CN117144049A - 检测隐球菌亚型的引物探针组合、方法以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种检测隐球菌亚型的引物探针组合、方法以及试剂盒。其中，该引物包括第一引物，第一引物包括第一正向引物和第一反向引物，第一正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，第一反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，该探针包括第一探针，第一探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。通过本申请提供的引物探针组合能够准确、快速地检测隐球菌的亚型，帮助提高对易致病的隐球菌亚型的快速诊断和治疗，为疾病的治疗争取宝贵的时间。
Description
技术领域
本发明属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种检测隐球菌亚型的引物探针组合、方法以及试剂盒。
背景技术
近年来，国内外隐球菌感染呈上升趋势。隐球菌是一类能够导致隐球菌病的真菌，隐球菌属包括17个中和8个变种。不同种属的隐球菌的致病率、感染人群具有明显差异。随着基因检测手段的提升，隐球菌还具有不同的分子分型，例如，VGI型隐球菌、VGII型隐球菌等。不同分型的隐球菌在流行性、临床表现以及诊断治疗中也存在显著的差异。因此，鉴别感染是由哪种分型的隐球菌引起的对于临床诊断至关重要。
现有的隐球菌检测方法尽管能够进行隐球菌检测，但大多仅能实现隐球菌的检测，无法进一步确定隐球菌的分子分型。因此，如何准确检测隐球菌的亚型是一项亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种检测隐球菌亚型的引物探针组合、方法、试剂盒以及该引物探针组合在检测隐球菌亚型中的应用，通过针对多种隐球菌亚型的特定基因片段分别设计对应的引物探针组合，能够准确地检测隐球菌的亚型，帮助隐球菌病的早期临床诊断。
第一方面，本申请提供一种检测隐球菌亚型的引物探针组合，所述引物包括第一引物，所述第一引物包括第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述第一反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；所述探针包括第一探针，所述第一探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
在一些实施例中，所述第一引物用于识别VGIb型隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述第一探针的5’端连接有第一荧光报告基团，所述第一探针的3’端连接有第一荧光淬灭基团。
在一些实施例中，所述引物包括第二引物，所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.5，所述第二反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.6所示；所述探针包括第二探针，所述第二探针的核苷酸序列如Seq IDNo.7所示。
在一些实施例中，所述第二引物用于识别VGIa型隐球菌中如Seq ID No.8所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述第二探针的5’端连接有第二荧光报告基团，所述第二探针的3’端连接有第二荧光淬灭基团。
第二方面，提供一种检测隐球菌亚型的方法，所述方法包括：获取待测样本的模板DNA；通过聚合酶链式反应PCR对所述模板DNA进行扩增以获取扩增结果，其中所述PCR的反应物包括第一方面任一实施例中的引物探针组合了；根据所述扩增结果判断所述待测样本中隐球菌的亚型。
在一些实施例中，所述隐球菌包括VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌以及野生隐球菌中的至少一个。
应理解，野生隐球菌指的是除了VGIa型隐球菌和VGIb型隐球菌以外的其他类型的隐球菌。
在一些实施例中，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述隐球菌的亚型包括：在所述扩增结果中所述第一荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述隐球菌为VGIb型隐球菌；在所述扩增结果中所述第二荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述隐球菌为VGIa型隐球菌。
第三方面，提供一种检测隐球菌亚型的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面任一实施例中的引物探针组合。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷酸三磷酸dNTP。
第四方面，提供一种如第一方面任一实施例中的引物探针组合在检测隐球菌中的应用。
附图说明
图1是本申请实施例一种隐球菌亚型的检测方法的示意性流程图。
图2是本申请实施例VGIb型隐球菌的特异性扩增曲线图。
图3是本申请实施例VGIa型隐球菌的特异性扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请的技术方案作进一步介绍。
本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。在本申请中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。另外，当表述某个参数为≥2的整数，则相当于公开了该参数为例如整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等。
在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
如果没有特别的说明，本申请所提到的“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分，也可以仅包括或包含列出的组分。
如果没有特别的说明，在本申请中，术语“或”是包括性的。举例来说，短语“A或B”表示“A，B，或A和B两者”。更具体地，以下任一条件均满足条件“A或B”：A为真（或存在）并且B为假（或不存在）；A为假（或不存在）而B为真（或存在）；或A和B都为真（或存在）。
如果没有特别的说明，本申请的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
隐球菌是一类广泛存在于自然界的真菌，属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母科。隐球菌属包括17个种和8个变种，其中致病的主要是新型隐球菌，以下简称隐球菌。不同种类的隐球菌的致病率、感染人群具有显著差异。例如，新生隐球菌主要感染免疫抑制人群，而格特隐球菌主要感染免疫正常人群。
随着基因检测手段的提升，隐球菌在一级分型上被分为8个类型，其包括：VNI型隐球菌、VNII型隐球菌、VNIII型隐球菌、VNIV型隐球菌、VGI型隐球菌、VGII型隐球菌、VGIII型隐球菌以及VGIV型隐球菌。此外，发明人研究发现，在上述8个分型下，隐球菌还能够被进一步细分，例如，VGI型隐球菌还能够被分为VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌、VGIc型隐球菌等多个亚型。有临床数据显示，VGIb型隐球菌的致死率明显高于其他菌株，与其他菌株相比将会导致更为严重的临床后果。因此，如何检测并鉴定隐球菌的亚型对临床诊断具有重要的意义。
有鉴于此，本申请提供了一种检测隐球菌亚型的引物探针组合，基于该引物探针组合的聚合酶链式反应PCR能够准确、快捷地进行隐球菌并鉴定隐球菌的亚型。
首先本申请实施例提供一种检测隐球菌亚型的引物探针组合。
其中，该引物包括第一引物，第一引物包括第一正向引物和第一反向引物。第一正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，第一反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
该探针包括第一探针，第一探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
具体来说，发明人通过生物信息学方法，通过对各种类型的隐球菌的全部基因组进行比较，不局限于单一的编码基因，而是在整个基因组层面寻找差异位点，从而设计出了核苷酸序列如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的第一引物以及核苷酸序列如Seq ID No.3所示的第一探针。利用第一引物和第一探针能够准确检测并鉴定VGIb型隐球菌，从而帮助对VGIb型隐球菌引发的疾病的早期诊断。
应理解，本申请所述的隐球菌包括VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌以及野生型隐球菌。其中，野生型隐球菌指除了VGIa型隐球菌和VGIb型隐球菌以外的其他类型隐球菌。
第一正向引物的核苷酸序列具体为：
GCTTAAAGGGATTTTCTTGG。
第一反向引物的核苷酸序列具体为：
TCAGATGTGTGTCGGCCAGA。
第一引物用于识别VGIb型隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。换言之，针对VGIb型隐球菌设计的第一引物能够特异性识别Seq ID No.4所示的核苷酸序列，该核苷酸序列只存在于VGIb型隐球菌中。
可选地，第一探针的5’端连接有第一荧光报告基团，所述第一探针的3’端连接有第一荧光淬灭基团。
其中，第一荧光报告基团包括但不限于6-羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、六氯-6-甲基荧光素（HEX）、花青素荧光染料CY3、6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）。第一荧光淬灭基团包括但不限于6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）、4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸（DABCYL）或黑洞淬灭剂BHQ1、BHQ2、BHQ3。
例如，第一探针的5’端连接有FAM基团，第一探针的3’端连接有BHQ1基团。即第一探针为：
FAM-ATATGGCTGGAAACTGAACA-BHQ1。
可选地，该引物包括第二引物，第二引物包第二正向引物和第二反向引物。其中第二正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.5所示，第二反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.6所示。该探针包括第二探针，第二探针的核苷酸序列如Seq ID No.7所示。
第二引物用于识别VGIa型隐球菌中如Seq ID No.8所示的核苷酸序列。
具体来说，用于检测隐球菌亚型的引物探针组合还可以包括第二引物和第二探针。其中，第二引物和第二探针针对VGIa型隐球菌设计，能够特异性地识别VGIa型隐球菌如Seq ID No.8所示的核苷酸序列，从而对VGIa型隐球菌进行准确地检测。换言之，通过第二引物和探针不仅能够准确地检测隐球菌，并且能够确定检测到的隐球菌为VGIa型隐球菌。
其中，第二正向引物的核苷酸序列具体为：
GTTGCCCCAAAAATTGTATTATAC。
第二反向引物的核苷酸序列具体为：
AGTGAACTGAGACATGTTTCTT。
可选地，第二探针的5’端连接有第二荧光报告基团，第二探针的3’端连接有第二荧光淬灭基团。
其中，第二荧光报告基团包括但不限于6-羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、六氯-6-甲基荧光素（HEX）、花青素荧光染料CY3、6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）。第二荧光淬灭基团包括但不限于6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）、4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸（DABCYL）或黑洞淬灭剂BHQ1、BHQ2、BHQ3。
例如，第二探针的5’端连接有FAM基团，第二探针的3’端连接有BHQ1基团。即第二探针为：
FAM-ACCAAATCCTCCGCTTAACGTGATTTTTAACGT-BHQ1。
应理解，第一荧光报告基团和第二荧光报告基团可以相同也可以不同。第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团可以相同也可以不相同。
本申请实施例提供的引物探针组合可以仅包括第一引物和第一探针，或仅包括第二引物和第二探针，分别用于进行高效、准确地VGIb型隐球菌或VGIa型隐球菌检测；也可以同时包括第一引物、第二引物、第一探针和第二探针，用于进行同时进行VGIb型隐球菌和VGIa型隐球菌的检测。
上述引物探针组合在检测和鉴定隐球菌亚型时具有敏感性高、特异性强的明显优势。进一步地，利用上述引物探针组合还能够在检测隐球菌的同时鉴定隐球菌的类型，帮助临床早期对隐球菌的快速诊断。
本申请实施例还提供一种检测隐球菌的方法100。
图1为本申请实施例检测隐球菌的方法100的示意性流程图。如图1所示，方法100包括：
S101，获取待测样本的模板DNA。
S102，通过聚合酶链式反应PCR对待测样本的模板DNA进行扩增以获取扩增结果。其中，PCR的反应物包括本申请任一实施例中的引物探针组合。
S103，根据扩增结果判断待测样本中隐球菌的亚型。
具体来说，本申请提供的上述引物探针组合通过荧光定量PCR能够有效检测待测样本中的隐球菌并鉴定待测样本中的隐球菌亚型。
可选地，方法100中的隐球菌包括VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌以及野生型隐球菌中的至少一个。其中，野生型隐球菌指的是除VGIa型隐球菌和VGIb型隐球菌以外的其他类型的隐球菌。
可选地，待测样本包括血液、体液、和/或肺部组织。
可选地，在S102中，PCR反应物包括第一引物和第一探针。在S103中，根据扩增结果判断待测样本中隐球菌的亚型包括：
在扩增结果中，第一荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断待测样本中的隐球菌为VGIb型隐球菌。
在扩增结果中，第一荧光报告基团没有荧光对数增长或第一荧光报告基团有荧光对数增长但循环阈值Ct大于30.0的情况下，判断待测样本中的隐球菌不是VGIb型隐球菌。
可选地，在S102中，PCR反应物包括第二引物和第二探针。在S103中，根据扩增结果判断待测样本中隐球菌的亚型包括：
在扩增结果中，第二荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断待测样本中的隐球菌为VGIa型隐球菌。
在扩增结果中，第二荧光报告基团没有荧光对数增长或第二荧光报告基团有荧光对数增长但循环阈值Ct大于30.0的情况下，判断待测样本中的隐球菌不是VGIa型隐球菌。
实际应用中，待测样本通常为未知样本。可以先通过第一引物和第一探针检测待测样本中的隐球菌是否为致病率更高的VGIb型隐球菌，再通过第二引物和第二探针检测待测样本中的隐球菌是否为VGIa型隐球菌。也可以同时通过上述多个引物和多个探针对待测样本进行检测，通过各个引物探针的检测结果结合分析确定待测样本中隐球菌的亚型。
可选地，在S102中，PCR反应物包括第一引物、第二引物、第一探针和第二探针。在S103中，根据扩增结果判断待测样本中隐球菌的亚型包括：
在所述扩增结果中所述第一荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述隐球菌为VGIb型隐球菌。
在所述扩增结果中所述第二荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述隐球菌为VGIa型隐球菌。
具体来说，若第一荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0，而第二荧光报告基团没有荧光对数增长或有荧光对数增长但循环阈值Ct大于30.0，则判断待测样本中的隐球菌中存在VGIb型隐球菌且不存在VGIa型隐球菌；若第二荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0，而第一荧光报告基团没有荧光对数增长或有荧光对数增长但循环阈值Ct大于30.0，则待测样样本中的隐球菌存在VGIa型隐球菌且不存在VGIb型隐球菌；若第一荧光报告基团和第二荧光报告基团均有荧光对数增长，且循环阈值Ct均小于或等于30.0，则判断待测样本中的隐球菌中同时存在VGIa型隐球菌和VGIb型隐球菌。其他情况下，判断待测样本中没有隐球菌或隐球菌为野生型隐球菌。
应理解，在第一荧光报告基团和第二荧光报告基团为相同的基团时，荧光定量PCR可以通过荧光对数增长的具体数量确定第一荧光报告基团和第二荧光报告基团是否有相应的对数增长。
本申请实施例还提供一种检测隐球菌亚型的试剂盒，该试剂盒包括本申请任一实施例中的引物探针组合。
可选地，该试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷酸三磷酸dNTP。
可选地，该试剂盒还包括MgCl2。
使用本申请实施例提供的试剂盒，能够准确、快速地检测隐球菌。操作简单、检测时间短、适应性强的同时还能鉴别致病菌的亚型，从而进行快速准确的临床诊断，为疾病治疗赢得宝贵的时间。
另外，本申请实施例还提供一种如上述任一实施例中的引物探针组合在检测隐球菌亚型中的应用。
接下来，对本申请提供的检测方法100的具体步骤做进一步介绍。应理解，下述实施例仅为了说明本申请的鉴定方法的实施方式，其中具体试剂用量或仪器的使用可根据需要调整，不构成对本申请实施例的限定。
实施例1：模板DNA的提取
一、试验材料：待测样本
本申请所述的待测样本包括但不限于血液、体液或肺部组织。
二、主要试剂与仪器
DNA提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；DNA聚合酶购自Takara公司；荧光定量PCR仪购于Roche公司。
三、实验方法
按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，使用分光光度计，测定样品中DNA含量，测定OD260/OD280比值。本实施例中提供的待测样本中含有新生隐球菌、VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌。
实施例2：PCR扩增反应
2.1 VGIb型隐球菌的PCR检测
一、试验材料
模板DNA。具体的PCR反应体系详见表1。
二、主要试剂与仪器
表1：实时荧光PCR反应体系1 (25 μL)
三、实验方法
本实施例采用TAKARA公司的Prime STAR 2X Mix的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增反应，PCR扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书。
本实施例中，反应体系1中第一正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，第一反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，第一探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
本实施例中，PCR反应的扩增条件为：95oC预变性5min；95oC 10s，68oC 60s，45个循环，获得扩增结果。
四、分析判断扩增结果
图2为本申请实施例通过上述操作得到的VGIb型隐球菌的扩增曲线。图2的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位(Relative fluorescence unit, RFU)，横坐标为扩增的循环数目(cycle)。
如图2所示，在对待测样本的检测结果中，只有VGIb型隐球菌被特异性扩增，具有相应的扩增曲线，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct≤30.0。而平行实验的VGIa型隐球菌、新生隐球菌均无特异性扩增曲线。说明第一引物和第一探针对VGIb型隐球菌具有良好的特异性，能够准确识别待测样本中的VGIb型隐球菌。并且，VGIb型隐球菌的3条扩增曲线具有几乎一致的荧光对数增长，说明通过第一引物和第一探针检测VGIb型隐球菌的方法具有良好的重复性。另外，图2中的模板DNA浓度为0.1 ng/μL，经过荧光PCR仍能有良好的荧光对数响应，说明通过第一引物和第一探针检测VGIb型隐球菌的方法具有优异的敏感性。
由此，本申请提供的引物探针组合能够准确、高效地检测VGIb型隐球菌。
2.2 VGIa型隐球菌的PCR检测
一、试验材料：模板DNA。具体的PCR反应体系详见表2。
二、主要试剂与仪器
表2：实时荧光PCR反应体系2 (25 μL)
三、实验方法
本实施例采用TAKARA公司的Prime STAR 2X Mix的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增反应，PCR扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书。
本实施例中，反应体系2中第二正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.5所示，第二反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.6所示，第二探针的核苷酸序列如Seq ID No.7。
本实施例中，PCR反应的扩增条件为：95oC预变性5min；95oC 10s，68oC 60s，45个循环，获得扩增结果。
四、分析判断扩增结果
图3为本申请实施例通过上述操作得到的VGIa型隐球菌的扩增曲线。图3的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位(Relative fluorescence unit, RFU)，横坐标为扩增的循环数目(cycle)。
如图3所示，在对待测样本的检测结果中，VGIa型隐球菌被特异性扩增，具有相应的扩增曲线，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct≤30.0。而平行实验的VGIb型隐球菌、新生隐球菌均无特应性扩增曲线。说明第二引物和第二探针能够特异性识别待测样本中的VGIa型隐球菌，具有良好的特异性。并且VGIa型隐球菌的3条扩增曲线均具有几乎一致的荧光对数增长，说明通过第二引物和第二探针检测VGIa型隐球菌的方法具有良好的重复性。另外，图3中的模板DNA为0.1 ng/μL，经过荧光PCR仍能有良好的荧光对数响应，说明通过第二引物和第二探针检测VGIa型隐球菌的方法具有优异的敏感性。
由此，本申请提供的引物探针组合能够准确检测VGIa型隐球菌。
经过上述对VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌以及新生隐球菌的检测可以看出，本申请提供的引物探针组合能够对VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌进行特异性鉴定，平行实验的其他菌株的结果均为阴性，没有特异性扩增曲线，由此，该引物探针组合具有良好的特异性能够准确对VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌进行检测。另外，通过本申请提供的引物探针组合进行隐球菌检测时，不仅能够检测是否存在隐球菌，还能够直接确定隐球菌的亚型，有利于在临床上帮助对致病率或致死率更高的隐球菌亚种进行早期干预和治疗。通过本申请提供的检测试剂盒对隐球菌亚型进行检测，操作简单且结果可靠准确，能够帮助医师对隐球菌感染的疾病进行快速地诊断，有利于尽早制定合适的治疗方法，减少药物滥用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一种实现方式”、“一些实施例”、“示意性实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (12)
1.一种检测隐球菌亚型的引物探针组合，其特征在于，所述引物包括第一引物，所述第一引物包括第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的核苷酸序列如Seq IDNo.1所示，所述第一反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；所述探针包括第一探针，所述第一探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一引物用于识别VGIb型隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一探针的5’端连接有第一荧光报告基团，所述第一探针的3’端连接有第一荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物包括第二引物，所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.5，所述第二反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.6所示；所述探针包括第二探针，所述第二探针的核苷酸序列如Seq ID No.7所示。
5.根据权利要求4所述的引物探针组合，其特征在于，所述第二引物用于识别VGIa型隐球菌中如Seq ID No.8所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的引物探针组合，其特征在于，所述第二探针的5’端连接有第二荧光报告基团，所述第二探针的3’端连接有第二荧光淬灭基团。
7.一种检测隐球菌亚型的方法，其特征在于，所述方法包括：
获取待测样本的模板DNA；
通过聚合酶链式反应PCR对所述模板DNA进行扩增以获取扩增结果，其中所述PCR的反应物包括如权利要求1-6中任一项所述的引物探针组合；
根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述隐球菌的亚型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述隐球菌包括VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌以及野生隐球菌中的至少一个。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述隐球菌的亚型包括：
在所述扩增结果中所述第一荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述隐球菌为VGIb型隐球菌；
在所述扩增结果中所述第二荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述隐球菌为VGIa型隐球菌。
10.一种检测隐球菌亚型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-6中任一项所述的引物探针组合。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷三磷酸dNTP。
12.一种如权利要求1-6中任一项所述的引物探针组合在检测隐球菌亚型中的应用。
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| CN117248068A (zh) * | 2023-10-11 | 2023-12-19 | 首都医科大学附属北京世纪坛医院 | 检测VGIb型隐球菌的引物探针组合、方法及试剂盒 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20090246767A1 (en) * | 2007-06-20 | 2009-10-01 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Compositions and methods for detecting Cryptococcus neoformans |
| CN116356064A (zh) * | 2023-02-17 | 2023-06-30 | 首都医科大学附属北京世纪坛医院 | 一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒 |
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