CN101434985A - K-ras基因突变的定量检测方法 - Google Patents

K-ras基因突变的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了K-ras基因突变的定量检测的方法,包括以下步骤:设计一种与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交的PNA;用所述PNA分别对已知拷贝数的突变型标准品和野生型标准品进行SYBR-RT-PCR定量检测,得出标准曲线和融解曲线;用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR-RT-PCR定量检测;根据所述融解曲线判断待测样品核酸为野生型或突变型或突变/野生混合型后,根据所述标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高,并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。

Description

K-ras基因突变的定量检测方法
技术领域
本发明涉及K-ras基因突变的检测,尤其涉及一种K-ras基因突变的定量检测方法。
背景技术
K-ras基因(GenBank:NC_000012)突变在胰腺癌的发生发展中起重要作用。已报道,在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中可检测出K-ras基因第12、13或61密码子点突变(Takahashi,et al.GastrointestinalEndo 2005.61:76—9;Luigi L,et al.Oncogene 2002.21:4301—6;TadaM,et al.Cancer Res 1993.53:2472—4;Lu XH,et al.Natl Med J China2001.81:1050-3;N van Heek,et al.J.Clin.Pathol.2005.58:1315-1320)。
研究表明,检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否可作为胰腺癌早期诊断的一种方法。但在一些实验中发现慢性胰腺炎及胆道结石等良性疾病中也存在K-ras基因突变,单纯定性分析,特异性较差,定量分析能更好反映突变程度,以便于良恶性鉴别。目前普遍应用的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFLP法)和扩增受阻突变体系法(ARMS法)。
RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点:
(1)步骤烦琐,需要2天时间才能完成鉴定;
(2)只能作定性研究,即只能明确是否存在K-ras基因突变,若要求定量,则需用其他方法进行进一步检测;
(3)存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。
ARMS法的原理是:根据3′端错配原则,在进行扩增反应时,若3′端碱基对形成错配,链延伸反应就会因3′,5′二磷酸二酯键形成的障碍而受阻,因此,只有模板链是特定的等位基因时,才会检测出特异的扩增产物。在ARMS的反应体系中,引物上标记2个不同荧光素,或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。
ARMS法的步骤包括:
(1)设计针对K-ras基因某一种突变类型的特异性引物或探针;
(2)对已知突变量的标准品进行实时定量PCR检测,得出标准曲线;
(3)对未知样本进行实时定量PCR检测,根据上述标准曲线,得出未知标本突变量。
但是,该方法的缺点是:
(1)每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定,而K-ras基因在第12、13密码子的突变类型可有十余种,需要逐一检测;
(2)可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性。
肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一种DNA类似物,其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了DNA的磷酸二酯糖,其较之传统DNA探针具有不少优点:1.PNA十分稳定,正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相应的DNA/DNA,同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物,亦不会被其他酶所降解;2.对于错配的PNA/DNA,哪怕只有一个碱基的错配,也会造成其融解温度下降9—10℃左右。目前,肽核酸已在多个领域得到应用(张兵波等,《高分子通报》2006,9:62-68;Egholm M,et al.Nature,1993,365:566~568)。
SYBR Green I是一种绿色荧光染料,它与双链DNA结合发出荧光,通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量,同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种K-ras基因突变的定量检测方法,该方法只需设计一种针对野生型的PNA,并将该PNA与SYBR实时定量PCR相结合,可对K-ras基因在第12、13密码子的所有突变类型进行定量检测。
为了解决上述技术问题,本发明K-ras基因突变的定量检测方法,包括以下步骤:
(1)设计一种PNA,该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交,用于封闭野生型K-ras基因扩增;
(2)构建突变型标准品和野生型标准品,该突变型标准品包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列,该野生型标准品包含野生型K-ras基因序列;
(3)对已知拷贝数的突变型标准品进行加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测,得出用于突变型K-ras基因定量的标准曲线;对已知拷贝数的野生型和/或突变型标准品进行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测,得出用于总体K-ras基因定量的标准曲线;
(4)由步骤(3)的SYBR—RT—PCR定量检测,得出用于定性判断待测样品为野生型或突变型或突变/野生混合型的PCR产物融解曲线;
(5)在与步骤(3)相同的反应条件下,用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR—RT—PCR定量检测,并根据步骤(4)的融解曲线的差异对待测样品核酸进行定性判断后,根据步骤(3)的标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量及其占总体K-ras基因的比例。
所述突变型标准品和野生型标准品至少包括质粒、基因组DNA或人工合成序列中的一种。
优选的,所述突变型标准品为质粒,该质粒包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列;所述野生型标准品为质粒,该质粒包含野生型K-ras基因序列。
所述步骤(2)和步骤(3)之间,还包括:对待检样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。
所述步骤(5)中待测样品核酸的K-ras基因突变量为突变K-ras基因的拷贝数量,所述比例为拷贝数比值。
所述待检样品包括粪便、血液、组织液、细胞株或组织。
本发明K-ras基因突变的定量检测方法,将PNA与SYBR实时定量PCR的结合应用于K-ras基因检测,由于PNA能同时覆盖K-ras基因第一外显子中第12、13密码子的6个碱基,任一突变均可导致PNA/DNA的错配,使得融解温度发生明显改变,因此只需设计一种针对野生型的PNA,进行一次PCR反应,即可将K-ras基因在第12、13密码子的十余种突变型与野生型区分开。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高,可实时定量检测K-ras基因突变量,并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的质粒测序结果图;
图2是本发明实施例1的标准品扩增曲线图;
图3是根据图2绘制的标准曲线图;
图4是本发明实施例1的扩增产物的融解曲线图;
图5是本发明实施例1的定量方法示意图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明采用联合肽核酸(PNA)的实时定量PCR法检测K-ras基因点突变。所述K-ras基因可以是从慢性胰腺炎及胰腺癌患者的胰液、粪便及血液中提取的DNA中的基因。因为PNA同时覆盖了K-ras基因第一外显子中第12、13密码子的6个碱基,任一突变均可导致PNA/DNA的错配,使得融解温度发生明显改变,故只需设计一种针对野生型K-ras基因的PNA,进行一次PCR反应,即可区分野生型与突变型。
实施例1 对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测
1.主要试剂来源:
1.1 设计PNA
PNA是针对野生型K-ras基因第12、13密码子设计的PNA,其序列为Ac-ACGCCACCAGCTC-Lysine-COOH(SEQ ID NO:1),由韩国panagene公司合成。
1.2 PCR引物
本发明用于扩增K-ras基因靶序列的引物,包括以下引物对:
上游引物F1:5′-TACTGGTGGAGTATTTGATA-3′(SEQ ID NO:2);
下游引物R1:5′-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3′(SEQ ID NO:3);
上述PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 TA克隆试剂盒
TA克隆试剂盒(Target Clone)购买于TOYOBO公司。
1.4 质粒抽提试剂盒
质粒抽提试剂盒购买于TIANGEN公司。
1.5 SYBR Green realtime PCR Master Mix购买于ABI公司。
2.细胞株DNA抽提
选取胰腺癌细胞株Panc-1、BxPC-3、CFPAC及SW1990(细胞株来自本实验室),用酚提取法常规抽提细胞株DNA,并使用DNA纯化试剂盒(Tiangen公司)进行纯化。
使用Gene公司NanoDrop ND1000型核酸微量测量仪测定所抽提DNA浓度(OD260/OD280=1.0~2.0)。经检测,DNA浓度分别为:Panc-1,517ng/μl;BxPC-3,337ng/μl;CFPAC,425ng/μl;SW1990,425ng/μl。
3.PCR方法克隆构建含突变型和野生型检测靶序列的质粒标准品
3.1 PCR反应液配制
PCR反应体系包括10×Ex Taq缓冲液2μl,dNTP混合液200μM,引物F1(SEQ ID NO:2)、R1(SEQ ID NO:3)各0.5μM,DNA模板100ng,Taq酶1U用无菌双蒸水定容至20μl。
3.2 PCR反应
所用仪器为德国Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR仪。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,52℃退火40s,72℃延伸40s,共35个循环,72℃延伸10min。
3.3 电泳
2.0%琼脂糖凝胶电泳确定产物正确性。
4.PCR产物克隆入质粒
4.1 菌株构建
将PCR产物纯化后,通过T载体连接,构建出携带突变和野生检测靶序列的质粒,此质粒在E.coli DH5α(该大肠杆菌由本实验室培养所得)进行大量扩增,并抽提纯化获得,测序正确后作为标准品。
4.1.1 通过以下公式求得构建质粒时Xμl以上的PCR产物:X=50Y÷Z(Ykb:PCR产物的大小、Zng/μl:PCR产物浓度)。按以下组成配制T载体连接液:包括灭菌蒸馏水2μl、2×连接缓冲液5μl、pTA2载体(50ng/μl)1μl、T4 DNA连接酶1μl、PCR产物1μl,共10μl。将反应液于室温(15~25℃)进行30分钟反应。
4.1.2 制备感受态细胞,并加入上述连接液,用氯化钙方法转化大肠杆菌,并进行X-gal和IPTG筛选(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版上册第96-99、103页)。
4.2 质粒提取
挑取筛选所得的白色菌落,加入5ml预先加入氨苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基中,37℃振摇12~16小时。用Tiangen普通质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒。
4.3 质粒测序
质粒测序由invitrogen公司承接。
测序结果:BxPC-3为野生型K-ras基因(第12、13密码子为GGTGGC),Panc-1、CFPAC及SW1990为突变株,第12、13密码子分别突变为GATGGC、GTTGGC、GGTGAC(见图1)。
5.SYBR—RT—PCR实时定量检测K-ras基因突变
5.1 标准品配制
根据测序结果,选取突变型细胞株Panc-1为标准品模板。
模板拷贝数换算:拷贝数=质量/分子量×6.02×1023
质粒分子量计算:MW=(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)—61≈碱基数×324.5;或是使用软件DNAMAN计算。
本实验中合成的质粒为3457bp,WM≈2131.19Kda,因此1ng质粒拷贝数约为3×108
将模板倍比稀释为107、106、105、104、103拷贝,作为标准品模板。
5.2 SYBR—RT—PCR荧光嵌合反应
在实时定量反应中以非特异性双链嵌合荧光染料SybrGreen I进行荧光标记,PCR反应后根据融解曲线判断PCR产物的特异性。实验中PNA能将野生型基因的扩增进行抑制,因此仪器所检测的荧光量可反应突变基因的拷贝量。
5.2.1 反应体系及反应条件
仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。
突变型K-ras基因检测反应体系包括:2×Taqman realtime PCRMaster Mix,引物F1(SEQ ID NO:2)、R1(SEQ ID NO:3)各0.4μM,PNA(SEQ ID NO:1)3.75μM,DNA标准品模板为108、107、106、105、104、103、102拷贝,用无菌双蒸水定容至25μl。设定纯水为阴性对照(NTC)。
总体K-ras基因检测(不加PNA,针对突变/野生混合型)反应体系包括:2×Taqman realtime PCR Master Mix,引物F1(SEQ ID NO:2)、R1(SEQ ID NO:3)各0.4μM,DNA标准品模板为108、107、106、105、104、103、102拷贝,用无菌双蒸水定容至25μl。设定纯水为阴性对照(NTC)。
PCR反应条件:95℃预变性60s,95℃变性15s,70℃PNA结合10s,60℃退火60s,共40个循环;之后,95℃变性15s后,再以0.7℃/s从95℃降至60℃,进行融解曲线分析。
5.2.2 标准曲线绘制
根据步骤5.2.1中检测的结果分别绘制出相应突变型K-ras基因检测标准曲线和总体K-ras基因检测标准曲线。
图2为突变型K-ras基因检测标准曲线,在该图中,上升的八条曲线自左向右依次分别代表稀释倍比为108、107、106、105、104、103、102、10拷贝的突变型质粒标准品模板。图2中,横轴指循环数,纵轴指荧光检测值。由图2进一步绘制用于计算的标准曲线(见图3)。在图3中,横轴指拷贝数的对数值,纵轴指Ct值,标准曲线的斜率为-3.01,截距(Intercept)为39.06,R2为0.997。
同样,可绘制出总体K-ras基因检测标准曲线(图略)。
5.2.3 扩增产物的融解曲线分析
PNA分别封闭野生型和突变型序列后,扩增产物的融解曲线如图4所示。多次重复测定可获得,野生型与突变型融解温度分别为83.5℃±0.5(n=15)和80.8℃±0.6(n=15)。在图4中,横轴指温度,纵轴指荧光强度变化的导数(derivative),融解曲线1代表纯野生型不加PNA的产物融解曲线,其Tm值为83.9℃;融解曲线2代表纯突变型不加PNA的产物融解曲线,其Tm值为83.2℃;融解曲线3代表纯野生型或突变/野生混合型,加入PNA未能完全抑制野生型扩增的产物融解曲线,其Tm值也为83.9℃;融解曲线4代表纯突变型或突变/野生混合型,加入PNA能完全抑制野生型扩增的产物融解曲线,其Tm值为80.5℃。
5.2.4定量方法
选用同一系列倍比稀释的质粒标准品(Pancl),分成两组,一组标准品反应体系中不加PNA,另一组加入PNA(终浓度为3.75μM)。同时,待检模板也同样分为两组。这四组在同一条件下进行SYBR RT—PCR,反应结束后,根据PNA加入和不加入的情况分别制作突变型和总体K-ras基因定量检测标准曲线,并分别进行待检样本的定量。其中,对于未加入PNA的反应,野生型与突变型均扩增,结果计算出的模板量为野生型基因与突变型基因的总拷贝数;而加入PNA的反应,因为野生型基因受到抑制而无扩增,结果所得的模板量即为样本中所含的突变型基因的拷贝数(见图5)。但应当注意,在定量时,应先进行上述的融解曲线分析,若根据融解曲线判断样本为纯野生型或突变型时,只需进行总拷贝数计算;若判断为突变/野生混合型时,在PNA加入突变型K-ras基因检测反应中,野生型扩增完全抑制的前提下,依据突变型K-ras基因检测标准曲线,计算出K-ras突变基因拷贝数,在PNA不加入的总体K-ras基因检测反应中,依据总体K-ras基因检测标准曲线,计算出K-ras基因总体拷贝数。并由此计算出样本中突变占总体拷贝数的比例。
实施例2 临床样品(以血液和粪便样品为例)中K-ras基因突变的检测
1.收集临床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人的粪便及血液,抽提DNA。
2.血液DNA抽提方法:①抗凝全血0.5~12ml;②加入500~700ulTT缓冲液,剧烈振荡后,低温离心机以每分钟12000转离心5分钟;③收集沉淀,重复2,3步骤,直至沉淀为无色;④加入200ulPCR裂解液A;⑤37℃水浴过夜;⑥抽取PCR裂解物(约200ul),加入200ul酚氯仿,充分混匀后,以每分钟12000转离心20分钟;⑦取上清,加入200ul氯仿充分混匀,12000转/分离心10分钟;⑧取上清,加入100ul乙酸铵及2倍体积无水乙醇(约700ul)充分混匀,静置1分钟后,12000转/分离心10分钟;⑨弃上清加入1ml 70%乙醇洗涤,12000转/分离心5分钟;⑩弃上清,自然风干,用100ulTE液溶解沉淀,分装于—80℃保存。
3.粪便DNA抽提方法:采用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool MiniKit试剂盒进行。
4.DNA浓度测定方法同实施例1的步骤2。
5.按照实施例1的5.2.1,对标本进行K-ras基因的PNA钳制SYBR-RT-PCR检测。
6.结果分析:根据标准曲线,得出胰腺癌K-ras基因突变拷贝数及突变型与野生型的比例。
序列表
<110>上海长海医院
<120>K-ras基因突变的定量检测方法
<130>NP-07-11857
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
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<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>3

Claims (7)

1.一种K-ras基因突变的定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)设计一种PNA,该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交,用于封闭野生型K-ras基因扩增;
(2)构建突变型标准品和野生型标准品,该突变型标准品包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列,该野生型标准品包含野生型K-ras基因序列;
(3)对已知拷贝数的突变型标准品进行加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测,得出用于突变型K-ras基因定量的标准曲线;对已知拷贝数的野生型和/或突变型标准品进行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测,得出用于总体K-ras基因定量的标准曲线;
(4)由步骤(3)的SYBR—RT—PCR定量检测,得出用于定性判断待测样品为野生型或突变型或突变/野生混合型的PCR产物融解曲线;
(5)在与步骤(3)相同的反应条件下,用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR—RT—PCR定量检测,并根据步骤(4)的融解曲线的差异对待测样品核酸进行定性判断后,根据步骤(3)的标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量及其占总体K-ras基因的比例。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述突变型标准品和野生型标准品至少包括质粒、基因组DNA或人工合成序列中的一种。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述突变型标准品为质粒,该质粒包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述野生型标准品为质粒,该质粒包含野生型K-ras基因序列。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)和步骤(5)之间,还包括:对待检样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中待测样品核酸的K-ras基因突变量为突变K-ras基因的拷贝数量,所述比例为拷贝数比值。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品包括粪便、血液、组织液、细胞株或组织。
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