CN108060263A

CN108060263A - 一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒

Info

Publication number: CN108060263A
Application number: CN201810137956.4A
Authority: CN
Inventors: 方园; 吕火烊; 欧阳云
Original assignee: Hangzhou Blue Biology Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Blue Biology Technology Co Ltd
Priority date: 2018-02-10
Filing date: 2018-02-10
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2038-02-10
Also published as: CN108060263B

Abstract

本发明涉及一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒，属于病原微生物体外分子检测技术领域。本发明提供了一种基于荧光PCR法同时检测三种隐球菌的引物探针组合，所述隐球菌包括新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质。本发明提供的引物探针组合能够实现新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌的同时检测，检测特异型强，灵敏度高。

Description

一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及病原微生物体外分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

深部真菌病是指致病真菌不仅侵犯皮肤、黏膜而且侵犯深入部组织和内脏所致的疾病。真菌广泛分布于自然界，某些真菌可以感染人体而致病。深部真菌病常为继发感染，多在糖尿病、血液病、恶性肿瘤、大面积烧伤、严重营养不良或其他慢性消耗性疾病的基础上发病。或长期应用抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、使机体内菌群失调或抑制了机体的免疫反应而诱发。

隐球菌病是一种可能致命的真菌疾病，常使艾滋病患者罹患严重的脑膜炎或脑膜脑炎。其他易感者包括某些淋巴瘤患者(如霍奇金氏淋巴瘤)、结节病患者及长期使用糖皮质激素的患者。其中，新生隐球菌是最常见的病原，通常感染免疫功能低下者，而格特隐球菌越来越常被识别为具感染免疫功能正常者能力的病原体。

目前实验室对于隐球菌的诊断主要有以下三种：

(1)培养鉴定检测法

取自患处的标本作直接涂片或培养。隐球菌是实验室常见的污染菌，必须反复涂片或培养，多次阳性且为同一菌种才有诊断价值。虽然培养鉴定法是临床最常采用的方法，但是其培养周期较长。

(2)病理组织检查

取受损组织或淋巴结活检，可根据真菌形态确诊。尤其对播散性隐球菌，可及时作出诊断。病理组织检查的结果较为可靠，但是由于其具有创性，多数患者难以接受，限制了其应用。

(3)免疫方法

使用血清免疫学检测隐球菌细胞壁或代谢产物。该方法灵敏度不高、特异性不强，主要因为隐球菌感染早期局限在感染部位，未浸润入血，或仅微量入血因而抗原/抗体滴度很低。另一方面，真菌细胞壁蛋白为糖蛋白，其抗原性不强，抗体滴度普遍较低，且多糖包裹的蛋白隐藏在里面，抗体往往结合不上去，使得免疫活性降低。

(4)实时荧光聚合酶链反应法(Real-Time Fluorescence Polymerase ChainReaction，荧光PCR)

基于实时荧光聚合酶链反应法的检测技术经过二十多年的实践，不断改进并完善，逐渐成为临床分子诊断最成熟的核酸检测方法，它融汇了PCR技术的核酸高效扩增、基因扩增的灵敏性、分子杂交的特异性和光谱技术的敏感性及精确定量的特点，从根本上解决了PCR扩增产物的污染问题，尤其是荧光探针法(TaqMan法)，用一对引物加一条探针，决定了其特异性非常高，基本上不存在非特异性扩增，解决了交叉反应的难题。结果判定客观、真实。通过对微生物病原体的核酸检测，不仅可以协助判断是否有微生物病原体的感染，还可以对微生物病原体的流行进行调查和监控，帮助建立微生物病原体病的检测标准，为临床考评疗效提供依据，并能协助指导临床用药和预测疾病的发展等。然而，隐球菌由于种类繁多，种之间、种属之间(与其他属比如念珠菌属、曲霉属等)的核酸序列同源性较高，同时，整个真菌基因组发生变异的几率远大于人类基因组，使得可选择做为靶基因序列进行种属检测的基因序列不多，因此，对于设计特异性检测常见隐球菌比如新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌的荧光PCR的引物和探针的难度就比较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒。本发明提供的引物探针组合能够实现新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌的同时检测，检测特异型强，灵敏度高。

本发明提供了一种基于荧光PCR法同时检测三种隐球菌的引物探针组合，所述隐球菌包括新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质。

优选的是，所述荧光基团包括FAM、SYBR Green I、JOE、VIC、NED、CY-3、TEXAS Red或CY-5。

优选的是，所述荧光猝灭基团包括TAMRA或BHQ1。

本发明还提供了一种同时检测三种隐球菌的检测试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案所述引物探针组合、阴性对照、阳性对照和PCR反应液。

优选的是，所述PCR反应液包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、参比荧光、MgCl₂和缓冲液。

优选的是，所述上游引物、下游引物和探针的使用浓度独立地为8～12μM。

优选的是，所述阴性对照为含无关基因的质粒，所述无关基因的序列如SEQ IDNO.4所示。

优选的是，所述阳性对照包括含新生隐球菌阳性对照DNA片段的质粒、含格特隐球菌阳性对照DNA片段的质粒和含罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的质粒，所述新生隐球菌阳性对照DNA片段、格特隐球菌阳性对照DNA片段和罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～7所示。

优选的是，每20μL反应体系包括：10μLPCR反应液、1μL上游引物和下游引物、0.5μL探针、4.5μL水和4μL待检测样品。

优选的是，所述试剂盒的反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，57℃30s，40个循环。

本发明提供了一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合。本发明提供的引物探针组合能够实现新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌的同时检测，检测特异型强，灵敏度高。试验结果表明，本发明提供的引物探针组合能够检测浓度分别在0.000001ng/μL-1ng/μL范围内的新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌；与其他菌无交叉反应；精密度足够，其Ct值变异系数CV值≤5％；稳定性高；在临床上的应用效果好。最低检测限是0.000001ng/μL。

附图说明

图1为本发明实施例5提供的标准荧光PCR扩增曲线图；

图2为本发明实施例5提供的扩增曲线的标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于荧光PCR法同时检测三种隐球菌的引物探针组合，所述隐球菌包括新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示序列的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光猝灭基团的物质。

本发明根据罗伦特隐球菌、新生隐球菌、格特隐球菌三种隐球菌的同源保守基因组DNA片段设计特异引物及荧光标记的探针，通过检测荧光信号的强度和扩增曲线的形状来判定是否有特异性的PCR产物形成，进而判断所测样本中是否含有目的DNA片段。本发明选择隐球菌核糖体部位的保守序列做为靶基因的部位，经过大量序列比对和筛选，设计出可以同时检测新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌三种隐球菌的通用引物和探针，这三个寡核苷酸可以同时识别上述三种隐球菌，但不与其他真菌菌种如白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等进行交叉，实现了引物和探针的特异性，而不失灵敏性。

本发明根据新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌的核糖体RNA的基因组DNA的序列，筛选通用检测上述隐球菌且与其它物种不同源的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如下：

(1)新生隐球菌靶序列(73bp)如SEQ ID NO.8所示：

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCCCTTTGGT；

(2)格特隐球菌靶序列(73bp)如SEQ ID NO.9所示：

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCCCTTTGGT；

(3)罗伦特隐球菌靶序列(73bp)如SEQ ID NO.10所示：

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCTTTTGGT；

本发明针对新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌的靶序列进行引物的设计，本发明所述上游引物(Cry-F)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5'-AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCA-3'；所述下游引物(Cry-R)核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示：5'-ACCAAAGGGCGCAAGTTG-3'。本发明对所述引物的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行人工合成即可，如上海捷瑞生物技术有限公司。

本发明依据新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌的靶序列进行探针的设计，本发明得到的探针为：在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质。在本发明中，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为：5'-TTCAGTGAATCATCGAATC-3'。在本发明中，所述荧光基团包括FAM、SYBR Green I、JOE、VIC、NED、CY-3、TEXAS Red或CY-5等，优选为FAM；在本发明中，所述荧光猝灭基团包括TAMRA或BHQ1等，优选为四甲基罗丹明(TAMRA)。本发明对所述探针的合成方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行合成即可，如上海捷瑞生物技术有限公司。

在本发明中，所述试剂盒中优选包括浓度为8～12μM的上游引物，更优选为9～11μM，最优选为10μM。在本发明中，所述试剂盒中优选包含15～25μL的上游引物，更优选为18～23μL，最优选为22μL。在本发明中，所述上游引物的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述试剂盒中优选包括浓度为8～12μM的下游引物，更优选为9～11μM，最优选为10μM。在本发明中，所述试剂盒中优选包含15～25μL的下游引物，更优选为18～23μL，最优选为22μL。在本发明中，所述下游引物的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述试剂盒中优选包括浓度为8～12μM的探针，更优选为9～11μM，最优选为10μM。在本发明中，所述试剂盒中优选包含8～15μL的探针，更优选为10～12μL，最优选为11μL。在本发明中，所述探针的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述阴性对照为含无关基因的质粒，所述无关基因的序列(826bp)如SEQ ID NO.4所示。在本发明中，所述无关基因为植物拟南芥的DNA片段，所述拟南芥DNA片段具体序列为：

AATCGCCAAGCCAAATTCACACTTCAGTATGACTTGTGTCTTTCCAGGAAGGAATTTCTCAACCTCACTTTTTTCCTTCTCAGTAGAAACGGCCTTATGACCTGAAAGTGACATTAACATCAAGTATCATGCATAACGCATTTTCTATAAAAGAAAAAGGGTCTAAACCAAAAAAAGGTGCATAATAAACCCACATGATGCAGACGGTTAATAATCAACAGCTCCTCTTCATCTGTAAGACTGGCACTACCACATTCTGCGAATGGAGTATTAAACCATTCTTCGAAATTATGAATTGAGTTAAAGATGTGAGGAAGAAGAAAATTAAGCAGCGACCATAGTTCTTGCAGACTGTTCTGTATGGGAGTTCCAGTTAATAGAAGTCTGCGCTTAATCCGGTAGCTGCATCCAGGACAAATTAGTGTAAGCAAAATGTCTTTAAATTTCCTTTGTGACAGTATCTTTAAGAGATAAATCAGAGTAACAACTAATTAACACCATTCACTTCAGACTTCATCAAGCTAATGCGTAAAAAGGCATGTCTAAACATCTTTAAGAAACTAGATACAGTCTACTCAAAGACCAGAGTAACATACAGAAACATACCCAGTTCCTAGAGTCTTTGCGAGAGCACATTCATGGTTCTTCAGACGATGTCCTTCATCAACAATCATGTAGTTCCAGTCAATTTTCTTCAAAAATGCTTTATCTCTCATGATAAGATCGTAGTGGGTTATCAACACATTAAATTTTCCTCCTGCTATTCTTGCTCTTATTTCAGTTCTTTTCTCCTTTGATCCATCGTAAAGAAAATCGCTGAATCATG。

在本发明中，所述阴性对照的设置，选择一个植物模式遗传物质基因，与人的基因没有显著的同源性，与真菌的基因没有显著的同源性，不会造成与人和真菌的基因的交叉反应；然而该无关基因片段具有所有基因片段所具有的普遍特性，即由常见的四种脱氧核糖核酸ATCG组成，是一段真实的核酸基因序列，做为阴性对照比通常所用的空白对照或缓冲液对照更具代表性。所述阴性对照的浓度优选为1ng/mL。在本发明中，所述阴性对照优选为含植物拟南芥DNA片段的质粒，在本发明中，所述质粒优选为pTG19-T。本发明所述阴性对照质粒的构建过程优选为：提取拟南芥的基因组DNA；以拟南芥基因组DNA为模板，用引物A和引物B进行PCR扩增，获得拟南芥DNA片段；将该拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体中，构建获得阴性对照质粒。在本发明中，所述引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示：5'-AATCGCCAAGCCAAATTCACAC-3'；所述引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示：5'-CATGATTCAGCGATTTTCTTTACG-3'。

在本发明中，所述PCR扩增拟南芥DNA片段的体系优选为：5X缓冲液4μl(50mMTris-HCl[pH 8.5]，50mM NaCl，0.5mg/ml BSA)；25mM MgCl 1.6μl；10mM dNTP 0.5μl；10μMPrimer-F 0.5μl；10μM Primer-R 0.5μl；基因组DNA 1ng；5U/μl Taq酶0.25μl；消毒的超纯水加至20μl。

在本发明中，所述PCR扩增拟南芥DNA片段的扩增条件优选为：95℃4min；95℃30s，51℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min；12℃∝。

在本发明中，所述拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体的方法优选包括：pTG19-T(25ng/μl)1μl；新鲜PCR产物4μl；10xT4Buffer1μl；T4DNA Ligase2.5units；ddH₂O加至10μl。上述试剂混匀并离心，在16℃连接1小时，将连接反应物10μl转化100μl感受态细胞，冰浴20分钟，42℃热激45秒钟后，再在冰浴中放置2分钟，加入500μL SOC或LB培养基，在37℃震荡培养60分钟，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选单个白色菌落，用酶切法或PCR法进行鉴定插入片段，最后将PCR产物送测序确认克隆的目的基因片段。

在本发明中，所述阳性对照包括含新生隐球菌阳性对照DNA片段的质粒、含格特隐球菌阳性对照DNA片段的质粒和含罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的质粒，所述新生隐球菌阳性对照DNA片段、格特隐球菌阳性对照DNA片段和罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～7所示。本发明中，所述三种隐球菌的阳性对照DNA片段是针对所述三种隐球菌靶序列分别进行设计的，所述三种隐球菌阳性对照DNA片段的长度分别长于三种隐球菌靶序列，即所述三种隐球菌的阳性对照DNA能够完全覆盖整个荧光PCR扩增的靶序列。

在本发明中，所述阳性对照优选为含所述阳性对照DNA片段的质粒，所述质粒的浓度优选为20ng/mL，所述浓度为三种阳性对照DNA片段质粒的总浓度，在本发明中，每种质粒的浓度优选为20/3ng/mL。在本发明中，所述质粒优选为pTG19-T。

在本发明中，所述新生隐球菌阳性对照DNA片段的核苷酸序列(AXc 1015bp)如SEQID NO.5所示：

TGTCACCCTCTTTGATACCCTATTCCAAGGGACTTAGACACGGTCCAGCACGGAAAACGTTTCTGTAGATTACAACTCGGACGCCCGGAGGACGCCAGATTTCAAATTTGAGCTCTTCCCGGTTCACTCGCCGTTACTAAGGGAATCCTTGTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCCTACCTGATTTGAGGTCAAACAAAAAGAGATGGTTGTTATCAGCAAGCCGAAGACTACCCCATAGGCCCAGCGAAACTTATTACGCCGGGCTGACAGGTAATCACCTTCCCACTAACACATTTAAGGCGAGCCGACGTCCTTTGCAGGTCGCGGCAAACACCCAAATCCAAGTCCAACAGGTAATAAAACCCGAGGGATTGAGATTTTCATGACTCTCAAACAGGCATGCCCTTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGTTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGTGGAAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTATTATTGTTATAATAAGATTACATTCATTACATTTAGAAGTTTGTGTAAAACGTGCCGAAGCACATAAACAGTTCACAGGTGTAGATGGGTAGATAAATGGACCGAAGTCCAATATTCTCTACTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCAAGTTTGATCAACTTCTCGGCCAAGGGGTGCCGTTGCCGGCTCCCCAACGCCAATCCGGAGATCTCACTAAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGGTGACTCACGCTTACTAGGTATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACTGAGTTTCACAAGATTACCCAGGCCTCTCGGCCAAGGCGGTAAGACTCGCTGGCTCAG。

在本发明中，所述格特隐球菌阳性对照DNA片段的核苷酸序列(AGc 447bp)如SEQID NO.6所示：

AGATTCGGTCCATTTATCTACCCATCTACACCTGTGAACTGTTTATGTGCTTCGGCACGTTTTACACAAACTTCTAAATGTAATGAATGTAATCTTATTATAACAATAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTTCCACATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTTGAGAGTCATGAAAATCTCAATCCCTCGGGTTTTATTACCTGTTGGACTTGGATTTGGGTGTTTGCCGCGACCTGCAAAGGACGTCGGCTCGCCTTAAATGTGTTAGTGGGAAGGTGATTACCTGTCAGCCCGGCGTAATAAGTTTCGCTGGGCCTATGGGGTAGTCTTCGGCTTGCTGATAACAAAATC。

在本发明中，所述罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的核苷酸序列(ALc 993bp)如SEQ ID NO.7所示：

CTCTGTGAACCGTTGACCTCCGGGTCTATACAAACATTAGTGTAATGAACGTCTTTGTATTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCTTTTGGTATTCCGAAAGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTCAACCCCTCCAGGTTTCTGATCTGGGGGTGGCTTGGACTTGGACGTGTGCCAGCTAATGGCTCGTCTCAAAAGGATTAGTGGAATCTCGACATCCACGGCAGACGTAATAAGTTTCGTCTCGCCTCTTGTCGTAGGTCTGCTCACAACCTGCCATCGCGCACCTTTATGACTCTGACCTCAATCAGGTAGGCCTACCCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAACCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACGGCGAGTGAACCGGGATGAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCCTCAGGGCGTCCGAGTTGTAATCTATAGAGGCGTTTTCCGTGCCGGACCGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTATCAAAGAGGGTGACAATCCCGTACTTGACACGACGACCGGTGCTCTGTGATACGTCTTCTACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAATGGGTGGTGAGTTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAACGATTGAAGTCAGTCGTGACTGTTGGGCTCAGCAGGTTCTGCCTGTGTATTCCCTTCAGTCGGGTCAACATCAGTTTTGACCGGTGGATAAGGGCAGCAGGAATGTGGCACCCTCGGGTGTGTTATAGCCTGTCGTCGCATACATCGGTCGAGACTGAGGA。

在本发明中，以新生隐球菌为例，所述新生隐球菌阳性对照DNA片段的克隆质粒的构建方法如下：提取新生隐球菌的基因组DNA；以所述新生隐球菌基因组DNA为模板，采用引物AX-F/AX-R进行PCR扩增，扩增得到新生隐球菌阳性对照DNA片段；回收并纯化PCR产物，将其连入质粒载体(pTG19-T)中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证。重组转化子培养后提取质粒，得到克隆质粒AXc-T。在本发明中，所述引物AX-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示：5'-TGTCACCCTCTTTGATACCC-3'；所述引物AX-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示：5'-ACTGAGCCAGCGAGTCTTAC-3'。

本发明参照新生隐球菌阳性对照DNA片段的克隆质粒的构建方法，分别构建含格特隐球菌阳性对照DNA片段、罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的克隆质粒，依次分别命名为：AGc-T和ALc-T。

本发明在格特隐球菌阳性对照DNA片段的克隆质粒AGc-T的构建过程中，优选采用AG-F/AG-R引物进行格特隐球菌阳性对照DNA片段的扩增。所述引物AG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示：5'-CGGTCCATTTATCTACCCAT-3'；所述引物AG-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示：5'-TTGTTATCAGCAAGCCGAAG-3'。

本发明在罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的克隆质粒ALc-T的构建过程中，优选采用AL-F/AL-R引物进行罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的扩增。所述引物AL-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示：5'-CTCTGTGAACCGTTGACCTCC-3'；所述引物AL-R的核苷酸序列如SEQID NO.18所示：5'-TCCTCAGTCTCGACCGATGT-3'。

在本发明中，所述PCR反应液包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、参比荧光、MgCl₂和缓冲液。本发明所述参比荧光优选购自美国ABI公司，货号为4440038，所述参比荧光的作用为用于矫正孔与孔之间的荧光信号ROX。在本发明中，所述PCR反应液优选包括400～500μM的dNTP、0.1～0.2U/μL的Taq酶、0.1～0.2U/μL的UNG酶、0.1～0.25μM的参比荧光ROX、3～6mM的MgCl₂和缓冲液，所述缓冲液包括10～20mM的Tris-HCl、100～200mM的KCl，所述Tris-HCl的pH值为8。在本发明中，所述PCR反应液的保存温度优选为2～8℃，禁止冷冻。

在本发明中，所述引物、探针、阴性对照和阳性对照优选在-20℃条件下保存，其中，所述探针优选在避光条件下保存。

在本发明中，所述试剂盒的待检测样品包括脑脊液、尿液、痰液、胸水、腹水和分泌物等。本发明对所述待检测样品种DNA的提取方法没有特殊的限定，采用常规方法进行DNA提取即可。

在本发明中，每20μL反应体系包括：10μLPCR反应液、1μL上游引物和下游引物、0.5μL探针、4.5μL水和4μL待检测样品。

在本发明中，所述试剂盒的反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，57℃30s，40个循环。

在本发明中，当样本Ct值≤34，且扩增曲线形状正常，即有较好的对数增长曲线，检测结果为阳性；当样本Ct值＞34或者“Undetermined”或者扩增曲线形状不正常，即没有较好的对数增长曲线，检测结果为阴性。在本发明中，优选根据标准曲线和样本的Ct值计算样本中靶基因起始模板的DNA含量。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

试剂盒的组成

1、引物设计

根据新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌的核糖体RNA的基因组DNA的序列，筛选能够通用检测这三种隐球菌且与其他物种不同源的靶序列，靶序列的核苷酸序列如下：

(1)新生隐球菌靶序列(73bp)：

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCCCTTTGGT。

(2)格特隐球菌靶序列(73bp)：

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCCCTTTGGT。

(3)罗伦特隐球菌靶序列(73bp)：

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCTTTTGGT。

针对新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌的靶序列，设计用于荧光PCR检测这三种隐球菌的特异性引物，并委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

特异性引物的碱基序列为：

上游引物(Cry-F)：5'-AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCA-3'

下游引物(Cry-R)：5'-ACCAAAGGGCGCAAGTTG-3'

2、荧光探针设计

本发明中上述引物和探针的设计优选是根据上述三种隐球菌共同的同源靶序列设计得出。

荧光探针序列：

探针：FAM-5'-TTCAGTGAATCATCGAATC-3'-TAMRA。

在该荧光探针的5’端具有FAM荧光基团，FAM为羧基荧光素，其吸收波长为492nm，发射波长为518nm。该荧光探针的3’末端具有荧光淬灭基团TAMRA(四甲基罗丹明)。探针由invitrogen公司合成。

3、试剂盒的组成

(1)引物

引物由上述的上游引物和下游引物组成，浓度分别为10μM。

(2)探针

探针为上述的荧光探针，探针浓度为10μM。

(3)阴性对照

阴性对照为含无关基因的质粒，该无关基因为植物拟南芥的DNA片段，阴性对照浓度为1ng/mL。

阴性对照质粒的构建过程为：提取拟南芥的基因组DNA；以拟南芥基因组DNA为模板，用引物A和引物B进行PCR扩增，获得拟南芥DNA片段；将该拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体中，构建获得阴性对照质粒。

引物A：5'-AATCGCCAAGCCAAATTCACAC-3'

引物B：5'-CATGATTCAGCGATTTTCTTTACG-3'

拟南芥DNA片段序列(826bp)：

(4)阳性对照

阳性对照为分别含新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌阳性对照DNA序列的3种克隆质粒，每种隐球菌浓度为20/3ng/mL。

阳性对照的制备过程为：

1)三种克隆质粒的构建

提取新生隐球菌的基因组DNA；以该基因组DNA为模板，采用引物AX-F/AX-R进行PCR扩增，扩增得到新生隐球菌阳性对照DNA片段；回收并纯化PCR产物，将其连入质粒载体(pTG19-T)中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，新生隐球菌阳性对照DNA片段(AXc)如下所示。重组转化子培养后提取质粒，得到克隆质粒AXc-T。

AX-F：5'-TGTCACCCTCTTTGATACCC-3'

AX-R：5'-ACTGAGCCAGCGAGTCTTAC-3'

AXc序列(1015bp)：

参照含新生隐球菌阳性对照DNA片段的克隆质粒的构建方法，分别构建含格特隐球菌阳性对照DNA片段、罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段，依次分别命名为AGc-T、ALc-T。

克隆质粒AGc-T构建过程中，采用的引物AG-F/AG-R以及扩增得到的格特隐球菌阳性对照DNA片段(AGc)的序列如下：

AG-F：5'-CGGTCCATTTATCTACCCAT-3'

AG-R：5'-TTGTTATCAGCAAGCCGAAG-3'

AGc序列(447bp)：

克隆质粒ALc-T构建过程中，采用的引物AL-F/AL-R以及扩增得到的罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段(ALc)的序列如下：

AL-F：5'-CTCTGTGAACCGTTGACCTCC-3'

AL-R：5'-TCCTCAGTCTCGACCGATGT-3'

ALc序列(993bp)：

2)含新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌阳性对照DNA序列的3种克隆质粒混合，调节浓度每种质粒为0.02ng/μL。

(5)PCR反应液

PCR反应液包括dNTP(含脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP，dCTP，dGTP和dUTP)、耐热的Taq DNA聚合酶(Taq酶)、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、参比荧光(用来校正孔与孔之间的荧光信号ROX)，可购自美国ABI公司，货号为4440038、MgCl₂和缓冲液。

表1、试剂盒的组成

实施例2

试剂盒的检测方法

在使用本试剂盒进行检测前，需提取待检测样本的DNA，待检测样本可以是脑脊液、肺泡灌洗液、痰液、分泌物等可能含隐球菌的样本，样本DNA可采用常规方法进行提取。

1、PCR反应管的准备(试剂准备区)

(1)确定需要进行的反应管数n(样本数+阴性对照+阳性对照)；取出灭菌纯化水(用户自备)和PCR反应液；取出试剂盒中的其他组分，放冰上或室温融化。所有试剂盒组分使用前均需要瞬时离心。每份反应体系如表2：

表2、反应体系组成

PCR反应液	引物	探针	灭菌纯化水	样本/对照品	总体积
						10μL	1μL	0.5μL	4.5μL	4μL	20μL

按反应管数n计算上述各试剂(除了样本/对照品)的用量，并加入至离心管中，充分混匀(建议用移液器缓慢反复吹打混匀，同时避免液体飞溅或产生大量气泡)，瞬时离心后，向每个PCR反应管分装16μL。

(2)将上述准备好的PCR反应管及阴性对照、阳性对照转移到样本处理区或者加样区。

2、加样(样本处理区或者加样区)

向准备好的PCR反应管中分别加入4μL待测样本的DNA或阴性对照或阳性对照样本，盖紧管盖(或贴上封板膜)后瞬时离心，转移到样本检测区。

3、PCR扩增及荧光检测(样本检测区)

将准备好的反应管放置在荧光PCR仪中，依照已编辑的样本信息按下列条件进行扩增反应及检测(表3)：

表3、扩增反应条件

4、结果分析条件设定

(1)分析扩增曲线图(AmplificationPlot)结果时，一般可设定成图类型(Plottype)为：ΔRn vs Cycle。

(2)基线(Baseline)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置基线，通常是循环数2至最先扩增曲线之前3个循环数为基线。

(3)阈值(Threshold)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置阈值线，也可手动设置，通常阈值线设在基线以上扩增曲线的指数增长期内呈线性的部位，扩增曲线与阈值线相交的点即为Ct值，代表了标准化后报告集团荧光强度(Rn，The Normalized Intensityof the Reporter)扩增前后的变量值ΔRn[ΔRn＝Rn(PCR扩增后读数)-Rn(PCR扩增前读数)]，Ct值与反应初始目的DNA片段的量对数值呈线性负相关。

5、质控标准

本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：

(1)阴性质控：阴性对照Ct值＞34，且扩增曲线形状正常；或“Undetermined”。

(2)阳性质控：阳性对照Ct值≤34，且扩增曲线形状正常。

6、实验结果的读取

根据荧光PCR仪器配套的分析软件说明书，首先将基线和阈值设定好(建议基线设定选自动，阈值设定选手动，可设在ΔRn＝0.3附近)，然后在软件内点击分析(Analyse)，系统将自动生成结果，观察每个样本扩增曲线的Ct值，并下载到Excel文件中。

利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样本隐球菌(FAM)Ct值，根据表4进行判定。

表4、阳性判断值

实施例3

试剂盒的性能评价

1、检测限

1)本试剂盒与新生隐球菌阳性参考品的剂量效应曲线

新生隐球菌阳性参考品：即不同浓度的新生隐球菌克隆质粒AXc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对新生隐球菌阳性参考品进行检测。

表5、新生隐球菌的检测限

结果见表5，试剂盒在1ng/μl-0.00001ng/μl范围内可检出。

2)本试剂盒与格特隐球菌阳性参考品的剂量效应曲线

格特隐球菌阳性参考品：即不同浓度的格特隐球菌克隆质粒AGc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对格特隐球菌阳性参考品进行检测。

表6、格特隐球菌的检测限

结果见表6，试剂盒在1ng/μl-0.00001ng/μl范围内可检出。

3)本试剂盒与罗伦特隐球菌阳性参考品的剂量效应曲线

罗伦特隐球菌阳性参考品：即不同浓度的罗伦特隐球菌克隆质粒ALc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对罗伦特隐球菌阳性参考品进行检测。

表7、罗伦特隐球菌的检测限

结果见表7，试剂盒在1ng/μl-0.00001ng/μl范围可检出。

4)本试剂盒与新生隐球菌格特隐球菌、罗伦特隐球菌三种阳性参考品混合在一起的剂量效应曲线新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌三种阳性参考品质粒按(1ng/μl)等比混合(混合阳性参考品)，然后按表8浓度进行稀释。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对混合阳性参考品进行检测。

表8、新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌三种混合的检测限

结果见表8，试剂盒在1ng/μl-0.00001ng/μl范围可检出。

2、特异性

1)阳性反应

分别提取新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌的DNA(模板浓度为1ng/ul)，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测。

表9、特异性结果

样本类型	CT值	结果
			新生隐球菌	13.55±0.26	阳性
格特隐球菌	16.96±0.07	阳性
			罗伦特隐球菌	17.48±0.25	阳性

结果见表9，本产品可以与新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌产生阳性反应。

2)交叉反应

方法：分别提取白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、金黄色葡萄球菌(黄金亚种)和肺炎链球菌的DNA，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测。

结果见表10，本试剂盒与临床常见其他各类真菌病原体(白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、杂色曲霉)不产生交叉反应。另外，与呼吸道中的金黄色葡萄球菌(黄金亚种)和肺炎链球菌不存在交叉反应。

表10、交叉反应结果

样本类型	CT值	结果
			白色念珠菌	Undetermined	阴性
热带念珠菌	Undetermined	阴性
			光滑念珠菌	Undetermined	阴性
近平滑念珠菌	Undetermined	阴性
			黄曲霉	Undetermined	阴性
烟曲霉	Undetermined	阴性
			黑曲霉	Undetermined	阴性
杂色曲霉	Undetermined	阴性
			金黄色葡萄球菌(黄金亚种)	Undetermined	阴性
肺炎链球菌	Undetermined	阴性
			阴性对照	39.25	阴性
阳性对照	20.08	阳性

3、精密度

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，用高浓度(样本浓度为20ng/mL)、低浓度(样本浓度为0.4ng/mL)的混合阳性参考品连续重复10次检测。

高浓度样本的检测结果参见表11，低浓度样本的检测结果参见表12，计算得到高浓度样本的批内CV值为2.5％，低浓度样本的批内CV值为1.9％。

表11、高浓度样本的检测结果

样本编号	CT值	结果
			J2-1	16.49	阳性
J2-2	16.78	阳性
			J2-3	17.22	阳性
J2-4	17.48	阳性
			J2-5	17.52	阳性
J2-6	17.34	阳性
			J2-7	17.28	阳性
J2-8	17.19	阳性
			J2-9	16.58	阳性
J2-10	16.41	阳性

表12、低浓度样本的检测结果

样本编号	CT值	结果
			J1-1	23.48	阳性
J1-2	23.94	阳性
			J1-3	24.34	阳性
J1-4	24.79	阳性
			J1-5	24.95	阳性
J1-6	24.67	阳性
			J1-7	24.48	阳性
J1-8	24.13	阳性
			J1-9	24.04	阳性
J1-10	23.82	阳性

4、稳定性

对试剂盒进行热稳定试验，将试剂盒置于37℃温箱中放置，每天取出可进行试剂盒性能指标全检量的试剂盒进行性能检测，连续检测六天。性能指标包括最低检测限、阳性参考品符合率、特异性和精密度。

(1)最低检测限

设定试剂盒的最低检测限为0.01ng/mL，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对浓度为0.01ng/mL的混合阳性参考品进行检测，重复20次，计算阳性检出比(阳性检出样本数/20)。

(2)阳性参考品符合率

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对10份阳性参考品进行检测，计算阳性参考品符合率(阳性样本数/10)。

阳性参考品包括：100ng/mL新生隐球菌阳性参考品、20ng/mL新生隐球菌阳性参考品、10ng/mL新生隐球菌阳性参考品、2ng/mL新生隐球菌阳性参考品、100ng/mL格特隐球菌阳性参考品、20ng/mL格特隐球菌阳性参考品、10ng/mL格特隐球菌阳性参考品、100ng/mL罗伦特隐球菌阳性参考品、20ng/mL罗伦特隐球菌阳性参考品、10ng/mL罗伦特隐球菌阳性参考品。

(3)特异性

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对样本进行检测。样本包括：不含被测物的特异性样本、与被测物种属相近的特异性样本。

不含被测物的特异性样本包括：含人类DSCR3基因片段1的质粒、含人类ITM2B基因片段的质粒、含人类KLHDC8A基因片段的质粒、含人类LINC00441基因片段的质粒、含人类LPAR6基因片段1的质粒、含人类LPAR6基因片段2的质粒、含人类RB1基因片段1的质粒、含人类RB1基因片段2的质粒、含人类RCBTB2基因片段的质粒、含人类TTC3基因片段1的质粒。

与被测物种属相近、感染部位相同或感染症状相似的特异性样本包括：含黑曲霉基因片段质粒、含黄曲霉基因片段质粒、含烟曲霉基因片段质粒、含杂色曲霉基因片段质粒、含白色念珠菌基因片段质粒、含热带念珠菌基因片段质粒、含光滑念珠菌基因片段质粒、含近平滑念珠菌基因片段质粒、肺炎链球菌DNA、金黄色葡萄球菌(黄金亚种)DNA。

(4)精密度

以上4种性能指标的检测结果汇总参见表13。

表13 4种性能指标的检测结果

实施例4

试剂盒可以定量检测三种隐球菌

用已知浓度的标准品(将本试剂盒可检测的三种隐球菌每种浓度为1ng/μl等量均匀混合)，进行10倍连续梯度稀释制备成5至6个浓度点的标准曲线，每个浓度3个复管，以建立Ct值与浓度之间的线性关系。外加一个用阳性标准品制成的阳性对照(也可以不加，因为标准曲线所用的就是阳性标准品)，另外加一个阴性对照，用无关基因拟南芥的基因片段做为阴性对照。另外，可以加一个内参，此处用人的GAPDH管家基因，以监控样本核酸提取过程以及荧光PCR反应体系的状态。另外反应体系中加入ROX荧光素，以校准基础荧光值，消除孔与孔之间的差异。标准曲线在PCR反应的线性扩增区域形成线性方程Y＝aX+b，其中a是直线的斜率，b是直线在Y轴上的截距。可以根据起始模板含量的对数值与Ct值绘制标准曲线，本发明中荧光PCR反应中的R²为0.995,本试剂盒扩增效率是92.09％(见图1和图2)，其线性范围是：1ng/μl～0.00001ng/μl，各个浓度点的平均Ct值见表8。在测量样本时，上述标准曲线、阴、阳性对照、内参以及一定浓度的样本DNA同时进行荧光PCR反应，使用ABI7500、7300、罗氏480等荧光PCR仪，定量的原理是根据标准曲线和样本的Ct值计算样本中靶基因起始模板的DNA含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州缔蓝生物技术有限公司

<120> 一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgcgataa gtaatgtgaa ttgca 25

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accaaagggc gcaagttg 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcagtgaat catcgaatc 19

<210> 4

<211> 826

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatcgccaag ccaaattcac acttcagtat gacttgtgtc tttccaggaa ggaatttctc 60

aacctcactt ttttccttct cagtagaaac ggccttatga cctgaaagtg acattaacat 120

caagtatcat gcataacgca ttttctataa aagaaaaagg gtctaaacca aaaaaaggtg 180

cataataaac ccacatgatg cagacggtta ataatcaaca gctcctcttc atctgtaaga 240

ctggcactac cacattctgc gaatggagta ttaaaccatt cttcgaaatt atgaattgag 300

ttaaagatgt gaggaagaag aaaattaagc agcgaccata gttcttgcag actgttctgt 360

atgggagttc cagttaatag aagtctgcgc ttaatccggt agctgcatcc aggacaaatt 420

agtgtaagca aaatgtcttt aaatttcctt tgtgacagta tctttaagag ataaatcaga 480

gtaacaacta attaacacca ttcacttcag acttcatcaa gctaatgcgt aaaaaggcat 540

gtctaaacat ctttaagaaa ctagatacag tctactcaaa gaccagagta acatacagaa 600

acatacccag ttcctagagt ctttgcgaga gcacattcat ggttcttcag acgatgtcct 660

tcatcaacaa tcatgtagtt ccagtcaatt ttcttcaaaa atgctttatc tctcatgata 720

agatcgtagt gggttatcaa cacattaaat tttcctcctg ctattcttgc tcttatttca 780

gttcttttct cctttgatcc atcgtaaaga aaatcgctga atcatg 826

<210> 5

<211> 1015

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtcaccctc tttgataccc tattccaagg gacttagaca cggtccagca cggaaaacgt 60

ttctgtagat tacaactcgg acgcccggag gacgccagat ttcaaatttg agctcttccc 120

ggttcactcg ccgttactaa gggaatcctt gttagtttct tttcctccgc ttattgatat 180

gcttaagttc agcgggtagc cctacctgat ttgaggtcaa acaaaaagag atggttgtta 240

tcagcaagcc gaagactacc ccataggccc agcgaaactt attacgccgg gctgacaggt 300

aatcaccttc ccactaacac atttaaggcg agccgacgtc ctttgcaggt cgcggcaaac 360

acccaaatcc aagtccaaca ggtaataaaa cccgagggat tgagattttc atgactctca 420

aacaggcatg cccttcggaa taccaaaggg cgcaagttgc gttcaaagat tcgatgattc 480

actgaattct gcaattcaca ttacttatcg catttcgctg cgttcttcat cgatgtggaa 540

gccaagagat ccgttgttga aagttttatt attgttataa taagattaca ttcattacat 600

ttagaagttt gtgtaaaacg tgccgaagca cataaacagt tcacaggtgt agatgggtag 660

ataaatggac cgaagtccaa tattctctac tgatccttcc gcaggttcac ctacggaaac 720

cttgttacga cttttacttc ctctaaatga ccaagtttga tcaacttctc ggccaagggg 780

tgccgttgcc ggctccccaa cgccaatccg gagatctcac taagccattc aatcggtagt 840

agcgacgggc ggtgtgtaca aagggcaggg acgtaatcaa cgcgagctgg tgactcacgc 900

ttactaggta ttcctcgttg aagagcaata attgcaatgc tctatcccca gcacgactga 960

gtttcacaag attacccagg cctctcggcc aaggcggtaa gactcgctgg ctcag 1015

<210> 6

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agattcggtc catttatcta cccatctaca cctgtgaact gtttatgtgc ttcggcacgt 60

tttacacaaa cttctaaatg taatgaatgt aatcttatta taacaataat aaaactttca 120

acaacggatc tcttggcttc cacatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt 180

gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca acttgcgccc tttggtattc 240

cgaagggcat gcctgtttga gagtcatgaa aatctcaatc cctcgggttt tattacctgt 300

tggacttgga tttgggtgtt tgccgcgacc tgcaaaggac gtcggctcgc cttaaatgtg 360

ttagtgggaa ggtgattacc tgtcagcccg gcgtaataag tttcgctggg cctatggggt 420

agtcttcggc ttgctgataa caaaatc 447

<210> 7

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctctgtgaac cgttgacctc cgggtctata caaacattag tgtaatgaac gtctttgtat 60

tttaacaaaa caaaactttc aacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca 120

gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 180

accttgcgcc ttttggtatt ccgaaaggca tgcctgtttg agtgtcatga aatctcaacc 240

cctccaggtt tctgatctgg gggtggcttg gacttggacg tgtgccagct aatggctcgt 300

ctcaaaagga ttagtggaat ctcgacatcc acggcagacg taataagttt cgtctcgcct 360

cttgtcgtag gtctgctcac aacctgccat cgcgcacctt tatgactctg acctcaatca 420

ggtaggccta ccccgctgaa cttaagcata tcaataaccg gaggaaaaga aactaacaag 480

gattccccta gtaacggcga gtgaaccggg atgagctcaa atttgaaatc tggcgtcctc 540

agggcgtccg agttgtaatc tatagaggcg ttttccgtgc cggaccgtgt ccaagtccct 600

tggaacaggg tatcaaagag ggtgacaatc ccgtacttga cacgacgacc ggtgctctgt 660

gatacgtctt ctacgagtcg agttgtttgg gaatgcagct caaaatgggt ggtgagttcc 720

atctaaagct aaatattggc gagagaccga tagcgaacaa gtaccgtgag ggaaagatga 780

aaagcacttt ggaaagagag ttaaacagta cgtgaaattg ttgaaaggga aacgattgaa 840

gtcagtcgtg actgttgggc tcagcaggtt ctgcctgtgt attcccttca gtcgggtcaa 900

catcagtttt gaccggtgga taagggcagc aggaatgtgg caccctcggg tgtgttatag 960

cctgtcgtcg catacatcgg tcgagactga gga 993

<210> 8

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcaact 60

tgcgcccttt ggt 73

<210> 9

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcaact 60

tgcgcccttt ggt 73

<210> 10

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacct 60

tgcgcctttt ggt 73

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatcgccaag ccaaattcac ac 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catgattcag cgattttctt tacg 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtcaccctc tttgataccc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actgagccag cgagtcttac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggtccattt atctacccat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttgttatcag caagccgaag 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctctgtgaac cgttgacctc c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcctcagtct cgaccgatgt 20

Claims

1.一种基于荧光PCR法同时检测三种隐球菌的引物探针组合，所述隐球菌包括新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、SYBRGreen I、JOE、VIC、NED、CY-3、TEXAS Red或CY-5。

3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光猝灭基团包括TAMRA或BHQ1。

4.一种同时检测三种隐球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1～3任意一项所述引物探针组合、阴性对照、阳性对照和PCR反应液。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、参比荧光、MgCl₂和缓冲液。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的使用浓度独立地为8～12μM。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为含无关基因的质粒，所述无关基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括含新生隐球菌阳性对照DNA片段的质粒、含格特隐球菌阳性对照DNA片段的质粒和含罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的质粒，所述新生隐球菌阳性对照DNA片段、格特隐球菌阳性对照DNA片段和罗伦特隐球菌阳性对照DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～7所示。

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，每20μL反应体系包括：10μLPCR反应液、1μL上游引物和下游引物、0.5μL探针、4.5μL水和4μL待检测样品。

10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，57℃30s，40个循环。