CN102747158A - 一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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段卫涛
喻德华
赵平锋
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Abstract

本发明公开了一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR混合反应液、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，以及阳性对照品。本发明将PNA技术与taqman-MGB探针技术相结合，并设计相关的ARMS引物，PNA能够和野生型K-ras基因12或13密码子序列稳定结合，只有突变样本能够被扩增，可以对K-ras基因突变进行检测。本发明方法快速、简便、特异性好、灵敏度高，可用于临床上K-ras基因突变的筛查。

Description

一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于临床分子诊断技术领域，具体涉及一种基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，尤其涉及一种人类K-ras基因的7种常见突变的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
K-ras 基因定位于人类的第12 号染色体上，含有4个编码外显子和1个5′端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸组成的ras蛋白，因其分子量为21D，又称为P21蛋白。K-ras基因最常见的激活方式为点突变，突变的位点几乎都集中在2号外显子12、13密码子，常见的热点突变有7种，分别为K-ras基因第12密码子的六种突变类型（GAT，GCT，GTT，GAC，TGT，AGT，CGT）和第13密码子的一种突变类型（GAC）。
P21蛋白作为EGFR信号通路的分子开关，参与细胞内的信号传递。正常情况下，P21蛋白不存在活性，能控制调控细胞生长的路径；当K-ras基因突变时，P21蛋白构象发生异常，在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，P21蛋白被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后而活化，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。进一步研究发现，多数人类肿瘤中均有K-ras 基因的突变激活，其中最常见于胰腺癌、结肠癌和肺癌。
K-ras基因在很多癌中都发生了突变，约30-50％的直肠癌，90％以上的胰腺癌，10-20%的肺癌。靶向药物的疗效往往与其靶向分子的信号通路的相关基因状态有关，如靶向药物爱必妥(Erbitux)和帕尼单(Panitumumab)与K-ras基因突变相关。K-ras基因突变与大肠癌等肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂等靶向药物的原发性耐药有关。K-ras基因野生型的患者能从爱必妥 (Erbitux，又称西妥昔单抗/Cetuximab) 或维克替比 (Vectibix，又称帕尼单抗/Panitumumab) 治疗中获益， 而K-ras基因突变的大肠癌患者治疗效果较差。欧洲药监局和美国FDA明确规定了在使用靶向药物爱必妥和维克替比治疗转移性大肠癌前必须检测K-ras 基因。因此，对于K-RAS基因突变检测有利于为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。
目前，针对K-ras突变检测的方法有为传统的sanger测序法，然而测序法存在很多缺点，包括：（1）检测周期长，从样本DNA的抽提到得出检测报告要1-2天的时间。（2）操作过程复杂，并且要进行PCR扩增后操作，容易导致污染。（3）测序结果判读复杂，需要有经验的人才能准确判读，样本量大时，尤为突出。（4）检测灵敏度不高，出现假阳性的比例很高。（5）单次检测样本量很有限。（6）存在不安全性，实验过程中存在很多的有毒物质，如EB、丙烯酰胺，对操作者有危害。（7）检测费用比较高。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
本发明只需设计一个PNA就可以抑制野生型DNA的扩增，通过一次反应即可区别野生型和突变型DNA，通过7种不同ARMS引物识别7种不同的突变类型，再通过实时定量PCR相结合，可对K-ras基因突变进行实时定量。
本发明的目的是这样实现的：
一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，以及阳性对照品。
所述肽核酸（PNA）探针的序列为SEQ ID NO：1所示，用来抑制K-ras基因野生型基因的扩增。
SEQ ID NO1：H2N -CTACGCCACCAGCTC-CON2H
所述PCR混合反应液中含PCR正向引物和反向引物，所述PCR正向引物选自如下所示序列的一种或多种：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，所述PCR反向引物的序列为SEQ ID NO：9所示。
SEQ ID NO2：5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’
SEQ ID NO3：5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’
SEQ ID NO4：5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’
SEQ ID NO5：5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’
SEQ ID NO6：5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’
SEQ ID NO7：5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’
SEQ ID NO8：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGA-3’
SEQ ID NO9：5’-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3’
其中：
SEQ ID NO2是检测K-ras基因12密码子GGT-GAT的置换突变；
SEQ ID NO3是检测K-ras基因12密码子GGT-GCT的置换突变；
SEQ ID NO4是检测K-ras基因12密码子GGT-GTT的置换突变；
SEQ ID NO5是检测K-ras基因12密码子GGT-AGT的置换突变；
SEQ ID NO6是检测K-ras基因12密码子GGT-CGT的置换突变；
SEQ ID NO7是检测K-ras基因12密码子GGT-TGT的置换突变；
SEQ ID NO8是检测K-ras基因13密码子GGC-GAC的置换突变。
所述taqman-MGB探针的序列如SEQ ID NO：10所示。
SEQ ID NO10： 5’-FAM-GAGTGCCTTGACGAT-MGB-3’
所述用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示。
SEQ ID NO11：5’-CCTGTCTCTTGGATATTCTC-3’
SEQ ID NO12：5’-AGTCCTCATGTACTGGTC-3’
SEQ ID NO13：5’-FAM-ACTCCTCTTGACCTGCTGTGT-TAMAR-3’
所述用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针的序列分别如SEQ  ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。
SEQ ID NO14：5’-GGATTAGAGCAGTGGAGT-3’
SEQ ID NO15：5’-TCGGTAGTGGTGGTGCTGGGA-3’
SEQ ID NO16：5’-FAM-ACAGAAGGCTGTGGAGTC-TAMAR-3’
所述阳性对照品是存在K-ras基因第12密码子六种突变类型（GAT，GCT，GTT，GAC，TGT，AGT，CGT）的质粒基因组DNA或/和第13密码子一种突变类型（GAC）的混合质粒基因组DNA。
一种人类K-ras基因突变分型荧光定量的PCR检测方法，包括以下步骤：在含有PCR反应液的反应体系中加入PCR引物、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，进行核酸样本的荧光定量PCR检测；其中：
所述肽核酸（PNA）探针的序列为SEQ ID NO：1所示；
SEQ ID NO1：H2N -CTACGCCACCAGCTC-CON2H
所述PCR引物包括PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物选自如下所示序列的一种或多种：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，所述PCR反向引物的序列为SEQ ID NO：9所示；
SEQ ID NO2：5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’
SEQ ID NO3：5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’
SEQ ID NO4：5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’
SEQ ID NO5： 5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’
SEQ ID NO6：5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’
SEQ ID NO7：5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’
SEQ ID NO8：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGA-3’
SEQ ID NO9：5’-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3’
所述taqman-MGB探针的序列如SEQ ID NO：10所示；
SEQ ID NO10：5’-FAM-GAGTGCCTTGACGAT-MGB-3’
所述用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示；
SEQ ID NO11：5’-CCTGTCTCTTGGATATTCTC-3’
SEQ ID NO12：5’-AGTCCTCATGTACTGGTC-3’
SEQ ID NO13：5’-FAM-ACTCCTCTTGACCTGCTGTGT-TAMAR-3’
所述用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。
SEQ ID NO14：5’-GGATTAGAGCAGTGGAGT-3’
SEQ ID NO15：5’-TCGGTAGTGGTGGTGCTGGGA-3’
SEQ ID NO16：5’-FAM-ACAGAAGGCTGTGGAGTC-TAMAR-3’
    与传统的测序法比较，本发明涉及的K-ras基因突变分型荧光定量的PCR检测试剂盒具有以下优点和显著的进步：
（1）特异性强：设计的7条ARMS引物分别针对K-ras基因第12或13密码子的7种特异突变序列，特异性的扩增7种突变的DNA。Taqman -MGB探针的高检测灵敏度、低荧光背景值，可使检测信号很明显。另外，本发明在PCR反应液中加入抑制野生型K-ras基因的肽核酸序列，通过抑制野生型基因组产物扩增而富集突变型扩增，也提高了检测的特异性。
（2）检测灵敏度高：本发明在PCR反应液中加入肽核酸抑制野生型K-ras基因的扩增而富集突变型，提高了检测的敏感性；由于Taqman -MGB探针短，且使用Taqman -MGB非荧光淬灭基团，使得背景荧光值很低，也提高了检测灵敏度。本发明检出K-ras基因突变基因组DNA的敏感度为1%，远远高于敏感度为20-30%的直接测序法。
（3）本发明对标本DNA获取质量要求低，无论是新鲜组织还是石蜡组织，都能获得理想的检测效果。
（4）检测时间短：从样本送检到出结果约3个小时完成。
（5）操作简单：从PCR反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中实时监测进行，大大降低了污染几率，并且降低了结果存在偏差的几率。
（6）结果判读明确直观：直接通过CT值来判定阴性或阳性结果，非常简单直观。
（7）安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。
附图说明
图1为K-ras基因12密码子GGT>GAT突变的部分阳性扩增曲线图。
图2 为K-ras基因12密码子GGT>GCT突变的部分阳性扩增曲线图。
图3为K-ras基因12密码子GGT >GTT突变的阳性扩增曲线图。
图4为K-ras基因12密码子GGT >CGT突变的阳性扩增曲线图。
图5为K-ras基因13密码子GGT>GAT突变的部分阳性扩增曲线图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
收集临床病理诊断为结肠癌或胰腺癌的的50例患者的蜡块组织，所有患者手术前均未接受爱必妥治疗，使用QIAGEN 石蜡DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作步骤来提取蜡块中基因组DNA供以下实验使用。
实施例1用荧光定量PCR检测K-ras基因12密码子的六种突变，（密码子 12GGT> GAT，12GGT> GCT，12GGT> GTT，12GGT> AGT，12GGT> CGT，12GGT> TGT）
    设计能特异性识别并扩增上述6种突变的特异性ARMS正向引物，6条ARMS正向引物共用一条下游引物，以及Taqman-MGB检测探针，内控引物对和检测探针，各引物、探针序列如下：
肽核酸（PNA）序列为如序列表中SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO1：H2N -CTACGCCACCAGCTC-CON2H。
针对12GGT> GAT密码子突变，设计正向ARMS引物序列为5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’，如SEQ ID NO：2所示。
针对12GGT> GCT密码子突变，设计正向ARMS引物序列为SEQ ID NO3 ：5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’，如SEQ ID NO：3所示。
针对12GGT> GTT密码子突变，设计正向ARMS引物序列5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’，如SEQ ID NO：4所示。
针对GGT> AGT密码子突变，设计引物序列为SEQ ID NO5 5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’，如SEQ ID NO：5所示。
针对GGT>CGT密码子突变，设计引物序列为SEQ ID NO6 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’，如SEQ ID NO：6所示。
针对GGT>TGT密码子突变，设计引物序列为SEQ ID NO7：5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’如SEQ ID NO：7所示。
6条ARMS正向引物序列共用一条反向引物序列SEQ ID NO9：5’-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3’，如序列表中SEQ ID NO：9所示。
突变检测探针为：SEQ ID NO10: 5’-FAM-GAGTGCCTTGACGAT-MGB-3’，如序列表中SEQ ID NO：10所示。
内控正向引物序列为：SEQ ID NO11：5’-CCTGTCTCTTGGATATTCTC-3’，如序列表中SEQ ID NO：11所示；内控反向引物序列为：SEQ ID NO12：5’-AGTCCTCATGTACTGGTC-3’，如序列表中SEQ ID NO：12所示；内控检测探针序列为：SEQ ID NO13：5’-FAM-ACTCCTCTTGACCTGCTGTGT-TAMAR-3’，如序列表中SEQ ID NO：13所示。
外控正反向引物和探针的序列分别如SEQ  ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。
  阳性对照品是存在K-ras基因12密码子六种突变的的质粒基因组DNA。
    优化反应体系进行实时荧光定量PCR检测，反应体系为25uL，PCR引物各0.5ul(终浓度20uM)，Taqman-MGB探针、内控检测探针、外控检测探针各0.6ul(终浓度20uM)、PNA1ul(终浓度20uM)、模板DNA3uL(终浓度200-500ng/ul)、PCR反应液8ul、加入ddH2O至25ul。荧光定量反应在ABI Step one plus检测仪上进行。反应条件为：95℃变性4分钟， 95℃20秒，70℃ 20秒，60℃ 20秒，扩增反应40循环。
    结果为：在50例样本中共检测出6例K-ras基因12密码子GGT>GAT突变，9例K-ras基因12密码子GGT>GCT突变，3例K-ras基因12密码子GGT>GTT突变，1例K-ras基因12密码子GGT>CGT突变。部分阳性样本见图1-4，图1表示K-ras基因12密码子GGT>GAT突变的部分阳性扩增曲线。图2表示K-ras基因12密码子GGT>GCT突变的部分阳性扩增曲线。图3表示K-ras基因12密码子GGT >GTT突变的阳性扩增曲线。图4表示K-ras基因12密码子GGT >CGT突变的阳性扩增曲线。
实施例2 ：用荧光定量PCR检测K-ras基因13密码子的一种突变（密码子 13GGC>GAC）。
设计能特异性识别并扩增上述1种突变的特异性ARMS正向引物，1条ARMS正向引物共用一条下游引物，以及Taqman-MGB检测探针，内控引物对和检测探针，各引物、探针序列如下：
PNA序列为 H2N-CTACGCCACCAGCTC-CON2H，如序列表中SEQ ID NO1：所示：SEQ ID NO1：H2N -CTACGCCACCAGCTC-CON2H。
针对GGT>GAC 13密码子突变，设计引物序列为SEQ ID NO8：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGA-3’，如SEQ ID NO：8所示. 1条ARMS正向引物序列共用一条反向引物序列SEQ ID NO9 5’-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3’，如序列表中SEQ ID NO：9所示。；
突变检测探针为：SEQ ID NO10: 5’-FAM-GAGTGCCTTGACGAT-MGB-3’如序列表中SEQ ID NO10所示。
内控正向引物序列为：SEQ ID NO11：5’-CCTGTCTCTTGGATATTCTC-3’，如序列表中SEQ ID NO11所示；内控反向引物序列为SEQ ID NO12：5’-AGTCCTCATGTACTGGTC-3’，如序列表中SEQ ID NO：12所示；内控检测探针序列为：SEQ ID NO13：5’-FAM-ACTCCTCTTGACCTGCTGTGT-TAMAR-3’如序列表中SEQ ID NO：13所示。
外控正反向引物和探针的序列分别如SEQ  ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。
阳性对照品是存在K-ras基因13密码子1种突变质粒基因组DNA。
    优化反应体系进行实时荧光定量PCR检测，反应体系为25uL，PCR引物各0.5ul(终浓度20uM)，Taqman-MGB探针、内控检测探针、外控检测探针各0.6ul(终浓度20uM)、PNA1ul(终浓度20uM)、模板DNA3uL(终浓度200-500ng/ul)、PCR反应液8ul、加入ddH2O至25ul。荧光定量反应在ABI Step one plus检测仪上进行。反应条件为：95℃变性4分钟， 95℃20秒，70℃ 20秒，60℃ 20秒，扩增反应40循环。
    结果为：在50例样本中共检测出2例K-ras基因13密码子GGT>GAT突变，图5表示K-ras基因13密码子GGT>GAT突变的部分阳性扩增曲线。
上述结果表明本发明的荧光定量PCR检测方法检测肿瘤组织K-ras基因突变不仅仅快速、高效并且结果简单直观，结果可靠、特异。

Claims (8)

1.一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括PCR混合反应液、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，以及阳性对照品。
2.根据权利要求1所述的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述肽核酸探针的序列为SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR混合反应液中含PCR正向引物和反向引物，所述PCR正向引物选自如下所示序列的一种或多种：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，所述PCR反向引物的序列为SEQ ID NO：9所示。
4.根据权利要求1所述的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述taqman-MGB探针的序列如SEQ ID NO：10所示。
5.根据权利要求1所述的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示。
6.根据权利要求1所述的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针的序列分别如SEQ  ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。
7.根据权利要求1所述的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品是存在K-ras基因第12密码子六种突变类型（GAT，GCT，GTT，GAC，TGT，AGT，CGT）的质粒基因组DNA或/和第13密码子一种突变类型（GAC）的质粒基因组DNA。
8.一种人类K-ras基因突变分型荧光定量的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：在含有PCR反应液的反应体系中加入PCR引物、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，进行核酸样本的荧光定量PCR检测；
所述肽核酸探针的序列为SEQ ID NO：1所示；
所述PCR引物包括PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物选自如下所示序列的一种或多种：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，所述PCR反向引物的序列为SEQ ID NO：9所示；
所述taqman-MGB探针的序列如SEQ ID NO：10所示；
所述用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示；
所述用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针的序列分别如SEQ  ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。
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