CN102827932B

CN102827932B - 一种人类粒细胞抗原（hna）1-5系统基因分型的pcr-sbt方法及试剂

Info

Publication number: CN102827932B
Application number: CN201210297522.3A
Authority: CN
Inventors: 朱发明; 何俊俊; 何吉; 吕杭军
Original assignee: ZHEJIANG BLOOD CENTER
Current assignee: ZHEJIANG BLOOD CENTER
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: CN102827932A

Abstract

本发明提供一种HNA1-5系统抗原分型的PCR-SBT方法，它包括以下步骤：制备人基因组DNA；提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系统的基因序列；将扩增产物进行双酶切纯化；提供测序引物，将纯化产物进行测序PCR反应；将测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；将获得的序列通过软件分析，确定其基因型。本发明还提供上述方法所用的试剂。本发明通过对HNA抗原5个系统分别进行序列测序，获得HNA抗原基因分型的寡核苷酸序列，精确地对其基因进行定型。本发明对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

Description

一种人类粒细胞抗原(HNA)1-5系统基因分型的PCR-SBT方法及试剂

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于人类粒细胞抗原（HumanNeutrophil Alloantigens，缩写为HNA）1-5系统抗原基因分型的分子生物学检测方法，本发明还涉及该方法所应用的试剂。

背景技术

人类白细胞膜上具有一系列的血型抗原，包括粒细胞特异性抗原和人类白细胞抗原，这些抗原在不同人群中表现出高度的多态性，输注后由于个体抗原的差异可以刺激不同的机体产生免疫反应，从而引发某些输血不良反应，导致输注无效或引起某些严重的疾病，因此研究粒细胞特异性抗原具有重要的临床意义。目前国际输血协会的粒细胞抗原工作组制订了人类粒细胞特异性抗原（Human Neutrophil Alloantigens）的命名原则，粒细胞特异性抗原系统被称“HNA”。命名原则中作为抗原糖蛋白的定位用阿拉伯数字表示，如HNA-1定位于FcγReceptor Ⅲb；同一糖蛋白不同的多态性则根据发现先后顺序用小写英文字母表示（如HNA-1a，HNA-1b、HNA-1c等）。目前研究发现的粒细胞特异性抗原系统（HNA）有7个抗原，归属于5个人类粒细胞抗原系统。

个体粒细胞特异性抗原的差异可以导致输血后产生粒细胞抗体，目前证实粒细胞抗原、抗体在多种临床疾病中起重要的作用，包括新生儿同种免疫性粒细胞减少症、自身免疫性粒细胞减少症、发热性非溶血性输血反应、输血相关性急性肺损伤（TRALI）、骨髓移植后同种免疫性粒细胞减少症、输血相关性同种免疫性粒细胞减少症、药物诱导的粒细胞减少症和粒细胞输注无效等。其中粒细胞抗体与TRALI的关系近年来受到血液领域的高度关注，国外研究发现粒细胞特异性抗体与TRALI的发生密切相关，大多数发生TRALI的病例均能检测到粒细胞特异性抗体，而且存在抗原系统的差异性。TRALI是临床输血并发的急性呼吸窘迫综合症，是一种严重的输血不良反应，患者可发生急性呼吸困难、低氧血症、非心源性肺水肿、低血压和发烧，其死亡率较高，是输血反应并发死亡的主要原因，目前已成为输血反应引起死亡的第二位原因。现有关粒细胞特异性抗原系统与TRALI的关系以及TRALI的预防已成为输血领域的研究热点之一，近年国外部分国家已开展在献血人群中系统检测粒细胞特异性抗原系统的研究，以期预防和减少TRALI的发生。

目前粒细胞特异性鉴定方法主要有血清学方法和基因分型方法。血清学鉴定粒细胞抗原或抗体方法主要有粒细胞凝集试验、粒细胞免疫荧光试验（GIFT）、单克隆抗体特异性粒细胞抗原捕获试验(Monoclonal Antibody Immobilization of Granulocyte Antigen，MAIGA)、流式细胞术和ELISA等方法。粒细胞抗原系统的基因分型方法主要有PCR-RFLP、PCR-SSP、PCR-SSO等。Bux等的实验表明，基因分型法与MAIGA方法对HNA的分型具有同样的可靠性，而GIFT有15%的分型失误率。

目前的HNA抗原基因分型最主要的方法是PCR-SSP（PCR-序列特异性引物），该方法需要进行多管扩增，并且PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的HNA抗原进行基因分型，对于一些特殊的新突变位点则难以明确。而HNA的PCR-SBT（PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术）分型方法可以克服上述缺陷和局限性，为最准确的分型的方法。但现阶段的HNA抗原基因PCR-SBT分型方法还不够完善，虽然也有实验室采用PCR-SBT的方法对HNA个别抗原进行基因分型，但至今未对HNA五个系统进行系统分型。因此，建立HNA1-5系统的PCR-SBT分型方法具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于HNA1-5系统抗原分型的PCR-SBT方法，以克服现有基因分型技术中的上述缺陷。为此，本发明采用以下技术方案：

它对五个HNA抗原系统的基因进行分型，包括以下步骤：

（1）制备人基因组DNA；

（2）提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系统的基因序列；

（3）将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；

（4）提供测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；

（5）将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；

（6）将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。

所述步骤（3）中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。

本发明另一个所要解决的技术问题是提供上述方法所用的试剂。为此，本发明采用以下技术方案：它由用于扩增的引物和用于测序分析的寡核苷酸测序引物组成；

所述用于扩增的引物为：

（1）HNA-1抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-1F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT GGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3’

HNA-1R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC TGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3’

（2）HNA-2抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-2F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT CTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT-3’

HNA-2R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC TAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3’

（3）HNA-3抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-3F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT CTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3’

HNA-3R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC CATGCCCATCCTCATAGGTC-3’

（4）HNA-4抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-4F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT GTTCCCACTTCTCCCCACA-3’

HNA-4R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC GGACAGATATGGGCATGGTC-3’

（5）HNA-5抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-5F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGATATTCCCCACCCTGA-3’

HNA-5R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC ACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3’

所述2条寡核苷酸测序引物序列如下：

M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’

M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’。

本发明中引物设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据GenBank中人类HNA抗原基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而设计获得的。HNA-1抗原系统的基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000001.10(161592986..161601158)的序列设计；HNA-2抗原系统的基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000019.9(43857825-43867480)的序列设计；HNA-3抗原系统的基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000019.9(10713121..10755235)的序列设计；HNA-4抗原系统的基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000016.9(31271288..31344213)的序列设计；HNA-5抗原系统的基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000016.9(30483983..30534506)的序列设计。所有正向扩增引物5’端连接有M13载体正向序列上的18个碱基序列TGTAAAACGACGGCCAGT，所有反向扩增引物5’端连接有M13载体反向序列上的18个碱基序列CAGGAAACAGCTATGACC，通过连接后所有正向扩增引物、反向扩增引物分别具有共同的接头序列，然后选择这些接头序列作为测序引物。

本发明以5对寡核苷酸引物分别扩增HNA系统的5个基因片段(分别为：HNA-1抗原系统扩增GenBank编号为NC_000001.10(161592986..161601158)序列中1197-1668位的片段，HNA-2抗原系统扩增GenBank编号为NC_000019.9(43857825-43867480)序列中的1-457位的片段，HNA-3抗原系统扩增GenBank编号为NC_000019.9(10713121..10755235)序列中的28745-29265位的片段，HNA-4抗原系统扩增GenBank编号为NC_000016.9(31271288..31344213)序列中的5409-5838位的片段，HNA-5抗原系统扩增GenBank编号为NC_000016.9(30483983..30534506)序列中的33996-34321位的片段)，可保证五个抗原系统基因的有效扩增。扩增引物的设计避开了HNA抗原编码序列的多态性位点，避免了任何突变点的漏检。测序引物的设计能保证清晰准确测得所扩增片段的序列，通过对这些序列进行双向测序，从而将样本进行精确的基因定型。

本发明通过对HNA抗原5个系统分别进行序列测序，获得HNA抗原基因分型的寡核苷酸序列，精确地对其基因进行定型。随着DNA序列分析仪的普及，PCR-SBT技术广泛应用于临床检测。高通量获得的所有HNA抗原系统的编码序列信息在基因定型、基因多态性检测、基因频率调查分析等方面的应用将受到广泛重视。

本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了HNA抗原5个系统准确定型的问题，发挥PCR-SBT对HNA基因定型操作高通量，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。特别是明确献血人群粒细胞抗原系统分布情况，避免输注含有粒细胞抗体的血液，以预防粒细胞抗体产生的输血不良反应，将有效预防TRALI发生，从而提高血液的安全性。

附图说明

图1为本发明中检测标本的HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原基因PCR扩增电泳图谱。1为HNA-1系统扩增片段，2为HNA-2系统扩增片段，3为HNA-3系统扩增片段，4为HNA-4系统扩增片段，5为HNA-5系统扩增片段。

图2为本发明检测3个样本HNA-1系统的部分测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。141、147和227表示多态性碱基位置。检测到HNA-1抗原系统三个基因型，其中第141、147和227位为多态性碱基位置，分别以标本1（图的上部）HNA-1a+b-c-，标本2（图的中部）HNA-1a+b+c-，标本3（图的下部）HNA-1a-b+c-为例。

图3为本发明检测3个样本HNA-2系统的部分测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。49表示多态性碱基位置。检测到HNA-2抗原系统三个基因型，其中第49位为多态性碱基位置，分别以标本1（图的上部）为HNA-2a+b-，标本2（图的中部）HNA-2a+b+，标本3（图的下部）HNA-2a-b+为例。

图4为本发明检测3个样本HNA-3系统的部分测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。306表示多态性碱基位置。检测到HNA-3抗原系统三个基因型，其中第306位为多态性碱基位置，分别以标本1（图的上部）HNA-3a+b-，标本2（图的中部）HNA-3a+b+，标本3（图的下部）HNA-3a-b+为例。

图5为本发明检测1个样本HNA-4系统的部分测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。检测到HNA-4抗原系统一个基因型，其中第141位为多态性碱基位置。以标本HNA-4a+b-为例。

图6为本发明检测3个样本HNA-5系统的部分测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。2466表示多态性碱基位置。检测到HNA-5抗原系统三个基因型，其中第2466位为多态性碱基位置，分别以标本1（图的上部）HNA-5a+b-，标本2（图的中部）HNA-5a+b+，标本3（图的下部）HNA-5a-b+为例。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明内容作进一步详细说明。

实施例1：

本实施具体以献血者进行HNA1-5系统抗原基因分型为例对本发明内容做详细说明，本发明所采用的一种HNA 1-5系统抗原基因分型的PCR-SBT方法具体包括以下步骤：

1、制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。

取待检全血200μl，按照QuickGene DNAwhole blood kit S试剂盒说明书提取基因组DNA，利用分光光度计测定基因组浓度和纯度。

2、合成5对扩增引物和2条测序引物，具体序列见前述发明内容中的序列，不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至50μM；

准备La-Taq酶（Lot：CK4501，TaKaRa）、10×缓冲液（Lot：CK4501，TaKaRa）、Mg²⁺（Lot：AA2601A，TaKaRa）、dNTP（Lot：CBG4301A，TaKaRa）、纯水，与步骤1所制备的PCR扩增模板，按表1所述体系配制PCR扩增体系：

表1：步骤2中HNA 5个系统的PCR扩增体系

HNA 5个系统PCR扩增体系	体积（μl）
		10×PCR缓冲液	2.0
dNTP（2.5mM）	1.6
		Mg²⁺（25mM）	1.6
引物1	0.16
		引物2	0.16
La-Taq酶（5U/μl）	0.16
		H₂O	12.32
DNA模板(100ng/μl)	2.0
		总体系	20μl

上表中，引物1：HNA-1～5各引物对中的正向引物，引物2：HNA-1～5各引物对中的反向引物。

用PCR仪（ABI9700）按以下程序扩增：

95℃预变性5min，DNA双链充分解开；95℃变性30s，63℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸45s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；

3、扩增产物的双酶切纯化。检测样本所扩增片段，各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶（SAP，1U/μl，Lot：M820A，Promega）和核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ，5U/μl，Lot：CK11011B，TaKaRa），利用虾碱性磷酸酶（SAP）的核苷酸5′端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ）的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在25μl扩增产物体系中加入SAP 2μl和Exo-Ⅰ1μl，37℃30min酶切反应，80℃15min酶失活。

4、对PCR产物进行测序PCR。将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入20μl纯水稀释，混匀。将发明内容中所述的两条测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDye terminator v3.1sequencing kit（美国ABI公司）试剂按照表2配制反应体系：

表2：步骤4中PCR产物的PCR测序体系

5×缓冲液	1.5
		BigDye mix	1.0
测序引物1	1.0
		DNA	2.0
H₂O	4.5
		总体积	10.0
5×缓冲液	1.5

其中测序引物1为M13F和M13R中任意一条。

所测样本以扩增纯化的片段1:1稀释后作为模板，分别进行2个反应，用PCR仪（ABI9700）按以下程序扩增：预变性96℃1min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。

5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤4中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1μl EDTA（1.25μM）和25μl醋酸钠（3M）/无水乙醇（1：40）混合液，混匀，3000g离心30min；去除上清，加入50μl 75%乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。

6、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，确定HNA抗原系统的基因型，结果显示了检测样本HNA-1（图1），HNA-2（图2），HNA-3（图3），HNA-4（图4），HNA-5（图5）的部分序列。

其中图1为本发明中检测标本的HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原基因PCR扩增电泳图谱。1为HNA-1系统扩增片段，2为HNA-2系统扩增片段，3为HNA-3系统扩增片段，4为HNA-4系统扩增片段，5为HNA-5系统扩增片段。

所以，本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了HNA基因的准确分型鉴定问题，发挥PCR-SBT对HNA基因分型结果精确、高通量操作的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的意义。特别是明确献血人群粒细胞抗原系统分布情况，避免输注含有粒细胞抗体的血液，以预防粒细胞抗体产生的输血不良反应，将有效预防TRALI发生，从而提高血液的安全性。

<110> 浙江省血液中心

<120> 一种人类粒细胞抗原（HNA）1-5系统基因分型的PCR-SBT方法及试剂

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtaaaacga cggccagtgg gccaagatgc tctaagac 38

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<213> 人工序列

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caggaaacag ctatgacctg gctcttacca agtatttcag g 41

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<213> 人工序列

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tgtaaaacga cggccagtct gstgaaaaag cagaaagaga t 41

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caggaaacag ctatgaccta ggctgagagg ctggaaag 38

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tgtaaaacga cggccagtct tttccccctg tgaatgtg 38

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caggaaacag ctatgaccca tgcccatcct cataggtc 38

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tgtaaaacga cggccagtgt tcccacttct ccccaca 37

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caggaaacag ctatgaccgg acagatatgg gcatggtc 38

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tgtaaaacga cggccagttc tgatattccc caccctga 38

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tgtaaaacga cggccagt 18

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caggaaacag ctatgacc 18

Claims

1.一种人类粒细胞抗原（HNA）1-5系统基因分型的PCR-SBT方法所用的试剂，其特征在于它由用于扩增的引物和用于测序分析的寡核苷酸测序引物组成；

所述用于扩增的引物为：

（1）HNA-1抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-1F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3’

HNA-1R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCTGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3’

（2）HNA-2抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-2F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT-3’

HNA-2R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCTAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3’

（3）HNA-3抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-3F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3’

HNA-3R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCCATGCCCATCCTCATAGGTC-3’

（4）HNA-4抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-4F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCACTTCTCCCCACA-3’

HNA-4R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGGACAGATATGGGCATGGTC-3’

（5）HNA-5抗原系统的基因序列的扩增引物，

HNA-5F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGATATTCCCCACCCTGA-3’

HNA-5R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3’

所述2条寡核苷酸测序引物序列如下：

M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’

M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’。