CN107058563A - 一种用于检测外周血egfr基因t790m突变的试剂盒及其方法 - Google Patents

一种用于检测外周血egfr基因t790m突变的试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物，其包括SEQ NO ID：1～SEQ NO ID：6所示序列，本发明还涉及一种含有上述组合物的检测系统及其试剂盒，该检测体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其还包括冻干骨架，冻干保护剂，dNTPs和酶混合液，最后本发明还涉及一种上述试剂盒的检测方法，其包括该反应体系的冻干程序、扩增程序以及结果分析。本发明通过从患者外周血中富集所有的游离DNA，设计灵敏度高且特异性好的引物和探针，采用荧光PCR反应进行突变检测，降低通过手术或穿刺对患者造成的伤害，同时本发明所采用的独特的冻干技术会显著提高荧光PCR反应检测低拷贝突变的能力，可替代数字PCR向临床推广。

Description

一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域和临床检测诊断领域，尤其涉及一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法。
背景技术
肺癌是当今最常见的恶性肿瘤之一，也是高致死率的癌症之一，其中80～85％的患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)。根据《2012中国肿瘤登记年报》报道，我国癌症发病率和死亡率分别为286/10万人和181/10人万，相当于每分钟就有5～6个人确诊癌症，平均每5位癌症患者3个人死亡。在我国所有的肿瘤类别中，肺癌发病率和死亡率高居第一，高达54/10万人和45/10万人，换句话说，每分钟确诊的6位癌症患者中，就有1位是肺癌，并且死亡率极高。
以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶点，实施小分子基因靶点向药物(如易瑞沙)治疗，在非小细胞肺癌的治疗中日渐突出。大量研究表明，EGFR突变与TKI疗效具有相关性，因此并非所有肺癌患者都可以从TKI(酪氨酸激酶抑制剂)治疗中获益。携带EGFR基因突变的NSCLC患者在接受易瑞沙和特罗凯治疗时疗效显著，但是研究发现EGFR外显子20上的T790M突变位点为耐药位点，会抑制易瑞沙和特罗凯等药物的疗效。同时随着TKI药物在临床的广泛推广和应用，约30～40％患者接受TKI治疗后出现耐药现象，进一步检测发现T790M基因随之发生突变。因此在服用TKI药物之后，需要对T790M突变进行定期监控，以帮助医生选择最佳的治疗方案。
目前大量的文献和研究证实，通过无创性肿瘤诊断的方法可以进行肿瘤的早期诊断，即通过检测肿瘤患者外周血中游离的DNA可以检测到全身各处原发灶的多种异常基因，因此对T790M突变监测可以通过对患者外周血中游离的DNA进行检测。外周血中游离的DNA为大小不一的DNA片段，从几bp到几千bp。但是外周血中游离的DNA在血液中的含量很低，故而T790M突变的DNA含量就更少了，一般从1ml外周血中提取出来的DNA含量低于1ng，约为10～500拷贝左右。目前市场中液体试剂盒的灵敏度和精密度很难达到检测要求，同时在检测的过程中加入5～10μL的DNA模板量，实验结果波动液比较大，因此很多实验室采用数字PCR(ddPCR)进行检测。数字PCR精确度很高，但是其对设备要求高，操作过程困难及通量限制使得其在临床推广上受到了极大的制约。不仅如此，市场上现有的的试剂产品都为液态试剂，在运输和保存过程中对于温度具有严格的要求，具有明显的略势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种检测外周血中游离DNA的EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法，提高检测的准确度。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物，其包括检测T790M的引物对和探针，其中，检测T790M的引物对由SEQ ID NO：1所示序列的上游引物和SEQ ID NO：2所示序列的下游引物组成，检测T790M的探针为SEQ ID NO：3所示序列。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物还包括内参引物对和内参探针，其中，所述内参引物对由SEQ ID NO：4所示序列的上游引物和SEQ ID NO：5所示序列的下游引物组成，所述内参探针为SEQ ID NO：6所示序列。
优选地，所有探针的5’-端标记荧光基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、JOE、CY3、TAMRA；所有探针的的3’-端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA；其中检测T790M的探针和内参探针的荧光基团不同；更优选地，检测T790M的探针5’-端标记FAM，内参探针5’-端标记HEX。
各引物及探针的核苷酸序列如表1所示。
表1引物及探针核苷酸序列表
本发明还提供一种含有上述组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的检测体系。
优选地，该检测体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其还包括冻干骨架，冻干保护剂，dNTPs和酶混合液。
优选地，所述冻干骨架包括0.1％～0.5％甲基纤维素(MC)和/或0.5％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；所述冻干保护剂包括1％～5％的海藻糖；所述dNTPs包括0.1～0.3mM的dATP、dCTP、dGTP和dUTP；所述酶混合液包括1～3U HOT start Taq DNA聚合酶、1～2U UNG酶。
本发明还提供一种含有上述组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒。
优选地，该试剂盒还包括阳性参考品和阴性参考品。
最后，本发明提供一种用于非诊断和非治疗目的的采用上述试剂盒来检测外周血EGFR基因T790M突变的方法，其包括荧光PCR反应体系的冻干程序，其包括如下步骤：
1)将预先配置的荧光PCR反应体系按50μL分装到八联排管中；
2)-60℃预冻4h；
3)-45℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为20h；
4)25℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为2h；
经过上述处理获得冻干粉型荧光PCR反应体系。
优选地，所述每一冻干粉型荧光PCR反应体系的重量约为2～3mg。
优选地，上述检测外周血EGFR基因T790M突变的方法还包括荧光PCR反应体系的扩增程序，其包括如下步骤：
a)分别向冻干的八联排管中的荧光PCR反应体系中加入50μL样本、阳性参考品、阴性参考品和洗脱液；
b)按照下述条件进行荧光PCR扩增反应：
优选地，上述检测外周血EGFR基因T790M突变的方法还包括荧光PCR反应体系的扩增程序检测结果的分析，在此反应体系中，检测T790M的探针在5’-端标记FAM基团，内参探针在在5’-端标记HEX基团，该检测结果的分析包括如下步骤：
I)阴性对照无“S”曲线；
II)阳性对照有“S”曲线，且Ct值小于25；
III)样本孔HEX通道观察到扩增曲线，且Ct值小于30；
同时满足上述要求后，样本孔FAM通道观察到扩增曲线，且CtHEX-CtFAM绝对值<15循环，则样本中含有T790M突变。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所采用的试剂盒和方法通过从患者外周血中富集所有的游离DNA，采用荧光PCR反应进行突变检测，降低通过手术或穿刺对患者造成的伤害，同时本发明所采用的独特的冻干技术会显著提高荧光PCR反应检测低拷贝突变的能力。
附图说明
图1是样本中提取DNA扩增曲线的示意图，样本检测结果为阳性；
图2是阳性对照和阴性对照扩增曲线的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物，包括由SEQ IDNO：1所示序列的上游引物和SEQ ID NO：2所示序列的下游引物组成检测T790M的引物对和SEQ ID NO：3所示序列的检测T790M的探针；还包括由SEQ ID NO：4所示序列的上游引物和SEQ ID NO：5所示序列的下游引物组成的内参引物对和SEQ ID NO：6所示序列的内参探针；其中各探针的5’-端标记荧光基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、JOE、CY3、TAMRA；所有探针的的3’-端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA。引物及探针的核苷酸序列详见表1。
本发明还提供一种含有上述组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的检测体系，该检测体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其还包括冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。
本发明还提供一种含有上述检测体系的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒及其检测方法，该试剂盒还包括阳性参考品和阴性参考品。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1-从肺小细胞癌患者外周血中提取DNA
从肺小细胞癌患者外周血中提取DNA的具体操作方式如下：
样本收集和处理：
(1)选取10例肿瘤患者，每位抽取5ml静脉血分别放入EDTA抗凝管中。
(2)将收集的新鲜外周血离心，800g 10min，用移液器将上层上清移入无核酸酶污染的离心管中。
(3)再经过8000g离心5min，取上清液于无核酸酶污染的离心管中，-80℃保存，备用。
(4)需要在4h内将外周血进行离心处理，分离出的血浆可于4℃短期放置，建议尽快进行外周血DNA提取，以免影响实验结果的准确性。
实施例2-外周血游离DNA提取
采用上海默礼生物医药科技有限公司的核酸提取试剂盒提取DNA，具体操作如下：
(1)10份分离好的血浆分别取1～2ml，加入与血浆等体积的裂解液(LB)和20μL蛋白酶K(20mg/ml)，充分混匀。
(2)56℃孵育30min。
(3)加入与血浆等体积的等体积的结合液(BB)和50mg 1μm超顺磁珠和与血浆等体积的等体积的无水乙醇，充分混匀，65℃孵育10min，每隔2min混匀一次。
(4)将样本瞬时离心后放置于磁力架上，吸附2min，尽量吸干、弃去液体。
(5)加入500μL洗涤液1(WB1)充分混匀洗涤1次。
(6)加入500μL洗涤液2(WB2)充分混匀洗涤1-2次。
(7)将洗涤后样本放置于磁力架上，吸附2min，尽量吸干、弃去液体，放置2-5min，使残留的乙醇挥发掉，以免影响实验结果。
(8)加入50～100μL洗脱液、生理盐水或无菌水，充分混匀，室温(或56℃，可以提高得率)孵育5min，混匀后于磁力架上吸附2min，收集液体，即为提取的DNA溶液。
实施例3-制备冻干粉型荧光PCR反应体系
制备冻干粉型荧光PCR反应体系的步骤如下：
(1)在预先配置的荧光PCR反应体系按50μL分装到八联排管中；
(2)-60℃预冻4h；
(3)-45℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为20h；
(4)25℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为2h。
通过上述处理，经过上述处理获得冻干粉型荧光PCR反应体系，其中所述每一冻干粉型荧光PCR反应体系的重量约为2～3mg。
上述荧光PCR反应体系的组成如下：引物和探针浓度各300nM，由SEQ ID NO：1所示序列的上游引物和SEQ ID NO：2所示序列的下游引物组成检测T790M的引物对和SEQ IDNO：3所示序列的检测T790M的探针；由SEQ ID NO：4所示序列的上游引物和SEQ ID NO：5所示序列的下游引物组成的内参引物对和SEQ ID NO：6所示序列的内参探针；冻干骨架；冻干保护剂；dNTPs；酶混合液；其中所述冻干骨架包括0.1％～0.5％甲基纤维素(MC)和/或0.5％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；所述冻干保护剂包括1％～5％的海藻糖；所述dNTPs包括0.1～0.3mM的dATP、dCTP、dGTP和dUTP；所述酶混合液包括1～3U HOT start Taq DNA聚合酶，1～2U UNG酶。
在反应体系中，检测T790M的探针5’-端标记FAM，内参探针5’-端标记HEX，探针3’-端标记BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种。
实施例4-冻干粉型荧光PCR反应体系扩增临床样本DNA
在试剂准备间、样本处理间和扩增间完成PCR的准备工作，按照下面方法进完成加样工作：
(1)阳性参考品和阴性参考品，8000rpm离心2min后，加入500μL水溶解。
(2)按实施例3准备冻干粉型荧光PCR反应体系，按照样本数(n)、阳性参考品、阴性参考品和PCR参考品准备反应体系，即n＝3。
(3)分别向冻干的八联排管中的荧光PCR反应体系中加入50μL样本、阳性参考品、阴性参考品和洗脱液(或生理盐水或无菌水)。
(4)盖好管盖瞬时离心，上机。
(5)扩增程序：
(6)检测结果说明：
1)阴性对照无“S”曲线；(如图2所示)
2)阳性对照有“S”曲线，且Ct值小于25；(如图1所示)
3)样本孔HEX通道观察到扩增曲线，且Ct值小于30；
同时满足上述要求后，样本孔FAM通道观察到扩增曲线，且CtHEX-CtFAM绝对值<15循环，则样本中含有T790M突变。
(7)10例临床样本结果分析
10例样本的检测结果与数字PCR检测结果完全一致，因此采用冻干方法开发的T790M检测试剂盒，其检测的灵敏性较好，可以替代数字PCR向临床推广。
由上述实施例可知，本发明设计的引物和探针灵敏度高且特异性好，该技术操作简单、生物风险小、结果准确度高，具有非常广的应用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海默礼生物医药科技有限公司
<120> 一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒及其方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测T790M的上游引物TM-F
<400> 1
ccgtgcagct catcat 16
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测T790M的下游引物TM-R
<400> 2
tcccttccct gattacctt 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测T790M的探针TM-P
<400> 3
cttcggctgc ctcctggact at 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 内参上游引物Af
<400> 4
gcgttacacc ctttcttg 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 内参下游引物Ar
<400> 5
ccacattgtg aactttggg 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 内参探针AP
<400> 6
ctgctgtcac cttcaccgtt cca 23

Claims (10)

1.一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的组合物，其特征在于，包括检测T790M的引物对和探针，其中，检测T790M的引物对由SEQ ID NO：1所示序列的上游引物和SEQ IDNO：2所示序列的下游引物组成，检测T790M的探针为SEQ ID NO：3所示序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括内参引物对和内参探针，其中，所述内参引物对由SEQ ID NO：4所示序列的上游引物和SEQ ID NO：5所示序列的下游引物组成，所述内参探针为SEQ ID NO：6所示序列。
3.根据权利要求2所述的所述的组合物，其特征在于，所有探针的5’-端标记荧光基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、JOE、CY3、TAMRA；所有探针的的3’-端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA；其中检测T790M的探针和内参探针的荧光基团不同。
4.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的检测体系。
5.根据权利要求4所述的检测体系，其特征在于，该检测体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其还包括冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。
6.根据权利要求5所述的检测体系，其特征在于，所述冻干骨架包括0.1％～0.5％甲基纤维素和/或0.5％～5％聚乙烯吡咯烷酮；所述冻干保护剂包括1％～5％的海藻糖；所述dNTPs包括0.1～0.3mM的dATP、dCTP、dGTP和dUTP；所述酶混合液包括1～3U HOT start TaqDNA聚合酶、1～2U UNG酶。
7.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的组合物的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒。
8.一种用于非诊断和非治疗目的的采用权利要求7所述的试剂盒来检测外周血EGFR基因T790M突变的方法，其特征在于，包括如下所述的荧光PCR反应体系的冻干程度：
1)将预先配置的荧光PCR反应体系按50μL分装到八联排管中；
2)-60℃预冻4h；
3)-45℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为20h；
4)25℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为2h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括如下所述的荧光PCR反应体系的扩增程序：UNG酶反应50℃2min，1个循环；Taq酶活化95℃10min，1个循环；变性95℃15秒，退火、延伸62℃50秒，10个循环；变性95℃15秒，退火、延伸、荧光采集58℃45秒，35个循环；仪器冷却37℃2min，1个循环。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括荧光PCR反应体系的扩增程序检测结果的分析，在此反应体系中，检测T790M的探针在5’-端标记荧光基团FAM，内参探针在5’-端标记荧光基团HEX，该检测结果的分析包括如下步骤：
I)阴性对照无“S”曲线；
II)阳性对照有“S”曲线，且Ct值小于25；
III)样本孔HEX通道观察到扩增曲线，且Ct值小于30；
同时满足上述要求后，样本孔FAM通道观察到扩增曲线，且CtHEX-CtFAM绝对值<15循环，则样本中含有T790M突变。
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