anticuerpos CAdV2 a lo largo del estudio.

A diferencia de la respuesta de anticuerpos contra el CAdV2 de los 2 grupos vacunados, la respuesta de anticuerpos contra el CPV del grupo CAdV2-CPV VP2 fue mínima hasta la segunda vacunación, momento en el que el título de anticuerpos contra el CPV alcanzó un pico a los 7 DPV2 y luego se estabilizó hasta la provocación con CPV. Tras el desafío, la respuesta de anticuerpos del grupo CAdV2-CPV VP2 volvió a aumentar. La vacuna MLV respondió bien a la primera vacunación, con una respuesta adicional a la segunda vacunación. Los niveles de anticuerpos de CPV en el grupo MLV se nivelaron después de la segunda vacunación y no mostraron un aumento significativo durante la fase de desafío del estudio. Los animales de control negativo permanecieron negativos para anticuerpos CPV durante toda la fase de vacunación hasta la primera hemorragia después del momento de la provocación, momento en el que mostraron un título significativo de anticuerpos CPV.

Observaciones clínicas:

Se observó a todos los animales y se les tomó la temperatura rectal diariamente para la línea de base con una precisión de décimas de grado (Fahrenheit) en -2, -1 y 0 DPC. Después de la provocación, los animales fueron monitorizados diariamente hasta 14 días, en los que se tomó la temperatura rectal y se observaron los signos clínicos. Las jaulas de los animales no se limpiaron hasta que se completaron las observaciones del día.

Los signos clínicos de VPC incluían, entre otros, los siguientes: (1) Heces sanguinolentas - Heces específicas que contienen al menos un 10 % de sangre, normalmente asociadas a diarrea y/o mucosidad; las heces son típicamente de color rojo oscuro y tienen un fuerte olor a hierro característico; (2) Heces mucoides - Heces específicas que contienen al menos un 10 % de mucosidad, pueden estar asociadas a diarrea y pueden o no contener sangre. Una deposición mucoide puede o no tener textura y/o forma; (3) Diarrea - Acuosa, sin textura, charcos planos; (4) Se indicó fiebre si la temperatura rectal era de 103,4°F y al menos 1 grado Fahrenheit por encima de la temperatura basal. Se indicó hipotermia si la temperatura era de 99,5 °F o inferior y al menos un grado Fahrenheit por debajo de la temperatura basal.

Se pesó a todos los perros con una precisión de una décima de kilogramo (kg) los días 0, 7 y 14 DPC para determinar la pérdida o ganancia de peso tras la prueba. Todos los pesos se recogieron en el Registro de Peso Corporal.

Para los signos clínicos, una sola aparición de cualquier signo clínico típico de la infección por CPV, incluyendo diarrea, moco en las heces o sangre en las heces después de la provocación, definió a un animal como positivo para los signos clínicos. La inapetencia, la depresión/letargo y la presencia de vómitos también se consideraron criterios de apoyo para evaluar a un animal como positivo para la infección por parvovirus.

Cuatro (4) de los 18 animales de este estudio presentaron diarrea o vómitos en 2 DPC. Estas manifestaciones clínicas están fuera del rango típico de aparición del CPV de 3-4 DPC y pueden deberse al ayuno y/o al procedimiento de anestesia utilizado durante la provocación. No se consideran signos de infección por CPV.

El grupo rCAdV2-CPV VP2 (Grupo 1) no mostró signos de infección hasta el 10 DPC, cuando 1 de 6 animales presentó heces mucosas con sangre durante 1 día. Cabe señalar que 1 animal del grupo mostró signos de vómito a los 2 DPC, lo que está fuera del rango de aparición de CPV como se ha indicado anteriormente, y por lo tanto no se considera un signo de infección.

En el grupo MLV (Grupo 2), 2 de 6 animales mostraron signos clínicos a los 5 y 7 DPC, donde el perro n° 12 presentó heces mucosas a los 7 DPC y el perro n° 13 tuvo diarrea a los 5 y 7 DPC. También debe tenerse en cuenta que 3 animales de este grupo mostraron signos de vómito o diarrea en 2 DPC, que está fuera del rango de aparición de CPV como se ha indicado anteriormente, y por lo tanto no se consideran signos de infección.

Todos los perros del grupo de control negativo (Grupo 3) mostraron una serie de signos clínicos de moderados a graves (diarrea, heces mucoides, deshidratación, vómitos, inapetencia, heces sanguinolentas) que comenzaron a los 4 DPC y concluyeron a los 11 DPC con 4 animales que sucumbieron al CPV (3 a los 7 DPC y 1 a los 8 DPC).

Pirexia: Para la pirexia, un solo caso de pirexia (temperatura rectal de 103,4 °F y al menos 1 grado por encima del valor basal previo a la provocación) después de la provocación, categorizó a un animal como positivo.

El grupo de prueba rCAdV2-CPV VP2 (Grupo 1) presentó 1 caso de pirexia en 3 de 6 animales; 1 en 9 DPC y 2 en 12 DPC. Ninguno de los 6 animales del grupo MLV (Grupo 2) presentó pirexia. En el grupo de control negativo (Grupo 3), 3 de los 6 animales mostraron al menos 1 caso de pirexia (1 animal mostró 2 casos) entre el 4 y el 5 DPC. Dos de los 6 animales mostraron hipotermia el 7 DPC.

Peso: Para determinar la pérdida o ganancia de peso, se evaluó semanalmente el peso de cada animal restando el peso de la semana anterior.

Ningún animal del grupo de prueba rCAdV2-CPV VP2 (Grupo 1) ni del grupo de prueba MLV (Grupo 2) mostró pérdida de peso a los 7 o 14 DPC. Todos los animales del grupo de control negativo (Grupo 3) mostraron una pérdida de peso a los 7 DPC que osciló entre 0,1 y 0,8 kilogramos. Los animales que permanecieron en la prueba en el Grupo 3 a los 14 DPC experimentaron un aumento de peso a partir de los 7 DPC.

Linfopenia: Para la linfopenia, una sola aparición de linfopenia (>50 % de pérdida de la línea de base previa al desafío) después del desafío categorizó a un canino como positivo. En este estudio, el grupo de prueba rCAdV2-CPV VP2 (Grupo 1) incluyó 3 de 6 animales con al menos 1 caso de linfopenia con un inicio que osciló entre 9-12 DPC. El grupo MLV (Grupo 2) no mostró signos de linfopenia. Todos los animales del grupo de control negativo (Grupo 3) presentaron al menos 1 caso de linfopenia con inicio a los 4 DPC.

Leucopenia: Para la leucopenia, un solo caso de leucopenia (>50 % de pérdida de la línea de base previa al desafío) después del desafío categorizó a un canino como positivo. En este estudio, el grupo de prueba rCAdV2-CPV VP2 (Grupo 1) y el grupo MLV (Grupo 2) no mostraron signos de leucopenia. El grupo de control negativo (Grupo 3) incluyó 5 de 6 animales que presentaron al menos 1 caso de leucopenia con inicio a los 6 DPC.

Aislamiento del virus a partir de muestras fecales: Para el aislamiento del virus CPV fecal, un solo caso de detección del virus CPV en las heces después de la provocación categorizó a un canino como positivo. Un título de virus fecal CPV de ≤1,5 Log10FAID50/ml se registró como negativo para el aislamiento del virus fecal CPV. Todos los demás títulos registrados > 1,5 Log10FAID50/ml se clasificaron como positivos para la detección del virus fecal CPV.

En este estudio, el grupo rCAdV2-CPV VP2 (Grupo 1), incluyó 4 de 6 animales que mostraron al menos 1 día de excreción del virus iniciada entre 8 y 14 DPC. El grupo MLV (Grupo 2) no excretó cantidades detectables de virus vivo.

Todos los animales del grupo de control negativo excretaron cantidades detectables de virus en las heces a partir de los días 3 ó 4 del CPD y hasta el 9 del CPD.

Resumen de los resultados:

En resumen, los caninos, de 6 semanas 2 días a 7 semanas 2 días de edad, fueron vacunados con 1,0 ml de las siguientes vacunas en 0 DPV1 y 21 DPV1: (Grupo 1) rCAdV2-CPV VP2 = 8,0 logs/ml; (Grupo 2) MLV Combo -CAdV2 / CDV/ CPV = 4,7 / 2,6 / 3,9 logs/ml; (Grupo 3). Control de PBS. Todos los caninos vacunados fueron desafiados con CPV-2b virulento, por vía oro-nasal el 22 DPV2.

La vacuna de prueba rCAdV2-CPV VP2 no cumplió los criterios de eficacia cuando se administró en un régimen de 2 dosis a 8,0 logs por dosis. Tres (3) perros presentaron fiebre, excreción de CPV en heces y linfopenia y 1 perro presentó signos clínicos definitivos de parvovirus canino. Un cuarto perro sólo presentó excreción de CPV. La vacuna pareció proporcionar una protección inicial hasta aproximadamente 10 DPC, lo que supone un retraso en la aparición de signos clínicos de infección en comparación con los controles negativos. Se informó de un vacunado con una opacidad completa de la córnea sin causa conocida.

Ejemplo 8: preparación de composiciones farmacéuticas (vacunas) que comprenden rCAdV-EHV-4 p430/RabG (N): Preparación de composiciones farmacéuticas (vacunas) que comprenden rCAdV-EHV-4 p430/RabG (N)Vacuna: Formulación de la vacuna:

El stock de cultivo tisular rCAdV-EHV-4 pp430/RabG (N)se diluyó con 0,01M PBS hasta la dosis objetivo. No se utilizaron adyuvantes.

Inoculación de cerdos con rCAdV-EHV-4 P430/RabG (N) y evaluación de la respuesta serológica:

Diseño del estudio: Lechones vacunados y grupos control de 4-8 semanas de edad, la dosis (única/dosis) fue de 2 ml/dosis por vía intramuscular.

Para investigar sus propiedades como vacuna vectorizada en lechones jóvenes, se probó rCAdV-EHV-4 P(GG430) RABG (N) Cl en un estudio de vacunación-serología.

En concreto, se vacunó a los lechones dos veces con rCAdV-EHV-4 p430/RabG (N) C1 a una dosis de 6,7 logs en los días 0 y 21 del estudio (vacunación de dos disparos, 2x rCAdV). Un grupo no vacunado sirvió de control negativo.

Serología: Ensayos para medir la seroconversión tras la vacunación

La inducción de anticuerpos neutralizantes contra el CAdV-2 tras la vacunación se comprobó en sueros de animales vacunados una o dos veces con la vacuna rCAdV-2 p430 RabG. Los animales vacunados mostraron títulos detectables de neutralización del virus (VN) frente al CAdV2, mientras que los sueros de los grupos no vacunados no presentaban niveles detectables de anticuerpos neutralizantes del CAdV-2 (Tabla 2.). Las pruebas de inhibición rápida de focos fluorescentes (RFFIT) realizadas en sueros por el Laboratorio de Rabia de la Universidad Estatal de Kansas mostraron títulos RFFIT detectables en 3 de los 12 animales vacunados y ningún título RFFIT detectable en los grupos de control) que miden los anticuerpos neutralizantes de la rabia. También se realizaron pruebas de anticuerpos antirrábicos completos por ELISA, así como de excreción viral del CAdV.

TABLA 7

Estos resultados confirman la utilidad de los promotores EHV-4 de la presente invención en el vector CAdV al demostrar la expresión eficaz del transgén de interés (mediante la evaluación de la expresión de qué proporción del virus vacunal conduce a la expresión del transgén de interés en las células infectadas), así como el rescate viral, y la inmunogenicidad del transgén en los animales vacunados. La evaluación de la expresión ni siquiera fue posible con los vectores CAdV con casetes de expresión dirigidos por los promotores CMV. Todas las composiciones y métodos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden fabricarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de formas de realización preferidas, será evidente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en el presente documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están química y fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en el presente documento, mientras que los mismos o similares resultados se lograrían. Todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la materia se consideran dentro del espíritu, el alcance y el concepto de la invención, tal como se define en las reivindicaciones siguientes.

Referencias

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) que comprende un casete de expresión que codifica al menos un ADN heterólogo enlazado operablemente a un promotor de herpesvirus equino-4 (EHV4), en donde el promotor de herpesvirus equino-4 (EHV4) comprende la SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32 o las secuencias nucleotídicas complementarias de las mismas o un derivado funcional de las mismas o las secuencias nucleotídicas complementarias de las mismas, en donde dicha secuencia promotora conduce a la expresión de un antígeno heterólogo, en donde el derivado funcional de la secuencia promotora tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32.

2. El vector rCAdV de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ADN heterólogo codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un epítopo antigénico de interés, un factor de crecimiento, una secuencia de reconocimiento, un gen terapéutico y una proteína de fusión.

3. El vector rCAdV de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el epítopo antigénico de interés es un antígeno de un patógeno canino o felino o un antígeno derivado de un patógeno animal productor de alimentos.

4. El vector rCAdV de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el epítopo antigénico de interés se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de Morbillivirus, una glicoproteína de la rabia, la proteína de la envoltura del virus de la leucemia felina (FeLV), un antígeno del virus de la inmunodeficiencia, un antígeno de parvovirus, un antígeno de poxvirus.

5. Una composición inmunogénica o de vacuna que comprende el vector de adenovirus canino recombinante (rCAdV) de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, y un portador o diluyente aceptable para uso farmacéutico o veterinario.

6. Un método de producción de la composición inmunogénica o de vacuna para reducir la incidencia o la gravedad de uno o más signos clínicos asociados con o causados por una infección, que comprende las siguientes etapas: a. introducir en una célula huésped un vector recombinante de rCAdV de acuerdo con las reivindicaciones 1-4; b. cultivar las células infectadas en condiciones adecuadas;

c. cosechar las células infectadas y/o el vector y/o los componentes del virus;

d. opcionalmente, purificar la cosecha de la etapa (c); y

e. mezclar dicha cosecha con un portador farmacéuticamente aceptable.

7. La composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso en un método de reducción o prevención de los signos clínicos o enfermedad causados por una infección con un patógeno en un animal o para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección con un patógeno en un animal que comprende la etapa de administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición inmunogénica o vacuna.

8. La composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso en un método de inmunización de un animal contra una enfermedad clínica causada por un patógeno en dicho animal, que comprende la etapa de administrar al animal dicha composición inmunogénica o vacuna, por lo que dicha composición inmunogénica o vacuna no causa signos clínicos de infección pero es capaz de inducir una respuesta inmune que inmuniza al animal contra formas patógenas de dicho patógeno.

9. Un kit para vacunar a un animal, contra una enfermedad y/o reducir la incidencia o la gravedad de uno o más signos clínicos causados por un patógeno en un animal que comprende:

a. un dispensador capaz de administrar una vacuna a dicho animal; y

b. la composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, y

c. opcionalmente, un prospecto de instrucciones.