TWI852923B - 具不活化ul18及/或ul8之新穎馬阿爾發疱疹病毒(ehv) - Google Patents

Abstract

本發明係關於(載體)疫苗之領域，且尤其關於具有不活化UL18及/或UL8之新穎EHV。本發明進一步關於適於表現所關注基因，尤其抗原編碼序列之相關表現盒及載體。本發明之病毒載體可用於產生免疫原性組合物或疫苗。

Description

具不活化UL18及/或UL8之新穎馬阿爾發疱疹病毒(EHV)

本發明係關於(載體)疫苗之領域，且尤其係關於EHV中之UL18及/或UL8之不活化。本發明進一步係關於具有UL18及/或UL8之不活化之複製缺陷型EHV。本發明進一步係關於適於表現所關注基因、尤其抗原編碼序列之相關表現盒及載體。本發明之病毒載體可用於產生免疫原性組合物或疫苗。

馬病原體馬阿爾發疱疹病毒1 (馬流產病毒，EHV-1)屬疱疹病毒目疱疹病毒科中之亞科阿爾發疱疹病毒科水痘病毒屬。其係具有約150,000個鹼基對之雙鏈DNA基因體之大的包膜病毒。亞屬水痘病毒屬之其他重要成員係人類阿爾發疱疹病毒3 (水痘帶狀疱疹病毒)、豬阿爾發疱疹病毒1 (假狂犬病病毒)、牛阿爾發疱疹病毒1 (傳染性支氣管炎病毒)及馬阿爾發疱疹病毒4 (馬鼻肺炎病毒，EHV-4) (Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, 2015年7月；Email ratification 2016 (MSL編號30))。 EHV-1及EHV-4係地方性的且影響著全世界的馬。儘管EHV-4引起上呼吸道之大部分輕微感染，但EHV-1可引起全身感染，端視宿主之菌株及免疫狀態而定，自呼吸道症狀至流產及致死腦脊髓病之一系列疾病。目前在美國及歐洲有兩種獲得許可之針對EHV-1之改良活疫苗(MLV)，分別為Rhinomune® (Boehringer Ingelheim)及Prevaccinol® (MSD)。兩者皆含有典型減毒之EHV-1 RacH菌株，其在豬上皮細胞中傳代256次用於減毒(Ma等人 2013)。已在分子層面上研究了減毒之機制。Osterrieder等人 (1996)顯示RacH缺少orf67 (IR6)之兩個基因體拷貝，且一個拷貝之恢復足以恢復毒力。另外，RacH攜帶1283 bp缺失，從而去除超過90％之編碼免疫抑制病毒蛋白的orf1 (UL56)之編碼序列。其他突變亦可能影響減毒，但迄今為止尚未詳細研究。此皆使得RacH成為極為安全之疫苗菌株，此乃因藉由在接種疫苗之動物中傳代而毒力返強係基本不可能的(若可能)。

擁有馬阿爾發疱疹病毒1 (EHV-1)疫苗菌株RacH之整個基因體之大腸桿菌細菌人工染色體(BAC)的兩個變體pRacH及pRacH-SE已知作為載體疫苗研發之平臺。BAC pRacH-SE係基於pRacH生成，pRacH係一種最初在Klaus Osterrieder, FU Berlin之實驗室選殖之BAC。pRacH具有編碼醣蛋白II (gpII；Wellington等人，1996)之orf71 (US5)的缺失。在其位置引入BAC-載體序列及GFP表現盒。為了自pRacH拯救未經修飾之EHV-1 RacH，其必須與含有整個orf71 (US5)加側翼區之質體共轉染，使得在病毒複製過程中，BAC-載體序列部分及GFP表現盒經由同源重組有orf71 (US5)置換，使得將恢復初始RacH基因體。pRacH在本發明中經修飾，使得BAC-載體序列/GFP表現盒在細胞培養物中轉染時可自切除(SE) (Tischer等人，2007)。此改良之BAC被命名為pRacH-SE。pRacH及pRacH-SE二者皆可用作載體疫苗研發之平臺，唯一區別係pRacH-SE有利於顯著拯救orf71 (US5)修復之病毒。

已顯示，基於EHV-1 RacH之載體疫苗能夠在若干哺乳動物物種(包括豬、牛及狗)中引發免疫性(Rosas等人， 2007, Rosas等人 2008, Trapp等人2005, Said等人， 2013)。編碼病原體之抗原性蛋白之基因可由重組EHV-1 RacH表現。EHV-1-RacH基因體在大腸桿菌中以其BAC形式經操縱，且通常藉由插入轉基因表現盒經定製以表現額外蛋白質(Tischer等人，2010)。在培養之允許細胞中轉染pRacH-SE DNA時，EHV-1複製由細胞轉錄因子起始。病毒DNA聚合酶之活性導致所有BAC-載體相關序列之缺失及EHV-1 RacH基因體恢復至其初始狀態。產生之傳染性病毒與RacH無法區分。

當在大腸桿菌中例如藉由插入轉基因表現盒操縱pRacH-SE時，在允許細胞中轉染後重構之病毒將進行修飾且將表現額外基因。重組EHV-1 RacH可用作載體疫苗。

野生型EHV-1菌株在其基因體之長的獨特區段之一端具有三個開放讀碼框(orf)，稱為orf1 (UL56)、orf 2及orf3 (序列坐標1298-3614；圖1)。Orf1 (UL56)及orf3連續佈置於DNA之一條鏈上，而orf2由互補鏈編碼。疫苗菌株RacH在影響orfs 1及2之該區域具有1283 bp缺失，指示該等基因對於病毒複製係非必需的。為此，該位點用作轉基因插入位點。此插入位點稱為ORF1/3 (UL56)。

然而，通常限制可插入ORF1/3 (UL56)插入位點之轉基因的大小及數量。因此，為了增強EHV載體之能力，對於自EHV載體、尤其重組EHV-1 RacH載體插入及表現轉基因之新穎且替代方法存在未滿足之需求。

具有複製缺陷型EHV載體疫苗可能係有益的。該複製缺陷型EHV載體疫苗不能在宿主動物中複製，且不會自一種動物傳播至另一動物，因此，對於安全性或調節原因係有利的。

Barnard等人1997(Virology； 237,97-106)闡述單純疱疹病毒類型1中之一些UL8突變體顯示一定複製抑制。此外，Muylaert等人，2012 (Journal of Biological Chemistry；第287卷，第40期，第 33142-33152頁)闡述單純疱疹病毒類型1中具有DNA合成缺陷之一些UL8突變體。另外，將一些突變引入EHV中，且當相應突變引入EHV-1 UL8中時觀察到類似之表型。

CN 105641692 A闡述單純疱疹病毒類型1 (HSV-1)中UL18之完全缺失(剔除)。然而，CN 105641692 A闡述對於該HSV-1 UL18剔除，斑塊抑制率降低約80％，但複製並未完全消除。此外，CN 105535959亦研究HSV-1 UL18剔除之表型，且闡述複製及感染顯著較低且幾乎未觀察到感染。因此，關於複製，CN 105535959闡述與CN 105641692 A類似之表型(複製減少但未完全消除)。此外，CN 105535959闡述對於HSV-1 UL18剔除幾乎無感染，此對於載體疫苗(例如重組EHV疫苗)係有問題的，此乃因載體疫苗必須感染宿主細胞以提供足夠免疫反應。具體而言，感染細胞中之感染性及轉基因對於表現外源抗原之載體疫苗有效係必不可少的。因此，對於複製缺陷型(但感染性) EHV載體系統存在未滿足之需求。

為了增強EHV載體之能力，本發明提供產生複製缺陷型EHV及自EHV載體主鏈插入及表現轉基因的方式。

本發明係關於複製缺陷型EHV，其包含UL18及/或UL8之不活化及新穎之替代轉基因插入位點UL18及/或UL8，該等插入位點可用於自EHV載體插入轉基因序列及表現轉基因蛋白質。

UL8及/或UL18之不活化係完全或部分缺失、完全或部分截短、完全或部分取代、完全或部分反轉、插入。

本發明進一步係關於包含本發明之複製缺陷型EHV載體的哺乳動物宿主細胞。

本發明進一步係關於表現EHV之UL8及/或UL18或其功能部分的細胞系，其用於培養本發明之複製缺陷型EHV載體。

本發明進一步係關於包含質體之細胞系，該質體含有包含EHV之UL8及/或UL18或其功能部分之表現盒，其中細胞系表現UL8及/或UL18或其功能部分。

本發明進一步係關於產生複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)之方法，其包含根據本發明使UL18及/或UL8不活化。

本發明進一步係關於產生複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)之方法，其包含以下步驟： a) 提供野生型EHV或減毒之EHV； b)使步驟a)之EHV之UL18及/或UL8不活化，並選擇不帶有UL18及/或UL8之完整或功能部分之EHV純系； c)提供表現UL18及/或UL8或其功能部分之補充細胞系； d) 藉由將步驟b)之EHV與步驟c)之補充細胞系一起培養來獲得複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)。

本發明進一步係關於包含本發明之一或多種EHV載體的免疫原性組合物。

本發明進一步係關於對個體實施免疫之方法，其包含向該個體投與本發明之免疫原性組合物之方法。

本發明進一步係關於治療或預防有需要之個體中由病原體引起之臨床體徵的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本發明之免疫原性組合物。

因此，藉由在申請專利範圍中表徵之說明及實施例解決上述技術問題，且根據申請專利範圍實現了本發明之不同態樣。

該等性質允許基於藉由UL18及/或UL8之不活化使EHV為複製缺陷型來生成重組載體疫苗。此外，抗原可以插入該EHV載體中。來自另一插入位點ORF1/3 (UL56)及/或US4 (ORF70)之至少一種抗原或具有相似效率之平行至少兩種不同抗原可自ORF1/3 (UL56)及/或US4 (ORF70)表現。此外，來自新近闡述之UL18及/或UL8插入位點之至少一種抗原或來自新近闡述之UL18及/或UL8之具有相似效率的平行至少兩種不同抗原可表現。此外，來自新近闡述之UL18及/或UL8插入位點及該另一插入位點ORF1/3 (UL56)及/或US4 (ORF70)之抗原可表現。複製缺陷型EHV載體疫苗出於安全性及調節原因係有利的。此外，若疫苗靶標由兩種或更多種不同病原體/抗原組成，則具有已確立插入位點(如ORF1/3 (UL56)及/或US4 (ORF70))之平行新穎UL18及/或UL8插入位點的應用可顯著降低商品成本且代表超過僅表現一種抗原組分之載體的明顯優點。

序列表

本申請案含有符合37 C.F.R. 1.821 - 1.825之序列表。本申請案隨附之序列表特此以全文引用方式併入。

本發明解決了先前技術中固有之問題，且提供最先進之明顯進步。

本發明進一步係關於包含UL18及/或UL8之不活化之馬疱疹病毒(EHV)、具體而言馬阿爾發疱疹病毒、例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9、更具體而言馬阿爾發疱疹病毒1 (EHV-1)載體、最具體而言菌株RacH。

通常，本發明提供包含UL18及/或UL8之不活化之複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)載體，較佳菌株RacH。

有利地，如本文所述之EHV載體具有複製缺陷型表型。該複製缺陷型EHV載體疫苗不會在宿主動物中複製且不會自一種動物傳播至另一種動物，且因此，對於安全性或調節原因係有利的。

在本發明載體之一個態樣中，UL18不活化。

在本發明載體之另一態樣中，UL8不活化。

在本發明載體之另一態樣中，UL18及UL8不活化。 不活化UL18及UL8

在本發明載體之另一態樣中，UL18之不活化係完全或部分缺失、完全或部分截短、完全或部分取代、完全或部分反轉、插入。

在本發明載體之另一態樣中，UL8之不活化係完全或部分缺失、完全或部分截短、完全或部分取代、完全或部分反轉、插入。

在本發明載體之另一態樣中，UL18之起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:1之核苷酸1-3)不活化。

在本發明載體之另一態樣中，UL18之起始密碼子(ATG)之該不活化係缺失、取代、反轉或插入。

在本發明載體之另一態樣中，UL8之起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:1之核苷酸2-3)不活化。

在本發明載體之另一態樣中，UL8之起始密碼子(ATG)之該不活化係缺失、取代、反轉或插入。 不活化UL18

在本發明載體之另一態樣中，自UL18之起始密碼子(ATG、SEQ ID NO:1之核苷酸1-3)之5’-末端缺失、取代或反轉至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50、個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900、個核苷酸、至少925個核苷酸、至少940個核苷酸。

在本發明載體之另一態樣中，自UL18之起始密碼子(ATG、SEQ ID NO:1之核苷酸1-3)之A、T或G的至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50、個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900、個核苷酸、至少925個核苷酸、至少940個核苷酸缺失、取代或反轉。

在本發明載體之另一態樣中，UL18內至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少925個核苷酸、至少940個核苷酸缺失、取代或反轉。

在本發明載體之另一態樣中，UL18內與如SEQ ID NO:1中所述之DNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的DNA序列缺失、取代或反轉。

在本發明載體之另一態樣中，在UL18內插入至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少300個核苷酸、至少500個核苷酸、至少800個核苷酸、至少1000個核苷酸。

不活化UL8在本發明載體之另一態樣中，其中自UL8之起始密碼子(ATG、SEQ ID NO:2之核苷酸1-3)之5’-末端缺失、取代或反轉至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1000個核苷酸、至少1250個核苷酸、至少1500個核苷酸、至少1750個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2225個核苷酸。

在本發明載體之另一態樣中，自UL8之起始密碼子(ATG、SEQ ID NO:2之核苷酸1-3)之A、T或G的至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1000個核苷酸、至少1250個核苷酸、至少1500個核苷酸、至少1750個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2225個核苷酸缺失、取代或反轉。

在本發明載體之另一態樣中，UL8內至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1000個核苷酸、至少1250個核苷酸、至少1500個核苷酸、至少1750個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2225個核苷酸缺失、取代或反轉。

在本發明載體之另一態樣中，UL8內與如SEQ ID NO:2中所述之DNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的DNA序列缺失、取代或反轉。

在本發明載體之另一態樣中，在UL8內插入至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少300個核苷酸、至少500個核苷酸、至少800個核苷酸、至少1000個核苷酸。 表現盒

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含表現盒，該表現盒包含： (i) 至少一個所關注之外源核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列，其中該所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列可操作地連接至啟動子序列，及 (ii) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL18側翼區：SEQ ID NO:5及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO:9及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，及 (iii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL18側翼區：SEQ ID NO: 6及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO:10及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含表現盒，該表現盒包含： (i) 至少一個所關注之外源核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列，及 (ii) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL18側翼區：SEQ ID NO:5及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO:9及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，及 (iii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL18側翼區：SEQ ID NO: 6及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO:10及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含表現盒，該表現盒包含： (i) 至少一個所關注之外源核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列，其中所關注之該核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列可操作連接至啟動子序列，及 (ii) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL8側翼區：SEQ ID NO:11及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，及 (iii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL8側翼區：SEQ ID NO: 12及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含表現盒，該表現盒包含： (i) 至少一個所關注之外源核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列，及 (ii) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL8側翼區：SEQ ID NO:11及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，及 (iii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL8側翼區：SEQ ID NO:12及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。

在本發明載體之另一態樣中，表現盒之插入使UL18及/或UL8不活化。 藉由將表現盒插入UL18之缺失

在本發明載體之另一態樣中，將表現盒插入UL18之特徵在於RacH之UL18內約945bp部分(SEQ ID NO:1)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 藉由將表現盒插入UL8之缺失

在本發明載體之另一態樣中，將表現盒插入UL8之特徵在於RacH之UL8內約2256bp部分(SEQ ID NO:2)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 UL18之側翼區

在本發明載體之另一態樣中，EHV包含至少一個選自由以下組成之群之側翼區：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及與該等序列中之任一者70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV包含(i) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL18側翼區：SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:9，及(ii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL18側翼區：SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:10。 UL8之側翼區

在本發明載體之另一態樣中，EHV包含至少一個選自由以下組成之群之側翼區：SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12及與該等序列中之任一者70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV包含(i) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL8側翼區：SEQ ID NO:11，及(ii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL8側翼區：SEQ ID NO:12。

本發明進一步係關於包含側翼區之質體，該等側翼區用於同源重組或RED介導之重組(參見上述二者)至病毒載體基因體中之特定靶位點中，較佳重組至EHV載體、具體而言EHV-1、更具體而言RacH載體之UL18及/或UL8位點中。 重組EHV

在本發明載體之另一態樣中，該EHV載體係非天然及/或重組EHV。 複製缺陷之功能定義

在本發明載體之另一態樣中，複製缺陷型意指複製率至少降低90%。

在本發明載體之另一態樣中，複製缺陷型意指複製率至少降低95%。

在本發明載體之另一態樣中，複製缺陷型意指複製率至少降低99%。

在本發明載體之另一態樣中，複製缺陷型意指複製率至少降低99.5%。

在本發明載體之另一態樣中，複製缺陷型意指複製率至少降低99.75%。

在本發明載體之另一態樣中，複製缺陷型意指完全廢除複製率。

在本發明載體之另一態樣中，藉由TCID₅₀ 分析量測複製率。

在本發明載體之另一態樣中，複製缺陷型EHV載體仍具感染性。

有利地，如本文所述之EHV載體具有複製缺陷型表型，但仍具感染性。由於病毒疫苗必須感染宿主細胞用於提供足夠免疫反應，故感染性係必需的。具體而言，表現外來抗原之病毒載體疫苗需要感染性。

在本發明載體之另一態樣中，EHV仍具感染性，可在感染之真核細胞系中複製，但僅包裝為補充細胞系中之複製勝任病毒。有利地，仍在宿主中產生病毒DNA及病毒蛋白，且因此，本發明之複製缺陷型EHV仍誘導免疫反應及/或保護免疫性。有利地，本發明之數據顯示蛋白質表現(標記蛋白質表現)仍在本發明之複製缺陷型EHV病毒中發生。 插入UL56或US4中

在本發明載體之又一特定態樣中，該EHV載體進一步包含至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之另一基因、更佳抗原編碼序列。在一個態樣中，至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之另一基因、更佳抗原編碼序列例如經由IRES /2a肽插入相同插入位點UL18及/或UL8中。在另一態樣中，該載體或表現盒包含至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之另一基因、更佳抗原編碼序列插入另一插入位點中，較佳插入UL56及/或US4中。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含插入插入位點、較佳UL56及/或US4中之至少一個所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含UL18及/或UL8之不活化及插入UL56及/或US4中之至少一個所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含不活化UL18及至少一個插入UL56 (單價疫苗)中之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含不活化UL18及至少一個插入US4 (單價疫苗)中之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含不活化UL8及至少一個插入UL56 (單價疫苗)中之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含不活化UL8及至少一個插入US4 (單價疫苗)中之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含不活化UL18及至少一個插入UL56及US4 (二價疫苗)中之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含不活化UL8及至少一個插入UL56及US4 (二價疫苗)中之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

本發明進一步係關於馬疱疹病毒(EHV)，具體而言馬阿爾發疱疹病毒，例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9，更具體而言馬阿爾發疱疹病毒1 (EHV-1)載體，最具體而言菌株RacH，其包含插入UL18及/或UL8中之所關注之第一核苷酸序列或基因、較佳抗原編碼序列及插入至少一個其他插入位點(較佳UL56 (ORF1/3)及/或US4 (ORF70))之至少一個所關注之又一核苷酸序列或基因、較佳另一抗原編碼序列。在本發明之該EHV載體之特定態樣中，至少兩個所關注之基因可操作連接至調節序列、較佳啟動子序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含插入兩個或更多個插入位點之兩個或更多個所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL18及/或UL8及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入UL56及/或US4中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL18及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入UL56中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL18及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入US4中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL18及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入UL56及US4中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL8及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入UL56中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL8及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入US4中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL8及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入UL56及US4中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL18及UL8及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入UL56中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL18及UL8及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入US4中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含藉由插入至少一個插入之所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列不活化之UL18及UL8及至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列(或包含其之表現盒)及插入UL56及US4中之至少一個所關注之又一核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。 US4 (ORF70)

在本發明載體之另一態樣中，插入US4中之特徵在於US4中之部分缺失、截短、取代、修飾或諸如此類，其中US5保留功能。

在本發明載體之另一態樣中，插入US4中之特徵在於RacH之US4內約801bp部分(SEQ ID NO:24)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。

在本發明載體之特定態樣中，插入US4 (ORF70)中之特徵在於US4 (ORF70)之部分缺失、截短、取代、修飾或諸如此類，其中US5 (ORF71)保持功能。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含至少一個選自由以下組成之群之側翼區：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22及與該等序列中之任一者70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體包含(i) 至少一個選自由以下組成之群之左US4側翼區：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21，及(ii) 至少一個選自由以下組成之群之右US4側翼區：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:22。 核苷酸序列及病原體

在本發明載體之另一態樣中，該所關注之核苷酸序列係重組及/或異源及/或外源的。

在本發明載體之另一態樣中，該抗原編碼序列係關於感染產食性動物(例如豬、牛或家禽)或伴侶動物(例如貓、馬或狗)之病原體。

在本發明載體之另一態樣中，抗原編碼序列係來自選自但不限於以下清單之病原體：施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus)、A型流行性感冒病毒、豬呼吸及生殖症候群病毒、豬環狀病毒、典型豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、E型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、狂犬病病毒、貓麻疹病毒、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae)。

在本發明之載體或表現盒之特定態樣中，該抗原編碼序列係關於感染豬之病原體。在又一特定態樣中，該病原體係豬A型流行性感冒病毒(IAV)。在又一特定態樣中，該抗原係血球凝集素(HA)抗原，尤其該血球凝集素抗原係源自A型流行性感冒病毒。舉例而言，A型流行性感冒病毒係A型流行性感冒病毒(A/豬/意大利/116114/2010(H1N2))、A型流行性感冒病毒(A/豬/意大利/7680/2001(H3N2))、A型流行性感冒病毒(A/豬/Gent/132/2005(H1N1))及/或A型流行性感冒病毒(A/豬/意大利/4675/2003(H1N2))。在又一特定態樣中，該抗原包含由SEQ ID NO SEQ ID NO:14編碼之序列或由其組成。在另一特定態樣中，該抗原包含編碼與如SEQ ID NO:14中所述之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列的序列或由其組成。 調節序列及啟動子

在本發明載體之另一態樣中，所關注之基因可操作連接至調節序列、較佳啟動子序列。

在本發明載體之另一態樣中，可操作連接至所關注之序列或基因的啟動子序列係選自但不限於由以下組成之群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子、聚合酶II啟動子、功能片段。

在本發明載體之另一態樣中，可操作連接至至少一個所關注之基因的啟動子序列係MCMV或其功能片段或其互補核苷酸序列。

在本發明載體之另一態樣中，可操作連接至至少一個所關注之基因的啟動子序列係UL8或UL18之內源啟動子。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體係選自由以下組成之群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。

在本發明載體之另一態樣中，EHV載體係EHV-1、較佳RacH。

本發明進一步係關於本發明之EHV載體，其包含： a.插入UL18及/或UL8中之所關注之第一核苷酸序列、較佳所關注之基因、例如抗原編碼序列， b.所關注之該第一核苷酸序列視情況與調節核酸序列/啟動子序列可操作連接， c. 所關注之該第一核苷酸序列視情況與(又一)調節核酸(例如多腺苷酸化序列、較佳71pA或BGHpA)可操作連接。

在特定態樣中，EHV載體進一步包含 a.插入第二插入位點(較佳UL56及/或US4)中之所關注之第二核苷酸序列、較佳所關注之第二基因、例如抗原編碼序列， b.所關注之該第二核苷酸序列視情況與調節核酸序列/啟動子序列可操作連接， c. 所關注之該第二核苷酸序列視情況與調節核酸(例如多腺苷酸化序列、較佳71pA或BGHpA)可操作連接。

本發明進一步係關於本發明之EHV載體，其包含： a.不活化UL18及/或UL8； b.插入UL56及/或US4中之所關注之第一核苷酸序列、較佳所關注之基因、例如抗原編碼序列， c.所關注之該第一核苷酸序列視情況與調節核酸序列/啟動子序列可操作連接， d. 所關注之該第一核苷酸序列視情況與(又一)調節核酸(例如多腺苷酸化序列、較佳71pA或BGHpA)可操作連接。 宿主細胞

此外，本發明提供特徵在於包含如本文所述之複製缺陷型EHV載體的哺乳動物宿主細胞。

本發明亦係關於特徵在於包含本發明之載體的哺乳動物宿主細胞。

本發明進一步係關於製備宿主細胞之方法，其特徵在於以下步驟： a.用本發明之載體感染本發明之哺乳動物宿主細胞， b.在適宜條件下培養感染之細胞， c.視情況收穫該宿主細胞。

本發明進一步係關於本發明之載體或本發明之哺乳動物宿主細胞的用途，其用於製造免疫原性組合物或疫苗。 補充細胞系

此外，本發明提供表現EHV之UL8及/或UL18或其功能部分的細胞系，其用於培養如本文所述之複製缺陷型EHV載體。

此外，本發明提供包含質體之細胞系，該質體含有包含EHV之UL8及/或UL18或其功能部分之表現盒，其中細胞系表現UL8及/或UL18或其功能部分。

在本發明之細胞系之另一態樣中，細胞系係選自但不限於以下之群：Vero細胞、RK-13 (兔腎)、ST (豬睪丸)、MDCK (Madin-Darby犬腎)、MDBK (Madin-Darby牛腎)及馬皮膚細胞(NBL-6)。

在本發明之細胞系之另一態樣中，細胞系係ST細胞系。 產生方法

此外，本發明提供產生複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)之方法，其包含使如本文所述之UL18及/或UL8不活化。

此外，本發明提供產生複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)之方法，其包含以下步驟： a) 提供野生型EHV或減毒之EHV； b)使步驟a)之EHV之UL18及/或UL8不活化，並選擇不帶有UL18及/或UL8之完整或功能部分之EHV純系； c)提供表現UL18及/或UL8或其功能部分之補充細胞系； d) 藉由將步驟b)之EHV與步驟c)之補充細胞系一起培養來獲得複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)。

本發明進一步係關於產生本發明之載體之方法，其包含： a.將所關注之第一核苷酸序列、較佳所關注之基因、例如抗原編碼序列插入UL18及/或UL8中， b.視情況使所關注之該第一核苷酸序列與調節核酸序列/啟動子序列可操作連接， c. 視情況使所關注之該第一核苷酸序列與(又一)調節核酸(例如多腺苷酸化序列、較佳71pA或BGHpA)可操作連接。

在特定態樣中，該方法進一步包含 a.a.將所關注之第二核苷酸序列、較佳所關注之第二基因、例如抗原編碼序列插入第二插入位點(較佳UL56及/或US4)中， b.視情況使所關注之該第二核苷酸序列與調節核酸序列/啟動子序列可操作連接， c.視情況使所關注之該第二核苷酸序列與調節核酸(例如多腺苷酸化序列、較佳71pA或BGHpA)可操作連接。

本發明進一步係關於產生本發明之載體之方法，其包含： a.使EHV之UL18及/或UL8不活化； b.將所關注之第一核苷酸序列、較佳所關注之基因、例如抗原編碼序列插入UL56及/或US4中， c.視情況使所關注之該第一核苷酸序列與調節核酸序列/啟動子序列可操作連接， d. 視情況使所關注之該第一核苷酸序列與(又一)調節核酸(例如多腺苷酸化序列、較佳71pA或BGHpA)可操作連接。

本發明進一步係關於製備用於降低與感染相關或由感染引起之一或多種臨床體徵之發病率或嚴重程度的免疫原性組合物或疫苗之方法，其包含以下步驟： a.用本發明之載體感染本發明之補充細胞系， b.在適宜條件下培養感染之細胞， c.收集感染之細胞培養物， d.視情況純化步驟c)之該等收集之感染之細胞培養物 e.視情況混合該收集之感染之細胞培養物與醫藥上可接受之載劑。 疫苗

此外，本發明提供包含一或多種如本文所述之EHV載體的免疫原性組合物。

在本發明之免疫原性組合物之另一態樣中，該免疫原性組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。

在本發明之免疫原性組合物之另一態樣中，該免疫原性組合物係疫苗。

因此，本發明進一步係關於包含以下之免疫原性組合物： a.本發明之載體，及/或 b.由本發明之載體(例如病毒、經修飾之活病毒、類病毒顆粒(VLP)或諸如此類)表現之多肽，及 c.視情況醫藥或獸醫上可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於經口、真皮內、肌內或鼻內施加， 較佳地該免疫原性組合物包含病毒。在特定態樣中，該病毒係傳染性病毒。

本發明進一步係關於包含以下之疫苗或醫藥組合物： a.本發明之載體，及/或 b.由本發明之載體(例如病毒、經修飾之活病毒、類病毒顆粒(VLP)或諸如此類)表現之多肽，及 c.醫藥或獸醫上可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於經口、真皮內、肌內或鼻內施加， d.視情況該疫苗進一步包含佐劑。 治療及使用方法

此外，本發明提供對個體進行免疫之方法，其包含向該個體投與如本文所述之免疫原性組合物。

此外，本發明提供治療或預防有需要之個體中由病原體引起之臨床體徵的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如本文所述之免疫原性組合物。

本發明提供如本文所述之免疫原性組合物，其用於對個體進行免疫之方法中，該方法包含向該個體投與該免疫原性組合物。

本發明提供如本文所述之免疫原性組合物，其用於治療或預防有需要之個體中由病原體引起之臨床體徵的方法中，該方法包含向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物。

在本發明之方法或用途之另一態樣中，該個體係選自由豬、牛、家禽、貓、馬及狗組成之清單。

在本發明之方法或用途之另一態樣中，免疫原性組合物投與一次。

在本發明之方法或用途之另一態樣中，以兩個或更多個劑量投與免疫原性組合物。

本發明亦係關於套組，其用於針對與動物中之病原體相關之疾病對動物(較佳產食性動物(例如豬或牛)或伴侶動物(例如貓、馬或狗))進行疫苗接種，及/或降低與病原體相關或由病原體引起之一或多種臨床體徵的發病率或嚴重程度，該套組包含： a)能夠將疫苗投與該動物之分配器；及 b)本發明之免疫原性組合物或疫苗，及 c)視情況散頁說明書。

本發明進一步係關於由本發明之載體、視情況轉染試劑及散頁說明書組成之套組。定義

除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與提交時熟習本發明所屬技術領域者通常所瞭解含義相同之含義。術語之含義及範疇應當明確；然而，在任何潛在的模糊性之情況下，本文提供之定義先於任何辭典或外在定義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語將包括複數且複數術語將包括單數。在本文中，除非另有說明，否則使用「或」意指及「/或」。此外，使用術語「包括(including)」以及其他形式(例如「includes」及「included」)不具有限制性。本文中提及之所有專利及出版物皆以引用方式併入本文中。

除非另外指示，否則本發明之實踐將採用熟習此項技術者熟知之病毒學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習用技術。該等技術完全闡釋於文獻中。參見例如Sambrook， Fritsch及Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第I、II及III卷，第2版(1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D. N. Glover編輯，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編輯， 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney編輯，1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris及S. Angal編輯，IRL Press at Oxford University Press)；及Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯，1986, Blackwell Scientific Publications)。

在詳細闡述本發明之前，應理解本發明不限於特定DNA、多肽序列或過程參數，因此當然可變化。亦應理解，本文所用術語僅為闡述本發明特定實施例之目的，而非意欲限制。必須注意，除非內容另外明確說明，否則本說明書及所附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，提及「一種抗原」包括兩種或更多種抗原之混合物，提及「一種賦形劑」包括兩種或更多種賦形劑之混合物，及諸如此類。分子生物學定義

如業內已知，術語「載體」係指用於將遺傳物質傳遞至宿主細胞之聚核苷酸構築體，通常為質體或細菌人造染色體。載體可為例如細菌、病毒、噬菌體、細菌人造染色體、黏接質體(cosmid)或質體。本文使用之載體係由DNA或RNA組成或含有DNA或RNA。在一些實施例中，載體係由DNA構成。在一些實施例中，載體係傳染性病毒。該病毒載體含有病毒基因體，其以攜帶外源基因之方式運作，該外源基因不論在細胞培養中或在宿主動物中，在病毒載體之複製中，均沒有功能。根據本發明之特定態樣，載體可用於各種態樣，例如僅傳遞遺傳物質，用於轉染宿主細胞或生物體，用作疫苗(例如DNA疫苗)或用於基因表現目的。基因表現是闡述細胞中蛋白質之生物合成由稱為基因之特定聚核苷酸序列引導的術語。在特定態樣中，載體可為「表現載體」，當其存在於適當環境中時，其係能夠引導該載體攜帶之一或多種基因編碼之蛋白質表現的載體。

載體及製備及/或使用載體(重組體)進行表現之方法可藉由以下中揭示之方法或類似於該等方法來進行：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」，PNAS USA 93: 11349-11353，1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety」，PNAS USA 93: 11341-11348，1996年10月；Smith等人，美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編輯), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人，「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165頁；Pennock等人，「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」，Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，第406頁；EPA0 370 573；於1986年10月16日提出之美國申請案第920,197號；EP專利公開案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors」，PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors」，PNAS USA 93: 11313-11318，1996年10月；Robertson等人，「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」，PNAS USA 93: 11334-11340，1996年10月；Frolov等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications」，PNAS USA 93: 11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；容許之美國申請案第08/675,556號及第08/675,566號，二者皆係於1996年7月3日提出申請(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992，「Adenovirus as cloning vectors」，Seminars in Virology (第3卷)第237-52頁，1993；Ballay等人， EMBO Journal，第4卷，第3861-65頁，Graham, Tibtech 8, 85-87，1990年4月；Prevec等人，J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人 (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420, 1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature，及尤其Furth等人，Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors。亦參見WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人，美國專利第4,945,050號；Fischbach等人 (Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷， 第271-283頁(1997)，(DNA載體細胞)；Szoka等人，美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞中之方法)；McCormick等人，美國專利第5,677,178號(細胞病變病毒之使用)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文引用之其他文件。

術語「病毒載體」闡述藉由重組DNA技術操縱之經遺傳修飾之病毒，使得其進入宿主細胞產生特異性生物活性，例如由載體攜帶之轉基因的表現。在特定態樣中，轉基因係抗原。病毒載體在靶細胞、組織或生物體中可複製勝任或可不複製勝任。

病毒載體之產生可使用業內熟知之任何適宜基因工程技術來完成，包括但不限於限制內核酸酶消化、連接、轉變、質體純化、DNA測序、細胞培養物轉染之標準技術，例如如以下中所述：Sambrook等人 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))或K. Maramorosch及H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))。

病毒載體可納入來自任何已知生物體之基因體的序列。序列可以其天然形式納入或可以任何方式經修飾以獲得期望活性。舉例而言，序列可包含插入、缺失或取代。

病毒載體可包括兩種或更多種所關注之蛋白質的編碼區。舉例而言，病毒載體可包括所關注之第一蛋白質之編碼區及所關注之第二蛋白質之編碼區。所關注之第一蛋白質及所關注之第二蛋白質可相同或不同。在一些實施例中，病毒載體可包括所關注之第三或第四蛋白質之編碼區。所關注之第三及第四蛋白質可相同或不同。由一種病毒載體編碼之兩種或更多種所關注之蛋白質的總長度可變。舉例而言，兩種或更多種蛋白質之總長度可為至少約200個胺基酸。至少約250個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約800個胺基酸或更長。

較佳病毒載體包括(例如)源自EHV-1或EHV-4或其他水痘病毒(如PrV (偽狂犬病病毒)或BHV-1 (牛疱疹病毒1))的疱疹病毒載體。

根據本發明之特定態樣，術語「病毒載體」或「病毒構築體」係指源自病毒之重組病毒構築體，其選自疱疹病毒科，例如EHV-1、EHV-4。較佳病毒載體包括(例如)源自EHV-1或EHV-4之疱疹病毒載體。

術語「病毒載體」及「病毒構築體」可互換使用。

如本文所用術語「構築體」係指人工產生之重組核酸，例如質體、BAC或重組病毒。

術語「質體」係指獨立於細菌宿主細胞內之細菌染色體複製的細胞質DNA。在本發明之特定態樣中，術語「質體」及/或「轉移質體」係指用於構築(例如)表現盒用於插入病毒載體中之重組DNA技術的元件。在另一特定態樣中，術語「質體」可用於指定可用於DNA疫苗接種目的之質體。

如本文所用術語「核酸」及「聚核苷酸」可互換使用且係指任何核酸。

如本文所用之術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「聚核苷酸」、「聚核苷酸序列」、「RNA序列」或「DNA序列」係指寡核苷酸、核苷酸或聚核苷酸及其片段及部分，且係指基因體或合成來源之DNA或RNA，其可為單鏈或雙鏈且代表有義鏈或反義鏈。序列可為非編碼序列、編碼序列或二者之混合物。本發明之核酸序列可使用熟習此項技術者熟知之標準技術來製備。

術語「核酸」及「聚核苷酸」亦具體而言包括由除5個生物鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外之鹼基構成之核酸。

術語「調節性核酸」、「調節元件」及「表現控制元件」可互換使用，且係指可影響特定宿主生物體中可操作連接之編碼序列之表現的核酸分子。該等術語廣泛用於並涵蓋促進或調節轉錄之所有元件，包括啟動子、啟動子序列、RNA聚合酶及轉錄因子之基本相互作用所需之核心元件、上游元件、增強子及反應元件。原核生物中之實例性調節元件包括啟動子、操縱子序列及核糖體結合位點。真核細胞中使用之調節元件可包括但不限於轉錄及轉譯控制序列，例如啟動子、增強子、剪接信號、多腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號、內部核糖體進入位點(IRES)、小核糖核酸病毒2A序列及諸如此類，其提供及/或調節宿主細胞中編碼序列之表現及/或編碼多肽之產生。

「內部核糖體進入位點」或「IRES」闡述獨立於IRES之基因5´在功能上促進轉譯起始並容許兩個順反子(開放讀碼框)自動物細胞中之單個轉錄物轉譯的序列。IRES提供獨立之核糖體進入位點用於在其下游立即轉譯開放讀碼框。不同於可為多順反子、亦即編碼自mRNA順序轉譯之幾種不同多肽的細菌mRNA，動物細胞之大部分mRNA係單順反子，且編碼僅一種多肽之合成。在真核細胞中具有多順反子轉錄物，轉譯將自最5´轉譯起始位點起始，終止於第一終止密碼子，且轉錄物將自核糖體釋放，導致僅轉譯mRNA中之第一編碼多肽。在真核細胞中，具有可操作連接至轉錄物中之第二或後續開放讀碼框之IRES的多順反子轉錄物容許該下游開放讀碼框之順序轉譯以產生由相同轉錄物編碼之兩種或更多種多肽。IRES可具有不同長度且來自各種來源，例如，腦心肌炎病毒(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒、FMDV或脊髓灰白質炎病毒(PV))或C型肝炎病毒(HCV)。各種IRES序列及其在載體構築中之用途已經闡述且為業內所熟知。下游編碼序列可在不負面地影響下游基因之表現的任何距離可操作連接至IRES之3'端。IRES與下游基因開始之間之最佳或允許的距離可以容易地藉由改變距離及量測隨距離變化之表現來測定。

術語「2a」或「2a肽」係指闡述為2a及「2a樣」之短寡肽序列，其用作能夠藉由定義為核糖體跳躍之過程介導蛋白質之間之共轉譯裂解的連接體。可使用該等2a及「2a樣」序列(來自小核糖核酸病毒科及其他病毒或細胞序列)將多個基因序列濃縮成單個基因，確保其在相同細胞內共表現(參見Luke及Ryan，2013)。

如本文所用術語「啟動子」或「啟動子序列」係指允許RNA聚合酶結合並引導基因轉錄之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因之5'非編碼區中，靠近基因之轉錄起始位點。啟動子內用於起始轉錄之序列元件通常特徵在於具有共有核苷酸序列。啟動子之實例包括(但不限於)來自細菌、酵母、植物、病毒及動物(例如哺乳動物(包括馬、豬、牛及人類))、鳥或昆蟲之啟動子。啟動子可為誘導型、抑制型及/或組成型。誘導型啟動子因應於培養條件之一些變化(例如溫度變化)，在其控制下啟動增加之自DNA之轉錄程度(Ptashne, 2014)。熟習此項技術者熟知之啟動子之實例係(例如) SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子、聚合酶II啟動子。

術語「增強子」表示在順式位置中作用於啟動子之活性且因此刺激與該啟動子功能連接之基因或編碼序列的轉錄的聚核苷酸序列。不同於啟動子，增強子之效應與位置及取向無關，且因此其可以位於轉錄單元之前面或後面，在內含子內，或甚至在編碼區內。增強子可位於轉錄單位之鄰近區域並且距離啟動子相當遠。亦可與啟動子具有物理及功能重疊。熟習此項技術者將明瞭來自各種來源的多種增強子(並且保藏於諸如基因庫等數據庫中，例如SV40增強子、CMV增強子、多瘤增強子、腺病毒增強子)，其用作獨立元件或選殖於聚核苷酸序列內之元件(例如，保藏於ATCC或來自商業及個人來源)。多種啟動子序列亦含有增強子序列，例如經常使用之CMV啟動子。人類CMV增強子係迄今為止鑑別之最強的增強子之一。誘導型增強子之一個實例係金屬硫蛋白增強子，其可由糖皮質激素或重金屬刺激。

術語「互補核苷酸序列」闡述聚核苷酸之兩條配對鏈之一條鏈，例如DNA或RNA。互補鏈之核苷酸序列與其配對鏈之核苷酸序列成鏡像，使得對於每一腺苷，其含有胸腺激素(或對於RNA為尿嘧啶)，對於每一鳥嘌呤為胞嘧啶，且反之亦然。例如，5’-GCATAC-3’之互補核苷酸序列係3’-CGTATG-5’或對於RNA為3’-CGUAUG-5’。

如本文所用術語「基因」、「所關注之基因」具有相同含義且係指編碼所關注之產物之任何長度的聚核苷酸序列。基因可進一步包含編碼序列之前之調控序列(5'非編碼或非轉譯序列)及隨後之調控序列(3'非編碼或非轉譯序列)。選擇之序列可係全長或截短的、融合或標記之基因，且可為cDNA、基因體DNA或DNA片段。通常理解，編碼多肽或RNA之基因體DNA可包括自成熟信使RNA (mRNA)剪接之非編碼區(即內含子)且因此不存在於編碼相同多肽或RNA之cDNA中。其可為天然序列，即天然形式，或可經突變，或包含源自不同來源之序列或視需要進行其他修飾。該等修飾包括密碼子最佳化，以最佳化所選宿主細胞中之密碼子使用或標記。此外，其可包括去除或添加順式作用位點，例如(隱藏)剪接供體、受體位點及分支點、多腺苷酸化信號、TATA-盒、chi位點、核糖體進入位點、重複序列、二級結構(例如莖環)、轉錄因子或其他調節因子之結合位點、限制性內切酶位點等，僅給出幾個但並非限制性實例。選擇之序列可編碼分泌之、細胞質、核、膜結合之或細胞表面多肽。

如本文所用之術語「所關注之核苷酸序列」係比所關注之基因更通用之術語，此乃因其不一定包含基因，但可包含基因之元件或部分或其他遺傳資訊(例ori (複製起點))。所關注之核苷酸序列可為任何DNA或RNA序列，與其是否包含編碼序列無關。

「開放讀碼框」或「ORF」係指包含轉譯起始信號或起始密碼子(例如ATG或AUG)及終止密碼子之一定長度的核酸序列(DNA或RNA)，且可潛在轉譯成多肽序列。

術語「UL (獨特長的)」係用於闡述EHV基因體、較佳EHV-1基因體之獨特長的區段的縮寫。

術語「US (獨特短的)」係用於闡述EHV基因體、較佳EHV-1基因體之獨特短的區段的縮寫。

術語「轉錄」闡述細胞中mRNA之生物合成。

如本文所用之術語「表現」係指宿主細胞內核酸序列之轉錄及/或轉譯。根據本發明之特定態樣，術語「表現」係指宿主細胞內異源及/或外源核酸序列之轉錄及/或轉譯。在宿主細胞中期望產物之表現程度可基於存在於細胞中之相應RNA或mRNA的量或由所選序列編碼之期望多肽的量來測定。舉例而言，可藉由北方印跡雜交、核糖核酸酶RNA保護、與細胞RNA原位雜交或藉由RTqPCR (反轉錄，之後定量PCR)來定量自所選序列轉錄之mRNA。自所選序列表現之蛋白質可藉由各種方法定量，例如藉由ELISA、西方墨點法、藉由放射免疫分析、藉由免疫沈澱、藉由分析蛋白質之生物活性或藉由蛋白質之免疫染色、之後FACS分析。

術語「表現盒」或「轉錄單元」或「表現單元」定義含有一或多個欲轉錄基因之載體、構築體或聚核苷酸序列內的區，其中編碼轉錄基因之核苷酸序列以及含有包含於表現盒內之調節元件的聚核苷酸序列彼此可操作地連接。其係自啟動子轉錄，且轉錄係由至少一個聚腺苷酸化信號終止。在一個特定態樣中，其係自一個單一啟動子轉錄。因此，不同基因至少係轉錄相關聯的。可自每一轉錄單元(多順反子轉錄單元)轉錄及表現一種以上蛋白質或產物。每一轉錄單元將包含轉錄及轉譯包含於單位內之任何所選序列所需之調節元件。且每一轉錄單元可含有相同或不同調節元件。舉例而言，每一轉錄單元可含有相同終止子，IRES元件或內含子可用於轉錄單元內基因之功能性連接。載體或聚核苷酸序列可含有一個以上轉錄單元。

術語「增加之表現」、「增加之效價或生產力」或「改良之表現或生產力」意指藉由與適宜對照相比(例如由cDNA編碼之蛋白質相對於由含內含子之基因編碼之蛋白質)，例如編碼治療性蛋白質之基因之引入宿主細胞中之異源及/或外源序列之表現、合成或分泌增加。若本發明之細胞係根據本文闡述之本發明方法培養，且若此細胞之比生產力或效價增加至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍，則效價或生產力增加。若本發明之細胞係根據本文闡述之本發明方法培養，且若此細胞之比生產力或效價增加至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少3倍，則效價或生產力亦增加。若本發明之細胞係根據本文闡述之本發明方法培養，且若此細胞之比生產力或效價增加至少1.2倍至5倍、較佳1.5倍至5倍、更佳2倍至5倍，則特定而言效價或生產力亦增加。「增加之表現」亦可意指更多細胞實際上表現所關注之基因/序列。舉例而言，增加之表現可能意味著本發明之新啟動子相對於其他啟動子在病毒複製週期期間更長時間段有活性。

增加之表現、效價或生產力可藉由使用本發明之異源載體獲得。此可與諸如FACS輔助選擇重組宿主細胞等其他方法組合，該重組宿主細胞含有作為額外可選標記物之一或多種螢光蛋白(例如GFP)或細胞表面標記物。亦可使用獲得增加之表現之其他方法及不同方法之組合，其係(例如)基於使用順式活性元件來操縱染色質結構(例如LCR、UCOE、EASE、隔離件、S/MAR、STAR元件)、使用(人工)轉錄因子、用天然或合成試劑處理細胞以上調內源或異源及/或外源基因表現、改良mRNA或蛋白質之穩定性(半衰期)、改良mRNA轉譯之啟動、藉由使用游離型質體(基於使用病毒序列作為複製起點，例如SV40、多瘤、腺病毒、EBV或BPV)增加基因劑量、使用擴增促進序列或基於DNA多聯體之活體外擴增系統。

術語「獲得」可包含熟習此項技術者已知之分離及/或純化步驟，較佳使用沈澱、管柱等。

用以量測「增加之表現」之分析係基於LC-MS/MS之蛋白質量測，例如多反應監測(MRM)；基於抗體之檢測方法，例如西方墨點、斑點墨點或免疫擴散及流式細胞術；及藉由血球凝集分析量測生物活性。

藉由對各別啟動子控制下轉錄之mRNA進行量化間接量測「啟動子活性」。藉由RTqPCR相對於內源標準量化mRNA。

術語「病毒效價」係每體積之病毒製劑之感染單位的量度。病毒效價係生物程序中之終點並定義為平行實施之一定比例之測試顯示效應的稀釋度(Reed及Muench，1938)。具體而言，每毫升之組織培養物感染劑量50 (TCID50/ml)給出病毒製劑之稀釋度，其中感染與該稀釋度平行接種之50%數量之細胞培養物。

「轉錄調節元件」通常包含欲表現之基因序列上游之啟動子、轉錄起始及終止位點及多腺苷酸化信號。

術語「轉錄起始位點」係指構築體中對應於納入一級轉錄物(即mRNA前體)中之第一核酸的核酸。轉錄起始位點可能與啟動子序列重疊。

「終止信號」或「終止子」或「多腺苷酸化信號」或「多A」或「轉錄終止位點」或「轉錄終止元件」係引起在真核mRNA之3'端之特異性位點裂解及在裂解之3'端轉錄後納入約100 - 200個腺嘌呤核苷酸之序列(多A尾)，且因此引起RNA聚合酶終止轉錄。多腺苷酸化信號包含在裂解位點上游約10-30個核苷酸之序列AATAAA及位於下游之序列。已知各種多腺苷酸化元件，例如tk多A、SV40晚期及早期多A、BGH多A (闡述於例如美國專利第5,122,458號中)或倉鼠生長激素多A (WO2010010107)。

「轉譯調節元件」包含欲表現之每一個別多肽之轉譯起始位點(AUG)、終止密碼子及多A信號。一些構築體中可包括內部核糖體進入位點(IRES)。為了最佳化表現，可能建議去除、添加或改變欲表現之核酸序列之5'及/或3'非轉譯區，以消除任何潛在之額外不適當的替代性轉譯起始密碼子或可能在轉錄或轉譯程度上干擾或降低表現之其他序列。可緊接起始密碼子之上游插入共有核糖體結合位點(Kozak序列)，以增強轉譯並由此表現。此核糖體結合位點附近增加之A/U含量促進更有效之核糖體結合。

根據定義，插入宿主細胞中之每個聚核苷酸序列或每個基因以及由此編碼之個別蛋白質或RNA當其來自不同(病毒)物種時，被稱為相對於宿主細胞之「外源」、「外源序列」、「外源基因」、「外源編碼序列」。因此，鑒於EHV-1病毒載體，基於EHV-4之啟動子係外源的。如本文關於所關注之序列或基因(例如抗原)所使用之術語「外源」意指所關注之該序列或基因、具體而言該抗原在其天然物質之背景外表現。因此，來自豬IAV之HA抗原相對於EHV-1載體係外源抗原之一個實例。因此，源自除EHV-1外之不同病原體之任何序列係所關注之外源序列或基因或本發明之特定態樣之抗原。

根據定義，插入宿主細胞中之每個聚核苷酸序列或每個基因以及由此編碼之各別蛋白質或RNA被稱為相對於宿主細胞之「異源」、「異源序列」、「異源基因」、「異源編碼序列」、「轉基因」或「異源蛋白質」。即使欲引入之序列或欲引入之基因與宿主細胞之內源序列或內源基因一致，此亦適用。舉例而言，根據定義，相對於EHV-4野生型病毒中於不同位點或以經修飾形式引入EHV-4病毒載體中的EHV-4啟動子序列係異源序列。如本文關於所關注之序列或基因(例如抗原)所使用之術語「異源」意指所關注之該序列或基因、具體而言該抗原在其天然亞物質之背景外表現。因此，因此，所關注之任何非EHV-1特異性序列或基因、例如抗原、例如除EHV-1外之任何馬阿爾發疱疹病毒之抗原(例如EHV-3、EHV-8)係所關注之異源序列或基因或本發明之特定態樣之抗原。

術語「非天然」意指在此背景下天然存在之所關注之任何序列或基因(例如抗原)，例如來自不同物種之雜交序列或所關注之序列或基因(例如抗原)，或由於人造突變、插入、缺失或諸如此類而並非自然產物的所關注之序列或基因(例如抗原)。

在本發明之整個說明書中，術語「重組」可與術語「非天然」、「異源」及「外源」交換使用。因此，「重組」蛋白質係由異源或外源聚核苷酸序列表現之蛋白質。關於病毒使用之術語重組意指藉由人工操縱病毒基因體產生之病毒。包含異源或外源序列(例如外源抗原編碼序列)之病毒係重組病毒。術語重組病毒與術語非天然病毒可互換使用。

因此，術語「異源載體」意指包含異源或外源聚核苷酸序列之載體。術語「重組載體」意指包含異源或重組聚核苷酸序列之載體。

如本文所用術語「可操作連接」用於闡述調節元件與基因或其編碼區之間之連結。通常，基因表現係在一或多個調節元件(例如但不限於組成型或可誘導型啟動子、組織特異性調節元件及增強子)控制下。據稱基因或編碼區「可操作連接至」或「以可操作方式連接至」或「可操作締合至」調節元件意指基因或編碼區受到調節元件控制或影響。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子係可操作連接至編碼序列。 此外，在本說明書之範疇內，術語「功能連接」(「functional linking」)、「功能性連接」(「functionally linked」)或「可操作連接」意指兩個或更多個核酸序列或序列元件以允許其依所預期方式運作的方式定位。舉例而言，若啟動子/增強子或終止子能夠控制或調節依順式位置連接之基因序列的轉錄，則啟動子/增強子或終止子係與編碼基因序列呈功能性連接。通常但並非必需的，功能性連接之DNA序列係鄰接，且若需要接合兩個多肽編碼區或在分泌信號肽之情形下，則係鄰接並在讀碼框中。然而，儘管可操作連接之啟動子通常位於上游，或者可操作連接之終止子通常位於編碼序列下游，但不一定與之鄰接。增強子不必係鄰接的，只要其增加編碼序列之轉錄即可。為此，其可位於編碼序列之上游或下游且甚至位於一定距離處。若多腺苷酸化位點位於編碼序列之3'端，則多腺苷酸化位點可操作連接至編碼序列，使得轉錄通過編碼序列進入聚腺苷酸化信號。連接係藉由業內已知之重組方法來實現，例如藉由在適當限制性位點或平端連接或藉由使用融合PCR方法。若不存在適宜限制位點，則可按照習用實踐使用合成的寡核苷酸連接體或銜接子。

因此，術語啟動子序列之「功能片段」或「功能衍生物」意指片段或衍生物仍然影響啟動子活性。如何評價啟動子活性之功能測試為熟習此項技術者所熟知(Bustin 2000，Nolan等人 2006)。該功能分析之實例性實施例包括(例如)啟動子動力學實驗。將經攜帶表現盒之載體病毒感染之細胞培育不同時間，其中啟動子或其片段引導報導基因轉基因之轉錄。總RNA係自感染後不同時間收集之試樣製備。藉由DNAse I消化而破壞污染DNA後，RNA經逆轉錄。一個重複試樣在添加反轉錄酶(RT)下進行處理，第二重複在不添加RT下進行處理，以展現自RNA製備成功去除污染DNA。純化所得cDNA並在習用PCR中用作模板。僅在添加RT下處理之試樣將產生PCR產物。隨後可將該等cDNA用於使用報導基因轉基因之引子及平行使用病毒載體之必需基因(內標準基因)之qPCR中，其轉錄為感染及複製效率提供內標準。使用內標準基因之qPCR值在不同構築體及感染後時間之間正規化報導基因之qPCR值。此可解釋不同啟動子及其片段之啟動子活性。

如本文所用之「序列同源性」係指測定兩個序列之相關性的方法。為了測定序列同源性，將兩個或更多個序列優化比對，且若需要，引入間隙。然而，與「序列一致性」相反，當測定序列同源性時，將保守胺基酸取代計數為匹配。

換言之，為了獲得與參照序列具有95%序列同源性之可比較之多肽或聚核苷酸，參照序列中之85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.9%之胺基酸殘基或核苷酸必須與另一胺基酸或核苷酸匹配或包含經另一胺基酸或核苷酸之保守取代。或者，可向參照序列中插入佔參照序列中總胺基酸殘基或核苷酸(不包括保守取代)多達15%、較佳多達10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳多達5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之數目的胺基酸或核苷酸。較佳地，同源序列至少包含50個、甚至更佳100個、甚至更佳250個、甚至更佳500個核苷酸之段。

術語「序列一致性」已為業內所知且係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個聚核苷酸序列、亦即參照序列與欲與參照序列進行比較之給定序列之間之關係。藉由在將序列最佳地比對以產生最高序列相似性程度之後比較給定序列與參考序列來測定序列一致性，如藉由該等序列串之間之匹配所測定。在該比對後，基於逐個位置來確定序列一致性，例如，若核苷酸或胺基酸殘基在一個位置一致，則該等序列在該位置「一致」。然後將該等位置一致性之總數除以參考序列中之核苷酸或殘基之總數以得到序列一致性%。序列一致性可藉由已知方法容易地計算，該等方法包括但不限於以下中所述之彼等：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.編輯，Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編輯，Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin, A.M.及Griffin, H. G.編輯，Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編輯，M. Stockton Press, New York (1991)；及Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)，其教示以引用方式併入本文中。設計用於測定序列一致性之較佳方法以得到所測試序列之間之最大匹配。將測定序列一致性之方法編成測定給定序列間之序列一致性之公開獲得之電腦程式。該等程式之實例包括(但不限於) GCG程式包(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)。BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual, Altschul, S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)，其教示以引用方式併入本文中)。該等程式最佳地使用默認空位權重比對序列以在給定序列與參考序列之間產生最高序列一致性程度。作為闡釋，對於聚核苷酸具有與參照核苷酸序列具有至少(例如) 85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.9%「序列一致性」之核苷酸序列而言，預計給定聚核苷酸之核苷酸序列與參照序列一致，只是給定聚核苷酸序列可包括多達15個、較佳多達10個、甚至更佳多個5個點突變/參照核苷酸序列之100個核苷酸。換言之，在具有相對於參照核苷酸序列具有至少85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.9%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸中，參照序列中高達15%、較佳10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或可向參照序列插入佔參照序列中總核苷酸之高達15%、較佳10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之數目的核苷酸。參照序列之該等突變可發生在參照核苷酸序列之5’或3’末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參照序列中之各核苷酸之間或在參照序列內呈一或多個鄰接基團形式。類似地，對於多肽具有與參照胺基酸序列具有至少(例如) 85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定胺基酸序列而言，預計多肽之給定胺基酸序列與參照序列一致，只是給定多肽序列可包括高達15個、較佳高達10、9、8、7、6個、甚至更佳高達5、4、3、2、1個胺基酸改變/參照胺基酸序列之100個胺基酸。換言之，為了獲得與參照胺基酸序列具有至少85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定多肽序列，參照序列中高達15%、較佳高達10%、9%、8%、7%、甚至更佳高達5%、4%、3%、2%、1%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代，或可向參照序列中插入佔參照序列中胺基酸殘基之總數之高達15%、較佳高達10%、9%、8%、7%、甚至更佳高達5%、4%、3%、2%、1%之數目的胺基酸。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。然而，在測定序列一致性時，並不包括保守取代作為匹配。

術語「序列一致性」或「一致性%」在本文中可互換使用。出於本發明目的，此處定義為了測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性%，將序列進行比對以達到最佳比較目的(例如，可在第一胺基酸或核酸之序列中引入空位，用於與第二胺基酸或核酸序列進行最佳比對)。然後比較相應胺基酸或核苷酸位置之胺基酸或核苷酸殘基。當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同之胺基酸或核苷酸殘基佔據時，則分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性%隨該等序列所共用之一致位置數變化(即，一致性% =一致位置數/總位置(即重疊位置)數× 100)。較佳地，兩個序列之長度相同。

序列比較可在比較之兩個序列之整個長度上實施，或在兩個序列之片段上實施。通常，比較將在所比較之兩個序列之整個長度上實施。然而，序列一致性可在(例如) 20、50、100或更多個鄰接胺基酸殘基之區上實施。

熟習此項技術者將明瞭以下事實：若干不同電腦程式可用於測定兩個序列之間之同源性。舉例而言，兩個序列之間之序列比較及一致性%之測定可使用數學算法來完成。在較佳實施例中，使用Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))算法測定兩個胺基酸或核酸序列之間之一致性%，該算法納入Accelrys GCG軟體包中之GAP程式中，使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣、及16、14、12、10、8、6或4之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重。熟習此項技術者應瞭解，所有該等不同參數將產生略微不同之結果，但在使用不同算法時，兩個序列之總體一致性%並不顯著改變。

可使用本發明之蛋白質序列或核酸序列作為「詢問序列」來實施針對公共數據庫之檢索，以例如鑑別其他家族成員或相關序列。該等搜索可使用Altschul等人，(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10之BLASTN及BLASTP程式(2.0版)來實施。BLAST蛋白搜索可利用BLASTP程式、評分=50、字長=3來實施，以獲得與本發明之蛋白質分子同源之胺基酸序列。為了獲得用於比較目的之空位化比對，可如以下中所述利用空位化BLAST：Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res.25(17): 3389-3402. 在利用BLAST及空位化BLAST程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之默認參數。參見國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)主頁EHV-1 及 EHV-4/ 重組載體技術定義

術語「馬科動物」或「馬」(「equine」或「equin」)意指或屬馬科動物科，其包括馬、驢及斑馬，較佳地馬。另外，術語「馬科動物」或或「馬」(「equine」或「equin」)亦涵蓋馬科動物科之成員之雜種(例如騾子、駃騠等)。

「疱疹病毒」或「疱疹病毒載體」係指疱疹病毒目疱疹病毒科中之物種。

術語「馬科動物疱疹病毒載體」或「馬科動物疱疹病毒」或「EHV」意指影響馬之疱疹病毒科之成員。迄今為止，已經鑑別了八種不同物種之馬科動物疱疹病毒，其中五種屬亞科阿爾發疱疹病毒科(EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)且三種屬丙型疱疹病毒亞科。(Virus Taxonomy: 2015年發佈EC 47, London, UK，2015年7月；電子郵件批准2016 (MSL編號30)

術語「EHV-1」意指馬阿爾發疱疹病毒1，即疱疹病毒科阿爾發疱疹病毒亞科屬水痘病毒屬亞屬之成員。EHV-1之非限制性參照序列將為(例如)野生型EHV-1菌株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)或RacH (Hübert 1996)。

術語EHV-4意指馬阿爾發疱疹病毒4，即疱疹病毒科阿爾發疱疹病毒亞科屬水痘病毒屬亞屬之成員。

術語「插入UL18中」或「插入ORF43中」意指在編碼馬阿爾發疱疹病毒1開放讀碼框43 (UL18)之位置將DNA片段插入基因體DNA中。在本發明之特定態樣中，所提及之插入導致ORF43 (UL18)之(945bp)完全缺失。

術語「插入UL8中」或「插入ORF54中」意指在編碼馬阿爾發疱疹病毒1開放讀碼框54 (UL8)之位置將DNA片段插入基因體DNA中。在本發明之特定態樣中，所提及之插入導致ORF 54 (UL8)之(2256bp)缺失。

術語「插入ORF70中」或「插入US4中」意指在編碼馬阿爾發疱疹病毒1開放讀碼框70 (US4)之位置將DNA片段插入基因體DNA中。在本發明之特定態樣中，所提及之插入導致缺失ORF70 (US4)之801個5’鹼基對，使得3’端之其餘423bp完整，但消除orf70 (US4)基因產物醣蛋白G之表現。顯示包括EHV-1在內之若干阿爾發疱疹病毒之醣蛋白G可自經感染細胞分泌並藉由結合促發炎細胞介素用作免疫調節蛋白。與具有完整醣蛋白G表現之野生型EHV-1相比，消除其在病毒載體中之表現應增加病毒感染之免疫原性。

術語「插入ORF1/3中」或「插入UL56中」意指在疫苗菌株EHV-1 RacH之減毒程序期間藉由傳代意外缺失，包含90% ORF1及整個ORF2之1283 bp片段丟失的位置將DNA片段插入病毒基因體中。選擇此插入位點，此乃因自此位置之轉基因之表現可能干擾病毒複製的可能性預計將非常低。

術語「不活化」係指UL8 (ORF54)及/或UL18 (ORF43)內之突變。術語突變包含編碼該等蛋白質之病毒DNA中之修飾，其導致該編碼之蛋白質之改變。術語突變係關於(但不限於)取代(置換一個或若干核苷酸/鹼基對)、缺失(去除一個、若干或所有核苷酸/鹼基對)及/或插入(添加一個或若干核苷酸/鹼基對)。因此，術語突變包含包括但不限於以下之突變：點突變(單一核苷酸突變)或較大突變，其中例如缺失(部分缺失)或缺失(完全缺失)編碼(及/或非編碼)核苷酸/鹼基對之部分，取代所有編碼(及/或非編碼)核苷酸/鹼基對及/或插入額外編碼(及/或非編碼)核苷酸/鹼基對。應理解，術語突變包含編碼核苷酸/鹼基對內之突變、非編碼核苷酸/鹼基對內、例如調節性核苷酸/鹼基對內之突變，及編碼核苷酸/鹼基對及非編碼核苷酸/鹼基對內之突變。此外，術語突變亦包含核苷酸/鹼基對(編碼及/或非編碼)之反轉，例如一部分或所有編碼核苷酸/鹼基對之反轉或一部分或所有非編碼核苷酸/鹼基對之反轉或其組合。此外，術語突變亦包含核苷酸/鹼基對(編碼及/或非編碼)之再定位，例如一部分或所有編碼核苷酸/鹼基對之再定位或一部分或所有非編碼核苷酸/鹼基對之再定位或其組合。如本文所用，突變可為單一突變或若干突變，因此，術語「突變」經常用於且係指單一突變及若干突變。該等突變可由於編碼序列之改變引起改良表現之蛋白質。然而，術語突變為熟習此項技術者所熟知且熟習此項技術者可產生突變而無需贅言。

此外，術語「不活化」涵蓋UL18及/或UL8 RNA及/或蛋白之降低(或消除)之表現。應理解，降低之表現涵蓋降低之RNA轉錄以及降低之蛋白質表現。較佳地，與野生型EHV病毒或在補充細胞系中培養之本發明之EHV病毒的表現相比，UL18及/或UL8 RNA及/或蛋白質之表現由RNA及/或蛋白質降低5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-99%或更多。更佳地，與野生型EHV病毒或在補充細胞系中培養之本發明之EHV病毒的表現相比，UL18及/或UL8 RNA及/或蛋白質之表現由RNA及/或蛋白質降低50-100%、60-100%、70-100%、80-100%或90-100%。甚至更佳地，與野生型EHV病毒或在補充細胞系中培養之本發明之EHV病毒的表現相比，UL18及/或UL8 RNA及/或蛋白質之表現由RNA及/或蛋白質在本發明之EHV中降低80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。

術語「完全或部分缺失、取代或反轉」涵蓋完全或部分缺失、完全或部分取代及完全或部分反轉。術語「完全」意指自起始密碼子至ORF (UL)之停止影響整個ORF (UL)。較佳地，UL18及/或UL8係完全缺失、取代或反轉。然而，術語「部分」意指僅整個ORF (UL)之一部分受影響。較佳地，UL18及/或UL8係部分缺失、取代或反轉。

術語「自起始密碼子之5’-末端」係指在5’-末端之ORF (UL)之缺失、取代或反轉。如本文所用術語應理解為該缺失、取代或反轉影響(包括) ORF之起始密碼子。因此，保留ORF之3’-末端之部分，而缺失ORF之5’-末端區之部分。然而，自5’-末端之該缺失、取代或反轉可在相應蛋白質內引起一或多個胺基酸之缺失，或在ORF中引起框移，此產生不同於野生型蛋白質之編碼區。然而，5’-末端之該缺失、取代或反轉可完全不引起蛋白質之表現，此乃因起始密碼子經截短。

如本文所用術語「自起始密碼子之A、T或G」應理解為該缺失、取代或反轉可以A或T或G開始。倘若缺失以A開始，則A缺失。然而，若來自A之缺失包含缺失兩個或更多個核苷酸，則T亦缺失。此外，若來自A之缺失包含缺失三個或更多個核苷酸，則A、T及G缺失。然而，應理解，若缺失以T開始，則T缺失，而仍保留ATG之A。此外，若缺失以G開始，則G缺失，而仍保留ATG之A及T。

如本文所用術語「在UL18內」或「在UL8內」應理解為核苷酸之該缺失、取代或反轉可在該ORF (UL)內之任何地方發生。因此，核苷酸之該缺失、取代或反轉可影響僅UL8 (ORF54)及/或UL18 (ORF43)之5’-末端、僅UL8 (ORF54)及/或UL18 (ORF43)之3’-末端或該ORF (UL)之其餘核苷酸或其任何組合。

術語「複製缺陷」為熟習此項技術者所熟知。一般而言，該術語意指病毒在宿主(例如哺乳動物細胞或細胞系)中之複製降低。較佳地，複製降低至少90%、較佳95%、較佳97.5%、甚至更佳99.5%、甚至更佳99.75%且最佳100%。倘若複製降低100%，則完全消除複製。較佳地，複製與相同物種之非複製缺陷型病毒相當。較佳地，複製與在補體細胞或細胞系中培養之複製缺陷型病毒之複製相當。較佳地，本發明之複製缺陷型EHV仍係傳染性的且複製，但可僅包裝為補體細胞或細胞系中之複製勝任病毒。較佳地，在宿主中仍產生病毒DNA及病毒蛋白，且因此，本發明之複製缺陷型EHV仍誘導免疫反應及/或保護免疫性。

術語「補充細胞系」或「補充細胞」為熟習此項技術者所熟知。在本發明中，補充細胞系係細胞表現EHV (較佳EHV-1)之UL8及/或UL18 (或其功能部分)的細胞系。由於複製缺陷型EHV載體包含不活化之UL8及/或UL18，故複製缺陷型EHV在宿主細胞(例如哺乳動物細胞或細胞系)中不複製，但在表現UL8及/或UL18之相應補充細胞系中複製。

術語「TCID₅₀ 」為熟習此項技術者所熟知。一般而言，此終點稀釋分析量化殺死50%感染細胞或在50%接種之組織培養細胞中產生細胞病變效應所需的病毒之量。量測TCID₅₀ 之分析為熟習此項技術者所熟知，例如Spearman-Karber或Reed-Muench方法(Reed及Muench, 1938)。

術語「感染性」意指向宿主或宿主細胞中引入病毒。疫苗定義

「免疫原性或免疫組合物」係指包含至少一種抗原或其免疫原性部分之物質的組合物，其引發宿主中細胞或抗體介導之對組合物之免疫反應的免疫反應。

本文使用之術語「抗原」在業內係眾所周知的，且包括具有免疫原性之物質(即免疫原)，以及誘導免疫不反應性或無反應性(即身體之防禦機制對外來物質無反應)的物質。如本文所用術語「抗原」欲指含有或包含表位之全長蛋白質以及其肽片段。

術語「產食性動物」意指用於人類消費之動物，例如豬、牛、家禽、魚及諸如此類，較佳地產食性動物意指豬及牛，最佳地豬。

如本文所用之「免疫原性組合物」可以指多肽或蛋白質，例如引發如本文所述之免疫反應之病毒表面蛋白。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指蛋白質或多肽之片段或截短及/或取代形式，其包括一或多個表位且由此引發本文所述之免疫反應。一般而言，該等截短及/或取代之形式或片段將包含來自全長蛋白質之至少六個鄰接胺基酸。該等片段可使用任一數目之業內熟知之表位定位技術來鑑別。參見(例如) Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷(Glenn E. Morris編輯，1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。舉例而言，線性表位可藉由在固體載體上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白質分子之部分)、及使肽與抗體反應同時肽仍連接至載體來測定。該等技術係業內已知及經闡述的，參見例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；及Geysen等人 (1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類似地，例如藉由例如x射線結晶學及二維核磁共振，藉由測定胺基酸之空間構形來容易地鑑別構形表位。參見Epitope Mapping Protocols，上文文獻。該定義內亦包括合成抗原，例如多表位、側接表位及其他重組或合成衍生之抗原。參見(例如) Bergmann等人 (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann等人 (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；及Gardner等人，(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998年6月28日至7月3日。(其教示及內容全部以引用方式併入本文中。)

術語「免疫」係關於藉由以下方式達成之主動免疫：向欲進行免疫之產食性動物投與免疫原性組合物，藉此引起針對該免疫原性組合物中所包括之抗原之免疫學反應。

本文所用之術語"有需要(in need或of need)"意指，投與/治療與加強或改良健康或臨床體徵或對於接受本發明之免疫原性組合物之動物之健康的任一其他正性醫學效應。

如本文所用術語"疫苗"係指包含至少一種在動物中誘導免疫反應之免疫活性組分且可能但不一定包含一或多種增強活性組分之免疫活性之額外組分的醫藥組合物。疫苗可另外包含醫藥組合物典型之其他組分。藉由區別，疫苗之免疫活性組分可包含呈其初始形式之完整病毒顆粒或所謂經修飾活疫苗(MLV)中之減毒顆粒或藉由適當方法在所謂殺死之疫苗(KV)中不活化之顆粒。在另一形式中，疫苗之免疫活性組分可包含生物體之適當元件(亞單位疫苗)，其中該等元件係藉由以下方式生成：藉由破壞整個顆粒或含有該等顆粒之生長培養物及視情況隨後之純化步驟從而產生期望結構，或藉由合成方法，包括利用基於例如細菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種之適宜系統的適當操縱加上視情況隨後之分離及純化程序，或藉由使用適宜醫藥組合物直接納入遺傳物質來誘導需要疫苗之動物中的合成過程(聚核苷酸疫苗接種)。疫苗可包含上述元件中之一種或同時一種以上。如在本發明之特定態樣中所用，「疫苗」係指活疫苗或活病毒，亦稱為重組疫苗。在本發明之另一特定態樣中，「疫苗」係指包括類病毒顆粒(VLP)在內之不活化或殺死之病毒。因此，疫苗可為亞單位疫苗或殺死(KV)或不活化之疫苗。

術語「感染複數(M.O.I.)」闡述多少感染單元，例如，每個細胞使用病毒製劑之TCID50以感染培養之細胞。舉例而言，M.O.I.為0.01意味著對於培養容器中之每100個細胞，接種一個感染單位。

術語「DNA疫苗接種」或「聚核苷酸疫苗接種」意指使用適宜醫藥組合物直接接種遺傳物質。

不活化之各種物理及化學方法為業內已知。術語「不活化」係指先前有毒力或無毒力之病毒或細菌經輻照(紫外線(UV)、X射線、電子束或γ輻射)、加熱或化學處理以不活化或殺死該病毒或細菌，同時保留其免疫原性。適宜不活化劑包括β-丙內酯、二元或β-或乙醯基-次乙亞胺、戊二醛、臭氧及福馬林(formalin) (甲醛)。

對於由福馬林或甲醛不活化，通常將甲醛與水及甲醇混合以產生福馬林。添加甲醇可防止不活化過程中之降解或交叉反應。一個實施例使用約0.1%至1%之37%甲醛溶液來不活化病毒或細菌。至關重要的是，調節福馬林之量以確保材料不活化，但不會多至發生高劑量之副作用。

更特定而言，術語「不活化」在病毒中意指該病毒不能在活體內或活體外複製，且分別，術語「不活化」在細菌中意指細菌不能在活體內或活體外複製。舉例而言，術語「不活化」可以指已經在活體外繁殖且然後使用化學或物理方式使其不活化以使其不再能夠複製的病毒。在另一實例中，術語「不活化」可以指已經繁殖且然後使用化學或物理方式使其不活化之細菌，從而產生細菌、細菌之片段或組分之懸浮液，例如產生可用作疫苗之組分之菌苗。

如本文所用術語「不活化」、「殺死」或「KV」可互換使用。

術語「活疫苗」係指包含活生物體或複製勝任病毒或病毒載體之疫苗。

「醫藥組合物」基本上由一或多種能夠改變接受投藥之生物體或在生物體中或上面存活之生物體之生理(例如免疫)功能的成分所組成。該術語包括(但不限於)抗生素或抗寄生蟲劑、以及通常用於達成某些其他目的(例如但不限於加工性狀、不孕性、穩定性、經腸或非經腸途徑(例如經口、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、真皮內或其他適宜途徑)投與組合物之可行性、投藥後耐受性、或控制釋放性質)之其他成分。該醫藥組合物之一個非限制性實例(僅供闡釋目的)可如下製備：將感染之細胞培養物之細胞培養物上清液與穩定劑(例如亞精胺(spermidine)及/或牛血清白蛋白(BSA))混合，隨後混合物進行凍乾或藉由其他方法脫水。隨後在疫苗接種之前，混合物在水溶液(例如，生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS))或非水溶液(例如，油乳液、基於鋁之佐劑)中再水合。

如本文所用之「醫藥上或獸醫上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗佈劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。在一些較佳實施例且尤指彼等包括凍乾之免疫原性組合物中，用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。

在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。如本文所用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。具體而言，乳液可基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典型)；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(具體而言異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；酸或含有直鏈烷基之醇之酯，更具體而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，具體而言異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子表面活性劑，具體而言：山梨醇酐之酯、二縮甘露醇之酯(例如，無水甘露醇油酸酯)、二醇之酯、聚甘油之酯、丙二醇之酯，及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸(其視情況經乙氧基化)之酯，及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具體而言Pluronic產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (編輯Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, 第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570 (1997)。佐劑實例係由M. Powell及M. Newman編輯之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，Plenum Press, 1995之第147頁上闡述之SPT乳液、及同一本書第183頁上闡述之乳液MF59。

佐劑之另一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利的佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸尤其與糖或多元醇之聚烯基醚交聯的聚合物。該等化合物以術語卡波姆(carbomer)為人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參照美國專利第2,909,462號，其闡述了與具有至少3個、較佳不超過8個羥基之多羥基化化合物交聯的該等丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團置換。較佳基團係含有2至4個碳原子之彼等，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團本身可含有其他取代基，例如甲基。以名稱CARBOPOL® (BF Goodrich, Ohio, USA)銷售之產品特別適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。其中，可以提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳使用CARBOPOL® 971P。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，尤其係共聚物EMA (Monsanto)，其係馬來酸酐與乙烯之共聚物。該等聚合物在水中之溶解產生酸溶液，其將被中和、較佳至生理pH，以產生將引入免疫原性、免疫或疫苗組合物本身之佐劑溶液。

其他適宜佐劑尤其包括(但不限於)RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(重組或其他)之熱不穩定腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽、或其天然或重組細胞介素或其類似物或內源細胞介素釋放之刺激劑等。

預計佐劑可以每劑量約100 μg至約10 mg之量、較佳以每劑量約100 μg至約10 mg之量、更佳以每劑量約500 μg至約5 mg之量、甚至更佳以每劑量約750 µg至約2.5 mg之劑量、且最佳以每劑量約1 mg之量添加。或者，以最終產物之體積計，佐劑可為約0.01%至50%之濃度，較佳約2%至30%之濃度，更佳為約5%至25%之濃度，仍更佳為約7%至22%之濃度，且最佳為10%至20%之濃度。

「稀釋劑」可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。

「分離」意指自其天然狀態「由人手」改變，即若其在自然界中存在，則其已經改變或自其初始環境中移出，或兩者兼而有之。舉例而言，天然存在於活生物體中之聚核苷酸或多肽並非「分離的」，但自其天然狀態之共存物質分離之相同聚核苷酸或多肽係「分離的」，如本文中使用之術語。

「減毒」意指降低病原體之毒力。在本發明中，「減毒」與「無毒力」同義。在本發明中，減毒病毒係毒力已降低從而不會引起感染之臨床體徵但能夠在目標哺乳動物中誘導免疫反應者，但亦可意指與感染非減毒病毒或病原體且未接受減毒病毒之動物之「對照組」相比在感染減毒病毒、尤其所主張之EHV-1 RacH病毒載體之動物中臨床體徵之發生率或嚴重程度有所降低。在此上下文中，術語「降低(reduce/reduced)」意指與如上文所定義之對照組相比降低至少10%、較佳25%、甚至更佳50%、仍更佳60%、甚至更佳70%、仍更佳80%、甚至更佳90%且最佳100%。因此，減毒之無毒力病原體(例如所主張之減毒之病毒載體、尤其所主張之EHV-1 (較佳地RacH)病毒載體)適於產生經修飾之活疫苗(MLV)或經修飾之活的免疫原性組合物。

術語「治療及/或預防」係指減小畜群中感染之發病率或降低由特定感染引起或與特定感染相關之臨床體徵之嚴重程度。因此，術語「治療及/或預防」亦係指與動物尚未接受如本文所提供之免疫原性組合物之動物群相比，在動物已接受有效量之該免疫原性組合物之動物群中，減小畜群中感染病原體之動物數量或降低通常與感染相關或由感染引起之臨床體徵的嚴重程度。

「治療及/或預防」通常涉及將有效量之本發明之免疫原性組合物投與需要此一治療/預防或可自其獲益之動物或動物畜群。術語「治療」係指在動物或畜群之至少一些動物已感染該病原體且其中該等動物已顯示由該病原體感染引起或與其相關之一些臨床體徵後，投與有效量之免疫原性組合物。術語「預防」係指在動物經病原體任何感染之前或至少在該動物或動物群中沒有動物不顯示由該病原體感染引起或與其相關之任一臨床體徵之前，向該動物投與。術語「預防」及「防止」在本申請案中可互換使用。

如本文所用術語「臨床體徵」係指動物感染病原體之體徵。感染之臨床體徵取決於所選病原體。該等臨床體徵之實例包括但不限於呼吸窘迫、耳炎、被毛粗亂、微熱、抑鬱症及食欲減小。 然而，臨床體徵亦包括但不限於可自活動物直接觀察到之臨床體徵。可自活動物直接觀察到之臨床體徵之實例包括流鼻涕與眼淚、嗜睡、咳嗽、哮鳴、重擊、高熱、失重、去水、跛行、消瘦、皮膚蒼白、羸弱及諸如此類。

在本文中，「有效劑量」意指(但不限於)引起或能夠引發免疫反應之抗原在投與該抗原之動物中造成臨床症狀減少之量。

如本文所用，術語「有效量」在組合物中意指能夠誘導免疫反應，降低動物疾病之發生率或減少感染的嚴重程度或疾病事件的免疫原性組合物之量。特別地，有效量係指每劑量之菌落形成單位(CFU)。或者，在療法中，術語「有效量」係指療法之量足以降低或改善疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重程度或持續時間，防止疾病或病症進展，引起疾病或病症消退，防止與疾病或病症相關之一或多種症狀之復發、發展、發作或進展，或增強或改良另一療法或治療劑之預防或治療。

「免疫反應」或「免疫學反應」意指(但不限於)對所關注之(免疫原性)組合物或疫苗發生細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，免疫或免疫學反應包括(但不限於)以下效應中之一或多者：產生或活化特異性針對所關注組合物或疫苗中所包括之一或多種抗原的抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，宿主將展現治療性或保護性免疫(記憶)反應，使得對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度降低。該保護將由症狀數量、症狀嚴重程度之降低，或無與病原體感染相關之一或多種症狀、病毒血症發作之延遲、病毒持久性降低、整體病毒負荷之降低及/或病毒排出之降低證明。

「保護抵抗疾病」、「保護免疫性」、「功能免疫性」、「臨床症狀之減少」、「中和抗體之誘導/產生及/或血清轉化」及類似片語意指藉由投與本發明之一或多種治療性組合物或其組合產生之針對疾病或病況之部分或完全反應，其導致比未免疫個體暴露於疾病或感染所預期少之有害效應。亦即，在接種疫苗個體中減輕感染之有害效應之嚴重程度。在接種疫苗個體中可減少、減慢或可能完全預防感染。在本文中，若意指完全預防感染，將特別指出。若未指出完全預防，則該術語包括部分預防。

在本文中，「臨床體徵之發生率及/或嚴重程度之降低」或「臨床症狀之減少」意指(但不限於)與野生型感染相比，減少組中感染個體之數量、減少或消除展現感染之臨床體徵之個體之數量、或降低一或多個個體中存在之任何臨床體徵之嚴重程度。舉例而言，其應該指病原體負荷之任何減少、病原體脫落、病原體傳播減少或瘧疾之症狀之任何臨床體徵減少。較佳地，與未接受本發明之治療性組合物且被感染之個體相比，接受該組合物之一或多個個體之該等臨床體徵減少至少10%。更佳地，接受本發明組合物之個體之臨床體徵減少至少20%、較佳至少30%、更佳至少40%且甚至更佳至少50%。

術語「增加之保護」在本文中意指(但不限於)相對於未接種疫苗之個體對照組，接種疫苗之個體組中一或多種與由傳染原感染相關之臨床症狀在統計學上顯著減輕。術語「臨床症狀之統計學顯著減輕」意指(但不限於)接種疫苗之個體組之至少一種臨床症狀的發病頻率比在攻擊傳染原後未接種疫苗之對照組中低至少10%、較佳20%、更佳30%、甚至更佳50%且甚至更佳70%。

「持久保護」將指持續至少3週、但更佳至少3個月、仍更佳至少6個月之「改良之效能」。在牲畜之情形下，最佳地，持久保護應持續直至動物出售用於肉類之平均年齡。

術語由病毒誘導之「病毒血症之減輕」意指(但不限於)進入動物血流之病毒減少，其中與未接受本發明組合物且可被感染之動物相比，接受該組合物之動物之血清中的病毒血症程度、即每毫升血清之病毒DNA或RNA拷貝數或每公合血清之噬菌斑形成菌落數減少至少50%。更佳地，接受本發明組合物之動物之病毒血症程度降低至少90%、較佳至少99.9%、更佳至少99.99%、且甚至更佳至少99.999%。

術語「病原體」為熟習此項技術者所熟知。然而，術語「病原體」包含細菌及病毒。術語「病原體」包含病原體，例如施馬倫貝格病毒、A型流行性感冒病毒、豬呼吸及生殖症候群病毒、豬環狀病毒、典型豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、E型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、狂犬病病毒、貓麻疹病毒、破傷風梭菌、結核分枝桿菌、胸膜肺炎放線桿菌。

術語「產食性動物」意指用於人類消費之動物，例如豬、牛、家禽、魚及諸如此類，較佳豬。

術語「伴侶動物」包含諸如貓、馬或狗等動物。

如本文所用術語「病毒血症」特定而言應理解為病毒顆粒在動物、特定而言哺乳動物、鳥或昆蟲之血流中複製及/或循環之病況。

「安全性」係指在疫苗接種後，在接種疫苗之動物中不存在不良後果，包括但不限於：基於病毒之疫苗潛在地逆轉成有毒力、臨床上顯著之副作用，例如持久性、全身性疾病或在疫苗投與位點不可接受之發炎。

如本文所用術語「疫苗接種」(「vaccination」或「vaccinating」)或其變化形式意指(但不限於)包括投與本發明之免疫原性組合物之過程，在投與動物時，其引發或能夠引發(直接或間接)該動物之免疫反應。

在本發明上下文中，「死亡率」係指由感染引起之死亡，且包括感染如此嚴重以致於將動物安樂死以防止痛苦並為其生命提供人道結局的情況。調配物

投與組合物之個體較佳係動物，包括(但不限於)牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠及大鼠，最佳哺乳動物係豬。

本發明之調配物包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。疫苗包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。調配物應適合於投與方式。

免疫原性組合物(若需要)亦可含有極少量之潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末。經口調配物可包括標準載劑，例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。 治療方法

較佳投與途徑包括(但不限於)鼻內、經口、真皮內及肌內。最佳呈單一劑量之於飲用水中投與係合意的。熟習此項技術者將認識到，本發明組合物亦可以一個、兩個或更多個劑量藉由其他投與途徑來投與。舉例而言，該等其他途徑包括皮下、皮內、腹膜內，且根據治療之期望持續時間及有效性，本發明組合物可以例如每日計一次或若干次、亦間歇地以不同劑量(例如約10³ 至10⁸ TCID50 (參見上述病毒效價))投與若干天、若干週或若干月。在本發明之特定態樣中，劑量係約10³ 至10⁸ TCID50，尤其對於活病毒/活疫苗。

若期望，組合物可在包裝或分配器裝置中呈遞，該包裝或分配器裝置可含有一或多個含有活性成分之單位劑型。包可(例如)包含金屬或塑膠箔，例如泡罩包。該包或分配器裝置可伴有投與說明書，較佳投與哺乳動物、尤其豬。該(等)容器可附帶有監管醫藥物或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告顯示該機構已批准用於人類投與之製造、使用或銷售。 抗原定義

熟習此項技術者已知術語「豬流行性感冒病毒」。術語豬流行性感冒病毒係指來自引起豬流行性感冒之正黏液病毒家族之A型或C型流行性感冒病毒。儘管正黏液病毒具有三組：A型、B型及C型，但僅A型及C型流行性感冒病毒感染豬。較佳地，豬流行性感冒病毒係豬A型流行性感冒病毒。豬流行性感冒病毒之亞型包括H1N1、H1N2、H3N2及H3N1。H9N2及H5N1亦可發現於豬中。較佳地，豬流行性感冒病毒係自豬分離之流行性感冒病毒。

熟習此項技術者已知術語「HA」或「H」、「NA」或」N」及「NP」。然而，一般而言，A型流行性感冒病毒細分成17 H (血球凝集素)及10 N (神經胺酸酶)亞型，其可產生許多可能組合(指定為H1N1、H1N2….H2N1、H2N2….H5N1、H5N2….等)。H (血球凝集素)及N (神經胺酸酶)係A型流行性感冒病毒(例如SIAV)中之表面醣蛋白。此外，N係中和抗體之主要抗原性靶。此外，NP (核蛋白)形成核殼體。序列概述 ：

以下序列詳細闡述並揭示於本發明中： SEQ ID NO: 1 EHV-1 ORF43 (UL18)基因序列 SEQ ID NO: 2 EHV-1 ORF54 (UL8)基因序列 SEQ ID NO: 3 密碼子最佳化之ORF43 (UL18)基因序列 SEQ ID NO: 4 密碼子最佳化之ORF54 (UL8)基因序列 SEQ ID NO: 5 在ORF43 (UL18)基因上游之171個鹼基 SEQ ID NO: 6 在ORF43 (UL18)基因下游之265個鹼基 SEQ ID NO: 7 具有側接SEQ ID NO:5及6之BGH多A的mCMV啟動子驅動之RFP基因 SEQ ID NO: 8 側接SEQ ID NO:5及6之康黴素基因 SEQ ID NO: 9 在ORF43 (UL18)基因上游之161個鹼基 SEQ ID NO: 10 在ORF43 (UL18)基因下游之120個鹼基 SEQ ID NO: 11 在ORF54 (UL8)基因上游之200個核苷酸 SEQ ID NO: 12 在ORF54 (UL8)基因下游之200個核苷酸 SEQ ID NO: 13 具有側接SEQ ID NO:5及6之BGH多A的mCMV啟動子驅動之RFP基因 SEQ ID NO: 14 在ORF1/3 (UL56)位點選殖之HA序列 SEQ ID NO: 15 轉移載體pU70-p455-71K71之核苷酸序列 SEQ ID NO: 16 轉移質體pU70-p455-H3-71K71之核苷酸序列 SEQ ID NO: 17 左(Up70)側翼區(417 bp) SEQ ID NO: 18 右(Up71)側翼區(431 bp) SEQ ID NO: 19 位於核苷酸127264 - 127680之野生型EHV-1菌株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)中的左側翼區(上orf70) SEQ ID NO:20 野生型EHV-1菌株ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)中位於核苷酸128484 - 128913之右側翼區(上orf71) SEQ ID NO: 21 RED系統中經截短之側翼區：左(Up70)側翼區(283 bp) = 與417 bp 「典型」側翼區之3’ 283 bp相同 SEQ ID NO: 22 RED系統中之截短之側翼區：右(Up71)側翼區(144 bp) = 與431 bp 「經典」側翼區之5’ 144 bp一致 SEQ ID NO: 23 野生型ab4 (基因庫登錄號AY665713.1)基因體序列中之缺失部分，nt 127681 - 128482 SEQ ID NO: 24 RacH基因體序列中之缺失部分(無nt數目可用，此乃因完整基因體序列未知) SEQ ID NO: 25 在ORF1/3 (UL56)位點選殖之HA序列 條款

本文中闡述以下條款： 本發明提供以下條款： 1.一種複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)載體，其包含UL18及/或UL8之不活化。 2.如條款1之複製缺陷型EHV載體，其中UL18不活化。 3.如條款1或2之複製缺陷型EHV載體，其中UL8不活化。 4.如條款1至3中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中UL18及UL8不活化。 5.如條款1至4中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該UL18之不活化係完全或部分缺失、完全或部分截短、完全或部分取代、完全或部分反轉、插入。 6.如條款1至5中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該UL8之不活化係完全或部分缺失、完全或部分截短、完全或部分取代、完全或部分反轉、插入。 7.如條款1至6中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中UL18之起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:1之核苷酸1-3)不活化。 8.如條款7之複製缺陷型EHV載體，其中UL18之該起始密碼子(ATG)之該不活化係缺失、取代、反轉或插入。 9.如條款1至8中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中UL8之該起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:1之核苷酸2-3)不活化。 10.如條款9之複製缺陷型EHV載體，其中UL8之該起始密碼子(ATG)之該不活化係缺失、取代、反轉或插入。 11.如條款1至10中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中自該UL18之該起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:1之核苷酸1-3)之5’-末端缺失、取代或反轉至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少925個核苷酸、至少940個核苷酸。 12.如條款1至11中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中自該UL18之該起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:1之核苷酸1-3)之A、T或G的至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少925個核苷酸、至少940個核苷酸缺失、取代或反轉。 13.如條款1至12中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該UL18內至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少925個核苷酸、至少940個核苷酸缺失、取代或反轉。 14.如條款1至13中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該UL18內與如SEQ ID NO:1中所述之DNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的DNA序列缺失、取代或反轉。 15.如條款1至14中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少300個核苷酸、至少500個核苷酸、至少800個核苷酸、至少1000個核苷酸插入該UL18內。 16.如條款1至15中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中自該UL8之該起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:2之核苷酸1-3)之5’-末端缺失、取代或反轉至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1000個核苷酸、至少1250個核苷酸、至少1500個核苷酸、至少1750個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2225個核苷酸。 17.如條款1至16中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中自該UL8之該起始密碼子(ATG，SEQ ID NO:2之核苷酸1-3)之A、T或G端缺失、取代或反轉至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1000個核苷酸、至少1250個核苷酸、至少1500個核苷酸、至少1750個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2225個核苷酸。 18.如條款1至17中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該UL8內至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1000個核苷酸、至少1250個核苷酸、至少1500個核苷酸、至少1750個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2225個核苷酸缺失、取代或反轉。 19.如條款1至18中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該UL8內與如SEQ ID NO:2中所述之DNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的DNA序列缺失、取代或反轉。 20.如條款1至19中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少300個核苷酸、至少500個核苷酸、至少800個核苷酸、至少1000個核苷酸插入該UL8內。 21.如條款1至20中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV包含表現盒，該表現盒包含： (i) 至少一個所關注之外源核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列，其中該所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列視情況可操作連接至啟動子序列，及 (ii) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL18側翼區：SEQ ID NO:5及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO:9及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，及 (iii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL18側翼區：SEQ ID NO: 6及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO:10及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 22.如條款1至21中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV包含表現盒，該表現盒包含： (i) 至少一個所關注之外源核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列，其中該所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列視情況可操作連接至啟動子序列，及 (ii) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL8側翼區：SEQ ID NO:11及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，及 (iii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL8側翼區：SEQ ID NO:12及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 23.如條款21或22之複製缺陷型EHV載體，其中該表現盒之該插入使UL18及/或UL8不活化。 24.如條款21至23中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該表現盒插入UL18之特徵在於RacH之UL18內約945bp部分(SEQ ID NO:1)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 25.如條款21至24中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該表現盒插入UL8之特徵在於RacH之UL8內約2256bp部分(SEQ ID NO:2)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 26.如條款1至25中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含至少一個選自由以下組成之群之側翼區：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及與該等序列中之任一者70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 27.如條款1至26中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含(i) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL18側翼區：SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:9，及(ii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL18側翼區：SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:10。 28.如條款1至27中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含至少一個選自由以下組成之群之側翼區：SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12及與該等序列中之任一者70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 29.如條款1至28中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含(i) 至少一個選自由以下組成之群之上游UL8側翼區：SEQ ID NO:11及(ii) 至少一個選自由以下組成之群之下游UL8側翼區：SEQ ID NO:12。 30.如條款1至29中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體係非天然及/或重組EHV。 31.如條款1至30中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中複製缺陷型意指複製率至少降低90%。 32.如條款1至31中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中複製缺陷型意指複製率至少降低95%。 33.如條款1至32中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中複製缺陷型意指複製率至少降低99%。 34.如條款1至33中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中複製缺陷型意指完全消除該複製率。 35.如條款1至34中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中藉由TCID₅₀ 分析量測該複製率。 36.如條款1至35中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該複製缺陷型EHV載體仍具感染性。 37.如條款1至36中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體仍具感染性，可在感染之真核細胞系中複製，但僅包裝為補充細胞系中之複製勝任病毒。 38.如條款1至37中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含插入插入位點、較佳UL56及/或US4中之至少一個所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。 39.如條款1至38中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含插入兩個或更多個插入位點中之兩個或更多個所關注之核苷酸序列、較佳所關注之基因、更佳抗原編碼序列。 40.如條款38或39之EHV載體，其中該插入US4中之特徵在於US4中之部分缺失、截短、取代、修飾或諸如此類，其中US5保留功能。 41.如條款38至40中任一條款之EHV載體，其中該插入US4中之特徵在於RacH之US4內約801bp部分(SEQ ID NO: 24)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。 42.如條款38至41中任一條款之EHV載體，其中該EHV載體包含至少一個選自由以下組成之群之側翼區：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22及與該等序列中之任一者70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。 43.如條款38至42中任一條款之EHV載體，其中該EHV載體包含(i) 至少一個選自由以下組成之群之左US4側翼區：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21，及(ii) 至少一個選自由以下組成之群之右US4側翼區：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:22。 44.如條款21至43中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該所關注之核苷酸序列係重組及/或異源及/或外源的。 45.如條款21至44中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該抗原編碼序列係關於感染產食性動物(例如豬、牛或家禽)或伴侶動物(例如貓、馬或狗)之病原體。 46.如條款21至45中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該抗原編碼序列係來自選自但不限於以下清單之病原體：施馬倫貝格病毒、A型流行性感冒病毒、豬呼吸及生殖症候群病毒、豬環狀病毒、典型豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、E型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、狂犬病病毒、貓麻疹病毒、破傷風梭菌、結核分枝桿菌、胸膜肺炎放線桿菌。 47.如條款21至46中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其進一步包含額外調節序列，例如終止信號或多腺苷酸化序列。 48.如條款21至47中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該所關注之基因可操作連接至調節序列、較佳啟動子序列。 49.如條款21至48中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中可操作連接至所關注之該序列或基因的該(等)啟動子序列係選自但不限於由以下組成之群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子、聚合酶II啟動子、功能片段。 50.如條款21至49中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中可操作連接至至少一個所關注之基因之該啟動子序列係MCMV或其功能片段或其互補核苷酸序列。 51.如條款21至50中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中可操作連接至至少一個所關注之基因之該啟動子序列係UL8或UL18之內源啟動子。 52.如條款1至51中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體係選自由以下組成之群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。 53.如條款1至52中任一條款之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體係EHV-1、較佳RacH。 54.一種哺乳動物宿主細胞，其特徵在於其包含如條款1至53中任一條款之複製缺陷型EHV載體。 55.一種表現EHV之UL8及/或UL18或其功能部分的細胞系，其用於培養如條款1至53中任一條款之複製缺陷型EHV載體。 56.一種包含質體之細胞系，該質體含有包含EHV之UL8及/或UL18或其功能部分的表現盒，其中該細胞系表現UL8及/或UL18或其功能部分。 57.如條款55或56之細胞系，其中該細胞係選自但不限於以下之群：Vero細胞、RK-13 (兔腎)、ST (豬睪丸)、MDCK (Madin-Darby犬腎)、MDBK (Madin-Darby牛腎)及馬皮膚細胞(NBL-6)。 58.如條款55至57中任一條款之細胞系，其中該細胞系係ST細胞系。 59.一種產生複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)之方法，其包含使如條款1至53中任一條款之UL18及/或UL8不活化。 60.一種產生複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)之方法，其包含以下步驟： a) 提供野生型EHV或減毒之EHV； b)使步驟a)之該EHV之UL18及/或UL8不活化，並選擇不帶有UL18及/或UL8之完整或功能部分之EHV純系； c)提供表現UL18及/或UL8或其功能部分之補充細胞系； d) 藉由將步驟b)之該EHV與步驟c)之該補充細胞系一起培養來獲得該複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(EHV)。 61.一種免疫原性組合物，其包含一或多種如條款1至53中任一條款之EHV載體。 62.如條款61之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。 63.如條款61或62中任一條款之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物係疫苗。 64.一種對個體實施免疫之方法，其包含向該個體投與如條款61至63中任一條款之免疫原性組合物。 65.一種治療或預防有需要之個體中由病原體引起之臨床體徵的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如條款61至63中任一條款之免疫原性組合物。 66.如條款61至63中任一條款之免疫原性組合物，其用於對個體實施免疫之方法中，該方法包含向該個體投與該免疫原性組合物。 67.如條款61至63中任一條款之免疫原性組合物，其用於治療或預防有需要之個體中由病原體引起之臨床體徵之方法中，該方法包含向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物。 68.如條款64至67中任一條款之方法或用途，其中該個體係選自由豬、牛、家禽、貓、馬及狗組成之清單。 69.如條款64至68中任一條款之方法或用途，其中投與該免疫原性組合物一次。 70.如條款64至69中任一條款之方法，其中以兩個或更多個劑量投與該免疫原性組合物。 實例

本發明包括以下實例以展現本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示之技術代表本發明者發現在實踐本發明中運行良好之技術，且因此可認為構成其實踐之較佳方式。然而，熟習此項技術者借助於本揭示內容應瞭解，可對所揭示特定實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結果，此並不背離本發明之精神及範疇。 實例1：生成表現 EHV-1 ORF 43 (UL18) 或 ORF 54 (UL8) 基因之穩定細胞系

將SEQ ID NO:3之合成、密碼子最佳化之ORF 43 (ORF 43(co))基因(基於EHV-1 RacH菌株ORF 43基因之核苷酸序列，SEQ ID NO:1)用XhoI/BamHI消化並連接至用相同限制內核酸酶消化之pCEP載體(Invitrogen，目錄號V044-50)中。將所得質體pCEP- ORF43 (co) (圖1)線性化並轉染至豬睪丸細胞(ST)中。在用潮黴素選擇兩週後，使用表現ORF43 (co)基因之穩定細胞(ST-43-CO細胞)以拯救複製缺陷型EHV-1病毒。

將SEQ ID NO:4之合成、密碼子最佳化之ORF 54 (ORF 54(co))基因(基於EHV-1 RacH菌株ORF 54基因之核苷酸序列，SEQ ID NO:2)用XhoI/BamHI消化並連接至用相同限制內核酸酶消化之pCEP載體(Invitrogen，目錄號V044-50)中。將所得質體pCEP- ORF54 (co) (圖2)線性化並轉染至豬睪丸細胞(ST)中。在用潮黴素選擇兩週後，使用表現ORF54 (co)基因之穩定細胞(ST-54-CO細胞)以拯救複製缺陷型EHV-1病毒。 實例2：載體構築及複製缺陷型 EHV 病毒拯救 EHV-1 Δ ORF43 病毒 ， mCMV 啟動子驅動之 RFP 置換 ORF 43

設計具有多個選殖位點(MCS)之合成DNA，其側接ORF43基因上游之171個核苷酸(SEQ ID NO:5)及下游之265個核苷酸(SEQ ID NO:6)。mCMV (鼠類CMV啟動子)驅動之紅色螢光蛋白(RFP/mCherry) (Shaner等人，2004)用作報導基因。作為轉錄終止信號及mRNA穩定功能，牛生長激素多腺苷酸化序列(BGHpA, Goodwin & Rottman, 1992)直接在報導基因(RFP)基因之3'端下游使用。將用MluI/SalI限制內核酸酶消化之RFP基因選殖於MCS中以生成質體pUC43-mCMV-RFP。自此質體，消化具有側接ORF 43側翼(SEQ ID NO 7)之mCMV-RFP-BGH多A的DNA片段且使用RED重組系統選殖於EHV-1 RacH BAC DNA中以生成EHV-1-43-mCMV RFP。Red重組剔除ORF43且將其置換為mCMV-RFP-BGH多A (圖3)。在康黴素選擇後，稍後將EHV-1-43-mCMV RFP BAC DNA轉染至ST-43-CO細胞中以拯救重組病毒-rEHV-1-43-mCMV-RFP。 實例3：EHV-1 Δ ORF43 病毒 ， 內源 EHV-1 啟動子驅動之 RFP 置換 ORF 43

在置換複製缺陷型EHV-1病毒之另一種形式中，使用經修飾之RED重組方案在框架中用ORFP基因置換ORF43 (圖5)。首先，設計合成DNA SceI/康黴素DNA，其側接ORF 43基因上游之171個核苷酸(SEQ ID NO:5)及下游之265個核苷酸(SEQ ID NO:6)。將此DNA片段(SEQ ID NO:8)轉變至攜帶EHV-1 BAC DNA之大腸桿菌K12 GS1783中。用康黴素選擇產生中間體EHV-1純系，其中ORF 43經SceI/康黴素片段置換。接下來，將側接ORF43基因上游之161個核苷酸(SEQ ID NO 9)及下游之120個核苷酸(SEQ ID NO:10)的RFP基因轉變至上述純系中以選擇EHV-1 BAC DNA純系，其中ORF43基因在框架中經RFP置換(EHV-1-43-RFP) (圖4)。將EHV-1-43 RFP BAC DNA轉染至ST-43-CO細胞中以拯救重組病毒-rEHV-1-43-RFP。由於吾人不包括外部啟動子，故在此情況下RFP表現依賴於內源ORF 43啟動子之固有EHV-1基因表現。 實例4：EHV-1 Δ ORF 54 病毒 ， mCMV 啟動子驅動之 RFP 置換 ORF 54

設計具有側接ORF 54基因上游之200個核苷酸(SEQ ID NO:11)及下游之200個核苷酸(SEQ ID NO:12)之MCS的合成DNA。將用MluI/SalI限制內核酸酶消化之mCMV驅動之RFP基因選殖於MCS中以生成質體pUC54-mCMV-RFP。自此質體，用I-CeuI消化具有側接ORF 54側翼(SEQ ID NO:13)之mCMV-RFP-BGH多A的DNA片段且使用RED重組系統選殖於EHV-1 RacH BAC DNA中以生成EHV-1-54-mCMV RFP。Red重組剔除ORF54且插入之mCMV-RFP-BGH多A在相同區域中(圖6)。在康黴素選擇後，稍後將EHV-1-54-mCMV RFP BAC DNA轉染至ST-54-CO細胞中以拯救重組病毒-rEHV-1-54-mCMV-RFP。 實例5：在 ORF43 或 ORF54 具有轉基因之複製缺陷型 EHV-1 病毒

用不同感染複數(MOI)之EHV-1/RacH、rEHV-1-43-mCMV-RFP、rEHV-1-43-RFP及rEHV-1-54-mCMV-RFP病毒感染常規ST細胞、ST-43-CO細胞及ST-54-CO細胞。藉由螢光顯微鏡術，每24h觀察感染細胞之基因表現及斑塊形成。藉由光學顯微術監測細胞病變效應(CPE)；以70% CPE收穫病毒並藉由TCID50滴定。

如圖7中所見，EHV-1/RacH病毒在所有三種細胞系中皆引起顯著CPE。在經EHV-1/RacH病毒感染之所有細胞中觀察到之特異性斑塊確立，實例1及實例2中生成之穩定細胞支持EHV-1複製以及常規ST細胞。

用rEHV-1-43-RFP病毒感染常規ST細胞及ST-43-CO細胞(圖8)。儘管兩種細胞皆經rEHV-1-43-RFP病毒感染(如自GFP表現可見)，但僅在ST-43-CO細胞中觀察到CPE及病毒產生。在所有感染之細胞中皆觀察到轉基因(RFP)表現，但僅在ST-43-CO細胞中觀察到可見之CPE或斑塊。

接下來，用rEHV-1-43-mCMV-RFP病毒感染常規ST細胞及ST-43-CO細胞(圖9)。儘管兩種細胞皆經rEHV-1-43-mCMV-RFP病毒感染(如自GFP表現可見)，但僅在ST-43-CO細胞中觀察到CPE及病毒產生。在所有感染之細胞中皆觀察到轉基因(RFP)表現，但僅在ST-43-CO細胞中觀察到可見之CPE或斑塊。

上述數據確認缺乏ORF43基因之EHV-1病毒僅能在表現ORF43蛋白之細胞中複製(如在ST-43-CO細胞中)，而不能在常規細胞中複製。該數據亦展現ORF43可經不同轉基因置換，該轉基因可經由外部啟動子(例如mCMV)或作為EHV-1基因之一部分(無外部啟動子；具有內源啟動子)在感染細胞中表現。

最後，用rEHV-1-54-mCMV-RFP病毒感染常規ST細胞及ST-54-CO細胞(圖10)。儘管兩種細胞皆經rEHV-1-54-mCMV-RFP病毒感染(如自GFP表現可見)，但僅在ST-54-CO細胞中觀察到CPE及病毒產生。在所有感染之細胞中皆觀察到轉基因(RFP)表現，但僅在ST-54-CO細胞中觀察到可見之CPE或斑塊。此數據確認缺乏ORF54基因之EHV-1病毒僅能在表現ORF54蛋白之細胞中複製(如在ST-54-CO細胞中)，而不能在常規細胞中複製。該數據亦展現ORF54可經不同轉基因置換，該轉基因可經由外部啟動子(例如mCMV)在感染細胞中表現。

比較在不同細胞系上產生之各種重組病毒的滴度(一式三份)。數據清楚地展現缺乏ORF 43或ORF 54之病毒不能在常規細胞中複製(表1)。

表1 實例6：在其他插入位點具有轉基因之複製缺陷型 EHV-1 病毒

設計具有側翼以藉由兩步red重組完全剔除ORF 43的合成DNA，並將其轉變至攜帶EHV-1/HA BAC DNA (HA序列，SEQ ID NO:14)之GS1783細胞中。在兩步red重組後，剔除ORF43 (藉由Sanger測序確認，數據未顯示)以生成EHV-1-ΔORF43-HA。將EHV-1-ΔORF43-HA BAC DNA (在ORF 1/3位點具有mCMV驅動之HA基因且缺乏ORF 43)轉染至ST-43-CO細胞中以拯救重組病毒rEHV-1-ΔORF43-HA。

設計具有側翼以藉由兩步red重組完全剔除ORF 54的合成DNA，並將其轉變至攜帶EHV-1/HA BAC DNA (HA序列，SEQ ID NO:14)之GS1783細胞中。在兩步red重組後，剔除ORF54 (藉由Sanger測序確認，數據未顯示)以生成EHV-1-ΔORF54-HA。將EHV-1-ΔORF54-HA BAC DNA (在ORF 1/3位點具有mCMV驅動之HA基因且缺乏ORF 54)轉染至ST-43-CO細胞中以拯救重組病毒rEHV-1-ΔORF54-HA。

當常規ST及ST-43-CO細胞用不同MOI之rEHV-1-ΔORF43-HA感染時，僅在感染之ST-43-CO細胞中觀察到CPE/病毒產生。可藉由使用抗HA抗體之IFA (免疫螢光分析)確認感染細胞中之HA表現。

當常規ST及ST-54-CO細胞用不同MOI之rEHV-1-ΔORF54-HA感染時，僅在感染之ST-54-CO細胞中觀察到CPE/病毒產生。可藉由使用抗HA抗體之IFA (免疫螢光分析)確認感染細胞中之HA表現。 實例7：豬中在另一插入位點活體內表現 HA 之複製缺陷型 EHV-1 載體疫苗的測試

設計具有側翼以藉由兩步red重組完全剔除ORF 43的合成DNA，並將其轉變至攜帶EHV-1/HA BAC DNA (HA序列，SEQ ID NO:25)之GS1783細胞中。在兩步red重組後，剔除ORF43 (藉由Sanger測序確認，數據未顯示)以生成EHV-1-ΔORF43-HA。將EHV-1-ΔORF43-HA BAC DNA (在ORF 1/3位點具有mCMV驅動之HA基因且缺乏ORF 43)轉染至ST-43-CO細胞中以拯救重組病毒rEHV-1-ΔORF43-HA。

當非補充ST及ST-43-CO細胞用rEHV-1-ΔORF43-HA感染時，僅在感染之ST-43-CO細胞中觀察到CPE/病毒產生。可藉由使用抗HA抗體之IFA (免疫螢光分析)確認感染細胞中之HA (SEQ ID NO: 25)表現(圖19)。

為了測試複製缺陷型EHV-1病毒作為疫苗之潛力，將5頭11週齡之豬疫苗接種兩次(第0天及第14天) rEHV-1-ΔORF43-HA病毒。動物之對照組疫苗接種安慰劑。自所有血清樣品實施血球凝集抑制(HI)分析以測試接種疫苗之豬是否攜帶針對存在於複製缺陷型EHV-1病毒中之抗原的抗體。

所有5隻接種疫苗疫苗之動物在一次疫苗接種後具有顯著HI滴度。在第二次疫苗接種後，所有接種疫苗之豬之HI滴度進一步增加。在相似之測試天，沒有對照動物具有顯著HI滴度(圖20)。 實例8：重組 EHV-1 載體疫苗中具有 p455 啟動子之 ORF70 (US4) 插入位點的使用及重組病毒之構築

將流行性感冒血球凝集素亞型H3 (A/豬/意大利/7680/2001(H3N2)，基因庫登錄號：ABS50302.2)選殖於pU70-p455-71K71 (圖11，SEQ ID NO. 15)中以生成轉移質體pU70-p455-H3-71K71，從而將H3置於p455啟動子及新穎71pA多腺苷酸化信號之控制下，並側接具有重組區之盒用於插入ORF70 (圖12，SEQ ID NO:16)中。使用RED重組系統(Tischer等人， 2006 Biotechnol. Tech. 40, 191-197)以在pRacH-SE之ORF70選殖表現盒p455-H3-71以生成pRacH-SE70-p455-H3 (圖13)。 用pRacH-SE70-p455-H3轉染PK/WRL細胞以拯救重組rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3病毒。藉由對插入區域之高保真度PCR產物之測序確認表現盒之插入。藉由間接免疫螢光分析(IFA，圖14)來分析感染細胞中轉基因之表現。 實例9豬之單價 EHV-1 載體 A 型流行性感冒病毒疫苗 (H3 疫苗 ) 的活體內測試

為了測試rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3作為潛在疫苗之效能，分別在2週齡及5週齡時對無針對豬IAV (無母體抗體)之母體源免疫性的仔豬兩次肌內疫苗接種劑量為1×10^7 TCID50/mL的rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3，或僅在5週齡時疫苗接種(單次疫苗接種)。未接種疫苗之仔豬組用作陰性對照，且根據製造商之說明書(疫苗接種之時間點除外)在2週齡及5週齡時疫苗接種市售不活化豬IAV疫苗之一組動物用作陽性對照(安樂死)。在8週齡時，除了陰性對照組之外之所有動物皆受到1×10^7 TCID50/mL之氣管內施用劑量之H3N2豬IAV攻擊菌株(歐洲田間病毒分離株R452-14，其H3為RacH-SE-70-p455-H3中所用之H3疫苗抗原的異源)的攻擊。未接種疫苗且未經攻擊之動物用作陰性對照，而未接種疫苗但經攻擊之動物用作攻擊對照。在選擇之時間點採集體溫及血樣。攻擊後一天，將每組中一半動物安樂死，且針對豬IAV感染典型之病灶對肺進行評分，每隻動物每個左右肺分別取三個肺樣品，以測定肺勻漿物中之傳染性豬IAV之效價，且對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行取樣。攻擊後3天，對每組之剩餘一半動物實施相同程序。

當在豬IAV攻擊病毒施加後研究體溫升高時，與疫苗接種兩次rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之仔豬不同，未接種疫苗之動物顯示攻擊後一天體溫增加約1℃(圖15)。

在攻擊後1或3天安樂死之動物中評價肺評分。在陰性對照組仔豬中不存在與豬IAV感染相關之典型肺病灶。但是，在攻擊對照組中觀察到肺病灶(平均範圍為6%至7％)。最後，在疫苗接種兩次rEHV1-RacH-SE-70-p455-H3疫苗之仔豬中，平均肺病灶評分顯著較低(小於4%) (圖16)。

在攻擊後1或3天安樂死之動物中評價平均豬IAV肺效價。儘管在陰性對照組仔豬之肺樣品中不存在豬IAV，但攻擊對照組顯示每克肺組織之病毒效價在超過5 (第3天)至超過7 log (第1天)之範圍內。與之形成鮮明對比的是，對於用rEHV1 RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次之組，組平均值強烈降低至約2 log或更低，且對於用rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗兩次之組，降低至不可檢測含量(圖17)。

當在疫苗接種後測試豬IAV中和抗體之誘導時，第一次疫苗接種後3週，來自用rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗一次之動物之血清顯示倒數中和效價為約160，且在第二次疫苗接種後3週，來自用rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種疫苗兩次之動物之血清顯示倒數中和效價為約2560，而來自未接種疫苗之組之血清無可檢測之豬IAV中和抗體含量(圖18)。

綜上所述，來自此實例之數據展現，在EHV-1載體背景中在ORF70插入之轉基因可使用外部啟動子表現，且所得重組EHV-1載體可在活體內用作潛在疫苗候選者。 參考文獻

以下參考文獻以提供例示性程序或其他補充本文所闡述者之細節的程度明確地以引用方式併入本文中。 1.Bustin, S.2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology25 (2): 169-193。 2.Goodwin, E.C.及Rottman, F.M.1992 . The 3’flanking sequence of the bovine growth hormone gene contains novel elements required for efficient and accurate polyadenylation. J.Biol.Chem. 267: 16330-16334 3.Hübert, P. H.、Birkenmaier, S.、Rziha, H.-J.及Osterrieder, N.1996 , Alterations in the Equine Herpesvirus Type-1 (EHV-1) Strain RacH During Attenuation. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 43: 1-14. doi:10.1111/j.1439-0450.1996.tb00282.x 4.Luke, GA及Ryan, MD.2013 . The protein coexpression problem in biotechnology and biomedicine: virus 2A and 2A-like sequences provide a solution.Future Virology, 第8卷，第10期，第983-996頁。 5.Ma, G.、Azab, W.、Osterrieder, N.2013. Equine herpesviruses type 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4)--masters of co-evolution and a constant threat to equids and beyond. Vet Microbiol. 167(1-2):123-34。 6.Nolan, T. Rebecca E Hands, R.E., and Bustin S.A.2006 . Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols 1: 1559-1582 7.Osterrieder, N.、Neubauer, A.、Brandmüller,C.、Kaaden, O.R.及O’Callaghan, D.J.1996 . The equine herpesvirus 1 IR6 protein influences virus growth at elevated temperature and is a major determinant of virulence. Virology 226:243-251。 8.Ptashne, M.2014 .The Chemistry of Regulation of Genes and Other Things The Journal of Biological Chemistry Vol. 289, ( 9) 5417-5435. Reed, L.J., and Muench, H.1938 . A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. (27) 3; 493-497。 9.Reed LJ及Muench H (1938). A simple method estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene 27(3) 493-497 10.Rosas, C.T.、Konig, P.、Beer, M.、Dubovi, E.J.、Tischer, B.K.、Osterrieder, N.,2007a . Evaluation of the vaccine potential of an equine herpesvirus type 1 vector expressing bovine viral diarrhea virus structural proteins. J. Gen. Virol. 88 (3), 748-757。 11.Rosas, C.T.、B.K. Tischer、G.A. Perkins、B. Wagner、L.B. Goodman、N. Osterrieder.2007b . Live-attenuated recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) induces a neutralizing antibody response against West Nile virus (WNV) Virus Research, 125 , 第69-78頁。 12.Rosas, C.T.、Van de Walle, G.R.、Metzger, S.M.、Loelzer, K.、Dubovi, E.J.、Kim, S.G.、Parrish, C.R.、Osterrieder, N.,2008 . Evaluation of a vectored equine herpesvirus type 1 (EHV-1) vaccine expressing H3 haemagglutinin in the protection of dogs against canine influenza. Vaccine 26 (19), 2335-3234。 13.Said, A.、Elke Lange, E.、Beer, M. Damiani, A.、Osterrieder, N.2013 . Recombinant equine herpesvirus 1 (EHV-1) vaccine protects pigs against challenge with influenza A(H1N1)pmd09 Virus Research 173: 371- 376 14.Sambrook J及Russell DW (2001). Molecular Cloning, 第3版，Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; ISBN 978-087969-577-4 15.Shaner, N.C.、Campbell, R.E.、Steinbach, P.A.、Giepmans, B.N.、Palmer, A.E.、Tsien, R,Y.2004. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. Dec；22(12):1567-72. Epub 2004年11月21日。 16.Tischer, B.K.、Kaufer, B.B.、Sommer, M.、Wussow, F.、Arvin, A.及Osterrieder, N. A Self-Excisable Infectious Bacterial Artificial Chromosome Clone of Varicella-Zoster Virus Allows Analysis of the Essential Tegument Protein Encoded byORF9. J. Virol.81 (23),2007 , 13200-13208。 17.Tischer, B.K、Smith, G.A.及Osterrieder, N.，於以下中：Jeff Braman (編輯.),In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition , Methods in Molecular Biology, 第634卷，DOI 10.1007/978-1-60761-652-8_30, © Springer Science+Business Media, LLC2010 , 第30章:En Passant Mutagenesis: A Two Step Markerless Red Recombination System。 18.Trapp, S.、von Einem, J.、Hofmann, H.、Kostler, J.、Wild, J.、Wagner, R.、Beer, M.、Osterrieder, N.,2005 . Potential of equine herpesvirus 1 as a vector for immunization. J. Virol. 79, 5445-5454。 19.Wellington, J.E.、Allen, G.P.、Gooley, A.A.、Love, D.N.、Packer, N.H.、Yan, J.X.、Whalley, J.M.1996. The highly O-glycosylated glycoprotein gp2 of equine herpesvirus 1 is encoded by gene 71. J Virol. 70(11):8195-8。

下列圖示形成本說明書之一部分且包括其以進一步闡釋本發明之某些態樣。可藉由參照該等圖示中之一或多者結合本文所示特定實施例之詳細說明來更好地理解本發明。

圖1：表現質體pCEP-ORF43 (CO)之質體圖。此載體經由CMV啟動子表現密碼子最佳化之EHV-1 ORF43基因且用於產生穩定細胞系之一。

圖2：表現質體pCEP-ORF54 (CO)之質體圖。此載體經由CMV啟動子表現密碼子最佳化之EHV-1 ORF54基因且用於產生穩定細胞系之一。

圖3：將mCMV驅動之RFP選殖於EHV-1 BAC DNA中之ORF43位點中的示意圖，其中ORF42-ORF45區放大。 U_L = 長的獨特區段 U_S = 短的獨特區段 IR = 內部反向重複序列 TR = 末端反向重複序列 orf = 開放讀碼框 bp = 鹼基對

圖4：將RFP選殖於EHV-1 BAC DNA中之ORF43位點中的示意圖，其中ORF42-ORF45區放大。 U_L = 長的獨特區段 U_S = 短的獨特區段 IR = 內部反向重複序列 TR = 末端反向重複序列 orf = 開放讀碼框 bp = 鹼基對

圖5：用於將RFP選殖於ORF43區中之經修飾之RED重組。上圖：質體不按比例。SceI/Kan質體用I-CeuI限制內核酸酶消化。SceI/Kan片段(側接ORF 43序列)轉變至攜帶EHV-/RacH BAC DNA之GS183細胞中。氯黴素(Chloramphenicol)及康黴素(Kanamycin)選擇用於選擇其中ORF43經SceI/Kan置換之EHV-1/RacH純系。中間純系命名為EHV-1/SceI-Kan。下圖：質體不按比例。將RFP (側接ORF 43序列) g-區段DNA轉變至攜帶EHV-1/SceI-Kan之GS1783細胞中，與阿拉伯糖一起培育且用氯黴素/阿拉伯糖選擇。在EHV-1/Sce-Kan純系中之ORF43處用RFP DNA置換SceI/Kan片段，產生EHV-1-43-RFP。

圖6：將mCMV-RFP-pA選殖於EHV-1 BAC DNA中之EHV-1 ORF 54位點中的示意圖，其中ORF53-ORF55區放大。 U_L = 長的獨特區段 U_S = 短的獨特區段 IR = 內部反向重複序列 TR = 末端反向重複序列 orf = 開放讀碼框 bp = 鹼基對

圖7：ST (上圖)、ST-43-CO及(中圖) ST-54-CO細胞用顯示相似CPE之EHV-1/RacH病毒感染。感染之細胞表現GFP (右圖)，但不表現RFP (數據未顯示)

圖8：ST (上圖)及ST-43-CO及(下圖) rEHV-1-43-RFP病毒。感染之細胞表現GFP (中圖)及RFP 右圖)，但僅在rEHV-1-43-RFP病毒感染之ST-43-CO細胞中觀察到病毒傳播及CPE。

圖9：ST (上圖)及ST-43-CO及(下圖) rEHV-1-43-mCMV-RFP病毒。感染之細胞表現GFP (中圖)及RFP 右圖)，但僅在rEHV-1-43-mCMV-RFP病毒感染之ST-43-CO細胞中觀察到病毒傳播及CPE。

圖10：ST (上圖)及ST-54-CO及(下圖) rEHV-1-54-mCMV-RFP病毒。感染之細胞表現GFP (中圖)及RFP (右圖)，但僅在rEHV-1-54-mCMV-RFP病毒感染之ST-54-CO細胞中觀察到病毒傳播及CPE。

圖11：轉移載體pU70-p455-71K71之質體圖

圖12：用於將表現盒p455-H3-71插入EHV-1 RacH之ORF70中的轉移質體之質體圖

圖13：rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之基因體之示意圖，其中orf70插入區放大。orf69：在orf70中之插入位點上游之69號開放讀碼框；p455：本文所述之新穎啟動子，參見例如實例1；H3：轉基因流行性感冒病毒血球凝集素；71pA：新穎多腺苷酸化序列；Δorf70：含有orf71之啟動子之orf70之其餘部分，其編碼結構病毒醣蛋白II (gpII)。

圖14：間接免疫螢光分析：用rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染之VERO細胞的間接免疫螢光分析 在感染後(p.i.) 24 h，將細胞用乙醇固定並風乾。使用針對H3之市售單株抗體作為一級抗體及使用FITC結合之兔抗小鼠IgG作為二級抗體，藉由螢光顯微鏡術在用重組EHV-1 RacHSE-70-p455-H3感染之細胞中顯示H3。

圖15：攻擊之前及攻擊後1、2及3天各組之平均體溫。誤差槓，標準偏差。每個研究日自左至右：陰性對照組(neg. ctrl.)、攻擊對照組(chall. ctrl.)、用RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗一次之動物(1x EHV-1)、用RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗兩次之動物(2x EHV-1)或用不活化之豬IAV疫苗接種疫苗兩次之動物(2x殺死)。

圖16：攻擊後1及3天各組之平均肺評分。誤差槓，標準偏差。陰性對照組(陰性對照)、攻擊對照組(攻擊對照)、用RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗一次之動物(1× EHV-1)、用RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗兩次之動物(2× EHV-1)或用不活化之豬IAV疫苗接種疫苗兩次之動物(2×殺死)。

圖 17A及17B：病毒效價：顯示攻擊後接種疫苗或未接種疫苗之豬之肺樣品之病毒負荷的圖。不活化= 市售不活化疫苗。EHV= rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3

圖18：在攻擊當天收集之針對豬IAV H3攻擊菌株R452-14的動物血清之倒數血清中和(SN)效價。20，檢測極限。陰性對照組(陰性對照)、攻擊對照組(攻擊對照)、用RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗一次之動物(1× EHV-1)、用RacH-SE-70-p455-H3接種疫苗兩次之動物(2× EHV-1)或用不活化之豬IAV疫苗接種疫苗兩次之動物(2×殺死)。

圖19：用rEHV-1-ΔORF43-HA病毒感染之ST-43-CO (上圖)及非補充ST細胞(下圖)之IFA分析。感染之細胞表現EHV-1 (左圖)及HA蛋白(右圖)，但僅在rEHV-1-ΔORF43-HA病毒感染之ST-43-CO細胞中觀察到病毒擴散及CPE。

圖20：用來自對照及rEHV-1-ΔORF43-HA病毒疫苗接種之豬之血清的HI分析(每組5頭豬)。

<110> 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)

<120> 具不活化UL18及/或UL8之新穎馬阿爾發疱疹病毒(EHV)

<130> P01-3303 Prio

<150> EP 18162630.0

<151> 2018-03-19

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 945

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 1

<210> 2

<211> 2256

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 2

<210> 3

<211> 945

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 3

<210> 4

<211> 2256

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 4

<210> 5

<211> 171

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 5

<210> 6

<211> 265

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 6

<210> 7

<211> 3528

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有RFP基因之mCMV啟動子

<400> 7

<210> 8

<211> 1505

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 側接SEQ ID NO 5及6之康黴素基因

<400> 8

<210> 9

<211> 161

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 9

<210> 10

<211> 120

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 10

<210> 11

<211> 200

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 11

<210> 12

<211> 200

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 12

<210> 13

<211> 3138

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mCMV啟動子驅動之RFP基因

<400> 13

<210> 14

<211> 1695

<212> DNA

<213> 豬流行性感冒病毒

<400> 14

<210> 15

<211> 5191

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉移載體pU70-p455-71K71之核苷酸序列

<400> 15

<210> 16

<211> 6892

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉移質體pU70-p455-H3-71K71之核苷酸序列

<400> 16

<210> 17

<211> 417

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 17

<210> 18

<211> 431

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 18

<210> 19

<211> 417

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 19

<210> 20

<211> 431

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 20

<210> 21

<211> 283

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 21

<210> 22

<211> 144

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 22

<210> 23

<211> 801

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 23

<210> 24

<211> 801

<212> DNA

<213> 馬疱疹病毒1

<400> 24

<210> 25

<211> 1698

<212> DNA

<213> 豬流行性感冒病毒

<400> 25

Claims (27)

1. 一種複製缺陷型馬阿爾發疱疹病毒(Equid Alphaherpesvirus)(EHV)載體，其包含UL18及/或UL8之不活化；其中UL18及/或UL8之不活化係完全或部分缺失、完全或部分截短、完全或部分反轉(inversion)、或插入；且其中該EHV載體係選自由以下組成之群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。
2. 如請求項1之複製缺陷型EHV載體，其中該UL18內至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少925個核苷酸、至少940個核苷酸缺失或反轉。
3. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該UL8內至少1個核苷酸、至少2個核苷酸、至少3個核苷酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少25個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1000個核苷酸、至少1250個核苷酸、至少1500個核苷酸、至少1750個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2225個核 苷酸缺失或反轉。
4. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該UL18內與如SEQ ID NO：1中所述之DNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的DNA序列缺失或反轉。
5. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該UL8內與如SEQ ID NO：2中所述之DNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的DNA序列缺失或反轉。
6. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含表現盒，其包含：(i)至少一個所關注之外源核苷酸序列，其中該所關注之核苷酸序列可操作地連接至啟動子序列或並未可操作地連接至啟動子序列，及(ii)至少一個選自由以下組成之群之上游UL18側翼區：SEQ ID NO：5及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO：9及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列， (iii)至少一個選自由以下組成之群之下游UL18側翼區：SEQ ID NO：6及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列；SEQ ID NO：10及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。
7. 如請求項6之複製缺陷型EHV載體，其中(i)中之該所關注之外源核苷酸序列係所關注之基因。
8. 如請求項6之複製缺陷型EHV載體，其中(i)中之該所關注之外源核苷酸序列係抗原編碼序列。
9. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含表現盒，其包含：(i)至少一個所關注之外源核苷酸序列，其中該所關注之核苷酸序列可操作地連接至啟動子序列或並未可操作地連接至啟動子序列，及(ii)至少一個選自由以下組成之群之上游UL8側翼區：SEQ ID NO：11及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列，及(iii)至少一個選自由以下組成之群之下游UL8側翼區：SEQ ID NO：12及其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列。
10. 如請求項9之複製缺陷型EHV載體，其中(i)中之該所關注之外源核苷酸序列係所關注之基因。
11. 如請求項9之複製缺陷型EHV載體，其中(i)中之該所關注之外源核苷酸序列係抗原編碼序列。
12. 如請求項6之複製缺陷型EHV載體，其中該表現盒插入UL18中之特徵在於RacH之UL18內約945bp部分(SEQ ID NO：1)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。
13. 如請求項9之複製缺陷型EHV載體，其中該表現盒插入UL8中之特徵在於RacH之UL8內約2256bp部分(SEQ ID NO：2)或其70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源及/或一致序列缺失。
14. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含(i)至少一個選自由以下組成之群之上游UL18側翼區：SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：9，及(ii)至少一個選自由以下組成之群之下游UL18側翼區：SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：10。
15. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含(i)至少一個選自由以下組成之群之上游UL8側翼區：SEQ ID NO：11及(ii)至少一 個選自由以下組成之群之下游UL8側翼區：SEQ ID NO：12。
16. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中複製缺陷型意指複製率至少降低90%。
17. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該複製缺陷型EHV載體仍具感染性。
18. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含至少一個所關注之核苷酸序列，其插入插入位點中。
19. 如請求項18之複製缺陷型EHV載體，其中該所關注之外源核苷酸序列係所關注之基因。
20. 如請求項18之複製缺陷型EHV載體，其中該所關注之外源核苷酸序列係抗原編碼序列。
21. 如請求項18之複製缺陷型EHV載體，其中該插入位點係UL56及/或US4。
22. 如請求項1或2之複製缺陷型EHV載體，其中該EHV載體包含表現盒，其包含至少一個所關注之外源核苷酸序列，其中該所關注之外源核苷酸序列係抗原編碼序列，該抗原編碼序列係關於感染產食動物或伴侶動物 之病原體。
23. 如請求項22之複製缺陷型EHV載體，其中該產食動物係豬、牛或家禽，或該伴侶動物係貓、馬或狗。
24. 如請求項22之複製缺陷型EHV載體，其中該抗原編碼序列係來自選自包含以下清單之病原體：施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus)、A型流行性感冒病毒、豬呼吸及生殖症候群病毒、豬環狀病毒、典型豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、E型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、狂犬病病毒、貓麻疹病毒(Morbillivirus)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)及胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae)。
25. 一種表現EHV之UL8及/或UL18或其功能部分的細胞系，其用於培養如請求項1至24中任一項之複製缺陷型EHV載體。
26. 一種免疫原性組合物，其包含一或多種如請求項1至24中任一項之EHV載體。
27. 一種如請求項26之免疫原性組合物之用途，其用於製造為個體免疫之藥劑。