CN113025754A

CN113025754A - 一种检测猫贫血病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN113025754A
Application number: CN202110337242.XA
Authority: CN
Inventors: 孙依欣; 王佳琳; 张晓婷
Original assignee: Shanghai Jiling Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Jiling Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-06-25

Abstract

本发明公开了一种检测猫贫血病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法，涉及分子生物技术体外诊断技术领域。该核酸组合物具有灵敏度高，检测限低的优势，且可最多同时检测猫贫血六种病原体。同时还提供了一种检测试剂盒，该试剂盒可一次性检测引起猫贫血的多重病原体，可根据实际检测不同病原体的需要提供对应的试剂盒。此检测试剂盒特异性好，灵敏度高，可实现目标病原体的快速检测。该核酸组合物以及试剂盒配合实时荧光定量PCR法可以在病原体感染早期就可进行特异性的检测，对猫贫血的临床诊断及治疗有着重要的意义。

Description

一种检测猫贫血病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术体外诊断技术领域，具体而言，涉及一种检测猫贫血病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法。

背景技术

贫血是宠物诊疗中常见的血液异常症状，但在临床诊断治疗时常常忽视了潜在的传染性疾病。在引起猫贫血的病原体中，猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫嗜血支原体(3种分型)、汉赛巴尔通体尤为常见，其以不同程度的再生或非再生性贫血为主要临床特征。

其中，猫获得性免疫缺陷综合征又称猫艾滋病，是由猫免疫缺陷病毒(Felineimmunodeficiency virus,FIV)引起的长潜伏期慢性接触性传染病。临床以发热、淋巴结肿胀、轻度至中度的非再生障碍贫血为特征，致死率较高。

猫白血病病毒(Feline leukemia virus,FeLV)是引起猫白血病的重要病原之一，感染后常伴发恶性肿瘤、血液病、免疫介导疾病以及神经性疾病等。

猫嗜血支原体(Mycoplasma haemofelis)又称猫血巴尔通体(Felinehemoplasmosis)、猫附红细胞体，是引起猫溶血性贫血的主要病原之一。俄亥俄州株(Mycoplasma haemofelis，Mhf)、加州株(Mycoplasma haemominutum，Mhm)和瑞士苏黎世变种(Mycoplasma turicensis，Mtc)是猫嗜血支原体主要的菌株类型。其中，俄亥俄株感染后症状最为严重，致病性强，常见发热、贫血、脱水等特征。加州株的致病力弱，但猫的携带率较高。瑞士苏黎世变种感染后症状较轻，多见于混合感染。

汉赛巴尔通体(B.henselae)俗称“猫抓热”，兼性细胞寄生，常寄生在红细胞和内皮细胞内，容易引起溶血性贫血、发热、菌血症、淋巴结病变等疾病，病程常呈自限性。

目前，猫免疫缺陷病毒和猫白血病病毒临床诊断中常用胶体金检测抗原或抗体，但不能在感染早期进行诊断，且其灵敏度较低；猫嗜血支原体(3种型)和汉赛巴尔通体常用血涂片进行细胞学检查，但对部分病原的诊断准确率较低，且对操作人员技术要求较高。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猫贫血病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种检测猫贫血病原体的核酸组合物，其包括如下至少一组的核酸组合：用于检测猫白血病病毒的第一核酸组合、用于检测猫免疫缺陷病毒的第二核酸组合、用于检测猫嗜血支原体俄亥俄州型的第三核酸组合、用于检测猫嗜血支原体加州型的第四核酸组合、用于检测猫嗜血支原体苏黎世型的第五核酸组合和用于检测猫汉赛巴尔通体的第六核酸组合；

第一核酸组合包括引物对1和/或探针1，引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针1的序列如SEQ ID NO.3所示；第二核酸组合包括引物对2和/或探针2，引物对2的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针2的序列如SEQ ID NO.6所示；第三核酸组合包括引物对3和/或探针3，引物对3的序列如SEQ ID NO.7-8所示，探针3的序列如SEQ ID NO.9所示；第四核酸组合包括引物对4和/或探针4，引物对4的序列如SEQ ID NO.10-11所示，探针4的序列如SEQID NO.12所示；第五核酸组合包括引物对5和/或探针5，引物对5的序列如SEQ ID NO.13-14所示，探针5的序列如SEQ ID NO.15所示；第六核酸组合包括引物对6和/或探针6，引物对6的序列如SEQ ID NO.16-17所示，探针6的序列如SEQ ID NO.18所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述探针1、探针2、探针3、探针4、探针5和探针6的5’端均标记有荧光报告基团，探针1、探针2、探针3、探针4、探针5和探针6的3’端均标记有荧光淬灭基团。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、CY5.5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

在可选的实施方式中，上述每个探针的5’端均标记有不同的荧光报告基团。

本发明还提供了一种核酸组合物在制备用于检测猫贫血病原体的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述检测猫贫血病原体的核酸组合物。

本发明还提供了一种猫贫血病原体的检测方法，其包括：以待测核酸样本为模板序列，采用上述的核酸组合物，或者采用上述的试剂盒进行检测；该方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

在本发明应用较佳的实施方式中，当核酸组合物含有第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合、第四核酸组合、第五核酸组合和第六核酸组合时，试剂盒中第一核酸组合的引物对1的工作浓度为0.1-20μM，探针1的工作浓度为0.1-20μM，试剂盒中第二核酸组合的引物对2的工作浓度为0.1-20μM，探针2的工作浓度为0.1-20μM，试剂盒中第三核酸组合的引物对3的工作浓度为0.1-20μM，探针3的工作浓度为0.1-20μM，试剂盒中第四核酸组合的引物对4的工作浓度为0.1-20μM，探针4的工作浓度为0.1-20μM，试剂盒中第五核酸组合的引物对5的工作浓度为0.1-20μM，探针5的工作浓度为0.1-20μM；试剂盒中第六核酸组合的引物对6的工作浓度为0.1-20μM，探针6的工作浓度为0.1-20μM。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的检测手段为PCR检测，PCR扩增检测的程序包括：50-52℃，逆转录10-20min；95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-10s，58-60℃，退火和延伸共20-30s，循环10-40次。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述待测核酸样本为待测RNA样本。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测手段为PCR检测，待测核酸样本为DNA样本时，PCR扩增检测的程序包括：95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-10s，58-60℃，退火和延伸共20-30s，循环30-40次。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种可以实现病原体感染早期的特异性检测的核酸组合物，该核酸组合物具有灵敏度高，检测限低的优势，且可最多同时检测猫贫血六种病原体。同时还提供了一种检测试剂盒，该试剂盒可一次性检测引起猫贫血的多重病原体，可根据实际检测不同病原体的需要提供对应的试剂盒。此检测试剂盒特异性好，灵敏度高，且检测过程无需开盖，无污染，可实现目标病原体的快速检测。该核酸组合物以及试剂盒配合实时荧光定量PCR法可以在病原体感染早期就可进行特异性的检测，对猫贫血的临床诊断及治疗有着重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为猫免疫缺陷病毒的引物探针筛选结果图；

图2是猫白血病病毒的引物探针筛选结果图；

图3是猫嗜血支原体俄亥俄州型引物探针筛选结果图；

图4是猫嗜血支原体加州型引物探针筛选结果图；

图5是猫嗜血支原体苏黎世型引物探针筛选结果图；

图6是汉赛巴尔通体引物探针筛选结果图；

图7为采用检测FIV(猫免疫缺陷病毒)的引物和探针对除FIV外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；

图8为采用检测FeLV(猫白血病病毒)的引物和探针对除FeLV外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；

图9为采用检测Mhf(猫嗜血支原体俄亥俄州型)的引物和探针对除Mhf外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；

图10为采用检测Mhm(猫嗜血支原体加州型)的引物和探针对除Mhm外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；

图11为采用检测Mtc(猫嗜血支原体苏黎世型)的引物和探针对除Mtc外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；

图12为采用检测B.h(汉赛巴尔通体)的引物和探针对除B.h外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；

图13是FIV在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；

图14是FeLV在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；

图15是Mhf在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；

图16是Mhm在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；

图17是Mtc在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；

图18是B.h在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；

图19是FIV在2.5×10²copies/mL时的扩增图；

图20是FeLV在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；

图21是Mhf在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；

图22是Mhm在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；

图23是Mtc在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；

图24是B.h在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；

图25为猫白血病病毒的测序结果对比图；

图26为猫免疫缺陷病毒的测序结果对比图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

发明人通过查询相关资料文献、对比数据库中各目标病原体的核苷酸序列，选取其中高度保守且具有特异性的基因部位，并在NCBI(美国国家生物信息中心)上下载相关序列：猫免疫缺陷病毒序列号NC-001482.1的第170-1359位、猫白血病病毒序列号NC-001940.1的第6087-7892位、猫嗜血支原体俄亥俄州型序列号MK632349.1的序列、猫嗜血支原体加州型序列号MK632351.1的序列、猫嗜血支原体苏黎世型序列号MN240801.1的序列和汉赛巴尔通体序列号MN107415.1的序列，并委托西安擎科生物科技有限公司合成相关病原的质粒，然后使用Primer5.0软件进行引物探针设计，设计中需尽量保证引物无二聚体、发卡结构的存在，且其引物退火温度在60℃左右。筛选后得到上述的核酸组合物序列。

需要说明的是，在实施方式中，可以选择第一核酸组合与第二核酸组合进行组合，用于检测猫白血病病毒和猫免疫缺陷病毒。也可以选择第一核酸组合与第三核酸组合进行组合，用于检测猫白血病病毒和猫嗜血支原体俄亥俄州型。也可以选择第一核酸组合与第四核酸组合进行组合，用于检测猫白血病病毒和猫嗜血支原体加州型。也可以选择第三核酸组合与第四核酸组合进行组合，用于检测猫嗜血支原体俄亥俄州型和猫嗜血支原体加州型。也可以选择第三核酸组合、第四核酸组合与第五核酸组合进行组合，用于检测猫嗜血支原体俄亥俄州型、猫嗜血支原体加州型和猫嗜血支原体苏黎世型。也可以选择第一至第五核酸组合用于检测猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫嗜血支原体俄亥俄州型、猫嗜血支原体加州型和猫嗜血支原体苏黎世型。也可以选择第一至第六核酸组合用于检测猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫嗜血支原体俄亥俄州型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型和猫汉赛巴尔通体。

在其他实施方式中，也可以选择上述六种核酸组合中的任意一种或多种进行组合，并不限于本申请中上述列举的几种实施方式。

在其他实施方式中，探针标记的荧光报告基团也可以根据需要进行自适应调整。猝灭基团也可以根据需要进行自适应调整。

荧光报告基团HEX的最大荧光吸收波长为535nm，中文名称为六氯-6-甲基荧光素。

FAM的最大荧光吸收波长为495nm，中文名称为6-羧基荧光素。

TET的最大荧光吸收波长为521nm，中文名称为四氯-6-羧基荧光素。

JOE的最大荧光吸收波长为520nm，中文名称为2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素。

TAMRA的最大荧光吸收波长为555nm，中文名称为6-羧基四甲基若丹明。

ROX的最大荧光吸收波长为575nm。

Texas Red的最大荧光吸收波长为589nm。

在一种实施方式中，上述探针1、探针2、探针3、探针4、探针5和探针6的5’端均标记有FAM、VIC、HEX、CY3、ROX和CY5，3’端标记有相应的猝灭基团。

可选的，上述试剂盒中引物对的工作浓度可选为0.2μM，0.5μM，0.8μM，1μM，2μM，5μM，10μM，15μM或20μM。探针的工作浓度可选为0.2μM，0.5μM，0.8μM，1μM，2μM，5μM，10μM，8μM，15μM，18μM或20μM。

在其他实施方式中，上述试剂盒中引物对的工作浓度可以根据需要进行适应性调整，并不限于上述限定的几种浓度。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的检测手段为PCR检测，PCR扩增检测的程序包括：50-52℃，逆转录10-20min；95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-10s，58-60℃，退火和延伸共20-30s，循环10-40次。在上述反应条件下，PCR检测具有更好的检测效果。

采集的荧光信号结果生成荧光曲线，当扩增曲线明显呈S型且Ct值≤36即可判定对应荧光检测通道的病原体为阳性。

在一种实施方式中，当核酸组合物中同时含有第一核酸组合和第二核酸组合，检测显示猫白血病病毒阳性，猫免疫缺陷病毒阴性；则只是待测样本中仅有猫白血病病毒感染，但猫免疫缺陷病毒的可能性很低。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种检测猫贫血病原体的核酸组合物，其包括用于检测猫白血病病毒的第一核酸组合、用于检测猫免疫缺陷病毒的第二核酸组合、用于检测猫嗜血支原体俄亥俄州型的第三核酸组合、用于检测猫嗜血支原体加州型的第四核酸组合、用于检测猫嗜血支原体苏黎世型的第五核酸组合和用于检测猫汉赛巴尔通体的第六核酸组合。

第一核酸组合包括引物对1和探针1，引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针1的序列如SEQ ID NO.3所示；第二核酸组合包括引物对2和探针2，引物对2的序列如SEQ IDNO.4-5所示，探针2的序列如SEQ ID NO.6所示；第三核酸组合包括引物对3和探针3，引物对3的序列如SEQ ID NO.7-8所示，探针3的序列如SEQ ID NO.9所示；第四核酸组合包括引物对4和探针4，引物对4的序列如SEQ ID NO.10-11所示，探针4的序列如SEQ ID NO.12所示；第五核酸组合包括引物对5和探针5，引物对5的序列如SEQ ID NO.13-14所示，探针5的序列如SEQ ID NO.15所示；第六核酸组合包括引物对6和探针6，引物对6的序列如SEQ IDNO.16-17所示，探针6的序列如SEQ ID NO.18所示。具体序列参照表1所示。

表1序列信息

实施例2

本实施例提供了设计筛选获得实施例1的核酸组合物的具体方法。

通过查询相关资料文献、对比数据库中各目标病原体的核苷酸序列，选取其中高度保守且具有特异性的基因部位，并在NCBI(美国国家生物信息中心)上下载相关序列：具体选择猫免疫缺陷病毒序列号NC-001482.1的第170-1359位、猫白血病病毒序列号NC-001940.1的第6087-7892位、猫嗜血支原体俄亥俄州型序列号MK632349.1的序列、猫嗜血支原体加州型序列号MK632351.1的序列、猫嗜血支原体苏黎世型序列号MN240801.1的序列和汉赛巴尔通体序列号MN107415.1的序列，并委托西安擎科生物科技有限公司合成相关病原的质粒，然后使用Primer5.0或Oligo7软件进行引物探针设计，设计中需尽量保证引物无二聚体、发卡结构的存在，且其引物退火温度控制在60℃左右。

设计出的引物序列参照表2所示，表2中，每一种病原体对应设计出2个核酸组合，每个核酸组合包括一个引物对和一个探针。

表2设计出的引物和探针序列。

将上述初步设计后的核酸组合进行扩增筛选，通过比较Ct值以及荧光度筛选出更优的核酸组合。

具体的，将上述核酸组合委托赛默飞世尔科技公司进行合成，并按照说明书进行稀释。

分别对来自本地动物医院馈赠的猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒、猫嗜血支原体俄亥俄州型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型和汉赛巴尔通体临床样本进行核酸提取。提取使用的是上海基灵的病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)。

配制如下的PCR反应体系：反应体系为25μL，包括12.5μL的PCR反应液(包括逆转录酶、聚合酶、buffer等，来自珠海宝锐生物的PCR反应液)、5μL模板(即为上述提取的RNA样本)，用DEPC处理水补足至25μL。

PCR反应条件如下：50℃逆转录10分钟；95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火和延伸20s，并采集荧光，共循环40次。

扩增结果参照图1-图6所示。对各核酸组合的扩增结果进行筛选，优选的核酸组合应满足Ct值较小且荧光值更高。按照图1-图6的对比结果，选出各核酸组合中最佳的一对引物和探针(即为实施例1表1所示的引物序列为最佳的核酸组合)。

图1为猫免疫缺陷病毒的引物探针筛选结果图。图2是猫白血病病毒的引物探针筛选结果图。图3是猫嗜血支原体俄亥俄州型引物探针筛选结果图。图4是猫嗜血支原体加州型引物探针筛选结果图。图5是猫嗜血支原体苏黎世型引物探针筛选结果图。图6是汉赛巴尔通体引物探针筛选结果图。

为确认各引物的特异性，发明人将各组引物的扩增产物进行测序，测序委托西安擎科生物科技有限公司进行。并将测序结果在NCBI中进行BLAST序列对比，对比结果显示扩增产物确实为各病原体中的片段，符合预期。图25为猫白血病病毒的测序结果对比图，图26为猫免疫缺陷病毒的测序结果对比图，对比结果显示扩增产物分别为猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒。

实施例3

本实施例提供了一种检测猫贫血病原体的试剂盒，其包括实施例1的核酸组合物。

本实施例中的试剂盒为25μL反应体系，在其他实施方式中，上述试剂盒的体系也可以根据需要进行自适应调整，例如可以选择是15μL或20μL反应体系。

25μL反应体系包括12.5μL的PCR反应液(包括聚合酶、buffer等，PCR反应液的来源与实施例2相同)、FIV-F 0.3μL，FIV-R 0.3μL，FIV-P 0.2μL；FeLV-F 0.3μL，FeLV-R 0.3μL，FeLV-P 0.2μL；MhF-F 0.4μL，MhF-R 0.4μL，MhF-P 0.25μL；Mhm-F 0.35μL，Mhm-R 0.35μL，Mhm-P 0.25μL；Mtc-F 0.4μL，Mtc-R 0.4μL，Mtc-P 0.3μL；B.h-F 0.35μL，B.h-R 0.35μL，B.h-P 0.25μL，5μL模板，DEPC处理水。

使用上述试剂盒的PCR反应条件为：50℃逆转录10分钟；95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火/延伸20s，并采集荧光，共循环40次。

实验例1

本实验例对实施例3的试剂盒进行特异性测试：

按照上述实施例3的PCR试剂盒的组分配制，分别加入其它干扰病原体进行测试(例如用扩增猫免疫缺陷病毒核酸组合扩增猫白血病病毒、猫嗜血支原体俄亥俄州型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型和汉赛巴尔通体)，包括猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒、猫嗜血支原体俄亥俄州型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型和汉赛巴尔通体。然后按照试剂盒的反应条件进行扩增。

测试结果参照图7-图12为测试结果。结果显示，各病原体的引物探针对其余病原体均无交叉扩增。

图7为采用检测FIV(猫免疫缺陷病毒)的引物和探针对除FIV外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；图8为采用检测FeLV(猫白血病病毒)的引物和探针对除FeLV外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；图9为采用检测Mhf(猫嗜血支原体俄亥俄州型)的引物和探针对除Mhf外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；图10为采用检测Mhm(猫嗜血支原体加州型)的引物和探针对除Mhm外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；图11为采用检测Mtc(猫嗜血支原体苏黎世型)的引物和探针对除Mtc外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果；图12为采用检测B.h(汉赛巴尔通体)的引物和探针对除B.h外的其他干扰病原体进行荧光定量PCR的测试结果。

实验例2

本实验例进行试剂盒的重复性测试。

本实验对稀释后的样本进行扩增，样本来源与实施例2相同。每种样本重复扩增10次，得出下表3的数据，变异系数(CV，％)均小于5％。

表3各病原体扩增的平均Ct值以及变异系数表。

	FIV	FeLV	Mhf	Mhm	Mtc	B.h
							平均Ct值	32.52	32.57	35.67	33.16	37.01	29.88
CV,％	1.41	1.66	2.12	0.88	1.96	0.72

实验例3

本实验例进行试剂盒的灵敏度测试。

将各病原体的质粒分别稀释至5×10²copies/mL、2.5×10²copies/mL后进行扩增，选择检出率在95％以上的最低浓度即为检测检浓度。最终确认FIV、FeLV、Mhf、Mhm、Mtc、B.h引物的检测限为5×10²copies/mL。

图13是FIV在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；图14是FeLV在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；图15是Mhf在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；图16是Mhm在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；图17是Mtc在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图；图18是B.h在最低检测限(5×10²copies/mL)时的扩增图。

图19是FIV在2.5×10²copies/mL时的扩增图；图20是FeLV在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；图21是Mhf在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；图22是Mhm在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；图23是Mtc在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图；图24是B.h在最低检测限2.5×10²copies/mL时的扩增图。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海基灵生物科技有限公司

<120> 一种检测猫贫血病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccaccgaccc caacaaaac 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agttacctaa gattgcaatc cct 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctctgcctgg tttctcgacc acc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgaaccctg tcgagtatct gtg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcttcactt cctcaatcac tct 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctgttcggg cgccaactgc 20

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agttgtatgc accgaatact acat 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccttcgcctc tggtgttctt a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agggagtttc ggaattaagc 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aacataggtc acgagcatta tcc 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aactcgttga gcaagtgcct t 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agcgtaggcg gacaaattg 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gggaatcttc cacaatggac g 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttgctgtca cttattcaga gggt 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccatgtgaac gacgaaggcc agac 24

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctccgtatgt gtttttctgt tcc 23

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gtggatgtcg aagcattttg ttca 24

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atccggtgct gactcgagct at 22

Claims

1.一种检测猫贫血病原体的核酸组合物，其特征在于，其包括如下至少一组的核酸组合：用于检测猫白血病病毒的第一核酸组合、用于检测猫免疫缺陷病毒的第二核酸组合、用于检测猫嗜血支原体俄亥俄州型的第三核酸组合、用于检测猫嗜血支原体加州型的第四核酸组合、用于检测猫嗜血支原体苏黎世型的第五核酸组合和用于检测猫汉赛巴尔通体的第六核酸组合；

所述第一核酸组合包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述探针1的序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二核酸组合包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述探针2的序列如SEQ ID NO.6所示；所述第三核酸组合包括引物对3和/或探针3，所述引物对3的序列如SEQ ID NO.7-8所示，所述探针3的序列如SEQ ID NO.9所示；所述第四核酸组合包括引物对4和/或探针4，所述引物对4的序列如SEQ ID NO.10-11所示，所述探针4的序列如SEQ ID NO.12所示；所述第五核酸组合包括引物对5和/或探针5，所述引物对5的序列如SEQ ID NO.13-14所示，所述探针5的序列如SEQ ID NO.15所示；所述第六核酸组合包括引物对6和/或探针6，所述引物对6的序列如SEQID NO.16-17所示，所述探针6的序列如SEQ ID NO.18所示。

2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述探针1、所述探针2、所述探针3、所述探针4、所述探针5和所述探针6的5’端均标记有荧光报告基团，所述探针1、所述探针2、所述探针3、所述探针4、所述探针5和所述探针6的3’端均标记有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、CY5.5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

4.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，每个探针的5’端均标记有不同的荧光报告基团。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的核酸组合物在制备用于检测猫贫血病原体的试剂盒中的应用。

6.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的核酸组合物。

7.一种猫贫血病原体的检测方法，其特征在于，其包括：以待测核酸样本为模板序列，采用权利要求1-4任一项所述的核酸组合物，或者采用权利要求6所述的试剂盒进行检测；

所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

8.根据权利要求7所述的猫贫血病原体的检测方法，其特征在于，当所述核酸组合物含有所述第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合、第四核酸组合、第五核酸组合和第六核酸组合时，所述试剂盒中第一核酸组合的引物对1的工作浓度为0.1-20μM，探针1的工作浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第二核酸组合的引物对2的工作浓度为0.1-20μM，探针2的工作浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第三核酸组合的引物对3的工作浓度为0.1-20μM，探针3的工作浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第四核酸组合的引物对4的工作浓度为0.1-20μM，探针4的工作浓度为0.1-20μM，所述试剂盒中第五核酸组合的引物对5的工作浓度为0.1-20μM，探针5的工作浓度为0.1-20μM；所述试剂盒中第六核酸组合的引物对6的工作浓度为0.1-20μM，探针6的工作浓度为0.1-20μM。

9.根据权利要求7所述的猫贫血病原体的检测方法，其特征在于，所述检测手段为PCR检测，所述PCR检测的程序包括：50-52℃，逆转录10-20min；95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-10s，58-60℃，退火和延伸共20-30s，循环10-40次；所述待测核酸样本为待测RNA样本。

10.根据权利要求7所述的猫贫血病原体的检测方法，其特征在于，所述检测手段为PCR检测，所述待测核酸样本为DNA样本时，所述PCR检测的程序包括：95-96℃，预变性2-5min；94-96℃，变性5-10s，58-60℃，退火和延伸共20-30s，循环30-40次。