CN108251530A

CN108251530A - 一种用于检测粪便中人源性kras基因突变的试剂盒以及方法

Info

Publication number: CN108251530A
Application number: CN201810110097.XA
Authority: CN
Inventors: 张良禄; 董兰兰; 姚希辉; 魏照云
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2018-07-06

Abstract

本发明涉及生物技术和医学领域，特别是涉及一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法。本发明涉及具体检测样本类型为粪便样本，具体涉及一种检测KRAS基因12、13密码子突变的检测方法。本试剂盒涉及粪便中人源性基因组分离纯化试剂，KRAS基因突变检测试剂。粪便人源性基因组分离纯化试剂，分离纯化获得人源性基因组；后续采用KRAS基因突变检测试剂，检测基因突变。通过粪便人源性基因组分离纯化试剂去除粪便中微生物基因组，纯化富集获得人源性基因组，减小非人源性基因组对检测的干扰；引物和探针可以抑制KRAS野生型的扩增及其与探针的结合，提高7种基因突变类型的检出灵敏性，能检出含0.1％KRAS基因突变DNA的样本。

Description

一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法。

背景技术

结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤。近年来，国结直肠癌发病率逐年上升，估计每年约有40万新发病例，在我国消化系统恶性肿瘤中位列第二。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，而临床诊断的结直肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率居高不下的关键因素之一。经有效治疗的早期结直肠癌患者其发病率降低60％，病死率降低80％，因此结直肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。

现有研究表明，结直肠癌的早期发生与结直肠癌相关基因突变存在很大关系。RAS基因家族与人类肿瘤密切相关的基因有三种HRAS、KRAS和NRAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90％的氨基酸序列同源，分子量均为21KDa，又称为RASp21蛋白。KRAS信号通路是EGFR和其他信号转导的下游通路，当RAS基因发生突变时，其编码的RAS蛋白水解GTP-RAS能力下降，使得信号转导通路一直处于持续激活状态，刺激细胞不断增殖分化，最终导致细胞恶变。KRAS突变基因是一种常见的致癌基因，多见于恶性肿瘤，结直肠癌患者中约有30％～40％存在KRAS基因突变，肺腺癌患者中约有15％～30％存在KRAS突变。KRAS突变主要定位在第12、13、61和63号密码子，其中有7个突变热点：Gly12Asp、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Cys、Gly12Ala、Gly12Arg和Gly13Asp共7类热点突变，占KRAS基因总突变的90％以上。

KRAS基因2号外显子的密码子12和13处的突变参与肿瘤发生，目前已经广泛使用KRAS基因突变的鉴定作为癌症诊断，例如胰腺、结肠直肠和非小细胞肺癌。但是主要通过组织或者血液检测KRAS基因突变用于用药指导或预后评估。由于血液检测到基因突变时，患者已经处于癌症中后期；组织检测为有创检测，一般作为病理辅助；目前KRAS基因检测尚未用于结直肠癌的早期诊断。

正常人体每天均有大量上皮细胞从肠道脱落通过肠道蠕动随粪便排出体外，由于结直肠癌或结直肠息肉等由于异常增生，更容易从肠壁上脱落。因此粪便样本会含有大量正常或者异常细胞，为结直肠癌粪便检测提供物质基础。由于粪便样本中存在大量微生物基因组，干扰人KRAS基因突变检测，导致不能检测或检测敏感性低下。本发明提供一种高灵敏性检测粪便中人源性KRAS突变方法，用以评估患者结直肠癌罹患风险。

发明内容

本发明针对上述缺点，提供了一种用于检测粪便样本KRAS基因突变所用的试剂盒及其方法，用于结直肠癌风险评估。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：

人源基因组分离纯化试剂分离纯化粪便样本中KRAS基因片段，具体操作如下：

向样本加入粪便细胞裂解液中充分混匀裂解，离心取上清，向上清中加入PVPP，去除掉大量杂质，如色素、蛋白质；

初步处理后得到的核酸样品中还有少量蛋白和RNA，再加入蛋白酶K和RNA酶完全除掉蛋白和RNA；

加入基因捕获试剂，震荡混匀，置于磁力架上吸附；

用DNA漂洗液反复漂洗离心，再加入DNA洗脱液将DNA从磁珠上洗脱下来，收集DNA溶液。

所述基因捕获剂标记KRAS特异性识别探针，探针序列

SEQ ID NO.1 5`生物素-TGGTCATTATTGTTATTATAAGGCCTGCTG-3’

所述KRAS检测试剂包括KRAS基因突变引物对，

每种突变位点对应一个正向引物：

34G＞A SEQ ID NO.2 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCAA-3’

34G＞T SEQ ID NO.3 5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’

34G＞C SEQ ID NO.4 5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGGTC-3’

35G＞A SEQ ID NO.5 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCCGA-3’

35G＞T SEQ ID NO.6 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGGTCT-3’

35G＞C SEQ ID NO.7 5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGATGC-3’

38G＞A SEQ ID NO.8 5’-TGTGGTAGTTGGAGCAGGGTA-3’

7种突变位点检测可共用一个下游引物，反向引物的序列为；

SEQ ID NO.9 5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’

本发明还提供一种用于检测KRAS基因突变的探针，所述的探针的序列为：SEQ IDNO.10 5’-AGTGCCTTGACGATACAGC-3’。

上述探针可选用下述任一荧光基团在其5'端标记：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED，选用下述任一淬灭基团在其3'端标记：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescentquencher,MGB NFQ)。优选地，荧光标记物选择FAM，淬灭剂选择BHQ。

本发明还提供一种KRAS基因突变的检测的肽核酸PNA，所述的肽核酸PNA序列为：SEQ ID NO.11N'-CCTACGCCACCAGCTCC-C'

本发明提出的一种用于检测粪便样本KRAS基因突变所用的试剂盒及其方法，有益效果在于：

1、有效去除粪便样本中微生物基因组，分离纯化人源性基因组，降低微生物基因组对检测体系的干扰；

2、引物和探针可以抑制KRAS野生型的扩增及其与探针的结合，提高7种突变基因的检出灵敏性，能检出含0.1％KRAS基因突变DNA的样本。

表格1

附图说明

图1是实施例1中KRAS 34G>A荧光定量PCR扩增曲线结果。

图2是实施例1中KRAS 34G>T荧光定量PCR扩增曲线结果。

图3是实施例1中KRAS 34G>C荧光定量PCR扩增曲线结果。

图4是实施例1中KRAS 35G>A荧光定量PCR扩增曲线结果。

图5是实施例1中KRAS 35G>T荧光定量PCR扩增曲线结果。

图6是实施例1中KRAS 35G>C荧光定量PCR扩增曲线结果。

图7是实施例1中KRAS 38G>A荧光定量PCR扩增曲线结果。

图8是实施例2中粪便捕获提取荧光定量PCR扩增曲线结果。

图9是实施例3中粪便样本KRAS 34G＞C测序结果

图10是实施例3中粪便样本KRAS 34G＞T测序结果

图11是实施例3中粪便样本KRAS 35G＞C测序结果

图12是实施例3中粪便样本KRAS 38G＞A测序结果

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1KRAS基因捕获试剂制备

针对KRAS基因序列，设计特异的寡核苷酸探针并由专业的公司合成。每种磁珠包被的具体步骤如下：

1.上下颠倒磁珠或者涡旋振荡，使磁珠充分混匀，吸取20μl磁珠加入到1.5mL灭菌离心管中；

2.加入1mL磁珠漂洗液，颠倒混匀，洗涤磁珠，磁场吸附2min，弃上清液；重复洗涤三次；

3.加入生物素标记的特异性核酸探针和等体积的偶联液，重悬磁珠，轻柔振荡，在室温下孵育10-15min；

4.磁场吸附2-3min，弃上清液；

5.加入500μL磁珠漂洗液洗涤磁珠2-3次，磁场吸附，每次2-3min，弃上清液；加入20μL磁珠保存液，重悬磁珠备用。

制备得到的KRAS基因捕获试剂包括有：A.包被探针的微球，每种微球包被的探针的碱基序列如下：SEQ ID NO.1。

实施例2粪便样本人KRAS基因捕获

1、向1-5g新鲜粪便样本加入粪便细胞裂解液1-10ml，充分混匀裂解，12000rpm离心转移上清至新的洁净的离心管中。

2、向上清中加入一片PVPP吸附剂，涡旋振荡，使样本充分混匀。

3、12000rpm离心2-5min，将上清转移到新的离心管中。

4、向初步处理后得到的核酸样品中，加入蛋白酶K和RNA酶完全除掉蛋白和RNA。

5、向上一步获得上清中加入向结合液CB，上下颠倒混匀。

6、向上述溶液中加入制备好的基因捕获试剂，颠倒混匀，室温下孵育1-2小时。

7、孵育后将离心管转移到磁力架吸附磁珠，弃去上清。

8、加入漂洗液WB使磁珠重悬，重复洗涤3次。

9、加入750μL漂洗液WB使磁珠重悬，磁力架上吸附2min，去上清，重复洗涤3次(最后一次尽量将液体去除完全)。

10、加入50μL洗脱液，震荡均匀，室温孵育3-5min，磁力架上吸附2min，转移上清至新的洁净的收集管中，收集的DNA溶液为捕获后的人源性DNA，可于4℃或者-20℃保存备用，用于后续基因检测。

按照上述方法捕获了8个样本，通过PCR检测8个样本总的KRAS和内参基因ACTIN的捕获情况，8个样本检测的CT值以及拷贝数见图8。

实施例3、在野生型质粒中检出KRAS基因突变型的实验

配制不同浓度梯度KRAS基因突变溶液，每一种突变类型的均配制出10⁵copies/μL的模板中含有100％突变基因、10％突变基因、1％突变基因、0.1％突变基因以及0％突变基因的KRAS溶液。以34G>A为例列出每种浓度的配制方法如下：

(1)KRAS 34G>A 100％突变溶液配制：为10⁵copies/μL的34G>A的突变质粒

(2)KRAS 34G>A 10％突变溶液配制：等体积2×10⁴copies/μL的KRAS 34G>A基因突变质粒与1.8×10⁵copies/μL的野生型质粒混合均匀，震荡混匀，瞬时离心；

(3)KRAS 34G>A 1％突变溶液配制：等体积2×10³copies/μL的KRAS 34G>A基因突变质粒与1.98×10⁵copies/μL的野生型质粒混合均匀，震荡混匀，瞬时离心；

(4)KRAS 34G>A 0.1％突变溶液配制：等体积2×10²copies/μL的KRAS 34G>A基因突变质粒与1.998×10⁵copies/μL的野生型质粒混合均匀，震荡混匀，瞬时离心；

(5)KRAS 34G>A 0％突变溶液配制：为10⁵copies/μL的KRAS野生型质粒。

2、反应体系配制

PCR缓冲液、2-5U/μL DNA聚合酶、UNG酶、2-3mmol/L dNTP、dUTP、5-10μmol/L的7种特异性引物、5-10μmol/L特异性探针和10-15μmol/L特异性肽核酸PNA。

取21μL的上述反应混合液，加入4μL的不同突变类型KRAS模板，涡旋震荡均匀后离心。

3、扩增程序

荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、62℃30s，10循环；第三阶段：94℃20s、62℃30s，30循环，收集FAM/VIC信号。以FAM/VIC达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，且呈现S型扩增曲线则基因检测为阳性，否则为阴性。

结果检测显示，该体系能够对7种基因突变类型均能有效检出，并且不扩增野生样本。本发明提供的KRAS检测试剂能检出含0.1％KRAS基因突变DNA的样本。

实施例4、粪便样本KRAS基因突变检测

在医院收集患者粪便样本与组织样本，涵盖不同发展阶段的直结肠癌病人与腺瘤性息肉的患者。所有癌症患者要求至少40岁，所有受试者没有艾滋病毒，乙肝病毒或癌症病史，并且无严重急性加重的症状慢性病。

收集60例结直肠进展期腺瘤中，经测序验证，有14例患者组织样本为KRAS基因突变阳，另外46例样本为KRAS基因突变为阴性。在16例结直肠癌中，经测序验证，有5例组织样本为KRAS基因突变为阳性。分别选取5个结直肠进展期腺瘤患者粪便样本、5个直结直肠癌患者粪便样本以及5个正常粪便样本。其中5位结直肠进展期腺瘤患者基因突变类型分别为34G＞C、34G＞C、35G＞A、35G＞A和38G＞A；5个直结直肠癌患者基因突变类型分别为34G＞C、34G＞T、35G＞A、35G＞A、38G＞A。

1、传统方法

采用粪便提取试剂盒提取粪便基因组，如天根粪便DNA提取试剂盒、QIAamp FastDNA Stool Mini Kit等粪便提取试剂盒；在此研究中采用天根粪便DNA提取试剂盒，具体参见说明书；

2、本发明提供方法

采用粪便样本人KRAS基因捕获步骤具体参见实施例2。

表三、传统方法检测粪便KRAS基因突变

利用质粒建立扩增标准曲线，通过扩增循环数计算对应的不同基因类型的条数

传统提取方法与本发明提取方法相比，提取产物中actin基因扩增循环数明显偏高，说明传统提取方法比本发明提取方法低；同时，提取产物中KRAS基因扩增循环数明显偏高，说明传统提取方法比本发明提取方法低；以上结果说明本发明提取方法捕获人基因组效率明显高于传统提取试剂盒。

表四、本发明方法检测粪便KRAS基因突变

表四利用质粒建立扩增标准曲线，通过扩增循环数计算对应的不同基因类型的条数

采用上述方法获得的基因组检测KRAS基因突变，如图表2、3所示。其中传统方法检测粪便KRAS基因突变检出率较低，为组织检出率的50％。如图表3显示，本发明提取粪便中直接检测KRAS基因突变与组织中检测KRAS基因突变结果完全一致，检出率为100％。

以上结果说明，粪便人源性基因组中直接检测KRAS基因突变与组织中检测KRAS基因突变结果完全一致。提示该方法可以用于粪便KRAS基因突变检测。

本发明所述的一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法。与传统检测方法相比，本发明采用的粪便人源性基因组分离纯化试剂分离纯化获得人源性基因组；后续采用KRAS基因突变检测试剂检测基因突变。通过粪便人源性基因组分离纯化试剂去除粪便中微生物基因组，纯化获得人源性基因组，减小非人源性基因组干扰检测；引物和探针可以抑制KRAS野生型的扩增及其与探针的结合，提高7种突变基因的检出灵敏性，能检出含0.1％Kras基因突变DNA的样本。适用于粪便样本检测人源性KRAS基因突变，用以评估直结肠癌罹患风险。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0001]

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法

<130> 1

<160> 11

<170> Patentin version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KRAS特异性识别探针

<400> 1

tggtcattattgttattataaggcctgctg 30

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 34G＞A正向引物

[0002]

<400> 2

acttgtggtagttggagcaa 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 34G＞T正向引物

<400> 3

aacttgtggtagttggagctt 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 34G＞C正向引物

<400> 4

aacttgtggtagttggaggtc 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 35G＞A正向引物

[0003]

<400> 5

acttgtggtagttggagccga 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 35G＞T正向引物

<400> 6

acttgtggtagttggaggtct 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 35G＞C正向引物

<400> 7

aacttgtggtagttggagatgc 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 38G＞A正向引物

[0004]

<400> 8

tgtggtagttggagcagggta 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 38G＞A正向引物

<400> 9

ctattgttggatcatattcgtc 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物

<400> 10

agtgccttgacgatacagc 19

<210> 11

<211> 19

<212> 肽核酸

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 检测核酸

[0005]

<400> 11

N'-cctacgccaccagctcc-C 19

Claims

1.一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法，所述试剂盒用于检测粪便中KRAS基因突变，以评估患者结直肠癌风险。

2.如权利要求1所述一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法，其特征在于，试剂盒包含粪便人源性基因组分离纯化试剂，KRAS基因突变检测试剂。

粪便人源性基因组分离纯化试剂用于去除粪便中微生物基因组，纯化获得人源性KRAS基因组。

KRAS基因突变检测试剂用于检测粪便中KRAS基因或其活性片段中12、13密码子突变。

3.如权利要求1所述一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法，其特征在于，粪便人源性基因组分离纯化试剂包括包被探针的磁珠，通过DNA特异性互补配对捕获人基因组，探针包括SEQ ID NO.1。

4.如权利要求1所述一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法，其特征在于，KRAS基因突变的试剂盒包含引物对、探针和肽核酸PNA，上游引物SEQ ID NO.2-8，下游引物SEQ ID NO.9；探针包括SEQ ID NO.10，肽核酸PNA序列如SEQ ID NO.11；

上述探针可选用下述任一荧光基团在其5'端标记：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED，选用下述任一淬灭基团在其3'端标记：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescent quencher,MGB NFQ)。优选地，荧光标记物选择FAM，淬灭剂选择BHQ。

5.如权利要求1所述一种用于检测粪便中人源性KRAS基因突变的试剂盒以及方法，其特征在于，包括PCR缓冲液、1-5U/μl DNA聚合酶、UNG酶、2-3mmol/L dNTP、dUTP、5-10μmol/L特异性引物对、5-10μmol/L特异性探针和10-15μmol/L特异性肽核酸PNA。