CN117165714A - 一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 - Google Patents
一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117165714A CN117165714A CN202311312452.9A CN202311312452A CN117165714A CN 117165714 A CN117165714 A CN 117165714A CN 202311312452 A CN202311312452 A CN 202311312452A CN 117165714 A CN117165714 A CN 117165714A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cryptococcus neoformans
- primer
- sample
- probe combination
- cryptococcus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 title claims abstract description 81
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims description 3
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010013654 Drug abuse Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 3
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000006142 Infectious Encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 244000000008 fungal human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请涉及一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒。引物探针组合中，引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。本申请提供的引物探针组合能够准确、高效地检测新生隐球菌，检测隐球菌的同时还能明确隐球菌种类，帮助临床快速准确地诊断新生隐球菌导致的疾病，减少药物滥用。
Description
技术领域
本申请属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒。
背景技术
隐球菌是一类危害人类健康的致病性真菌。不同种类的隐球菌在流行病学和临床致病过程中存在明显差异。其中，新生隐球菌是一类主要感染免疫抑制人群的致病隐球菌，每年可导致超过60万人死亡。新生隐球菌通常通过呼吸系统进入人体肺部，经血液扩散至不同脏器，最终可穿过血脑屏障进入脑部引发脑膜炎。新生隐球菌的感染通常为隐形感染，在临床早期不易察觉，容易误诊。因此，新生隐球菌的早期检测与分型对隐球菌病的治疗至关重要。
现有的隐球菌检测方法如墨汁染色法、培养鉴定法等尽管能够检测隐球菌，但敏感度较低、耗时较长，且无法检测隐球菌的类型。由此，如何快速准确地检测新生隐球菌成为一项亟待解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法、试剂盒以及该引物探针组合在检测新生隐球菌中的应用，通过针对新生隐球菌的特定基因片段设计对应的引物探针组合，能够准确地检测新生隐球菌，帮助提高新生隐球菌的检测效率以及准确性。
第一方面，本申请提供一种新生隐球菌的引物探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
在一些实施例中，所述引物用于识别所述新生隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
在一些实施例中，所述探针为：
FAM-GTGAGTTCCCCGTCTTTTTC-BHQ1。
第二方面，提供一种检测新生隐球菌的方法，所述方法包括：获取待测样本的模板DNA；通过聚合酶链式反应PCR对所述模板DNA进行扩增以获取扩增结果，其中，所述PCR的反应物包括第一方面任一实施例中的引物探针组合；根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阳性或阴性。
在一些实施例中，所述待测样本包括血液、体液和/或肺部组织。
在一些实施例中，所述根据所述扩增结果判断待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：在所述扩增结果中有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阳性；或在所述扩增结果中没有荧光对数增长，且循环阈值Ct大于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阴性；或在所述扩增结果中有荧光增长，且循环阈值Ct大于30.0的情况下，判断所述新生隐球菌的检测结果为阴性。
第三方面，本申请实施例提供一种检测新生隐球菌的试剂盒，所述试剂盒包括本申请任一实施例中的引物探针组合。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷三磷酸dNTP。
第四方面，本申请还提供一种本申请实施例任一实施例所述的引物探针组合在检测新生隐球菌中的应用。
附图说明
图1是本申请实施例一种新生隐球菌的检测方法的示意性流程图。
图2是本申请实施例新生隐球菌的特异性扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请的技术方案作进一步介绍。
本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。在本申请中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。另外，当表述某个参数为≥2的整数，则相当于公开了该参数为例如整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等。
在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
如果没有特别的说明，本申请所提到的“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分，也可以仅包括或包含列出的组分。
如果没有特别的说明，在本申请中，术语“或”是包括性的。举例来说，短语“A或B”表示“A，B，或A和B两者”。更具体地，以下任一条件均满足条件“A或B”：A为真（或存在）并且B为假（或不存在）；A为假（或不存在）而B为真（或存在）；或A和B都为真（或存在）。
如果没有特别的说明，本申请的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
隐球菌是一类能够导致隐球菌病的真菌，在真菌分类学上属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母科。隐球菌病是由隐球菌引起的肺部或散播性感染性疾病，主要引起肺炎、脑膜炎、皮肤或脏器感染。隐球菌的属内种类众多，其中引起人类感染的主要有新生隐球菌和格特隐球菌。
新生隐球菌是担子菌门最为重要的人类病原真菌，是导致免疫缺陷人群死亡的重要真菌病原菌之一，每年可导致超过60万人死亡。新生隐球菌通常通过呼吸系统进入宿主肺部，经由血液扩散至不同脏器，并可最终穿过血脑屏障进入脑部引发脑膜炎。该菌引发的脑膜炎致死/致残率较高，即便在欧美等诊疗发达的国家和地区其感染致死率仍超过20％。此外，新生隐球菌在我国的感染相对独特，有感染免疫健全人群的倾向，且在一些地区已成为感染性脑炎的主要病原体，对我国的公共健康安全构成了更严峻的挑战。
现有的隐球菌检测方法如墨汁染色法、培养鉴定法等尽管能够检测隐球菌，但其敏感度较低、检测耗时较长，且无法区分隐球菌的类型，不利于临床上对隐球菌病的快速诊断以及治疗方案的制定。
有鉴于此，本申请提供了一种检测新生隐球菌的引物探针组合，基于该引物探针组合的聚合酶链式反应PCR能够准确、快捷地进行新生隐球菌检测，检测隐球菌的同时确定隐球菌的类型。
首先本申请实施例提供一种检测新生隐球菌的引物探针组合。
其中，该引物包括正向引物和反向引物。正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，该探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
具体来说，发明人通过生物信息学方法，通过对新生隐球菌、格特隐球菌、金色葡萄球菌、克氏肺炎菌、大肠杆菌、白色念珠菌等细菌的全部基因组进行比较，不局限于单一的编码基因，而是在整个基因组层面寻找差异位点，从而设计出了核苷酸序列如Seq IDNo.1和Seq ID No.2所示的引物。该引物能够特异性识别只有新生隐球菌才有的如Seq IDNo.4所示的核苷酸序列，利用该引物对新生隐球菌进行高效、准确地检测。
其中，正向引物的核苷酸序列具体为：
CCCGTCCCAGTGGACTTTAC。
反向引物的核苷酸序列具体为：
TTGTAGCCCGGGACAAAGAC。
该引物用于识别新生隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。换言之，针对新生隐球菌设计的该引物能够特异性识别新生隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
可选地，该探针的5’端连接有荧光报告基团，该探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
其中，荧光报告基团包括但不限于6-羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、六氯-6-甲基荧光素（HEX）、花青素荧光染料CY3、6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）。荧光淬灭基团包括但不限于6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）、4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸（DABCYL）或黑洞淬灭剂BHQ1、BHQ2、BHQ3。
例如，该探针的5’端连接有FAM基团，该探针的3’端连接有BHQ1基团。即该探针为：
FAM-GTGAGTTCCCCGTCTTTTTC-BHQ1。
上述引物探针组合在检测和鉴定新生隐球菌时具有敏感性高、特异性强的明显优势，在检测隐球菌的同时还能确定该隐球菌是否为新生隐球菌，从而帮助临床早期对隐球菌病的诊断和治疗方案的制定，为疾病的治疗争取宝贵的时间。
本申请实施例还提供一种检测新生隐球菌的方法100。
图1为本申请实施例检测新生隐球菌的方法100的示意性流程图。如图1所示，方法100包括：
S101，获取待测样本的模板DNA。
S102，通过聚合酶链式反应PCR对待测样本的模板DNA进行扩增以获取扩增结果。其中，PCR的反应物包括本申请任一实施例中的引物探针组合。
S103，根据扩增结果判断待测样本中新生隐球菌的检测结果为阳性或阴性。
具体来说，本申请提供的上述引物探针组合通过荧光定量PCR能够有效检测待测样本中是否存在新生隐球菌。例如，通过TaqMan探针法进行荧光定量PCR检测。
可选地，待测样本包括血液、体液、和/或肺部组织。
可选地，在S103中，根据扩增结果判断待测样本中的新生隐球菌为阳性或阴性包括：
在扩增结果中，荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断待测样本中新生隐球菌的检测结果为阳性。
在扩增结果中，荧光报告基团没有荧光对数增长或第一荧光报告基团有荧光对数增长但循环阈值Ct大于30.0的情况下，判断待测样本中新生隐球菌的检测结果为阴性。
本申请实施例还提供一种检测新生隐球菌的试剂盒，该试剂盒包括本申请任一实施例中的引物探针组合。
可选地，该试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷酸三磷酸dNTP。
可选地，该试剂盒还包括MgCl2。
使用本申请实施例提供的试剂盒，具有上述引物探针组合，能够特异性地识别新生隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列，从而能够准确、快速地检测新生隐球菌。该方法100的操作简单、检测时间短、适应性强的优点，能够帮助实现快速准确的临床诊断，为疾病治疗赢得宝贵的时间。
另外，本申请实施例还提供一种如上述任一实施例中的引物探针组合在检测新生隐球菌中的应用。
接下来，对本申请提供的检测方法100的具体步骤做进一步介绍。应理解，下述实施例仅为了说明本申请的鉴定方法的实施方式，其中具体试剂用量或仪器的使用可根据需要调整，不构成对本申请实施例的限定。
实施例1：模板DNA的提取
一、试验材料：待测样本
本申请所述的待测样本包括但不限于血液、体液或肺部组织。
二、主要试剂与仪器
DNA提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；DNA聚合酶购自Takara公司；荧光定量PCR仪购于Roche公司。
三、实验方法
按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，使用分光光度计，测定样品中DNA含量，测定OD260/OD280比值。本实施例提供的待测样本中含有新生隐球菌和格特隐球菌。
实施例2：PCR扩增反应
2.1 新生隐球菌的PCR检测
一、试验材料
模板DNA。具体的PCR反应体系详见表1。
二、主要试剂与仪器
表1：实时荧光PCR反应体系 (25 μL)
三、实验方法
本实施例采用TAKARA公司的Prime STAR 2X Mix的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增反应，PCR扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书。
本实施例中，反应体系中正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
本实施例中，PCR反应的扩增条件为：95oC预变性5min；95oC 10s，68oC 60s，45个循环，获得扩增结果。
四、分析判断扩增结果
图2为本申请实施例通过上述操作得到的新生隐球菌的扩增曲线。图2的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位(Relative fluorescence unit, RFU)，横坐标为扩增的循环数目(cycle)。
如图2所示，在对待测样本的检测结果中，新生隐球菌被特异性扩增，具有相应的扩增曲线，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct≤30.0。而平行实验的格特隐球菌没有被扩增。由此，待测样本中新生隐球菌的检测结果为阳性。说明该引物探针组合对新生隐球菌具有良好的特异性，能够准确检测待测样本中的新生隐球菌。并且，新生隐球菌的3条扩增曲线具有几乎一致的荧光对数增长，说明利用该引物探针组合的检测方法具有良好的重复性。另外，图2中的模板DNA浓度为0.1 ng/μL，通过PCR具有良好的荧光对数响应，说明该利用该引物探针组合的检测方法具有优异的敏感性。
由此，本申请提供的引物探针组合能够准确、高效地进行新生隐球菌检测。
综上所述，本申请提供的引物探针组合对新生隐球菌具有良好的特异性，使得利用该引物探针组合对新生隐球菌的检测具有较好的重复性以及敏感性。利用含有该引物探针组合的试剂盒来检测新生隐球菌能够满足临床上快速、准确检测隐球菌的需求，且操作简单、结果可靠，有助于帮助医师在临床早期制定合适的治疗策略，减少药物滥用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一种实现方式”、“一些实施例”、“示意性实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种检测新生隐球菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SeqID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物用于识别所述新生隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针为：
FAM-GTGAGTTCCCCGTCTTTTTC-BHQ1。
5.一种新生检测隐球菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
获取待测样本的模板DNA；
通过聚合酶链式反应PCR对所述模板DNA进行扩增以获取扩增结果，其中所述PCR的反应物包括如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合；
根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阳性或阴性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括血液、体液和/或肺部组织。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：
在所述扩增结果中有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阳性；或
在所述扩增结果中有荧光对数增长，且循环阈值Ct大于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阴性；或
在所述扩增结果中没有荧光对数增长的情况下，判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阴性。
8.一种检测新生隐球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷三磷酸dNTP。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合在检测新生隐球菌中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311312452.9A CN117165714A (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311312452.9A CN117165714A (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117165714A true CN117165714A (zh) | 2023-12-05 |
Family
ID=88931916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311312452.9A Pending CN117165714A (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117165714A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090246767A1 (en) * | 2007-06-20 | 2009-10-01 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Compositions and methods for detecting Cryptococcus neoformans |
| JP2012182997A (ja) * | 2011-03-03 | 2012-09-27 | Teikyo Univ | クリプトコックス症起因菌の検出法と検出キット |
| CN108060263A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-05-22 | 杭州缔蓝生物技术有限公司 | 一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒 |
| CN113999933A (zh) * | 2020-03-10 | 2022-02-01 | 北京量觉科技有限责任公司 | 一种准确检测新生隐球菌的方法 |
-
2023
- 2023-10-11 CN CN202311312452.9A patent/CN117165714A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090246767A1 (en) * | 2007-06-20 | 2009-10-01 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Compositions and methods for detecting Cryptococcus neoformans |
| JP2012182997A (ja) * | 2011-03-03 | 2012-09-27 | Teikyo Univ | クリプトコックス症起因菌の検出法と検出キット |
| CN108060263A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-05-22 | 杭州缔蓝生物技术有限公司 | 一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒 |
| CN113999933A (zh) * | 2020-03-10 | 2022-02-01 | 北京量觉科技有限责任公司 | 一种准确检测新生隐球菌的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KAZUO SATOH 等: ""Detection and identification of probable endemic fungal pathogen, Cryptococcus gattii, and worldwide pathogen, Cryptococcus neoformans, by real-time PCR", MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, vol. 55, no. 6, 30 June 2011 (2011-06-30), pages 454 - 457 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111206120A (zh) | 一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法 | |
| CN111004862B (zh) | 用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用 | |
| CN113999933A (zh) | 一种准确检测新生隐球菌的方法 | |
| CN113584224B (zh) | 基于lamp技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN101158634A (zh) | 乙型肝炎病毒(hbv)荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN113862393A (zh) | 一种快速检测格特隐球菌的方法 | |
| CN105779625B (zh) | 一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量pcr引物、试剂盒及方法 | |
| CN110055347A (zh) | 一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法 | |
| CN115820921A (zh) | 三种肺侵袭性真菌检测的引物探针组合及其数字pcr试剂盒 | |
| CN117144049A (zh) | 检测隐球菌亚型的引物探针组合、方法以及试剂盒 | |
| CN1904068B (zh) | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CN106755379B (zh) | 对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量pcr方法 | |
| KR20220073327A (ko) | 형광 프로브를 이용한 칸디다 알비칸, 칸디다 아우리스, 및 칸디다 글라브라타를 감별하여 검출할 수 있는 동시다중 등온증폭반응 프라이머 세트 | |
| CN111424101A (zh) | 一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法 | |
| CN117265162B (zh) | 一种检测格特隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 | |
| CN117165714A (zh) | 一种检测新生隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 | |
| CN117089648B (zh) | 检测VGIa型隐球菌的引物探针组合、方法及试剂盒 | |
| CN117248068B (zh) | 检测VGIb型隐球菌的引物探针组合、方法及试剂盒 | |
| CN105567821A (zh) | 炭疽芽孢杆菌荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN117106966B (zh) | 一种检测格特隐球菌的引物对、方法以及试剂盒 | |
| KR102278402B1 (ko) | 홍역 바이러스 및 백신주의 검출용 프라이머 및 프로브와 이를 이용한 검출 방법 | |
| CN117051168A (zh) | 一种检测隐球菌的引物探针组合、方法以及试剂盒 | |
| CN117467791A (zh) | 一种检测新生隐球菌的引物对、方法以及试剂盒 | |
| KR102692361B1 (ko) | 형광 프로브를 이용한 칸디다 판 및 칸디다 알비칸스 검출용 동시다중 등온증폭반응 프라이머 세트 | |
| CN117051167A (zh) | 一种检测隐球菌的引物对、方法以及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |