CN112593014A - 一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法 - Google Patents

一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法，涉及分子生物技术体外诊断领域。该核酸组合物既可以实现其中一种的病原体的检测，也可以实现猫上呼吸道疾病多重病原体的同时检测。该核酸组合物具有检测特异性好，灵敏度高的优点。本发明还提供了一种检测试剂盒及检验方法，使用本发明提供的方法进行检测时，无需开盖，且无污染，检测方法方便快捷。本发明为猫呼吸道疾病的临床诊断提供了快速准确地检测方法。

Description

一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及 方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术体外诊断领域，具体而言，涉及一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法。
背景技术
猫上呼吸道疾病(Feline upper respiratory tract disease,URTD)是猫常见的临床疾病，以呼吸道粘膜发生炎症为主要特征，发病率高。URTD常见的病原有5种，包括猫疱疹1型病毒、猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌。
尽管猫三联疫苗已在世界范围内被广泛使用，但猫疱疹1型病毒(FelineHerpesvirus typeⅠ，FHV-1)与猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)仍是引起猫上呼吸道疾病的主要病因。在猫舍、收养所等饲养密度高的地方更易发生猫疱疹病毒及猫杯状病毒的感染。猫疱疹病毒及猫杯状病毒可引起猫的鼻炎、结膜炎、口腔炎症等，或伴有肺炎、发热等症状。另外猫杯状病毒的感染还能导致恶性系统性猫杯状病毒病，死亡率较高。猫支原体(Mycoplasma felis，M.felis)，又称为猫霉形体；猫衣原体(Chlamydophila felis，C.felis)，又称猫披衣菌；这两种病原临床表现为结膜炎、大量眼鼻分泌物、打喷嚏、气促等，后期可能会转化为化脓性肺炎。支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)感染猫后，临床症状是非特异性的，从打喷嚏和流涕等轻微症状到肺炎等严重症状不等，总发病率为0％-30％。
因此，引发猫上呼吸道疾病的几种病原体的临床症状相似度较高，且常出现多重病原共同感染的情况，在临床诊断中需要区分病原体时难度较大。
目前临床常用的诊断方法有免疫荧光抗体检测、血清抗体滴度、病毒分离或细菌培养等技术，但存在检测周期长、灵敏度低、检测病原单一等缺点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法以解决上述技术问题。
近两年PCR检测开始广泛应用于宠物体外诊断中，是行业内公认的一种快速、灵敏度高、特异性好的诊断方法。实时荧光定量PCR的原理为：在PCR扩增过程中，病原体的引物探针与靶核酸特异性地结合，然后模板-引物的结合物在聚合酶、dNTP等的作用下开始进行互补链的延伸，同时聚合酶的外切活性将探针上的荧光基团剪切下来，使其远离于探针另一端的淬灭基团，发出荧光。由此使得荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，进而通过仪器进行实时监控。如果对不同靶标的探针标记不同检测通道的荧光报告基团，则可实现同时对多种靶标进行核酸检测。
基于目前市面上较少同时检测猫呼吸道多重病原体的实时荧光定量PCR试剂盒及快速进行病原体分析的方法。本发明提供了一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法，该多重实时荧光PCR检测兼具PCR检测的优点，可实现快速准确地同时检测引起猫呼吸道疾病的多重病原体，对猫呼吸道疾病的临床诊断及治疗有着重要的意义。
此外，也可以单独使用其中一组核酸组合物实现特异性的单一病原体的检出。
本发明是这样实现的：
一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物，其包括如下至少一种的核酸组合：
用于检测猫疱疹1型病毒的第一核酸组合、用于检测猫杯状病毒的第二核酸组合、用于检测猫支原体的第三核酸组合、用于检测猫衣原体的第四核酸组合和用于检测支气管败血波氏杆菌的第五核酸组合；
第一核酸组合包括第一引物对和第一探针，第二核酸组合包括第二引物对和第二探针，第三核酸组合包括第三引物对和第三探针，第四核酸组合包括第四引物对和第四探针，第五核酸组合包括第五引物对和第五探针；
第一引物对的序列与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列至少有80％的序列一致性；第一探针的序列与SEQ ID NO.3所示的序列至少有80％的序列一致性；
第二引物对的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列至少有80％的序列一致性；第二探针的序列与SEQ ID NO.6所示的序列至少有80％的序列一致性；
第三引物对的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列至少有80％的序列一致性；第三探针的序列与SEQ ID NO.9所示的序列至少有80％的序列一致性；
第四引物对的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列至少有80％的序列一致性；第四探针的序列与SEQ ID NO.12所示的序列至少有80％的序列一致性；
第五引物对的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列至少有80％的序列一致性；第五探针的序列与SEQ ID NO.15所示的序列至少有80％的序列一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针和第五探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；第一探针的序列与SEQ ID NO.3所示；
第二引物对的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；第二探针的序列与SEQ IDNO.6所示；
第三引物对的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；第三探针的序列与SEQ IDNO.9所示；
第四引物对的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；第四探针的序列与SEQID NO.12所示；
第五引物对的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；第五探针的序列与SEQID NO.15所示。
一种检测猫上呼吸道疾病病原体的试剂盒，其包括上述的核酸组合物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中第一核酸组合的第一引物对的浓度为0.1-20μM，第一探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第二核酸组合的第二引物对的浓度为0.1-20μM，第二探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第三核酸组合的第三引物对的浓度为0.1-20μM，第三探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第四核酸组合的第四引物对的浓度为0.1-20μM，第四探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第五核酸组合的第五引物对的浓度为0.1-20μM，第五探针的浓度为0.1-20μM。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中第一核酸组合的第一引物对的浓度为0.3-1μM，第一探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第二核酸组合的第二引物对的浓度为0.3-1μM，第二探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第三核酸组合的第三引物对的浓度为0.3-1μM，第三探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第四核酸组合的第四引物对的浓度为0.3-1μM，第四探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第五核酸组合的第五引物对的浓度为0.3-1μM，第五探针的浓度为0.3-1μM。
一种猫上呼吸道疾病病原体的检验方法，其包括：以待测核酸样本为模板序列，采用上述的核酸组合物，或者采用上述的试剂盒进行PCR扩增检测。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增检测的程序包括：50-55℃，逆转录5-30min；95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-15s，55-60℃，退火和延伸共20-40s，循环40次。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增检测的程序包括：50℃，逆转录10min；95℃，预变性3min；95℃，变性5s，60℃，退火和延伸共20s，循环40次。
优选地，PCR扩增检测的程序包括：95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-15s，55-60℃，退火和延伸共20-40s，循环40次。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待测核酸样本为待测RNA样本或待测DNA样本。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增检测的体系中包括如下至少一种的反应体系：用于检测猫疱疹1型病毒的反应体系、用于检测猫杯状病毒的反应体系、用于检测猫支原体的反应体系、用于检测猫衣原体的反应体系和用于检测支气管败血波氏杆菌的反应体系；
其中，用于检测猫疱疹1型病毒的反应体系中第一引物对的浓度为0.1-20μM，第一探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫杯状病毒的反应体系中第二引物对的浓度为0.1-20μM，第二探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫支原体的反应体系中第三引物对的浓度为0.1-20μM，第三探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫衣原体的反应体系中第四引物对的浓度为0.1-20μM，第四探针的浓度为0.1-20μM，用于检测支气管败血波氏杆菌的反应体系中第五引物对的浓度为0.1-20μM，第五探针的浓度为0.1-20μM。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物，该核酸组合物既可以实现其中一种的病原体的检测，也可以实现猫上呼吸道疾病多重病原体的同时检测。该核酸组合物具有检测特异性好，灵敏度高的优点。本发明还提供了一种检测试剂盒及检验方法，使用本发明提供的方法进行检测时，无需开盖，且无污染，检测方法方便快捷。本发明为猫呼吸道疾病的临床诊断提供了快速准确地检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为使用引物对M.felis检测的荧光定量曲线；
图2是使用引物对FCV检测的荧光定量曲线；
图3是使用引物对Bb检测的荧光定量曲线；
图4是使用引物对C.felis检测的荧光定量曲线；
图5是采用检测FHV的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果；
图6是采用检测FCV的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果；
图7是采用检测M.felis的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果；
图8是采用检测C.felis的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果；
图9是采用检测Bb的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果；
图10是实验例5所示的试剂盒线性测试结果；
图11为FHV-1质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图；
图12为FCV质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图；
图13为M.felis质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图；
图14为C.felis质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图；
图15为Bb质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图；
图16为引物特异性实验电泳图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物，其包括如下至少一种的核酸组合：
用于检测猫疱疹1型病毒的第一核酸组合、用于检测猫杯状病毒的第二核酸组合、用于检测猫支原体的第三核酸组合、用于检测猫衣原体的第四核酸组合和用于检测支气管败血波氏杆菌的第五核酸组合。
可选的，选择第一核酸组合和第二核酸组合来检测猫疱疹1型病毒和猫杯状病毒。选择第一核酸组合和第三核酸组合来检测猫疱疹1型病毒和猫支原体。选择第一核酸组合和第四核酸组合来检测猫疱疹1型病毒和猫衣原体。选择第一核酸组合和第五核酸组合来检测猫疱疹1型病毒和支气管败血波氏杆菌。可选的，选择第二核酸组合和第三核酸组合来检测猫杯状病毒和猫支原体。可选的，选择第四核酸组合和第五核酸组合来检测猫衣原体和支气管败血波氏杆菌。
可选的，选择第一核酸组合、第二核酸组合和第三核酸组合来检测猫疱疹1型病毒、猫杯状病毒和猫支原体。可选的，选择第三核酸组合、第四核酸组合和第五核酸组合来检测猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌。
可选的，选择第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合和第四核酸组合来检测猫疱疹1型病毒、猫杯状病毒、猫支原体和猫衣原体。可选的，选择第二核酸组合、第三核酸组合、第四核酸组合和第五核酸组合来检测猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌。
可选的，选择第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合、第四核酸组合和第五核酸组合来同时检测猫疱疹1型病毒、猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌。
在其他实施方式中，用于检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物可以是上述五种核酸组合的任意几种的随机组合，并不限于上述列举的几种组合方式。
第一核酸组合包括第一引物对和第一探针，第二核酸组合包括第二引物对和第二探针，第三核酸组合包括第三引物对和第三探针，第四核酸组合包括第四引物对和第四探针，第五核酸组合包括第五引物对和第五探针。
第一引物对的序列与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列至少有80％的序列一致性；第一探针的序列与SEQ ID NO.3所示的序列至少有80％的序列一致性。
在一种实施方式中，第一引物对的序列与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性；第一探针的序列与SEQ ID NO.3所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性。
第二引物对的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列至少有80％的序列一致性；第二探针的序列与SEQ ID NO.6所示的序列至少有80％的序列一致性。
在一种实施方式中，第二引物对的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性；第二探针的序列与SEQ ID NO.6所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性。
第三引物对的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列至少有80％的序列一致性；第三探针的序列与SEQ ID NO.9所示的序列至少有80％的序列一致性。
在一种实施方式中，第三引物对的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性；第三探针的序列与SEQ ID NO.9所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性。
第四引物对的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列至少有80％的序列一致性；第四探针的序列与SEQ ID NO.12所示的序列至少有80％的序列一致性。
在一种实施方式中，第四引物对的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性；第四探针的序列与SEQ ID NO.12所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性。
第五引物对的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列至少有80％的序列一致性；第五探针的序列与SEQ ID NO.15所示的序列至少有80％的序列一致性。
在一种实施方式中，第五引物对的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性；第五探针的序列与SEQ ID NO.15所示的序列有80％，85％，90％，95％或100％的序列一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针和第五探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
可选的，设置第一探针、第二探针、第三探针、第四探针和第五探针的5’端标记有不同的荧光报告基因。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。在其他实施方式中，探针标记的荧光报告基团也可以根据需要进行自适应调整。猝灭基团也可以根据需要进行自适应调整。
荧光报告基团HEX的最大荧光吸收波长为535nm，中文名称为六氯-6-甲基荧光素。
FAM的最大荧光吸收波长为495nm，中文名称为6-羧基荧光素。
TET的最大荧光吸收波长为521nm，中文名称为四氯-6-羧基荧光素。
JOE的最大荧光吸收波长为520nm，中文名称为2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素。
TAMRA的最大荧光吸收波长为555nm，中文名称为6-羧基四甲基若丹明。
ROX的最大荧光吸收波长为575nm。
Texas Red的最大荧光吸收波长为589nm。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；第一探针的序列与SEQ ID NO.3所示；
第二引物对的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；第二探针的序列与SEQ IDNO.6所示；
第三引物对的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；第三探针的序列与SEQ IDNO.9所示；
第四引物对的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；第四探针的序列与SEQID NO.12所示；
第五引物对的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；第五探针的序列与SEQID NO.15所示。
一种检测猫上呼吸道疾病病原体的试剂盒，其包括上述的核酸组合物。
在其他的实施方式中，上述试剂盒还包括荧光定量预混液，荧光定量预混液还包括PCR buffer和酶混合液。PCR buffer可选择市售的PCR缓冲液。
PCR buffer含有PCR缓冲物质、阳离子、阴离子和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，PCR缓冲物质为Tris-HCl。Tris-HCl的浓度为40-400mM，有效缓冲范围在pH7.0-9.2之间。
在本发明的一些实施方式中，阳离子包括二价阳离子和一价阳离子；一价阳离子包括K+和NH4 +，二价阳离子包括Mg2+，阴离子包括SO4 2-和Cl-。
二价阳离子的浓度为15-40mM，一价阳离子的浓度为200-500mM，SO4 2-的浓度为15-40mM。
在本发明的一些实施方式中，脱氧核糖核苷酸包括dATP、dCTP、dGTP以及dUTP。dATP、dCTP和dGTP的浓度为0.4-4mM，dUTP的浓度为1.5-8mM。
酶混合液包括DNA聚合酶和UNG酶。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中第一核酸组合的第一引物对的浓度为0.1-20μM，第一探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第二核酸组合的第二引物对的浓度为0.1-20μM，第二探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第三核酸组合的第三引物对的浓度为0.1-20μM，第三探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第四核酸组合的第四引物对的浓度为0.1-20μM，第四探针的浓度为0.1-20μM，试剂盒中第五核酸组合的第五引物对的浓度为0.1-20μM，第五探针的浓度为0.1-20μM。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中第一核酸组合的第一引物对的浓度为0.3-1μM，第一探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第二核酸组合的第二引物对的浓度为0.3-1μM，第二探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第三核酸组合的第三引物对的浓度为0.3-1μM，第三探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第四核酸组合的第四引物对的浓度为0.3-1μM，第四探针的浓度为0.3-1μM，试剂盒中第五核酸组合的第五引物对的浓度为0.3-1μM，第五探针的浓度为0.3-1μM。
一种猫上呼吸道疾病病原体的检验方法，其包括：以待测核酸样本为模板序列，采用上述的核酸组合物，或者采用上述的试剂盒进行PCR扩增检测。
上述的检验方法可以对RNA样本的检验，也可以对DNA样本进行检验。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增检测的程序包括：50-55℃，逆转录5-30min；95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-15s，55-60℃，退火和延伸共20-40s，循环40次。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增检测的程序包括：50℃，逆转录10min；95℃，预变性3min；95℃，变性5s，60℃，退火和延伸共20s，循环40次。
在一种实施方式中，也可以DNA为模板，采用如下的PCR扩增检测的程序进行扩增：95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-15s，55-60℃，退火和延伸共20-40s，循环40次。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待测核酸样本为待测RNA样本或待测DNA样本。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增检测的体系中包括如下至少一种的反应体系：用于检测猫疱疹1型病毒的反应体系、用于检测猫杯状病毒的反应体系、用于检测猫支原体的反应体系、用于检测猫衣原体的反应体系和用于检测支气管败血波氏杆菌的反应体系；
其中，用于检测猫疱疹1型病毒的反应体系中第一引物对的浓度为0.1-20μM，第一探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫杯状病毒的反应体系中第二引物对的浓度为0.1-20μM，第二探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫支原体的反应体系中第三引物对的浓度为0.1-20μM，第三探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫衣原体的反应体系中第四引物对的浓度为0.1-20μM，第四探针的浓度为0.1-20μM，用于检测支气管败血波氏杆菌的反应体系中第五引物对的浓度为0.1-20μM，第五探针的浓度为0.1-20μM。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物。
本实施例提供的核酸组合物包括：用于检测猫疱疹1型病毒的第一核酸组合、用于检测猫杯状病毒的第二核酸组合、用于检测猫支原体的第三核酸组合、用于检测猫衣原体的第四核酸组合和用于检测支气管败血波氏杆菌的第五核酸组合；
第一核酸组合包括第一引物对和第一探针，第二核酸组合包括第二引物对和第二探针，第三核酸组合包括第三引物对和第三探针，第四核酸组合包括第四引物对和第四探针，第五核酸组合包括第五引物对和第五探针。
第一探针、第二探针、第三探针、第四探针和第五探针的5’端分别标记有如下的荧光报告基团：FAM、HEX、Texas Red、CY5和Alexa Flour，3’端标记有荧光淬灭基团分别为MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3和BHQ3。
通过查询相关资料文献、对比数据库中各目标病原体的核苷酸序列，选取其中高度保守且具有特异性的基因部位，并从NCBI(美国国家生物信息中心)下载相关序列(FHV-1TK基因、FCV P30基因、M.felis tuf基因C.felis ompA基因和Bb鞭毛蛋白基因)，然后使用Primer5.0或Oligo7软件进行引物探针设计，设计中需尽量保证引物无二聚体、发卡结构的存在，且其引物退火温度在60℃左右。筛选后得到表1所示的序列：
表1设计获得的引物序列和探针序列表。
Figure BDA0002878150420000091
表1中用于检测猫疱疹1型病毒的引物分别是FHV-1-F、FHV-1-R，探针序列为FHV-1-P。相对应的，FHV-1-F的序列如SEQ ID NO.1所示，FHV-1-R的序列如SEQ ID NO.2所示；FHV-1-P的序列与SEQ ID NO.3所示。
猫杯状病毒的检测引物是FCV-F、FCV-R，探针序列为FCV-P；FCV-F和FCV-R的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；FCV-P的序列与SEQ ID NO.6所示。
猫支原体的检测引物是M.felis-F、M.felis-R，探针序列为M.felis-P；M.felis-F、M.felis-R的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；M.felis-P的序列与SEQ ID NO.9所示。
猫衣原体的检测引物是C.felis-F、C.felis-R，探针序列为C.felis-P。C.felis-F、C.felis-R的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；C.felis-P的序列与SEQ IDNO.12所示；
支气管败血波氏杆菌的检测引物是Bb-F、Bb-R，探针序列为Bb-P。Bb-F、Bb-R的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；Bb-P的序列与SEQ ID NO.15所示。
根据表1所示的引物进行扩增出的目的片段长度及序列分别为：
由FHV-1-F、FHV-1-R扩增出的目的片段长度为71bp，目的片段的序列为CAGGATATCAGAAAGTTGTATGTGAGGTTCACCCCGACGTGACGGTTTTCATAGATAGACACCCTCTCGCC。
由FCV-F、FCV-R扩增出的目的片段长度为129bp，目的片段的序列为GTGTTAGGTTGGATGAACTTGCCGCCAATCAACATGTGGTAACCGTTAACTCGGTGTTTGATTTGGCCACGGCTCTTCGCCGTCACCTATCACTAACTGGGGTGTTTCAGGCCATCAGAGCCGCATATG。
由M.felis-F、M.felis-R扩增出的目的片段的长度为115bp，目的片段的序列为CCAATTATTCGTGGATCTGCTAATATAGCTCTTGATGGTGTTCCTGTATGAGAAGAAAAAGTTATGGAATTAATGGATGCAGTTGATAGTTACATTGAAACTCCAGAAAAAGACT。
由C.felis-F、C.felis-R扩增出的目的片段的长度为119bp，目的片段的序列为CACACCAAGTAGCGCAAGGAAGGCAAGGATCTCCTGAAGCACCTTCCCACATAGTGCCATGCATTAATAAACTTGGTTCAGCTGGGTTCCCTACAGGCATCGCTTGTAAGGAGAGAGCG。
由Bb-F、Bb-R扩增出的目的片段长度为93bp，目的片段的序列为GCAGTCCTTGAGCGTGATCTCGAAGGGCGTACGGCCAGCTTCGTCTCCATCGATGGCCAGCGCGCTCTTGGAATTCTTGGGCAATTGCACCAC。
对比例1
本对比例通过查询相关资料文献、对比数据库中各目标病原体的核苷酸序列，选取其中高度保守且具有特异性的基因部位，并从NCBI(美国国家生物信息中心)下载相关序列(FHV-1TK基因、FCV P30基因、M.felis tuf基因C.felis ompA基因和Bb鞭毛蛋白基因)，然后使用Primer5.0或Oligo7软件进行引物探针设计，设计中需尽量保证引物无二聚体、发卡结构的存在，且其引物退火温度在60℃左右。筛选后得到表2所示的序列：
表2对比例1设计的引物/探针序列表。
Figure BDA0002878150420000111
根据表2所示的引物进行扩增出的目的片段长度及序列分别为：
由FCV-F1、FCV-R1扩增出的目的片段长度为78bp，目的片段的序列为CTGACTTCAAGTTTCACCTCCTTAAGCCACCCGGATCTATGCTAACCCATGGCTCTATCCCTTCTGATTTAATTCCCA。
由M.felis-F1、M.felis-R1扩增出的目的片段的长度为68bp，目的片段的序列为GTTCGGTCTGCCATTTGCTTCTGGCTGATTAGTATTACTTGCGTTACCTGTAGCCTGCGTAGGAGTTG。
由C.felis-F1、C.felis-R1扩增出的目的片段的长度为81bp，目的片段的序列为GGGTTCCATGTAGTAATGTTAAGAATCTCCGATTTTAATTTAGGTTGAGCAATGCGGATAGTATCAGCATCAAAAGTTGCT。
由Bb-F1、Bb-R1扩增出的目的片段长度为104bp，目的片段的序列为GATCGAATACGCCTTTAGGTCGCCGGTAGCGTAGTCGGTGGTCGGCCCAGGCTCGAAGTACGCTTTCACGCCATTGTTCAGGGACGAGGGGCAGTCCTTGAGCG。
实验例1
本实验例使用实施例1表1提供的核酸组合物和对比例1提供的核酸组合物分别进行猫上呼吸道疾病病原体的检验。表1和表2中的引物委托赛默飞世尔科技公司进行合成。
待测样本的处理：分别对猫疱疹1型病毒、猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌临床样本进行核酸提取，提取后的病原体核酸先使用市售Y厂家的PCR单项检测试剂进行验证，以确认各病原体为阳性。本实验例中，猫疱疹1型病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌待测样本为DNA样本，猫杯状病毒待测样本为RNA样本。
分别使用实施例1表1中用于检测猫疱疹1型病毒，猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌的引物序列分别对猫疱疹1型病毒、猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌临床样本进行扩增。对应的，以对比例1表2中的引物及探针分别扩增猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体和支气管败血波氏杆菌临床样本。
荧光定量PCR反应体系如下：采用25μL的反应体系，其中有12.5μLPCR反应液(包括逆转录酶(仅在猫杯状病毒PCR中添加，其他的病原体检测无需添加逆转录酶)、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2)，引物探针终浓度均为0.4μM，即FHV-1的反应体系中FHV-1-F、FHV-1-R、FHV-1-P各加入0.2μL，FCV的反应体系中FCV-F、FCV-R、FCV-P各加入0.2μL，M.Felis的反应体系中M.Felis-F、M.Felis-R、M.Felis-P各加入0.2μL，C.Felis的反应体系中C.Felis-F、C.Felis-R、C.Felis-P各加入0.2μL，Bb的反应体系中Bb-F、Bb-R、Bb-P各加入0.2μL，DEPC处理水6.9μL，模板量为5μL。
荧光定量PCR反应程序如下：50℃，逆转录10min(逆转录步骤仅为猫杯状病毒，其他的病原体无需逆转录步骤，直接进行后续的预变性反应程序)；95℃，预变性3min；95℃，变性5s，60℃，退火和延伸共20s，循环40次。
荧光定量PCR的反应结果参照图1-图4所示，由图1可知，与对比例1相比，使用本实施例1提供的引物及探针进行检测M.felis时，Ct值差异较小，且检测M.felis的荧光值更高。由图2可知，与对比例1相比，使用本实施例1提供的引物及探针进行检测FCV时，Ct值小，且检测FCV的荧光值更高。
由图3可知，与对比例1相比，使用本实施例1提供的引物及探针进行检测Bb时，Ct值小，因此，实施例1提供的引物及探针组合可以用于检测Bb。
由图4可知，与对比例1相比，使用本实施例1提供的引物及探针进行检测C.felis时，Ct值小，且荧光值更高，因此，实施例1提供的引物及探针组合可以用于检测C.felis。
实验例2
进行引物特异性实验。使用实施例1提供的各组引物对实验例1的各阳性病原体样本进行扩增，并将扩增产物委托西安擎科生物科技有限公司进行电泳及测序。
扩增程序：50℃，逆转录10min(逆转录步骤仅为猫杯状病毒，其他的病原体无需逆转录步骤，直接进行后续的预变性反应程序)；95℃，预变性3min；95℃，变性5s，60℃，退火和延伸共20s，循环40次。
反应体系与实验例1相比，区别仅在于不添加荧光探针。
电泳图谱显示各引物组扩增出的条带大小与预期的目的片段大小一致，参照图16所示。
同时将测序结果在NCBI中进行BLAST序列对比，结果显示扩增产物确实为各病原体中的片段，符合预期。
实验例3
本实验例进行了检测时所使用的引物和探针浓度的筛选实验。
采用实施例1中筛选出的引物探针核酸组合，首先对其反应浓度进行筛选，筛选范围在0.1-1μM以内。然后按照各引物探针的不同浓度配制PCR反应液，筛选的引物探针浓度包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.8μM。对已确认为阳性的各病原体核酸样本(与实验例1的病原体核酸样本来源相同)进行扩增。通过扩增结果优选引物探针浓度，最终确定的各病原体引物探针反应浓度如表3所示。
采用25μL的反应体系，包括12.5μLPCR反应液(包括逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl)和各病原体的引物探针组合，各病原体的引物探针浓度筛选分别单独进行，互不影响。检测不同引物探针浓度下的荧光信号，其中PCR反应液购自宝锐生物科技有限公司。
PCR反应条件为：(1)50℃逆转录10min；(2)95℃预变性3min；(3)95℃变性5s；(4)60℃退火/延伸20s，采集荧光。其中(3)-(4)共进行40个循环。60℃设置采集荧光信号。
表3各病原体引物探针反应浓度表。
Figure BDA0002878150420000131
实验例4
本实验例提供了一种检测试剂盒，其包括实施例1提供的核酸组合。本实验例进行检测试剂盒的特异性实验，试剂盒采用25μL的反应体系，反应体系参照表4所示：
表4各实验组的反应体系表。
Figure BDA0002878150420000132
Figure BDA0002878150420000141
设置检测猫疱疹病毒(FHV)引物的特异性实验组8个PCR小管，分别向反应PCR小管中加入目标病原体和其它干扰病原体进行荧光定量PCR，8个PCR小管中分别添加猫疱疹病毒(FHV)、猫杯状病毒(FCV)、猫支原体(M.felis)、猫衣原体(C.felis)、支气管败血波氏杆菌(Bb)、猫冠状病毒(FCoV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)。然后按照表4所示的反应体系加入其他组分，按照优化后的反应条件(参照实验例1或3所示的反应程序)进行扩增。
同样地，设置检测猫杯状病毒(FCV)、猫支原体(M.felis)、猫衣原体(C.felis)、支气管败血波氏杆菌(Bb)引物的特异性实验组。每个实验例组设置8个PCR小管。设置3个重复。
图5-图9为示出的部分重复的测试结果。结果显示，各病原体的引物探针只能特异性扩增特定的病原体，而对其余病原体均无交叉扩增。
图5为采用检测FHV的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果，结果显示，本发明实施例1提供的FHV检测引物及探针的特异性高。
图6为采用检测FCV的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果，结果显示，本发明实施例1提供的FCV检测引物及探针的特异性高。
图7为采用检测M.felis的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果，结果显示，本发明实施例1提供的M.felis检测引物及探针的特异性高。
图8为采用检测C.felis的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果，结果显示，本发明实施例1提供的C.felis检测引物及探针的特异性高。
图9为采用检测Bb的引物和探针对目标病原体和其它干扰病原体的荧光定量PCR测试结果，结果显示，本发明实施例1提供的Bb检测引物及探针的特异性高。
实验例4
本实验例进行了检测试剂盒重复性实验。
本实验例对浓度小于1×104copies/mL的各病原样本进行扩增，每种样本重复扩增10次，得出下表5的数据，变异系数(CV，％)均小于2％。扩增采用的程序和体系与实验例1相同。
表5重复性实验数据。
FHV-1 FCV M.felis C.felis Bb
平均Ct值 34.24 32.06 36.10 35.29 34.38
CV,％ 1.49 1.21 1.56 1.48 1.60
实验例5
本实验例进行试剂盒的扩增线性测试。
根据各病原体的目的基因，委托西安擎科生物科技有限公司分别合成5个病原体的质粒。将浓度为1×107copies/mL的FHV-1质粒、×107copies/mL的M.felis1质粒、2×106copies/mLFCV的质粒、2×106copies/mL的C.felis质粒、2×106copies/mL的Bb质粒分别按十倍梯度进行稀释，共稀释4个梯度，然后进行扩增，测试其扩增效率，图10为测试结果。结果显示，质粒的各个浓度与Ct值间呈线性关系，质粒浓度相差10倍，Ct值相差约3.3，与理论值相符。
实验例6
本实验例进行引物的灵敏度实验。
将实验例5所示的各病原体的质粒分别稀释至1×103copies/mL、5×102copies/mL、2×102copies/mL浓度后进行扩增，选择检出率在95％以上的最低浓度即为检测限浓度。
图11为FHV-1质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图、图12为FCV质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图、图13为M.felis质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图、图14为C.felis质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图、图15为Bb质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图。最终确认FHV-1、FCV、M.felis、C.felis、Bb的引物检测限为5×102copies/mL。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海基灵生物科技有限公司
<120> 一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物、试剂盒以及方法
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caggatatca gaaagttgta tgtgaggtt 29
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcgagaggg tgtctatcta tgaaa 25
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccccgacg tgacgg 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgttaggtt ggatgaactt g 21
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catatgcggc tctgatggct tgaaacac 28
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcggtgtttg atttggccac 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccaattattc gtggatctgc taata 25
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agtctttttc tggagtttca atgtaac 27
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctcttgatgg tgttcctgt 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgctctctcc ttacaagcga 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cacaccaagt agcacaagga ag 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caccttccca catagtgcca tgc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcagtccttg agcgtgatct c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtggtgcaat tgcccaagaa t 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cggccagctt cgtctccatc ga 22

Claims (10)

1.一种检测猫上呼吸道疾病病原体的核酸组合物，其特征在于，其包括如下至少一种的核酸组合：
用于检测猫疱疹1型病毒的第一核酸组合、用于检测猫杯状病毒的第二核酸组合、用于检测猫支原体的第三核酸组合、用于检测猫衣原体的第四核酸组合和用于检测支气管败血波氏杆菌的第五核酸组合；
所述第一核酸组合包括第一引物对和第一探针，所述第二核酸组合包括第二引物对和第二探针，第三核酸组合包括第三引物对和第三探针，所述第四核酸组合包括第四引物对和第四探针，所述第五核酸组合包括第五引物对和第五探针；
所述第一引物对的序列与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列至少有80％的序列一致性；所述第一探针的序列与SEQ ID NO.3所示的序列至少有80％的序列一致性；
所述第二引物对的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列至少有80％的序列一致性；所述第二探针的序列与SEQ ID NO.6所示的序列至少有80％的序列一致性；
所述第三引物对的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列至少有80％的序列一致性；所述第三探针的序列与SEQ ID NO.9所示的序列至少有80％的序列一致性；
所述第四引物对的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列至少有80％的序列一致性；所述第四探针的序列与SEQ ID NO.12所示的序列至少有80％的序列一致性；
所述第五引物对的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列至少有80％的序列一致性；所述第五探针的序列与SEQ ID NO.15所示的序列至少有80％的序列一致性。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针、所述第四探针和所述第五探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
优选地，在所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针、所述第四探针和所述第五探针的5’端标记有不同的荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。
4.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一引物对的序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；所述第一探针的序列与SEQ ID NO.3所示；
所述第二引物对的序列与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；所述第二探针的序列与SEQ ID NO.6所示；
所述第三引物对的序列与SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述第三探针的序列与SEQ ID NO.9所示；
所述第四引物对的序列与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述第四探针的序列与SEQ ID NO.12所示；
所述第五引物对的序列与SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；所述第五探针的序列与SEQ ID NO.15所示。
5.一种检测猫上呼吸道疾病病原体的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的核酸组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中第一核酸组合的第一引物对的浓度为0.1-20μM，第一探针的浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第二核酸组合的第二引物对的浓度为0.1-20μM，第二探针的浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第三核酸组合的第三引物对的浓度为0.1-20μM，第三探针的浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第四核酸组合的第四引物对的浓度为0.1-20μM，第四探针的浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第五核酸组合的第五引物对的浓度为0.1-20μM，第五探针的浓度为0.1-20μM；
优选地，所述试剂盒中第一核酸组合的第一引物对的浓度为0.3-1μM，第一探针的浓度为0.3-1μM，所述试剂盒中第二核酸组合的第二引物对的浓度为0.3-1μM，第二探针的浓度为0.3-1μM，所述试剂盒中第三核酸组合的第三引物对的浓度为0.3-1μM，第三探针的浓度为0.3-1μM，所述试剂盒中第四核酸组合的第四引物对的浓度为0.3-1μM，第四探针的浓度为0.3-1μM，所述试剂盒中第五核酸组合的第五引物对的浓度为0.3-1μM，第五探针的浓度为0.3-1μM。
7.一种猫上呼吸道疾病病原体的检验方法，其特征在于，其包括：以待测核酸样本为模板序列，采用权利要求1-4任一项所述的核酸组合物，或者采用权利要求5-6中任一项所述的试剂盒进行PCR扩增检测。
8.根据权利要求7所述的检验方法，其特征在于，所述PCR扩增检测的程序包括：50-55℃，逆转录5-30min；95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-15s，55-60℃，退火和延伸共20-40s，循环40次；
优选地，50℃，逆转录10min；95℃，预变性3min；95℃，变性5s，60℃，退火和延伸共20s，循环40次；
优选地，所述PCR扩增检测的程序包括：95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-15s，55-60℃，退火和延伸共20-40s，循环40次。
9.根据权利要求7-8任一项所述的检验方法，其特征在于，所述待测核酸样本为待测RNA样本或待测DNA样本。
10.根据权利要求7-8任一项所述的检验方法，其特征在于，所述PCR扩增检测的体系中包括如下至少一种的反应体系：用于检测猫疱疹1型病毒的反应体系、用于检测猫杯状病毒的反应体系、用于检测猫支原体的反应体系、用于检测猫衣原体的反应体系和用于检测支气管败血波氏杆菌的反应体系；
其中，用于检测猫疱疹1型病毒的反应体系中第一引物对的浓度为0.1-20μM，第一探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫杯状病毒的反应体系中第二引物对的浓度为0.1-20μM，第二探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫支原体的反应体系中第三引物对的浓度为0.1-20μM，第三探针的浓度为0.1-20μM，用于检测猫衣原体的反应体系中第四引物对的浓度为0.1-20μM，第四探针的浓度为0.1-20μM，用于检测支气管败血波氏杆菌的反应体系中第五引物对的浓度为0.1-20μM，第五探针的浓度为0.1-20μM。
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