CN104357569B - 一种基于肽核酸(pna)钳制聚合酶链反应(pcr)的耳聋突变基因的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于肽核酸(PNA)钳制聚合酶链反应(PCR)的耳聋突变基因的检测方法，涉及分子生物学遗传工程核酸检测技术领域。包括如下步骤：(1)设计一种与野生型耳聋基因(含突变位点)杂交的肽核酸PNA；(2)构建和提取突变型及野生型耳聋基因质粒，计算拷贝数；(3)采集待测个体的样本，提取基因组DNA或线粒体DNA；(4)设计PCR扩增所需的一对上下游引物和Taqman探针；(5)用上述肽核酸PNA对质粒标准品或待测样本按照改进PCR反应条件进行检测，得出扩增曲线；(6)根据所述扩增曲线对照检测定性基因突变。本发明操作简便、敏感性高、特异性高，可实时检测耳聋基因突变量，可用于疾病的早期辅助诊断。

Description

一种基于肽核酸(PNA)钳制聚合酶链反应(PCR)的耳聋突变基因的检 测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学遗传工程中核酸检测技术领域，尤其是涉及一种基于肽核酸(PNA)钳制聚合酶链反应(PCR)的耳聋突变基因的检测方法。
背景技术
耳聋是威胁人类健康及致残的最常见疾病之一，约50％的耳聋患者有遗传背景。遗传性耳聋按表型特点不同分为综合征性耳聋(SHL)和非综合征性耳聋(NSHL)。根据遗传方式不同将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁遗传、Y连锁遗传及线粒体遗传五类，其中以AR耳聋最多见，约占75％～80％。迄今为止，与非综合征耳聋相关的28个常染色体隐性基因、22个常染色体显性基因、1个X连锁基因已被克隆，而每个基因中又有数目众多的耳聋突变位点，其中以GJB2、SLC26A4基因及线粒体mtDNA的突变最为常见，其它型所占比例较小。
国内研究人员针对中国人群耳聋的基因突变类型进行了较大规模的流行病学调查。结果显示，21％的耳聋患者带有GJB2基因突变、14.5％的患者带有SLC26A4基因突变、3.8％和0.6％的患者分别带有线粒体DNA突变和GJB3基因突变。其中GJB2基因突变热点为35delG、235delC、299-300delAT；SLC26A4基因突变热点IVS7-2A-G、2168A-G；mtDNA突变热点1555A-G、1494C-T。这一调查结果确定了GJB2、SLC26A4、线粒体基因是导致中国大部分遗传性耳聋发生的最常见的3个基因。此外GJB2基因109位点G-A突变、176-191位点缺失16个碱基，SLC26A4基因1174位点的A-T突变、1229位点的A-G突变、2027位点的T-A突变也有较高的突变频率。
目前，传统基因突变检测方法主要有PCR产物直接测序法、单链构象多态性分析(SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)、变性高效液相色谱(DDHPLC)、实时定量PCR法、扩增阻碍突变系统(ARM/S)法、基因芯片等。
PCR产物直接测序法被认为是检测基因突变的金标准，但其灵敏性较差。RFLP法是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成特定的DNA片段，反应DNA分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA序列上微小变化，能引起限制性内切酶的酶切位点丢失或产生，导致酶切产物长度变化，其结果可靠，重复性好，但是经常需要测序法确认，不能确定特殊突变。
高分辨率溶解曲线法(HRM)是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况。单核苷酸多态性(单个位点突变)位点不匹配会使双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度和时间曲线上判断是否存在SNP。
上述的方法或者检测能力有限、或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵。因此有必要创立一种高效、快捷、低成本的耳聋基因突变筛查方法，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。
发明内容
本发明的目的是针对目前中国人群耳聋基因突变的特点，选择9个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有基因突变筛查方法的不足，提供一种简单、快捷、高效、低成本的适合中国人群的耳聋基因突变筛查方法。
本发明的另一个目的是提供该方法所需的与耳聋基因野生型(含突变位点)互补杂交的肽核酸PNA序列、用于定性检测耳聋基因突变的引物以及构建和提取突变型及野生型耳聋基因质粒。
本发明技术方案的原理在于采用构建肽核酸PNA阻断PCR扩增法来检测样本，确定是否存在耳聋基因常见突变位点。将肽核酸PNA与实时定量PCR的结合应用于耳聋基因检测。由于肽核酸PNA能覆盖耳聋基因突变区域，而任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，因此只需设计一种针对野生型的肽核酸PNA，进行一次PCR反应，即可将耳聋基因突变型与野生型区分开。
实现本发明目的之技术方案如下：一种基于肽核酸PNA钳制PCR的耳聋突变基因的检测方法，包括以下步骤：
(1)设计一种与野生型耳聋基因(含突变位点)杂交的肽核酸PNA；
(2)构建和提取突变型及野生型耳聋基因质粒，计算拷贝数；
(3)采集待测个体的样本，提取基因组DNA或线粒体DNA；
(4)设计PCR扩增所需的一对上下游引物和Taqman探针；
(5)用上述肽核酸PNA对质粒标准品或待测样本按照改进的PCR反应条件进行检测，得出扩增曲线；
(6)根据所述扩增曲线对照检测定性基因突变。
所述耳聋突变基因的检测方法，利用耳聋基因9个突变热点为检测对象，设计与耳聋基因野生型(含突变位点)互补杂交的肽核酸PNA序列；针对每个位点的突变分别设计出肽核酸PNA和扩增引物，针对各个目的位点分别进行PCR扩增，通过扩增曲线分析，检测9个耳聋基因突变。
所述与野生型耳聋基因(含突变位点)杂交的肽核酸PNA；其肽核酸PNA能覆盖耳聋基因的突变区域，而任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，因此在PCR反应中可封闭野生型耳聋基因，阻止野生型耳聋基因扩增；构成肽核酸PNA阻断PCR扩增法来检测样本。
所述针对耳聋基因9个突变热点构建的肽核酸PNA序列，包括GJB2基因35delG突变的PNA序列为GJB2基因的20-45位点、GJB2基因235delC突变的PNA序列为GJB2基因的225-245位点、GJB2基因299-300delAT突变的PNA序列为GJB2基因的290-312位点，其碱基序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：10所示。
所述SLC26A4基因INS7-2A-G突变的PNA序列为SLC26A4基因22811-22835位点，SLC26A4基因2168A-G突变的PNA序列为SLC26A4基因49490-49511位点，其碱基序列分别如SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13～SEQ ID NO：14所示。
所述GJB3基因538C-T，547G-A突变位点接近，选用同一PNA序列；突变的PNA序列为GJB3基因4111-4130位点，其碱基序列如SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：16所示。
所述MtDNA基因1555A-G突变的PNA序列为MtDNA基因的1549-1570位点，MtDNA基因1494C-T突变的PNA序列MtDNA基因的1484-1511位点，其碱基序列分别如SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：20所示。
一种用于定性检测耳聋基因突变的引物，所述GJB2基因突变位点35delG、235delC、299-300delAT均采用第一对扩增引物，其碱基序列如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22所示。
所述SLC26A4基因突变位点INS7-2A-G采用第二对扩增引物，产物长度295bp，SLC26A4基因突变位点2168A-G采用第三对扩增引物，产物长度295bp，其碱基序列分别如SEQ ID NO：23～SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：26所示。
所述GJB3基因突变位点538C-T，547G-A，均采用第四对扩增引物，产物长度295bp；MtDNA基因突变位点1555A-G，1494C-T均采用第五对扩增引物，产物长度247bp；其碱基序列分别如SEQ ID NO：27～SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29～SEQ ID NO：30所示。
本发明的创造性在于设计一种与野生型耳聋基因(含突变位点)互补杂交的肽核酸PNA与PCR扩增所需的一对上下游引物和Taqman探针，按照Taq-PNA-PCR条件扩增构建的突变型及野生型耳聋基因质粒或待测样本，得出扩增曲线。由于肽核酸PNA与野生型耳聋基因结合后将阻断PCR扩增，不呈现扩增曲线；而PNA/DNA的错配将使融解温度发生明显改变，PNA脱离突变型耳聋基因，呈现扩增曲线，因而通过扩增曲线检测判断耳聋基因的突变型。
与现有技术比较，本发明的优点与显著效果如下：
1、克服了目前现有基因突变筛查方法的不足，提供一种简单、快捷、高效、低成本的适合中国人群的耳聋基因突变筛查方法。
2、通过检测来自患者的待测样本中是否存在耳聋基因常见突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型，进而为临床诊断尤其是新生儿先天性耳聋和治疗提供参考。
3、本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高，可实时检测耳聋基因突变量，并用于疾病的早期辅助诊断。
4、与传统的PCR相比检测时间缩短2个小时，且不做溶解曲线分析，更快、更简单。
附图说明
图1是本发明所述肽核酸PNA色谱图。
图2是本发明所述肽核酸PNA质谱图。
图3是本发明所述质粒标准品基因PCR扩增曲线图。
图4是本发明所述突变型与野生型质粒Taq-PNA-PCR扩增曲线图。
图5是本发明所说构建质粒获得的突变型耳聋基因质粒测序图。
图6是本发明所说构建质粒获得的质粒琼脂糖电泳图。
术语解释：
Taq-PNA-PCR：本发明命名简称，将Taqman探针和肽核酸PNA运用于改进的实时荧光PCR方法中检测基因突变的检测步骤。
PNA：肽核酸，一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，是丹麦有机化学家Ole Buchardt和生物化学家Peter Nielsen于20世纪80年代开始潜心研究的一种新的核酸序列特异性试剂。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。
具体实施方式
结合附图对本发明做进一步的具体说明。
一种基于肽核酸PNA钳制PCR的耳聋突变基因的检测方法，包括如下步骤：
(1)设计一种与野生型耳聋基因(含突变位点)杂交的肽核酸PNA；
(2)构建和提取突变型及野生型耳聋基因质粒，计算拷贝数；
(3)采集待测个体的样本，提取基因组DNA或线粒体DNA；
(4)设计PCR扩增所需的一对上下游引物和Taqman探针；
(5)用上述肽核酸PNA对质粒标准品或待测样本按照改进的PCR反应条件进行检测，得出扩增曲线；
(6)根据所述扩增曲线对照检测定性基因突变。
本发明利用NCBI基因库获得耳聋基因4个，其编号分别是GJB2Gene ID:2706；GJB3Gene ID:2707；SLC26A4Gene ID:5172；线粒体DNA Gene ID:4549。利用4个耳聋基因9个突变热点为检测对象设计出与耳聋基因野生型(含突变位点)互补杂交的肽核酸PNA序列，即设计出一段跟野生型互补的PNA序列。针对耳聋基因9个突变热点构建的肽核酸PNA序列，是正德奥生物科技有限公司合成。参见图1液相色谱图、图2质谱图；其产品报告显示，PNA名称19P，批量号：PD1210195，分子量M.W.4875.7，纯度：98％。设计出的PNA序列，包括GJB2基因35delG突变的PNA序列为GJB2基因的20-45位点、即35delG位点前15bp至后10bp，其碱基序列示例如序列表SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示；GJB2基因235delC突变的PNA序列为GJB2基因的225-245位点、即235delC位点前10bp至后10bp，其碱基序列示例如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：7所示；GJB2基因299-300delAT突变的PNA序列为GJB2基因的290-312位点即299-300delAT位点前10bp至后12bp，其碱基序列示例分别如SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：10所示。
所述SLC26A4基因INS7-2A-G突变的PNA序列为SLC26A4基因22811-22835位点，即INS7-2A-G位点前10bp至后15bp，其碱基序列示例如SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：12所示；SLC26A4基因2168A-G突变的PNA序列为SLC26A4基因49490-49511位点，即2168A-G位点前10bp至后13bp，其碱基序列示例如SEQ ID NO：13～SEQ ID NO：14所示。
所述GJB3基因538C-T，547G-A突变位点接近，选用同一PNA序列；突变的PNA序列为GJB3基因4111-4130位点，即538C-T突变位点前11bp至后10bp，其碱基序列示例如SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：16所示。
所述MtDNA基因1555A-G突变的PNA序列为MtDNA基因的1549-1570位点即1555A-G突变位点前7bp至后15bp，其碱基序列示例如SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：18所示；MtDNA基因1494C-T突变的PNA序列MtDNA基因的1484-1511位点即1494C-T突变位点前10bp至后16bp，其碱基序列示例如SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：20所示。
所述设计PCR扩增所需的一对上下游引物和Taqman探针，是针对耳聋基因突变位点附近的编码区，应用在线引物设计软件Primer5设计PCR扩增所需的一对上下游引物和检测所需的Taqman探针，用于PCR反应扩增；具体步骤如下：
一种用于定性检测耳聋基因突变的引物，所述GJB2基因突变位点35delG、235delC、299-300delAT均采用第一对扩增引物，产物长度479bp，其碱基序列如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22所示：
上游引物1Fl:5'–TTGGTGAGGTTGTGTAAGAG-3'(SEQID NO：21)；
下游引物Rl:5'-CTTGATGAACTTCCTCTTCTTC-3'(SEQID NO：22)；
所述SLC26A4基因突变位点INS7-2A-G采用第二对扩增引物，产物长度295bp，SLC26A4基因突变位点2168A-G采用第三对扩增引物，产物长度295bp，其碱基序列分别如SEQ ID NO：23～SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：26所示：
上游引物1Fl:5'–CTCACCATTGTCGTCTGT-3'(SEQID NO：23)；
下游引物R2:5'-CTAAGAGGAACACCACACT-3'(SEQ ID NO：24)；
上游引物1Fl:5'–TGAGCAATGATGCCACTG-3'(SEQ ID NO：25)；
下游引物R2:5'-ATGGAACCTTGACCCTCTT-3'(SEQ ID NO：26)；
所述GJB3基因突变位点538C-T，547G-A，均采用第四对扩增引物，产物长度295bp，MtDNA基因突变位点1555A-G，1494C-T均采用第五对扩增引物，产物长度247bp，其碱基序列分别如SEQ ID NO：27～SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29～SEQ ID NO：30所示：
上游引物1Fl:5'–AA CGCAGGCAAG AAGCACGGAG-3'(SEQ ID NO：27)；
下游引物R2:5'-TTGTTATTGCCTGGGTCTGG-3'(SEQ ID NO：28)；
上游引物1Fl:5'–CGTTAGGTCAAGGTGTAGC-3'(SEQ ID NO：29)；
上游引物1Fl:5'–ATGTTACGACTTGTCTCCTC-3'(SEQ ID NO：30)；
上述PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
一种用于定性检测耳聋基因突变的Taqman探针，所述探针用于检测耳聋基因靶序列的扩增。
所述GJB2基因突变位点35delG、235delC、299-300delAT均可采用同一taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：31所示：
序列为：FAM-CATGTCTCCGGTAGGCCACGTGCATGGCCAC-MGB。(SEQ ID NO：31)；
所述SLC26A4基因突变位点INS7-2A-G可采用一个Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：32所示：
序列为：FAM-ACCCCCTTGGGATGGATTTAACAATGCCAGC-MGB。(SEQ ID NO：32)；
所述SLC26A4基因突变位点2168A-G可采用一个Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：33所示：
序列为：FAM-CTTGGTTCTGTAGATAGAGATTAGCATGATGGACCG-MGB。(SEQ ID NO：33)；
所述GJB3基因突变位点538C-T，547G-A，均可采用一个Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：34所示：
序列为：FAM-CCTGTGGTGGACCTACCTGTTCAGCCCTCA-MGB。(SEQ ID NO：34)；
所述MtDNA基因突变位点1555A-G，1494C-T均可采用一个Taqman探针，其碱基序列示如SEQ ID NO：35所示：
序列为：FAM-CCATGAGGTGGCAAGAAATGGGCTACA-MGB。(SEQ ID NO：35)。
上述taqman探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。由于采用PCR-MGB法进行检测，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。
针对每个位点的突变分别设计出肽核酸PNA和扩增引物，针对各个目的位点分别进行PCR扩增，通过扩增曲线分析，检测9个耳聋基因突变。所述与野生型耳聋基因(含突变位点)杂交的肽核酸PNA；其肽核酸PNA能覆盖耳聋基因的突变区域，而任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，因此在PCR反应中可封闭野生型耳聋基因，阻止野生型耳聋基因扩增；构成肽核酸PNA阻断PCR扩增法来检测样本。
所述构建和提取突变型及野生型耳聋基因质粒，计算拷贝数；包括利用PCR方法克隆构建含突变型和野生型检测靶序列的质粒标准品。具体步骤如下：
(1)IPCR反应液配制
PCR反应体系包括10XTaq缓冲液2μl，dNTP混合液200μM，引物选用(SEQ ID NO：21)～(SEQ ID NO:30)中的一对上下游引物各0.5μM，Taq酶1.25u，DNA模板100ng突变和野生型基因，并用无菌双蒸水定容至20μl。设定纯水为阴性对照(NTC)；
(2)PCR反应
所用仪器为德国Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR仪。PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸I0min；
(3)电泳；
(4)2.0％琼脂糖凝胶电泳确定产物正确性，参见图6质粒琼脂糖电泳图；图6显示是琼脂糖电泳鉴定质粒与基因连接产物，其中1、突变型基因PCR产物，2、Marker，3、质粒与突变型基因连接产物，4、质粒；
(5)PCR产物克隆入质粒；
(6)菌株构建；
将PCR产物纯化后，通过T载体连接，构建出携带突变和野生检测靶序列的质粒，此质粒在E.coli DH5α(说明：该大肠杆菌由本实验室培养所得)进行大量扩增，并抽提纯化获得，测序正确后作为标准品；
按以下组成配制T载体连接液：包括灭菌蒸馏水2μl、2x6接缓冲液5μl、ΡTA2载体50ng/μl)1μl、T4DNA连接酶1μl、PCR产物1μl，共10μl。将反应液于室温15～25℃进行30分钟反应；
(7)制备感受态细胞，并加入上述连接液，用氯化钙方法转化大肠杆菌，并进行X-gal和IPTG筛选。具体方法按照见《分子克隆实验指南》第三版上册第96-99、103页步骤操作；
(8)质粒提取；
挑取筛选所得的白色菌落，加入5ml预先加入氨苄青霉素100mg/ml的LB培养基中，37℃振摇12～16小时。用Tiangen普通质粒小提试剂盒离心柱型提取质粒；
(9)质粒测序；
质粒测序由invitrogen公司承接，测序结果正确，参见图5。TA克隆试剂盒(Target Clone)购买于TOTOBO公司。质粒抽提试剂盒购买于TIANGEN公司。图5是突变型耳聋基因质粒测序图，是PTA2载体连接突变型基因后测序，结果显示突变型基因单点C-T突变。
所述采集待测个体的样本，提取基因组DNA或线粒体DNA。
基因组DNA的提取具体步骤如下：
提取正常血清及耳聋病人血清中的基因组DNA:采用生工Ezup柱式基因组抽提试剂盒(血液)进行抽提。
血液DNA抽提方法：1、在1.5ml离心管中加入0.05-0.1ml抗凝血液；2、加入0.1-0.15mlPBS Solution使总体积为0.2ml；3、加入0.02mlProteinaseK，混匀；4、再加入0.2mlBufferCL，振荡混匀，56℃水浴10min；5、加入0.2ml无水乙醇，充分颠倒混匀；6、将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，10000rpm室温离心1min，弃穿透液；7、把吸附柱放回收集管，向吸附柱加入0.5mlCW1Solution，10000rpm室温离心30s，弃穿透液；8、把吸附柱放回收集管，向吸附柱加入0.5mlCW2Solution，10000rpm室温离心30s，弃穿透液；9、把吸附柱重新放回收集管中，12000rpm室温离心1min，去除残余的CW2Solution；10、将吸附柱套入一个新的1.5ml离心管中，在吸附柱的滤膜中部加入0.05mlCEbuffer，然后室温放置3min；11、12000rpm室温离心2min，管底溶液即使DNA溶液，可即行使用或分装于-20℃保存。
线粒体DNA基因的提取具体步骤如下：
(1)提取耳聋病人线粒体DNA，采用GENMED线粒体基因抽提试剂盒(血液)进行抽提。
(2)白细胞分离
室温预热GENMED血溶液(ReagentA)，同时4℃预冷GENMED清理液(ReagentB)。分别移取5ml混匀的EDTA抗凝全血样品至2个50ml离心管，各加入25ml ReagentA，轻轻上下倾倒离心管5次，确保充分混匀，室温下孵育4min，离心5min，速度300g，去除上清液，余留0.5ml液体，以防抽掉白细胞颗粒群，用手指轻弹离心管2-3次，使白细胞颗粒群松动，分别加入15ml ReagentB，混匀细胞后合为1管，离心5min，速度300g，去除上清液，重复加入10ml预冷的ReagentB，混匀细胞，离心10min，速度300g，小心抽去上清液，确保没有液体残留。
(3)白细胞线粒体分离
取5ml ReagentD和5ml ReagentC至15ml锥形离心管，混匀，标记为GENMED裂解工作液，放置备用。在白细胞沉淀中加入GENMED裂解工作液，涡旋震荡5s，冰浴2min，加入预冷2.5ml GENMED强化液(ReagentE)，涡旋振荡5s，充分混匀，冰浴5min，加入预冷的5mlGENMED保存液(ReagentF)，离心10min，速度10000g，去除上清液，保留沉淀颗粒。
(4)DNA提取
加入2.5mlGENMED破膜液(ReagentG)到线粒体颗粒样品中，涡旋振荡15s后转入1.5ml离心管，冰浴15min，加入0.05mlGENMED酵解液(ReagentH)，涡旋振荡15s，离心5s，速度400g，放入58℃恒温水槽孵育2h，置于室温冷却15min，加入2.5mlGENMED萃取液(ReagentI)，涡旋振荡15s，离心5min。速度16000g，取上清至新1.5ml离心管，加入0.5ml浓缩液(ReagentJ)，加入5ml沉淀液(ReagentK)，振荡15s，充分混匀，离心15min，速度16000g，去除上清液，加入5ml纯化液(ReagentL)，离心5min，速度16000g，空气中晾干沉淀颗粒群，加入5ml缓冲液(ReagentM)，溶解后放进-20℃长期保持或者进行PCR反应。
所述用上述肽核酸PNA对质粒标准品或待测样本按照改进的PCR反应条件进行Taq-PNA-PCR检测，得出扩增曲线；具体步骤如下：
(1)Taq-PNA-PCR反应
在实时定量反应中以Taqman探针进行荧光标记，特异性的结合扩增序列，实时反应扩增动态。实验中PNA能将野生型基因的扩增进行抑制，因此仪器所检测的荧光量可反应突变基因的拷贝量。
(2)反应体系及反应条件
突变型耳聋基因检测反应体系包括：PCR反应体系包括10×Taq缓冲液2μl，dNTP混合液200μM，引物(SEQ ID NO：21)～(SEQ ID NO:30)中其中一对各0.5μM，Taq酶1.25u，PNA为(SEQ ID NO：1～20)中相对应突变点的1条0.25μM，Taqman探针选用与引物相对应的一条(SEQ ID NO：31)，～(SEQ ID NO:35)0.2μM，DNA模板为突变型样品和野生型质粒标准品，并用无菌双蒸水定容至20μI。设定纯水为阴性对照(NTC)。
所用仪器为德国Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR仪。所述PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，70℃PNA结合1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸I0min。比已知的PCR过程改进了进一步的PNA的温度循环。
(3)扩增曲线绘制
根据上述步骤检测的结果绘制出的耳聋基因Taq-PNA-PCR扩增曲线。参见图3。
图3为耳聋基因Taq-PNA-PCR扩增曲线，在该图中，上升的曲线自左向右依次分别代表不同拷贝数的突变型和野生型耳聋基因质粒标准品。图3中，横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。
所述根据所述扩增曲线对照定性基因突变，即选用同一系列稀释比例的野生型和突变型质粒标准品，两组都加入PNA(0.25μM)，在同一条件下进Taq-PNA-PCR反应，反应结束后，根据耳聋基因扩增曲线，对耳聋基因扩增进行突变位点分析。其中，在反应体系中突变型质粒标准品存在扩增曲线，而野生型质粒标准品无扩增曲线，则表明耳聋基因有相关位点突变，以此检测定性耳聋基因突变。
PNA钳制PCR实时定量检测耳聋基因突变的应用步骤实施例：
(1)标准品配制；
(2)选取耳聋基因突变型质粒和野生型质粒为标准品模板；
(3)模板拷贝数换算：拷贝数＝质量/分子量×6.02×1023；
(4)分子量计算：MW＝(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)-61；粗略计算一个单链DNA分子的分子量＝(碱基数bp)×(325道尔顿/碱基)或是使用软件DNAMAN计算；
(5)本实验合成的质粒为3215bp，WM≈1044.88Kda，因此1pg基因拷贝数约为5.76×108；
1OD260相当于33ug的寡核苷酸。
(6)将突变型模板和野生型DNA模板倍比稀释为108、107、106、105、104、103、102、101、100拷贝，作为质粒标准品模板；
图4为耳聋基因扩增曲线，不含PNA的扩增，是个阴性对照，在该图中，上升的四条曲线自左向右依次分别代表稀释倍比为106、105、104、103、102、101、100拷贝的突变型和野生型质粒标准品模板。图1中，横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。
(7)选用同一系列稀释比例的野生型和突变型质粒标准品，两组都加入PNA(0.25μM)，在同一条件下进行Taq-PNA-PCR反应，反应结束后，根据耳聋基因扩增曲线，对耳聋基因扩增进行突变位点分析。
本发明将PNA及实时定量PCR的结合形成Taq-PNA-PCR反应，应用于耳聋基因检测。耳聋基因可以是从血液、组织、线粒体中提取的基因。由于本发明的PNA能覆盖耳聋基因突变区域，而任一突变均可导致PNA/DNA的错配，我们设计一个碱基的差异，PNA的温度会差异很多，使得融解温度发生明显改变，这样会完全阻断Taq-PNA-PCR反应过程。因此只需设计一种针对野生型的PNA，进行一次PCR反应，即可将耳聋基因突变型与野生型区分开。从而实现本发明的目的。
PNA基因序列表
<110>四川佳沐生物科技有限公司
<120>一种基于肽核酸PNA钳制PCR的耳聋突变基因的检测方法
<130>
<160>1
<210>
<211>
<212>PNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>
GJB2
(1)35delG：PNA序列为20-45位点，
H2N-TTTGTTGACACCCCCCAGGA-CON2H(SEQ ID NO：1)；
H2N-TGTTGACACCCCCCAGGA-CON2H(SEQ ID NO：2)；
H2N-TGTTGACACCCCCCAGGATC-CON2H(SEQ ID NO：3)；
H2N-TTGACACCCCCCAGGATC-CON2H(SEQ ID NO：4)；
(2)235delC:PNA序列为225-245位点，
H2N-AGCTGCAGGGCCCATA-CON2H(SEQ ID NO：5)；
H2N-CAGCTGCAGGGCCCATA-CON2H(SEQ ID NO：6)；
H2N-AGCTGCAGGGCCCATAG-CON2H(SEQ ID NO：7)；
(3)299-300delAT:PNA序列为290-312位点，
H2N-TCTTCTTCTCATGTCTCCGG-CON2H(SEQ ID NO：8)；
H2N-CTTCTCATGTCTCCGGTA-CON2H(SEQ ID NO：9)；
H2N-CTTCTTCTCATGTCTCC-CON2H(SEQ ID NO：10)；
SLC26A4:
(1)INS7-2A-G：PNA序列为SLC26A4基因22811-22835位点，
H2N-GTAGCAATTATCGTCTGAAATAAGT-CON2H(SEQ ID NO：11)；
H2N-GCAATTATCGTCTGAAATAAGTA-CON2H(SEQ ID NO：12)；
(2)2168A-G:PNA序列为SLC26A4基因49490-49511位点
H2N-GTATTAGCATCATGGACCGTC-CON2H(SEQ ID NO：13)；
H2N-AGCATCATGGACCGTC-CON2H(SEQ ID NO：14)；
GJB3:
538C-T,547G-A,PNA序列为GJB3基因4111-4130位点，
H2N-TTCTCGGTAGGTGGGCAA-CON2H(SEQ ID NO：15)；
H2N-CTCGGTAGGTGGGCAAT-CON2H(SEQ ID NO：16)；
MtDNA：
(1)1555A-G：PNA序列为MtDNA基因1555A-G位点1549-1570，
H2N-CCTGTTACGACTTGTCTCCTC-CON2H(SEQ ID NO：17)；
H2N-CTGTTACGACTTGTCTCCTCT-CON2H(SEQ ID NO：18)；
(2)1494C-T：PNA序列为MtDNA基因1494C-T位点1484-1511，
H2N-GTATACTTGAGGAGGGTGACG-CON2H(SEQ ID NO：19)；
H2N-TACTTGAGGAGGGTGACG-CON2H(SEQ ID NO：20)。

Claims (1)

1.一种基于肽核酸PNA钳制PCR的检测耳聋突变基因的组合物，其特征在于，其包括针对耳聋基因GJB2基因突变位点35delG、235delC、299-300delAT，SLC26A4基因突变位点INS7-2A-G、2168A-G，GJB3基因突变位点538C-T，547G-A，MtDNA基因突变位点1555A-G、1494C-T共9个突变位点构建的肽核酸PNA序列、及其扩增引物和探针，所述针对GJB2基因35delG、235delC、299-300delAT突变位点的PNA序列分别为SEQ ID NO：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：10所示序列，同时其针对GJB2基因35delG、235delC、299-300delAT突变位点的上下游引物以及taqman探针分别为SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：31所示序列；针对SLC26A4基因INS7-2A-G、2168A-G突变位点的PNA序列分别为，SEQ ID NO：11～SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13～SEQ ID NO：14所示序列，针对SLC26A4基因INS7-2A-G突变位点的上下游引物以及taqman探针分别为SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：32所示序列，针对SLC26A4基因突变位点2168A-G的上下游引物以及taqman探针分别为SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：33所示序列；针对GJB3基因突变位点538C-T，547G-A的同一PNA序列为SEQ ID NO：15-16所示序列，同时针对其GJB3基因突变位点538C-T，547G-A的上下游引物以及taqman探针分别为，SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：34所示序列；针对MtDNA基因1555A-G突变、1494C-T突变的PNA序列分别为SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：20所示序列，同时针对其MtDNA基因1555A-G突变、1494C-T突变的上下游引物以及taqman探针分别为SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：35所示序列。
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CN109072301A (zh) * 2016-02-17 2018-12-21 新加坡科技研究局 Mtrnr1基因突变的测定
CN105861691A (zh) * 2016-05-06 2016-08-17 北京晋祺生物科技有限公司 一种braf基因突变检测的引物组合物、试剂盒及方法
CN105861687A (zh) * 2016-05-06 2016-08-17 北京晋祺生物科技有限公司 一种线粒体药物性耳聋的检测引物组合物、试剂盒及方法
CN107760768A (zh) * 2017-11-09 2018-03-06 上海赛安生物医药科技股份有限公司 Braf基因突变检测体系及其试剂盒
CN108929902B (zh) * 2018-07-28 2022-03-25 北京博奥晶典生物技术有限公司 用于检测等位基因hla-b*5801的肽核酸引物组合物、试剂盒及方法
CN110878307B (zh) * 2018-09-06 2021-10-08 中国人民解放军总医院 基因突变体及其应用

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CN102864232B (zh) * 2012-09-26 2014-03-26 潮州凯普生物化学有限公司 耳聋易感基因联合检测试剂盒
CN103276065A (zh) * 2013-05-15 2013-09-04 向华 用于检测与遗传性耳聋相关的基因snp的引物系统及其用途

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