CN101434985A - K-ras基因突变的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了K－ras基因突变的定量检测的方法，包括以下步骤：设计一种与野生型K－ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交的PNA；用所述PNA分别对已知拷贝数的突变型标准品和野生型标准品进行SYBR－RT－PCR定量检测，得出标准曲线和融解曲线；用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR－RT－PCR定量检测；根据所述融解曲线判断待测样品核酸为野生型或突变型或突变/野生混合型后，根据所述标准曲线得出待测样品核酸的K－ras基因突变量。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高，并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。

Description

K-ras基因突变的定量检测方法

技术领域

本发明涉及K-ras基因突变的检测，尤其涉及一种K-ras基因突变的定量检测方法。

背景技术

K-ras基因(GenBank：NC_000012)突变在胰腺癌的发生发展中起重要作用。已报道，在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中可检测出K-ras基因第12、13或61密码子点突变(Takahashi，et al.GastrointestinalEndo 2005.61：76—9；Luigi L，et al.Oncogene 2002.21：4301—6；TadaM，et al.Cancer Res 1993.53：2472—4；Lu XH，et al.Natl Med J China2001.81：1050-3；N van Heek，et al.J.Clin.Pathol.2005.58：1315-1320)。

研究表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否可作为胰腺癌早期诊断的一种方法。但在一些实验中发现慢性胰腺炎及胆道结石等良性疾病中也存在K-ras基因突变，单纯定性分析，特异性较差，定量分析能更好反映突变程度，以便于良恶性鉴别。目前普遍应用的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFLP法)和扩增受阻突变体系法(ARMS法)。

RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：

(1)步骤烦琐，需要2天时间才能完成鉴定；

(2)只能作定性研究，即只能明确是否存在K-ras基因突变，若要求定量，则需用其他方法进行进一步检测；

(3)存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。

ARMS法的原理是：根据3′端错配原则，在进行扩增反应时，若3′端碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′二磷酸二酯键形成的障碍而受阻，因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。

ARMS法的步骤包括：

(1)设计针对K-ras基因某一种突变类型的特异性引物或探针；

(2)对已知突变量的标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线；

(3)对未知样本进行实时定量PCR检测，根据上述标准曲线，得出未知标本突变量。

但是，该方法的缺点是：

(1)每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定，而K-ras基因在第12、13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；

(2)可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性。

肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是一种DNA类似物，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了DNA的磷酸二酯糖，其较之传统DNA探针具有不少优点：1.PNA十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被其他酶所降解；2.对于错配的PNA/DNA，哪怕只有一个碱基的错配，也会造成其融解温度下降9—10℃左右。目前，肽核酸已在多个领域得到应用(张兵波等，《高分子通报》2006，9：62-68；Egholm M，et al.Nature，1993，365：566～568)。

SYBR Green I是一种绿色荧光染料，它与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种K-ras基因突变的定量检测方法，该方法只需设计一种针对野生型的PNA，并将该PNA与SYBR实时定量PCR相结合，可对K-ras基因在第12、13密码子的所有突变类型进行定量检测。

为了解决上述技术问题，本发明K-ras基因突变的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)设计一种PNA，该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交，用于封闭野生型K-ras基因扩增；

(2)构建突变型标准品和野生型标准品，该突变型标准品包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列，该野生型标准品包含野生型K-ras基因序列；

(3)对已知拷贝数的突变型标准品进行加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于突变型K-ras基因定量的标准曲线；对已知拷贝数的野生型和/或突变型标准品进行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于总体K-ras基因定量的标准曲线；

(4)由步骤(3)的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于定性判断待测样品为野生型或突变型或突变/野生混合型的PCR产物融解曲线；

(5)在与步骤(3)相同的反应条件下，用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR—RT—PCR定量检测，并根据步骤(4)的融解曲线的差异对待测样品核酸进行定性判断后，根据步骤(3)的标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量及其占总体K-ras基因的比例。

所述突变型标准品和野生型标准品至少包括质粒、基因组DNA或人工合成序列中的一种。

优选的，所述突变型标准品为质粒，该质粒包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列；所述野生型标准品为质粒，该质粒包含野生型K-ras基因序列。

所述步骤(2)和步骤(3)之间，还包括：对待检样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。

所述步骤(5)中待测样品核酸的K-ras基因突变量为突变K-ras基因的拷贝数量，所述比例为拷贝数比值。

所述待检样品包括粪便、血液、组织液、细胞株或组织。

本发明K-ras基因突变的定量检测方法，将PNA与SYBR实时定量PCR的结合应用于K-ras基因检测，由于PNA能同时覆盖K-ras基因第一外显子中第12、13密码子的6个碱基，任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，因此只需设计一种针对野生型的PNA，进行一次PCR反应，即可将K-ras基因在第12、13密码子的十余种突变型与野生型区分开。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高，可实时定量检测K-ras基因突变量，并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的质粒测序结果图；

图2是本发明实施例1的标准品扩增曲线图；

图3是根据图2绘制的标准曲线图；

图4是本发明实施例1的扩增产物的融解曲线图；

图5是本发明实施例1的定量方法示意图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明采用联合肽核酸(PNA)的实时定量PCR法检测K-ras基因点突变。所述K-ras基因可以是从慢性胰腺炎及胰腺癌患者的胰液、粪便及血液中提取的DNA中的基因。因为PNA同时覆盖了K-ras基因第一外显子中第12、13密码子的6个碱基，任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，故只需设计一种针对野生型K-ras基因的PNA，进行一次PCR反应，即可区分野生型与突变型。

实施例1 对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测

1.主要试剂来源：

1.1 设计PNA

PNA是针对野生型K-ras基因第12、13密码子设计的PNA，其序列为Ac-ACGCCACCAGCTC-Lysine-COOH(SEQ ID NO：1)，由韩国panagene公司合成。

1.2 PCR引物

本发明用于扩增K-ras基因靶序列的引物，包括以下引物对：

上游引物F1：5′-TACTGGTGGAGTATTTGATA-3′(SEQ ID NO：2)；

下游引物R1：5′-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3′(SEQ ID NO：3)；

上述PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 TA克隆试剂盒

TA克隆试剂盒(Target Clone)购买于TOYOBO公司。

1.4 质粒抽提试剂盒

质粒抽提试剂盒购买于TIANGEN公司。

1.5 SYBR Green realtime PCR Master Mix购买于ABI公司。

2.细胞株DNA抽提

选取胰腺癌细胞株Panc-1、BxPC-3、CFPAC及SW1990(细胞株来自本实验室)，用酚提取法常规抽提细胞株DNA，并使用DNA纯化试剂盒(Tiangen公司)进行纯化。

使用Gene公司NanoDrop ND1000型核酸微量测量仪测定所抽提DNA浓度(OD260/OD280＝1.0～2.0)。经检测，DNA浓度分别为：Panc-1,517ng/μl；BxPC-3，337ng/μl；CFPAC，425ng/μl；SW1990，425ng/μl。

3.PCR方法克隆构建含突变型和野生型检测靶序列的质粒标准品

3.1 PCR反应液配制

PCR反应体系包括10×Ex Taq缓冲液2μl，dNTP混合液200μM，引物F1(SEQ ID NO：2)、R1(SEQ ID NO：3)各0.5μM，DNA模板100ng，Taq酶1U用无菌双蒸水定容至20μl。

3.2 PCR反应

所用仪器为德国Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR仪。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环，72℃延伸10min。

3.3 电泳

2.0％琼脂糖凝胶电泳确定产物正确性。

4.PCR产物克隆入质粒

4.1 菌株构建

将PCR产物纯化后，通过T载体连接，构建出携带突变和野生检测靶序列的质粒，此质粒在E.coli DH5α(该大肠杆菌由本实验室培养所得)进行大量扩增，并抽提纯化获得，测序正确后作为标准品。

4.1.1 通过以下公式求得构建质粒时Xμl以上的PCR产物：X＝50Y÷Z(Ykb：PCR产物的大小、Zng/μl：PCR产物浓度)。按以下组成配制T载体连接液：包括灭菌蒸馏水2μl、2×连接缓冲液5μl、pTA2载体(50ng/μl)1μl、T4 DNA连接酶1μl、PCR产物1μl，共10μl。将反应液于室温(15～25℃)进行30分钟反应。

4.1.2 制备感受态细胞，并加入上述连接液，用氯化钙方法转化大肠杆菌，并进行X-gal和IPTG筛选(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版上册第96-99、103页)。

4.2 质粒提取

挑取筛选所得的白色菌落，加入5ml预先加入氨苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基中，37℃振摇12～16小时。用Tiangen普通质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒。

4.3 质粒测序

质粒测序由invitrogen公司承接。

测序结果：BxPC-3为野生型K-ras基因(第12、13密码子为GGTGGC)，Panc-1、CFPAC及SW1990为突变株，第12、13密码子分别突变为GATGGC、GTTGGC、GGTGAC(见图1)。

5.SYBR—RT—PCR实时定量检测K-ras基因突变

5.1 标准品配制

根据测序结果，选取突变型细胞株Panc-1为标准品模板。

模板拷贝数换算：拷贝数＝质量/分子量×6.02×10²³

质粒分子量计算：MW＝(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)—61≈碱基数×324.5；或是使用软件DNAMAN计算。

本实验中合成的质粒为3457bp，WM≈2131.19Kda，因此1ng质粒拷贝数约为3×10⁸。

将模板倍比稀释为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³拷贝，作为标准品模板。

5.2 SYBR—RT—PCR荧光嵌合反应

在实时定量反应中以非特异性双链嵌合荧光染料SybrGreen I进行荧光标记，PCR反应后根据融解曲线判断PCR产物的特异性。实验中PNA能将野生型基因的扩增进行抑制，因此仪器所检测的荧光量可反应突变基因的拷贝量。

5.2.1 反应体系及反应条件

仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。

突变型K-ras基因检测反应体系包括：2×Taqman realtime PCRMaster Mix，引物F1(SEQ ID NO：2)、R1(SEQ ID NO：3)各0.4μM，PNA(SEQ ID NO：1)3.75μM，DNA标准品模板为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝，用无菌双蒸水定容至25μl。设定纯水为阴性对照(NTC)。

总体K-ras基因检测(不加PNA，针对突变/野生混合型)反应体系包括：2×Taqman realtime PCR Master Mix，引物F1(SEQ ID NO：2)、R1(SEQ ID NO：3)各0.4μM，DNA标准品模板为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝，用无菌双蒸水定容至25μl。设定纯水为阴性对照(NTC)。

PCR反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，70℃PNA结合10s，60℃退火60s，共40个循环；之后，95℃变性15s后，再以0.7℃/s从95℃降至60℃，进行融解曲线分析。

5.2.2 标准曲线绘制

根据步骤5.2.1中检测的结果分别绘制出相应突变型K-ras基因检测标准曲线和总体K-ras基因检测标准曲线。

图2为突变型K-ras基因检测标准曲线，在该图中，上升的八条曲线自左向右依次分别代表稀释倍比为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝的突变型质粒标准品模板。图2中，横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由图2进一步绘制用于计算的标准曲线(见图3)。在图3中，横轴指拷贝数的对数值，纵轴指Ct值，标准曲线的斜率为-3.01，截距(Intercept)为39.06，R2为0.997。

同样，可绘制出总体K-ras基因检测标准曲线(图略)。

5.2.3 扩增产物的融解曲线分析

PNA分别封闭野生型和突变型序列后，扩增产物的融解曲线如图4所示。多次重复测定可获得，野生型与突变型融解温度分别为83.5℃±0.5(n＝15)和80.8℃±0.6(n＝15)。在图4中，横轴指温度，纵轴指荧光强度变化的导数(derivative)，融解曲线1代表纯野生型不加PNA的产物融解曲线，其Tm值为83.9℃；融解曲线2代表纯突变型不加PNA的产物融解曲线，其Tm值为83.2℃；融解曲线3代表纯野生型或突变/野生混合型，加入PNA未能完全抑制野生型扩增的产物融解曲线，其Tm值也为83.9℃；融解曲线4代表纯突变型或突变/野生混合型，加入PNA能完全抑制野生型扩增的产物融解曲线，其Tm值为80.5℃。

5.2.4定量方法

选用同一系列倍比稀释的质粒标准品(Pancl)，分成两组，一组标准品反应体系中不加PNA，另一组加入PNA(终浓度为3.75μM)。同时，待检模板也同样分为两组。这四组在同一条件下进行SYBR RT—PCR，反应结束后，根据PNA加入和不加入的情况分别制作突变型和总体K-ras基因定量检测标准曲线，并分别进行待检样本的定量。其中，对于未加入PNA的反应，野生型与突变型均扩增，结果计算出的模板量为野生型基因与突变型基因的总拷贝数；而加入PNA的反应，因为野生型基因受到抑制而无扩增，结果所得的模板量即为样本中所含的突变型基因的拷贝数(见图5)。但应当注意，在定量时，应先进行上述的融解曲线分析，若根据融解曲线判断样本为纯野生型或突变型时，只需进行总拷贝数计算；若判断为突变/野生混合型时，在PNA加入突变型K-ras基因检测反应中，野生型扩增完全抑制的前提下，依据突变型K-ras基因检测标准曲线，计算出K-ras突变基因拷贝数，在PNA不加入的总体K-ras基因检测反应中，依据总体K-ras基因检测标准曲线，计算出K-ras基因总体拷贝数。并由此计算出样本中突变占总体拷贝数的比例。

实施例2 临床样品(以血液和粪便样品为例)中K-ras基因突变的检测

1.收集临床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人的粪便及血液，抽提DNA。

2.血液DNA抽提方法：①抗凝全血0.5～12ml；②加入500～700ulTT缓冲液，剧烈振荡后，低温离心机以每分钟12000转离心5分钟；③收集沉淀，重复2，3步骤，直至沉淀为无色；④加入200ulPCR裂解液A；⑤37℃水浴过夜；⑥抽取PCR裂解物(约200ul)，加入200ul酚氯仿，充分混匀后，以每分钟12000转离心20分钟；⑦取上清，加入200ul氯仿充分混匀，12000转/分离心10分钟；⑧取上清，加入100ul乙酸铵及2倍体积无水乙醇(约700ul)充分混匀，静置1分钟后，12000转/分离心10分钟；⑨弃上清加入1ml 70％乙醇洗涤，12000转/分离心5分钟；⑩弃上清，自然风干，用100ulTE液溶解沉淀，分装于—80℃保存。

3.粪便DNA抽提方法：采用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool MiniKit试剂盒进行。

4.DNA浓度测定方法同实施例1的步骤2。

5.按照实施例1的5.2.1，对标本进行K-ras基因的PNA钳制SYBR-RT-PCR检测。

6.结果分析：根据标准曲线，得出胰腺癌K-ras基因突变拷贝数及突变型与野生型的比例。

序列表

<110>上海长海医院

<120>K-ras基因突变的定量检测方法

<130>NP-07-11857

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>3

Claims (7)

1.一种K-ras基因突变的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计一种PNA，该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交，用于封闭野生型K-ras基因扩增；

(2)构建突变型标准品和野生型标准品，该突变型标准品包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列，该野生型标准品包含野生型K-ras基因序列；

(3)对已知拷贝数的突变型标准品进行加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于突变型K-ras基因定量的标准曲线；对已知拷贝数的野生型和/或突变型标准品进行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于总体K-ras基因定量的标准曲线；

(4)由步骤(3)的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于定性判断待测样品为野生型或突变型或突变/野生混合型的PCR产物融解曲线；

(5)在与步骤(3)相同的反应条件下，用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR—RT—PCR定量检测，并根据步骤(4)的融解曲线的差异对待测样品核酸进行定性判断后，根据步骤(3)的标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量及其占总体K-ras基因的比例。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变型标准品和野生型标准品至少包括质粒、基因组DNA或人工合成序列中的一种。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变型标准品为质粒，该质粒包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述野生型标准品为质粒，该质粒包含野生型K-ras基因序列。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)和步骤(5)之间，还包括：对待检样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中待测样品核酸的K-ras基因突变量为突变K-ras基因的拷贝数量，所述比例为拷贝数比值。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括粪便、血液、组织液、细胞株或组织。

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