CN101899496A - 一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、肽核酸探针、突变型K-Ras-AllgloTM荧光探针和阳性对照样品。本发明还提供了一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法：先针对K-Ras基因设计一对PCR引物和肽核酸探针，针对K-Ras基因突变位点分别设计AllgloTM荧光探针，反应体系中加入PCR反应液、PCR引物、肽核酸探针和AllgloTM荧光探针进行荧光定量PCR的检测。本发明采用了PNA技术，结合AllgloTM荧光探针技术，能快速、准确、高敏感度的检测各种癌组织中K-Ras基因突变位点，时间短、操作简单、判读明确、直观、安全。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法，特别涉及一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
Ras癌基因参与人类肿瘤的发生发展，最初是在急性转化性逆转录病毒实验中从Harvey、Kirsten两株大鼠肉瘤病毒中克隆出来的转化基因，自1982年Weinberg等人发现人的膀胱癌细胞中有活化的H-ras基因后，引起了人们对ras癌基因在人类肿瘤发生发展过程中所起的作用的极大关注。ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。其中，K-Ras则对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。研究人员发现K-Ras蛋白并不是永远位于细胞膜上，它的位置受到蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的控制。他们发现PKC使磷酸分子与K-Ras结合即磷酸化，这种磷酸化过程导致K-Ras与细胞膜的结合减弱而改变位置，并移至内质网、高尔基体和粒线体等位置。
K-Ras基因突变不但导致非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC，30％由K-Ras基因突变引起)，还诱发结肠癌和胰腺癌。KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。大肠癌患者KRAS突变率为30％-35％，而没有发生突变的正常kras基因占大多数，约60％。所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态，只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂治疗。
一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态，二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗(包括单药或与化疗联合)治疗。那么，KRAS对临床实践的影响究竟有多大？美国乔治敦大学马歇尔一言以蔽之：在结直肠癌的治疗中，结直肠癌从此“一分为二”：KRAS基因是野生型还是突变型，使传统意义上的一种疾病被分成两种独立的疾病。KRAS突变型结直肠癌患者约占40％，这类患者不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而其余60％左右的KRAS野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。
靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要作用靶点。FDA已经批准的作用于EGFR的靶向药物包括抗EGFR单克隆抗体药爱必妥(Erbitux/西妥西单抗/Cetuximab，默克)、帕尼单抗(Panitumumab/Vectibix，Amgen和尼妥珠单抗(Nimotuzumab)，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药)。但是，临床试验表明这些靶向药物仅对部分病人有显著疗效。进一步的研究发现肿瘤组织中KRAS基因发生突变(体细胞突变)的病人对此类靶向药物完全耐药。因此，检测病人KRAS基因是否突变成为决定能否使用EGFR靶向药物的必要前提条件。
目前，检测K-Ras基因突变的方法是传统的直接测序法。直接测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但是它却存在以下缺点：
1、检测周期长(从标本送检到得出结果最短要24-48个小时左右)。
2、操作过程复杂，且要涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想。
3、测序结果的判读较复杂、费时(当样本量大时，此点尤为突出)。
4、检测的敏感性不够高：Katsuhiko等人曾在2005年8月份出版的《Lung Cancer》(《肺癌》)上报道，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，则用直接测序法检测不到突变样本的存在。
5、一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。
6、不安全：整个实验过程要用到多种有毒物质，如EB、丙烯酰胺等，对操作者和环境都有危害。
7.费用较高(每个位点约需200元)。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、肽核酸(PNA)探针、突变型KRas-AllgloTM荧光探针和阳性对照样品。
所述肽核酸探针的序列如SEQ ID NO A0所示：
SEQ ID NO A0：PNA probe-5’-CCTACGCCACCAGCTCC-3’。
所述PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序列如SEQ ID NO A1所示，所述PCR反向引物的序列如SEQ ID NO A2所示：
SEQ ID NO A1：5’-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3’；
SEQ ID NO A2：5’-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3’。
所述突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQ ID NOA4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5、SEQ IDNO B6所示的序列中的一种或多种：
SEQ ID NO A3(GAT-12密码子)：5’-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3’；
SEQ ID NO A4(GTT-12密码子)：5’-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3’；
SEQ ID NO A5(GCT-12密码子)：5’-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3’；
SEQ ID NO B3(GAC-13密码子)：5’-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3’；
SEQ ID NO B4(TGT-12密码子)：5’-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3’；
SEQ ID NO B5(AGT-12密码子)：5’-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3’；
SEQ ID NO B6(CGT-12密码子)：5’-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3’；
当所述突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQ ID NOA4、SEQ ID NO A5所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号密码子三种突变类型(GAT，GTT和GCT)的混合质粒基因组DNA。该突变型KRas-AllgloTM荧光探针检测的是K-Ras基因第12密码子三种碱基置换突变(GGT→GAT，GGT→GTT，GGT→GCT)。
当所述突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO B3、SEQ ID NOB4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K-Ras基因第13号密码子一种突变类型(GAC)和第12密码子三种突变型(TGT、AGT和CGT)的混合质粒基因组DNA。该突变型KRas-AllgloTM荧光探针检测的是K-Ras基因第13密码子一种碱基置换突变(密码子13GGC→GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子12GGT→TGT，GGT→TGT和GGT→CGT)。
本发明的第二个目的是提供一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法。该方法具体是先针对K-Ras基因设计一对PCR引物和肽核酸探针，针对K-Ras基因突变位点分别设计AllgloTM荧光探针，反应体系中加入PCR反应液、PCR引物、肽核酸探针和AllgloTM荧光探针进行荧光定量PCR的检测。
所述的肽核酸探针的序列如SEQ ID NO A0所示：
SEQ ID NO A0：PNA probe-5’-CCTACGCCACCAGCTCC-3’。
所述的PCR引物如SEQ ID NO A1和SEQ ID NO A2所示：
SEQ ID NO A1：5’-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3’；
SEQ ID NO A2：5’-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3’。
所述的AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQ ID NO A4、SEQ ID NOA5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6所示的序列中的一种或多种。
SEQ ID NO A3(GAT-12密码子)：5’-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3’；
SEQ ID NO A4(GTT-12密码子)：5’-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3’；
SEQ ID NO A5(GCT-12密码子)：5’-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3’；
SEQ ID NO B3(GAC-13密码子)：5’-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3’；
SEQ ID NO B4(TGT-12密码子)：5’-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3’；
SEQ ID NO B5(AGT-12密码子)：5’-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3’；
SEQ ID NO B6(CGT-12密码子)：5’-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3’；
其中，SEQ ID NO A3、SEQ ID NO A4、SEQ ID NO A5是检测K-Ras基因第12密码子三种碱基置换突变(GGT→GAT，GGT→GTT，GGT→GCT)；SEQ IDNO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6是检测K-Ras基因第13密码子一种碱基置换突变(密码子13GGC→GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子12GGT→TGT，GGT→AGT和GGT→CGT)。
AllgloTM荧光探针SEQ ID NO A3的5′和3’端均标记MAR(荧光报告/淬灭基团)；AllgloTM荧光探针SEQ ID NO A4的5′和3’端均标记JUP(荧光报告/淬灭基团)；AllgloTM荧光探针SEQ ID NO A5的5′和3’端均标记SAT(荧光报告/淬灭基团)。AllgloTM荧光探针SEQ ID NO B3的5′和3’端均标记MAR(荧光报告/淬灭基团)；AllgloTM荧光探针SEQ ID NO B4的5′和3’端均标记JUP(荧光报告/淬灭基团)；AllgloTM荧光探针SEQ ID NO B5的5′和3’端均标记URA(荧光报告/淬灭基团)。AllgloTM荧光探针SEQ ID NO B6的5′和3’端均标记SAT(荧光报告/淬灭基团)。
优选的，反应体系之一包括(1)PCR混合反应液、(2)肽核酸(PNA)探针、(3)突变型KRas-AllgloTM荧光探针和(4)阳性对照样品。该体系检测的是K-Ras基因第12密码子三种碱基置换突变(GGT→GAT，GGT→GTT，GGT→GCT)。
其中，(1)PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO A1所示：SEQ ID NO A1：5’-TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC-3’；PCR反向引物的序列如SEQ ID NO A2所示：SEQ ID NOA2：5’-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3’。
(2)肽核酸探针抑制K-Ras基因突变区野生型基因扩增的PNA序列，其序列如SEQ ID NO A0所示：SEQ ID NO A0：PNA probe-5’-CCTACGCCACCAGCTCC-3’。
(3)突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQ ID NOA4、SEQ ID NO A5所示的序列：
SEQ ID NO A3(GAT-12密码子)：5’-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3’；
SEQ ID NO A4(GTT-12密码子)：5’-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3’；
SEQ ID NO A5(GCT-12密码子)：5’-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3’；
(4)阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号密码子三种突变类型(GAT，GCT和GTT)的混合质粒基因组DNA。
优选的，反应体系也可以为：包括(1)PCR混合反应液、(2)肽核酸(PNA)探针、(3)突变型KRas-AllgloTM荧光探针和(4)阳性对照样品。该体系检测的是K-Ras基因第13密码子一种碱基置换突变(密码子13GGC→GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子12GGT→TGT，GGT→AGT和GGT→CGT)。
其中，(1)PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO A1所示：SEQ ID NO A1：5’-TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC-3’；PCR反向引物的序列如SEQ ID NO A2所示：SEQ ID NOA2：5’-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3’。
(2)肽核酸探针的序列如SEQ ID NO A0所示：SEQ ID NO A0：PNA probe-5’-CCTACGCCACCAGCTCC-3’。
(3)AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NOB5、SEQ ID NO B6所示的序列：
SEQ ID NO B3(GAC-13密码子)：5’-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3’；
SEQ ID NO B4(TGT-12密码子)：5’-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3’；
SEQ ID NO B5(AGT-12密码子)：5’-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3’；
SEQ ID NO B6(CGT-12密码子)：5’-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3’；
(4)阳性对照样品是存在K-Ras基因第13号密码子一种突变类型(GAC)和第12密码子三种突变型(TGT，AGT和CGT)的混合质粒基因组DNA。
优选的，反应体系为15μl，PCR引物各0.15μl(终浓度20μM)，AllgloTM荧光探针探针各0.2μl(终浓度20μM)，PNA探针0.3μl(终浓度20μM)，模板DNA 2.5μl(终浓度100-300ng/μl)，PCR反应液7.5μl，加入ddH2O至15μl。
综合AllgloTM探针的优势和定量PCR技术特点，与PCR-SSCP测序等方法比较，本技术用PNA增敏的FQ-PCR检测K-Ras基因的突变具有以下优势：
1、特异性强：设计的AllgloTM探针分别针对KRAS基因第12和第13密码子的七种特异突变序列，能特异的与PCR扩增的特异突变产物杂交；AllgloTM探针提高TM值(可高达10℃以上)，可以抑制非特异性PCR产物扩增；另外本发明技术在PCR反应液中加入野生型K-Ras基因肽核酸序列(PNA)，通过抑制野生型基因组产物扩增而富集突变型扩增，也提高检测的特异性；
2、检测敏感性高：本发明技术在PCR反应液中加入野生型K-Ras基因肽核酸序列(PNA)，通过抑制野生型产物扩增富集突变型扩增，提高检测敏感性；由于探针更短，可以达到15-16mer；AllgloTM探针两端荧光即可相互粹灭，水解后又可报告荧光，也提高了检测灵敏度。本技术检测K-Ras突变基因组DNA敏感度为1％(即突变基因组DNA达到基因总DNA的1％即可检出)；直接测序法检测K-Ras突变基因组DNA敏感度为20-30％(即突变基因组DNA达到基因总DNA的20-30％才能检出)；表1列示不同检测方法对结直肠癌组织K-Ras基因突变检测的灵敏度：
表1
3、可以进行KRAS突变型基因组定量检测；测序和其它方法均不能实现对K-Ras基因突变基因组的真正定量检测；
4、本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果；直接测序法一般需要新鲜冰冻组织，检测步骤繁琐：送检标本-提取DNA-定性PCR扩增-验证PCR产物-纯化PCR产物-直接测序；
5、检测时间短(从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成)；测序方法最快需要24-48小时才能出结果；
6、操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率(比较如下所示)。
7、结果判读明确、直观(比较如下所示)；若需要亦可对结果进行定量分析。直接测序法结果的判读：需将测序峰形图人工读出序列，再将所读出的序列结合基因库中的原始序列一起分析，从而得到结果，荧光定量PCR法结果的判读：在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单，直观。
8、检测的样本量大，一次最多可检测384例；直接测序法一次试验最多可检测8-12例。
9、安全：整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
本发明的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测各种癌组织中K-Ras基因特定位点突变。
本发明采用了PNA技术合成覆盖K-Ras基因检测位点(第12和13密码子)的肽核酸序列，结合采用了最新发展的AllgloTM荧光探针技术。
肽核酸(PNA，Peptide Nucleic Acid)是近十几年发展起来的以中性酰胺键为骨架的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)类似物，以中性酰胺键为骨架并兼有多肽和核酸性质的独特化合物，其特点是：1、可以高度亲和并序列特异地与DNA和RNA结合， 与核酸的杂交能力强于核酸间的杂交能力，形成的杂交复合物具有相当高的热稳定性以及独特的耐离子强度变化性质；2、热稳定性高于核酸间的杂交体；3、抗酶解能力极强，由于其非肽和非核酸的结构特点，蛋白酶和核酸酶均不能降解PNA。目前，PNA被广泛用于化学、生物学、反义药物、分子识别、遗传诊断等领域。它能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备PNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加且能在低盐浓度下进行杂交，可大大提高微生物学检测和医疗诊断的效率和灵敏度。
AllgloTM探针是美国AlleLogic Biosciences公司推出的最新一代荧光定量探针，它拥有普通Taqman、Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，去掉了目前这几种探针的最大弊端，能够大大提高荧光定量PCR技术的研究和应用。
AllgloTM探针打破传统Taqman探针的一端报告基团一端粹灭基团的限制，利用美国AlleLogic Biosciences公司生物化学专家大量研究开发的、获得美国专利技术的几种常用波长的特制荧光染料，该系列染料标记在oligo上面互相互为报告及粹灭基团，而且上面含有特殊的可以大大提高TM值的化学基团，可以大大提高探针特异性，经同类比较，杂交特异性大大超过Taqman及Taqman-MGB，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，大大提高荧光增量。其优势在于，可提高TM值(可高达10℃以上)，探针更短，可以15-16mer，可以适用于A、T含量比较高的序列设计探针，大大提高探针配对和非配对的TM值差异，加大多重荧光定量PCR的选择：5-7种专利荧光选择，适用于所有品牌荧光定量PCR仪所有通道；每种染料即是报告基团又是粹灭基团，打破传统Taqman探针，因为波长原因标记选择困难，不受粹灭基团波长的限制；提高信噪比：无背景荧光，空间距离近，更好的淬灭效果，探针两端荧光即可相互粹灭，水解后又可报告荧光。
本发明的肽核酸(PNA)和AllgloTM探针增敏的K-Ras基因突变荧光定量PCR检测试剂盒是针对K-Ras基因热点突变区的检测而设计的，包括K-Ras基因第12、13密码子的共7种突变基因型。该试剂盒包括PCR混合反应液、优选的，包括两种荧光定量反应液，荧光定量反应液的特征是均含有正、反引物和AllgloTM荧光探针，抑制KRAS突变区野生型基因组PCR扩增的PNA序列，阳性对照样品，只是AllgloTM荧光探针针对的突变位点有所区别，相应的阳性对照样品也有所不同而已。
在本发明中，提供的两端都标有荧光发光基团MAR的特异性荧光探针，在探针完整时(随机状态和无PCR产物杂交状态)，则探针两端MAR荧光染料均不发出荧光。当特异的PCR产物与AllgloTM探针发生杂交反应时，Taq酶同时也把探针裂解，则探针两端标记的MAR荧光染料改变为杂交消化形态而发出荧光。由于标记AllgloTM探针两端的MAR互相互为报告及粹灭基团，而且上面含有特殊的可以大大提高TM值的化学基团，可以大大提高探针特异性，经同类比较，杂交特异性显著超过Taqman及Taqman-MGB，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，大大提高荧光增量。报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
附图说明
图1是用荧光定量PCR检测肠癌阳性样本的KRAS基因第12密码子三种碱基置换突变的扩增曲线图；
图2是用荧光定量PCR检测肠癌阳性样本的KRAS基因第13密码子一种碱基置换突变和第12密码子两种碱基置换突变的扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
收集临床病理诊断为肠腺癌(CRC)的80例患者的蜡块组织，所有患者术前均未接受过西妥昔单抗(cetuximab)治疗。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。
实施例1：用荧光定量PCR(FQ-PCR)检测KRAS基因第12密码子四种碱基置换突变(密码子12GGT→GAT，GGT→GTT，GGT→GCT)。
设计能特异性检测上述三种碱基置换突变的特异性AllgloTM荧光定量检测探针各一条及PCR引物一对，各探针、引物序列分别具体如下：
PNA序列为PNA probe-5’-CCTACGCCACCAGCTCC-3’，如序列表中SEQID NO A0所示；
针对GAT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针序列为：5’-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3’，如序列表中SEQ ID NO A3所示；
针对GTT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针序列为：5’-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3’，如序列表中SEQ ID NO A4所示；
针对GCT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针序列为：5’-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3’，如序列表中SEQ ID NO A5所示；
PCR正向引物序列为：5’-TTA GCT GTA TCG TCAAGG CAC TC-3’，如序列表中SEQ ID NO A1所示；
PCR反向引物序列为：5’-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3’，如序列表中SEQ ID NO A2所示。
其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突变区野生型基因扩增，针对GAT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针的5’和3’端均标记MAR(荧光报告/淬灭基团)；针对GTT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针的5’和3’端均标记JUP(荧光报告/淬灭基团)；针对GCT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM的荧光定量检测探针的5’和3’端均标记SAT(荧光报告/淬灭基团)。阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号密码子3种突变类型(GAT，GCT和GTT)的混合质粒基因组DNA。
优化反应体系进行FQ-PCR的检测：反应体系为15μl，PCR正向引物和PCR反向引物各0.15μl(终浓度20μM)，三种突变型KRAS-AllgloTM的荧光定量检测探针各0.2μl(终浓度20μM)，PNA探针0.3μl(终浓度20μM)，模板DNA 2.5μl(终浓度100-300ng/μl)，PCR反应混合液(CS PCR Master Mix，购自上海超市生物技术公司)7.5μl，补加ddH2O至总体积为15μl。荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行。反应条件为：95℃变性5分钟，95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，扩增反应40循环。
结果为：在80例样本中共检测出9例样本发生KRAS基因第12密码子GGT→GAT突变，5例样品发生KRAS基因第12密码子GGT→GTT突变，2例样本发生KRAS基因第12密码子GGT→GCT突变。部分阳性样本见图1，图1A示KRAS基因第12密码子GGT→GAT突变的部分样品阳性扩增曲线；图1B示KRAS基因第12密码子GGT→GTT突变的部分样品阳性扩增曲线；图1C示KRAS基因第12密码子GGT→GCT突变的部分样品的阳性扩增曲线。
实施例2：用荧光定量PCR检测KRAS基因第13密码子一种碱基置换突变(密码子13GGC→GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子12GGT→GCT，GGT→AGT，GGT→CGT)
设计能特异性检测上述四种碱基置换突变的特异性AllgloTM荧光定量检测探针各一条及PCR引物一对，各探针、引物序列分别具体如下：
PNA序列为PNA probe-5’-CCTACGCCACCAGCTCC-3’，如序列表中SEQID NO A0所示；
针对GAC-13密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针序列为：5’-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3’，如序列表中SEQ ID NO B3所示；
针对TGT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针序列为：5’-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3’，如序列表中SEQ ID NO B4所示；
针对AGT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针序列为：5’-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3’，如序列表中SEQ ID NO B5所示；
针对CGT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针序列为：5’-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3’；如序列表中SEQ ID NO B6所示；
PCR正向引物序列为：5’-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3’，如序列表中SEQ ID NO A1所示；
PCR反向引物序列为：5’-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3’，如序列表中SEQ ID NO A2所示。
其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突变区野生型基因扩增，针对GAC-13密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针B3的5’和3’端均标记MAR(荧光报告/淬灭基团)；针对TGT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM荧光定量检测探针B4的5’和3’端均标记JUP(荧光报告/淬灭基团)；针对AGT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM的荧光定量检测探针B5的5’和3’端均标记URA(荧光报告/淬灭基团)。针对CGT-12密码子的突变型KRAS-AllgloTM的荧光定量检测探针的5’和3’端均标记SAT(荧光报告/淬灭基团)。阳性对照样品B是存在K-Ras基因第13号密码子一种突变类型(GAC)和第12密码子三种突变型(TGT，AGT和CGT)的混合质粒基因组DNA。
优化反应体系进行FQ-PCR的检测：反应体系为15μl，PCR正向引物和PCR反向引物各0.15μl(终浓度20μM)，四种突变型KRAS-AllgloTM的荧光定量检测探针探针各0.2μl(终浓度20μM)，PNA探针0.3μl(终浓度20μM)，模板DNA2.5μl(终浓度100-300ng/μl)，PCR反应混合液(CS qPCR Master Mix，购自上海超市生物技术公司)7.5μl，补加ddH2O至总体积为15μl。荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行。反应条件为：95℃变性5分钟，95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，扩增反应40循环。
结果为：在80例样本中共检测出2例样本发生KRAS基因第13密码子GGC→GAC突变，1例样品发生KRAS基因第12密码子GGT→TGT突变，1例样本发生KRAS基因第12密码子GGT→AGT突变。本组病例没有发现KRAS基因第12密码子GGT→CGT突变。部分阳性样本见图2：图2A示KRAS基因第13密码子GGC→GAC突变的部分样品阳性扩增曲线；图2B示KRAS基因第12密码子GGT→TGT突变的部分样品阳性扩增曲线；图2C示KRAS基因第12密码子GGT→AGT突变的部分样品的阳性扩增曲线。
上述结果表明本发明的FQ-PCR法检测肿瘤组织KRAS基因突变不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的，结果可靠性的验证可见该实验的实验数据。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<120>一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
<160>10
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列A0
<400>1
cctacgccac cagctcc 17
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列A1
<400>2
ttagctgtat cgtcaaggca ctc 23
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列A2
<400>3
gcctgctgaa aatgactgaa tata 24
<210>1
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列A3
<400>4
tggagctgat ggcg 14
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列A4
<400>5
gttggagctg ttggcgt 17
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列A5
<400>6
tggagctgct ggcgt 15
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列B3
<400>7
agctggtgac gtaggc 16
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列B4
<400>8
gttggagctt gtggcgt 17
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列B5
<400>9
tggagctagt ggcgt 15
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列B6
<400>10
ttggagctcg tggcgt 16
Claims (10)
1.一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合反应液、肽核酸探针、突变型KRas-AllgloTM荧光探针和阳性对照样品。
2.根据权利要求1所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述肽核酸探针的序列如SEQ ID NO A0所示。
3.根据权利要求1所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序列如SEQ ID NO A1所示，所述PCR反向引物的序列如SEQID NO A2所示。
4.根据权利要求1所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQID NO A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6所示的序列中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，当所述突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQID NO A4和SEQ ID NO A5所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号密码子三种突变类型(GAT，GCT和GTT)的混合质粒基因组DNA。
6.根据权利要求4所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，当所述突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO B3、SEQID NO B4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K-Ras基因第13号密码子一种突变类型(GAC)和第12密码子三种突变型(TGT、AGT和CGT)的混合质粒基因组DNA。
7.一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，针对K-Ras基因设计一对PCR引物、肽核酸探针，并针对K-Ras基因突变位点分别设计AllgloTM荧光探针，反应体系中加入PCR反应液、PCR引物、肽核酸探针和AllgloTM荧光探针进行荧光定量PCR的检测。
8.根据权利要求7所述的一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的肽核酸探针的序列如SEQ ID NO A0所示。
9.根据权利要求7所述的一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的PCR引物如SEQ ID NO A1和SEQ ID NO A2所示。
10.根据权利要求7所述的一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQ ID NOA4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5和SEQ IDNO B6所示的序列中的一种或多种。
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