CN117904341B - 实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合、试剂盒及方法。所述引物探针组合包括的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑12所示，本发明提供的试剂盒及检测方法，能够准确检测猫嗜血支原体CMhm、Mhf和CMt三种基因型，从而在猫嗜血支原体早期感染时实现对猫嗜血支原体分型的检测和定量。
Description
技术领域
本发明所属生物检测领域，特别是涉及一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合、试剂盒及方法。
背景技术
猫嗜血支原体（Candidatus Mycoplasma haemominutum）又称猫附红细胞体、猫血支原体，分为三种基因型：加州型（CMhm）、俄亥俄州型（Mhf）和苏黎世型（CMt）。CMhm的发病率最高，是其他两种发病率的两倍以上，隐性携带者且能加速猫白血病病毒感染相关的骨髓增生性疾病。Mhf的致病性最强，感染后可能导致急性致命性溶血性贫血。CMt致病性弱，流行性低，一般不会有明显的症状，但经常与其他贫血支原体共同感染，尤其是与CMhm型，有可能增加贫血的严重程度。
现有技术中，对于猫嗜血支原体检测方法可进行血常规检查和血液涂片。血常规检查可表现出大细胞低色素性贫血，有相应的血细胞改变，溶血还可以出现高胆红素血症，但其他病原体也可造成该表现；血液涂片只可进行初筛，易与立克次体混淆。而基于分子生物学的普通PCR和荧光PCR在检测猫嗜血支原体的运用越来越广泛，与常规检测技术相比，此种方法不仅缩短了检测时间，而且节约了人力和物力，为病原的快速诊断提供了可靠的依据。实时定量PCR(qRT-PCR)可分为绝对定量和相对定量，绝对定量需要使用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量；而相对定量法由于具有灵敏度高、重复性好、易于操作和结果可靠等特点，应用更为广泛。使用2-ΔΔCt法计算是目前最常见的相对定量方法，该方法需要选择机体表达稳定，且与靶标扩增效率接近的内参。然而，现有的实时定量PCR检测方法中，检测体系未加入内参基因或试剂盒缺乏标准品，因而无法对检测对象进行定量分析。
因此，本领域亟需一种特异性检测猫嗜血支原体分型的引物探针组合、试剂盒和方法，能准确检测猫嗜血支原体CMhm、Mhf和CMt三种基因型，搭配在机体表达稳定的内参，从而在猫嗜血支原体早期感染时实现对猫嗜血支原体分型的检测和定量。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合，所述猫嗜血支原体包括CMhm型、Mhf型和CMt型，所述引物探针组合包括CMhm型引物探针组合、Mhf型引物探针组合、CMt型引物探针组合和RPS7内参基因引物探针组合，其中：
所述CMhm型引物探针组合包括CMhm型正向引物、CMhm型反向引物和CMhm型探针，所述CMhm型正向引物、CMhm型反向引物和CMhm型探针的核苷酸序列如下：
CMhm型正向引物：5’-AGTTGTTTGTGATAGATATCG-3’，如SEQ ID NO:1所示；
CMhm型反向引物：5’-TTGGTTCCTCAATATATCTACG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
CMhm型探针：5’-CTGGAATTCAATGTGTAGCGGTGG-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述Mhf型引物探针组合包括Mhf型正向引物、Mhf型反向引物和Mhf型探针，所述Mhf型正向引物、Mhf型反向引物和Mhf型探针的核苷酸序列如下：
Mhf型正向引物：5’- GGAATTGTCAGCCAAGCTG -3’，如SEQ ID NO:4所示；
Mhf型反向引物：5’- TGGTGGAAGTGAGGGGAC -3’，如SEQ ID NO:5所示；
Mhf型探针：5’- CGAACCCCCATCCAATTGACCAG -3’，如SEQ ID NO:6所示；
所述CMt型引物探针组合包括CMt型正向引物、CMt型反向引物和CMt型探针，所述CMt型正向引物、CMt型反向引物和CMt型探针的核苷酸序列如下：
CMt型正向引物：5’- AGAGGCGAAGGCGAAAACT -3’，如SEQ ID NO:7所示；
CMt型反向引物：5’- CTACAACGCCGAAACACAAA -3’，如SEQ ID NO:8所示；
CMt型探针：5’- TACCCCAGTAGTCCACACCGTAAACG -3’，如SEQ ID NO:9所示；
所述RPS7内参基因引物探针组合包括RPS7内参基因正向引物、RPS7内参基因反向引物和RPS7内参基因探针，所述RPS7内参基因正向引物、RPS7内参基因反向引物和RPS7内参基因探针的核苷酸序列如下：
RPS7内参基因正向引物：5’- GTCCCAGAAGCCGCACTT -3’，如SEQ ID NO:10所示；
RPS7内参基因反向引物：5’- CTCTTGCCCACAATCTCG -3’，如SEQ ID NO:11所示；
RPS7内参基因探针：5’- CCGTGCACGACGCGATCCTGG -3’，如SEQ ID NO:12所示。
具体地，所述CMhm型探针、Mhf型探针、CMt型探针和RPS7内参基因探针的5’端均标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、CY5或ROX中的任意一种，所述CMhm型探针、Mhf型探针、CMt型探针和RPS7内参基因探针的3’端均标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
本发明的第二方面，提供一种前述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合在制备实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒中的应用。
本发明的第三方面，提供一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述PCR试剂包括前述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合。
具体地，所述PCR扩增试剂还包括Buffer Mix和去离子水，所述Buffer Mix由DNA聚合酶、Mg2+和dNTP组成。
具体地，所述阴性对照为灭菌去离子水，所述阳性对照为猫嗜血支原体CMhm序列质粒、猫嗜血支原体Mhf序列质粒和猫嗜血支原体CMt序列质粒的混合物。
本发明的第四方面，提供一种非诊断目的检测猫嗜血支原体的实时荧光定量PCR方法，所述方法基于前述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，所述方法包括步骤：
1）提取待测样本总DNA；
2）制备反应体系，所述反应体系包括前述的PCR扩增试剂；
3）以提取的待测样本总DNA为模板，同时添加阴性对照、阳性对照为质控模板，进行实时荧光定量PCR反应；
4）反应结束，判定检测结果。
具体地，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：
Step1：94℃，5min；
Step2：94℃，10s，60℃，30s；
Step2执行45个循环。
有益效果：
本申请提供了特异性检测猫嗜血支原体分型的引物探针组合、试剂盒及其检测方法，能够准确检测猫嗜血支原体CMhm、Mhf和CMt三种基因型，试剂盒中加入RPS7内参，提高机体表达稳定性，避免因采样和提取异常导致的假阴性，有利于进一步定量分析。在猫嗜血支原体早期感染时实现对猫嗜血支原体分型的精准定量，本申请提供的引物探针组合、试剂盒及方法的灵敏度高、特异性好，检出限在1000 copies/mL以下，对猫嗜血支原体分型的早期检测和防治均有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中，CMhm型引物探针组合的线性上机结果图。
图2为实施例2中，CMt型引物探针组合的线性上机结果图。
图3为实施例2中， Mhf型引物探针组合的线性上机结果图。
图4为实施例2中，RPS7内参基因引物探针组合的线性上机结果图。
图5为实施例3中，检测样本的上机结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例示出本申请内参基因的筛选研究。
选择RPL17、RPL30、RPS7、YWHAZ和HPRT猫的五个内参基因来进行测试，使用实时荧光PCR（SYBR荧光染料）来测试五个内参基因在血液样本中的稳定性，各内参基因引物序列如表1所示：
表1 猫内参基因引物探针
收集30例猫不同类型样本进行筛选，筛选步骤如下：
1）提取样本核酸：吸取200μL样本加入刚竹医疗提取试剂条中的裂解液中，搭配刚竹医疗自动提取仪进行核酸提取。
2）按照表2配制PCR扩增试剂，吸取5μL核酸至PCR扩增试剂中
表2 内参PCR扩增试剂配制
3）按照下列PCR扩增进行进行扩增：
Step1：95℃，10min；
Step2：95℃，30s，60℃，30s；
Step2执行40个循环。
4）运行结束后，进行对比分析，结果如表3所示。
表3 内参筛选扩增结果
如表3所示，RPS7在30例猫不同样本中检出率100%，跟其他四组引物对比均一性和Ct值较好，因此选择RPS7作为猫嗜血支原体分型的内参基因。
实施例2
根据GenBank登录的核苷酸序列选取CMhm(登录号EU285281.1)、CMt（登录号：OK624815.1）、Mhf（登录号：HG519095.1）、RPS7（登录号：NM_001009832.1）生物信息学软件比对分析，选取保守区域为扩增靶序列区域，并合成猫嗜血支原体分型质粒。应用引物、探针设计软件Primer Premier 5.0和oligo 7分别设计多对引物和特异性探针，并进行了实验筛选，最后确定4对引物和4条探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:1-12所示。
本实施例示出一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合，猫嗜血支原体包括CMhm型、Mhf型和CMt型，引物探针组合包括CMhm型引物探针组合、Mhf型引物探针组合、CMt型引物探针组合和RPS7内参基因引物探针组合，其中：
CMhm型引物探针组合包括CMhm型正向引物、CMhm型反向引物和CMhm型探针，所述CMhm型正向引物、CMhm型反向引物和CMhm型探针的核苷酸序列如下：
CMhm型正向引物：5’-AGTTGTTTGTGATAGATATCG-3’，如SEQ ID NO:1所示；
CMhm型反向引物：5’-TTGGTTCCTCAATATATCTACG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
CMhm型探针：5’-CTGGAATTCAATGTGTAGCGGTGG-3’，如SEQ ID NO:3所示；
Mhf型引物探针组合包括Mhf型正向引物、Mhf型反向引物和Mhf型探针，Mhf型正向引物、Mhf型反向引物和Mhf型探针的核苷酸序列如下：
Mhf型正向引物：5’- GGAATTGTCAGCCAAGCTG -3’，如SEQ ID NO:4所示；
Mhf型反向引物：5’- TGGTGGAAGTGAGGGGAC -3’，如SEQ ID NO:5所示；
Mhf型探针：5’- CGAACCCCCATCCAATTGACCAG -3’，如SEQ ID NO:6所示；
CMt型引物探针组合包括CMt型正向引物、CMt型反向引物和CMt型探针，CMt型正向引物、CMt型反向引物和CMt型探针的核苷酸序列如下：
CMt型正向引物：5’- AGAGGCGAAGGCGAAAACT -3’，如SEQ ID NO:7所示；
CMt型反向引物：5’- CTACAACGCCGAAACACAAA -3’，如SEQ ID NO:8所示；
CMt型探针：5’- TACCCCAGTAGTCCACACCGTAAACG -3’，如SEQ ID NO:9所示；
RPS7内参基因引物探针组合包括RPS7内参基因正向引物、RPS7内参基因反向引物和RPS7内参基因探针，RPS7内参基因正向引物、RPS7内参基因反向引物和RPS7内参基因探针的核苷酸序列如下：
RPS7内参基因正向引物：5’- GTCCCAGAAGCCGCACTT -3’，如SEQ ID NO:10所示；
RPS7内参基因反向引物：5’- CTCTTGCCCACAATCTCG -3’，如SEQ ID NO:11所示；
RPS7内参基因探针：5’- CCGTGCACGACGCGATCCTGG -3’，如SEQ ID NO:12所示。
以上探针中，CMhm型探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，Mhf型探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，CMt型探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，RPS7内参基因探针的5’端标记有荧光报告基团ROX。
基于实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体分型的组合，使用质粒对其进行分析性能评估，具体内容如下：
1）线性测试
使用微量分光光度计对质粒进行定值，稀释到1×108Copies/mL至1×103Copies/mL，按照表4配制PCR扩增试剂，分别加入5μL各浓度质粒。
表4PCR扩增试剂配制表
检测如图1-图4所示，图1为猫嗜血支原体加州型的线性结果，图2为猫嗜血支原体苏黎世型的线性结果，图3为猫嗜血支原体俄亥俄州型的线性结果，图4为RPS7内参的线性结果，四组引物探针的1×108Copies/mL至1×103Copies/mL都可全部检出，线性良好。
2）特异性测试
选择同支原体属的猫支原体、犬支原体和易引起同症状/容易共患的病原体的猫杯状病毒、猫疱疹病毒Ⅰ型、猫衣原体、波氏杆菌进行特异性测试。使用刚竹医疗自动提取仪和提取卡盒对上述病原体进行核酸提取。按照表4配制PCR扩增试剂，取5μL提取好的核酸加入PCR扩增试剂中进行扩增，运行程序如下：
Step1：94℃，5min；
Step2：94℃，10s，60℃，30s；
Step2执行45个循环；
检测结果如表5所示，基于实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体分型的组合对同支原体属的猫支原体、犬支原体和易引起同症状/容易共患的病原体的猫杯状病毒、猫疱疹病毒Ⅰ型、猫衣原体、波氏杆菌无扩增，特异性良好。
表5 特异性测试结果
3）灵敏度测试
将质粒稀释至1×103Copies/mL和5×102Copies/mL，按照表4配制PCR扩增试剂，分别加入5μL各浓度质粒，每个浓度重复20次。
表6 灵敏度测试结果
注：“+”表示可检出，“-”表示未检出
如表6所示，四组引物探针在1×103Copies/mL都能全部检出，整个组合的最低检出限为1×103Copies/mL。
4）重复性测试
将质粒稀释至1×106Copies/mL和1×104Copies/mL，按照表4配制PCR扩增试剂，分别加入5μL各浓度质粒，每个浓度重复10次。
表7 重复性测试结果
如表7所示，四组引物探针在中浓度（1×106Copies/mL）和低浓度（1×104Copies/mL）的CV值均小于2%，重复性良好。
实施例3 定性分析
本实施例示出一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，试剂盒包括PCR试剂、阴性对照和阳性对照，PCR试剂包括实施例2示出的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合。阴性对照为灭菌去离子水，所述阳性对照为猫嗜血支原体CMhm序列质粒、猫嗜血支原体Mhf序列质粒和猫嗜血支原体CMt序列质粒的混合物。
基于实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，对待测样本中猫嗜血支原体分型进行检测的方法包括步骤：
1）吸取200μL待测血液样本至刚竹医疗提取试剂条中的LB孔，将磁棒套置于第一个空白孔，放入刚竹医疗提取仪中提取核酸。提取仪运行结束后，EB孔为提好的核酸；
2）制备反应体系，反应体系总体积为20μL，反应组分如表2所示；
3）分别吸取5μL待测样本核酸、阳性对照、阴性对照至PCR扩增试剂中，进行实时荧光定量PCR反应的程序为：
Step1：94℃，5min；
Step2：94℃，10s，60℃，30s；
Step2执行45个循环；
4）反应结束，根据Ct值判定检测结果。
采用本发明提供的方法检测待测样本中猫嗜血支原体分型时，判断标准如下：
定性分析：经PCR检测，在阴、阳性对照成立且内参CT值在24-28的条件下，待检样品中荧光通道的Ct<40，则判定对应猫嗜血支原体分型核酸阳性；若待检样品40≤Ct<42，则需要复测；若待检样本Ct≥42，则判定对应猫嗜血支原体分型核酸阴性。若内参无扩增，无论样本是否扩增，结果都判定为无效。
检测结果如图5所示，阳性对照和内参的Ct值都在24-28区间内，阴性对照无扩增，待测样本中的FAM通道有扩增且Ct值为<40，其他通道无扩增，则判定为猫嗜血支原体加州型阳性，其他分型为阴性。
实施例4 定量分析
本实施例示出一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，试剂盒包括PCR试剂、阴性对照和阳性对照，PCR试剂包括实施例2示出的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合。阴性对照为灭菌去离子水，所述阳性对照为猫嗜血支原体CMhm序列质粒、猫嗜血支原体Mhf序列质粒和猫嗜血支原体CMt序列质粒的混合物。
基于实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，对一例待测样本中猫嗜血支原体分型进行检测的方法包括步骤：
1）吸取200μL待测血液样本至刚竹医疗提取试剂条中的LB孔，将磁棒套置于第一个空白孔，放入刚竹医疗提取仪中提取核酸。提取仪运行结束后，EB孔为提好的核酸；
2）制备反应体系，反应体系总体积为20μL，反应组分如表2所示；
3）分别吸取5μL待测样本核酸、阳性对照、阴性对照至PCR扩增试剂中，进行实时荧光定量PCR反应的程序为：
Step1：94℃，5min；
Step2：94℃，10s，60℃，30s；
Step2执行45个循环；
4）反应结束，根据Ct值判定检测结果。
采用本发明提供的方法检测待测样本中猫嗜血支原体分型时，判断标准如下：
定量分析：在阴阳性对照及内参都符合的条件下进行定量分析，相对定量分析采用2-ΔΔCt法(Livak法)，计算公式如下所示：
ΔCt（test）=待测样本目的基因Ct值-待测样本内参基因Ct值
ΔCt（con）=对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值
ΔΔCt= ΔCt（test）- ΔCt（con）
表达量F=2- ΔΔCt（不同样本可互为对照组）
结果如下表8所示：
表8扩增检测结果
基于表8的扩增结果，对CMhm进行相对定量分析，结果如下表9所示：
表9相对定量分析表
检测结果如表9所示，待测样本的基因表达量为6.23。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合，其特征在于，所述猫嗜血支原体包括CMhm型、Mhf型和CMt型，所述引物探针组合包括CMhm型引物探针组合、Mhf型引物探针组合、CMt型引物探针组合和RPS7内参基因引物探针组合，其中：
所述CMhm型引物探针组合包括CMhm型正向引物、CMhm型反向引物和CMhm型探针，所述CMhm型正向引物、CMhm型反向引物和CMhm型探针的核苷酸序列如下：
CMhm型正向引物：5’-AGTTGTTTGTGATAGATATCG-3’，如SEQ ID NO:1所示；
CMhm型反向引物：5’-TTGGTTCCTCAATATATCTACG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
CMhm型探针：5’-CTGGAATTCAATGTGTAGCGGTGG-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述Mhf型引物探针组合包括Mhf型正向引物、Mhf型反向引物和Mhf型探针，所述Mhf型正向引物、Mhf型反向引物和Mhf型探针的核苷酸序列如下：
Mhf型正向引物：5’- GGAATTGTCAGCCAAGCTG -3’，如SEQ ID NO:4所示；
Mhf型反向引物：5’- TGGTGGAAGTGAGGGGAC -3’，如SEQ ID NO:5所示；
Mhf型探针：5’- CGAACCCCCATCCAATTGACCAG -3’，如SEQ ID NO:6所示；
所述CMt型引物探针组合包括CMt型正向引物、CMt型反向引物和CMt型探针，所述CMt型正向引物、CMt型反向引物和CMt型探针的核苷酸序列如下：
CMt型正向引物：5’- AGAGGCGAAGGCGAAAACT -3’，如SEQ ID NO:7所示；
CMt型反向引物：5’- CTACAACGCCGAAACACAAA -3’，如SEQ ID NO:8所示；
CMt型探针：5’- TACCCCAGTAGTCCACACCGTAAACG -3’，如SEQ ID NO:9所示；
所述RPS7内参基因引物探针组合包括RPS7内参基因正向引物、RPS7内参基因反向引物和RPS7内参基因探针，所述RPS7内参基因正向引物、RPS7内参基因反向引物和RPS7内参基因探针的核苷酸序列如下：
RPS7内参基因正向引物：5’- GTCCCAGAAGCCGCACTT -3’，如SEQ ID NO:10所示；
RPS7内参基因反向引物：5’- CTCTTGCCCACAATCTCG -3’，如SEQ ID NO:11所示；
RPS7内参基因探针：5’- CCGTGCACGACGCGATCCTGG -3’，如SEQ ID NO:12所示；
所述CMhm型探针、Mhf型探针、CMt型探针和RPS7内参基因探针的5’端均标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、CY5或ROX中的任意一种，所述CMhm型探针、Mhf型探针、CMt型探针和RPS7内参基因探针的3’端均标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
2.权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合在制备实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒中的应用。
3.一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述PCR扩增试剂包括权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合。
4. 根据权利要求3所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂还包括Buffer Mix和去离子水，所述Buffer Mix由DNA聚合酶、Mg2+和dNTP组成。
5.根据权利要求3所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为灭菌去离子水，所述阳性对照为猫嗜血支原体CMhm序列质粒、猫嗜血支原体Mhf序列质粒和猫嗜血支原体CMt序列质粒的混合物。
6.一种非诊断目的检测猫嗜血支原体的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法基于权利要求3-5中任一项所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，所述方法包括步骤：
1）提取待测样本总DNA；
2）制备反应体系，所述反应体系包括权利要求3-5中任一项所述的PCR扩增试剂；
3）以提取的待测样本总DNA为模板，同时添加阴性对照、阳性对照为质控模板，进行实时荧光定量PCR反应；
4）反应结束，判定检测结果。
7.根据权利要求6所述的非诊断目的检测猫嗜血支原体的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：
Step1：94℃，5min；
Step2：94℃，10s，60℃，30s；
Step2执行45个循环。
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