CN101921834B - 一种abo血型基因分型的pcr-sbt方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于ABO血型分型的PCR-SBT方法，它包括下述步骤：制备人基因组DNA；扩增ABO基因外显子1、外显子2-4、外显子5-7的片段；得到扩增产物进行双酶切纯化；将纯化产物进行测序PCR反应；将测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；将获得的序列通过软件分析，确定其基因型。本发明解决了ABO亚型的鉴定、疑难血型的判定、新突变位点的发现、基因之间的重组现象、基因多态性检测等问题，发挥PCR-SBT对ABO基因定型操作高通量，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于ABO血型基因分型的分子生物学检测方法，本发明还涉及该方法所应用的试剂。
背景技术
人类ABO基因位于9号染色体(9q34.1～34.2)，由A、B和O三个复等位基因控制，包含长度大小从28～688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，总长大约为18～20kb。其基因编码产物是糖基转移酶，多数编码序列(1062bp中823bp)位于第6和第7外显子上，负责编码糖基转移酶的催化区域。这些转移酶控制ABO血型抗原的生物合成，从而决定其血型。ABO血型的其它等位基因DNA序列高度保守，与A101的DNA序列紧密相关，仅有几个碱基替换或单个碱基缺失。对汉族人群中ABO血型进行频率调查发现，主要为A102、B101、O01、O02这几种等位基因。A102等位基因与A101等位基因相比只是在467位的单个碱基替换(C/T，Pro/Leu)，两者翻译的糖基转移酶活力没有显著性差异。B101基因仅在297、526、657、703、796、803、930和1096位碱基8个位置与A101有改变，导致糖基转移酶多肽链上有4个氨基酸替代：C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A(Leu/Met)、G803C(Gly/Ala)。O01等位基因与A101的差异是第261位核苷酸G缺失，引起了阅读框移动，在351至354位置产生终止密码子，肽链合成在117位氨基酸终止，产生一条无催化能力的短肽链。除此之外，人群中还存在大量的亚型和罕见基因型，通常也是由于单个核苷酸变异形成的。
现有技术中，人类ABO血型检测方法主要有两种：一是经典的血清学方法，二是基因分型方法。血清学方法具有简单实用等特点，但也存在一定的局限性，首先需要新鲜红细胞样品，对样本要求较高；其次方法检测的范围较窄，只能对ABO血型中的常见血型进行定型，对于一些亚型标本以及罕见样本，在血型检测时易出现正反定型不符，难以定型或定型错误的现象，且不能确定其具体基因型。基因分型的方法在某种程度上弥补了经典血清学方法在这方面的不足。
目前的ABO血型基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR-序列特异性引物)，但该方法需要进行多管扩增，需有进一步改进的基因扫描技术可进行单一管扩增。并且PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的ABO血型进行基因分型，对于一些特殊的亚型或存在的新突变位点则难以明确。而ABO血型PCR-SBT(PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术)分型方法可以克服前两者的上述缺陷和局限性。但现阶段的ABO血型PCR-SBT分型方法主要针对多态性位点比较集中的6、7号外显子的测定来确定其基因型，而对第1-5号外显子不进行测序，尤其是含有起始密码子的1号外显子，其GC含量比较高，PCR扩增较难获得，这种操作方法存在两个缺陷：第一，由于6、7号外显子单核苷酸多态性非常集中，而各个ABO血型之间的差异可能仅有单个或几个核苷酸的变异所引起，容易造成SNP位点(单核苷酸多态性位点)的漏检，引起血型基因型的误判。第二，第1-5号外显子以及所包含的内含子中同样存在大量的基因信息，对确定样本基因型和解决ABO血型相关问题具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于ABO血型分型的PCR-SBT方法，以克服现有血型分型技术中的上述缺陷。为此，本发明采用以下技术方案：
它包括以下步骤：
(1)制备基因组DNA；
(2)设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中ABO基因外显子1、外显子2-4、外显子5-7的三个片段，其中1号外显子采用含GC缓冲液的PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(4)设计测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；
(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；
所述步骤(2)中，三个片段扩增的反应体系和反应程序如下：
外显子1扩增体系，以25μl计，包括：2×GC buffer I 12.5μl、2.5mM dNTP 2μl、每条引物终浓度均为0.5μmol/L、La-Taq DNA聚合酶1.0U、100ng/μl DNA模板2.5μl，余量以纯水补足；
外显子2-4扩增体系，以25μl计，包括：10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP2μl，每条引物终浓度均为0.5μmol/L，Mg2+终浓度2.0mmol/L，La-Taq DNA聚合酶1.0U，100ng/μl DNA模板2.5μl，余量以纯水补足；
外显子5-7扩增体系，以25μl计，包括：10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP2μl，每条引物终浓度均为0.5μmol/L，Mg2+终浓度2.0mmol/L，La-Taq DNA聚合酶1.0U，100ng/μl DNA模板2.5μl，余量以纯水补足；
扩增程序为：
1号外显子扩增：94℃预变性1min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，67.5℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸35s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
2-4号外显子扩增：94℃预变性5min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，61℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸5min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
5-7号外显子扩增：94℃预变性5min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，63.8℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸3min30s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
所述步骤(2)和步骤(4)中的引物分别为3对寡核苷酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增ABO血型基因的1号外显子、2-4号外显子以及5-7号外显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分析；
所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下：
1号外显子扩增引物：
M13-E1F：5’-GTAAAACGACGGCCAGGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
M13-E1R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’
2-4号外显子扩增引物：
E24F2：5’-GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’
E24R1：5’-ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’
5-7号外显子扩增引物：
E57F：5’-CTGCTAAAACCAAGGGCG-3’
E7R：5’-CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3’
所述18条寡核苷酸测序引物序列如下：
外显子1片段的测序引物：
M13F：5’-GTAAAACGACGGCCA-3’
M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
外显子2-4片段的测序引物：
518F：5’-accaccctcctgcccacc-3’
252F：5’-acagaaggtcccagaaccaaga-3’
171F：5’-gggtcacctggatacctctgg-3’
682F：5’-cctctgttgggaccactcttg-3’
306F：5’-atcgccacagtgatggttgtt-3’
441F：5’-cctgggctcaagtgattctcc-3’
955F：5’-ttttatgtcgggctcaaatcac-3’
外显子5-7片段的测序引物：
I6F：5’-GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3’
I6R：5’-GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’
E7F：5’-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3’
5IR：5’-AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’
5IF：5’-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’
6IF1：5’-GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3’
6IR1：5’-CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’
6IF2：5’-CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3’
6IR2：5’-CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’；
所述步骤(4)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
本发明另一个所要解决的技术问题是提供上述方法所用的试剂。为此，本发明采用以下技术方案：它包括3对寡核苷酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增ABO血型基因的1号外显子、2-4号外显子以及5-7号外显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分析。
所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下：
1号外显子扩增引物：
M13-E1F：5’-GTAAAACGACGGCCAGGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
M13-E1R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’
2-4号外显子扩增引物：
E24F2：5’-GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’
E24R1：5’-ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’
5-7号外显子扩增引物：
E57F：5’-CTGCTAAAACCAAGGGCG-3’
E7R：5’-CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3’
所述18条寡核苷酸测序引物序列如下：
外显子1片段的测序引物：
M13F：5’-GTAAAACGACGGCCA-3’
M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
外显子2-4片段的测序引物：
518F：5’-accaccctcctgcccacc-3’
252F：5’-acagaaggtcccagaaccaaga-3’
171F：5’-gggtcacctggatacctctgg-3’
682F：5’-cctctgttgggaccactcttg-3’
306F：5’-atcgccacagtgatggttgtt-3’
441F：5’-cctgggctcaagtgattctcc-3’
955F：5’-ttttatgtcgggctcaaatcac-3’
外显子5-7片段的测序引物：
I6F：5’-GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3’
I6R：5’-GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’
E7F：5’-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3’
5IR：5’-AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’
5IF：5’-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’
6IF1：5’-GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3’
6IR1：5’-CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’
6IF2：5’-CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3’
6IR2：5’-CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’
本发明中引物设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据Genebank(序列号：AC000397)中人类ABO血型基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而设计获得的。所有引物的设计均避开突变位点，以免因位点的漏检而导致分型的错误。本发明以一对寡核苷酸引物可以扩增包含几个外显子的长片段，使其简化为3对扩增引物即可保证包含所有外显子的有效扩增。1号外显子含有大量GC碱基，较难获得有效扩增，同时与其他外显子之间隔有一段长片断内含子，因此将其单独作为一个片段，利用GC缓冲液，保证其有效扩增。5-7号外显子含有较多突变位点，同时考虑扩增片段长度及扩增效果，将此3个外显子合并成一个片段扩增。余下的外显子作为单独的一个片段扩增。扩增引物的设计避开了ABO血型抗原编码序列的多态性位点，避免了任何突变点的漏检从而导致的基因型误判。测序引物的设计能保证清晰准确测得所扩增片段的全长序列，对部分序列进行双向测序，从而将样本进行精确的基因分型。其中所述1号外显子扩增引物在其5′包含一段M13通用引物，以保证GC含量较高的1号外显子能有效地获得清晰的测序电泳图谱。
本发明通过对ABO血型所有外显子进行全长序列测序，获得ABO血型相关外显子的全长和部分内含子寡核苷酸序列，精确地对其基因进行分型。随着DNA序列分析仪的普及，PCR-SBT技术广泛应用于临床检测，如药物相关的乙肝病毒变异测序、骨髓移植的HLA高分辨测序分型等。高通量获得的所有ABO血型编码序列精确信息在基因定型，基因多态性检测，基因频率调查分析等方面的应用受到广泛重视。
本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了ABO亚型的鉴定、疑难血型的判定、新突变位点的发现、基因之间的重组现象、基因多态性检测等问题，发挥PCR-SBT对ABO基因定型操作高通量，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明中检测样本的外显子1(E1)、外显子2-4(E2-4)、外显子5-7(E5-7)三个片段的PCR扩增电泳图谱，M为DNA Marker(DL2000，TaKaRa)。
图2为本发明中对3例检测样本中的样本1(A102/B101)的1-7号外显子的全部测序电泳图谱。
图3为本发明中对3例检测样本中的样本2(B(A)02/B101)的1-7号外显子的全部测序电泳图谱。
图4为本发明中对3例检测样本中的样本3(B(A)02/O01)的1-7号外显子的全部测序电泳图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明内容作进一步详细说明。
实施例：
一般用抗A和抗B试剂来测定红细胞上是否有A抗原和B抗原，确定ABO血型称为正定型；用已知有A和B抗原的红细胞对血清定型，称为反定型。正反定型相符，才能避免ABO血型的误定。即试验中红细胞有A、B抗原，血清中无A、B抗体，可完全确信这次定型AB型是正确的。正反定型不符即正定型和反定型的结果不一致，不能确定其正确的血型。本实施例中样本正反定型不符即提示红细胞表达A、B抗原，其血清中有抗A1抗体，因此不能定义其血型。
本实施例具体以对一例正反定型符合和两例正反定型不符个体进行ABO血型定型为例对本发明内容做详细说明，本发明所采用的一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法具体包括以下步骤：
1、制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
取待检全血200μl，按照invitrogen DNA isolation试剂盒说明书提取基因组DNA，利用分光光度计测定基因组浓度和纯度。
2、合成3对扩增引物和18条测序引物，具体序列见前述发明内容中的序列，不再赘述。
将扩增引物用纯水稀释至25μM；准备La-Taq酶(Lot：CK4501，TaKaRa)、10×缓冲液(Lot：CK4501，TaKaRa)、2×GC buffer I(Lot：A2801A，TaKaRa)、dNTP(Lot：CBG4301A，TaKaRa)、纯水，与步骤1所制备的PCR扩增模板按表1、表2和表3所述体系配制PCR扩增体系：
表1：步骤2中1号外显子PCR扩增体系
| 1号外显子PCR扩增体系 | 体积(μl) |
| 2×GC buffer I | 12.5 |
| dNTP(2.5mM) | 2 |
| 引物M13-E1F | 0.5 |
| 引物M13-E1R | 0.5 |
| La-Taq酶(5U/μl) | 0.2 |
| H2O | 6.8 |
| DNA模板(100ng/μl) | 2.5 |
| 总体系 | 25μl |
表2：步骤2中2-4号外显子PCR扩增体系
| 2-4号外显子片段PCR扩增体系 | 体积(μl) |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5 |
| dNTP(2.5mM) | 2 |
| Mg2+(25mM) | 2 |
| 引物E24F2 | 0.5 |
| 引物E24R1 | 0.5 |
| La-Taq酶(5U/μl) | 0.2 |
| H2O | 14.8 |
| DNA模板(100ng/μl) | 2.5 |
| 总体系 | 25μl |
表3：步骤2中5-7号外显子PCR扩增体系
| 5-7号外显子片段PCR扩增体系 | 体积(μl) |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5 |
| dNTP(2.5mM) | 2 |
| Mg2+(25mM) | 2 |
| 引物E57F | 0.5 |
| 引物E7R | 0.5 |
| La-Taq酶(5U/μl) | 0.2 |
| H2O | 14.8 |
| DNA模板(100ng/μl) | 2.5 |
| 总体系 | 25μl |
用PCR仪(ABI9700)分别按以下程序扩增：
1号外显子扩增：94℃预变性1min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，67.5℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸35s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
2-4号外显子扩增：94℃预变性5min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，61℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸5min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
5-7号外显子扩增：94℃预变性5min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，63.8℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸3min30s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。
3、扩增产物的双酶切纯化。
检测样本所扩增的3个片段各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶(SAP，1U/μl，Lot：M820A，Promega)和核酸外切酶I(Exo-I，5U/μl，Lot：CK11011B，TaKaRa)，利用虾碱性磷酸酶(SAP)的DNA 5′端去磷酸化功能以及核酸外切酶I(Exo-I)的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在25μl扩增产物体系中加入SAP 2μl和Exo-I 1μl，37℃30min酶切反应，80℃15min酶失活。
4、对PCR产物进行测序PCR。
将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入25μl纯水稀释，混匀。测序引物用纯水稀释至1.6μM，以BigDye terminator v3.1 sequencing kit(美国ABI公司)试剂按照表3配制反应体系：
表3：步骤4中PCR产物的PCR测序体系
| 反应体系 | 体积(μl) |
| 5×缓冲液 | 1.6 |
| BigDye mix | 0.8 |
| 测序引物 | 1 |
| DNA | 2 |
| H2O | 4.6 |
| 总体积 | 10 |
三个样本以所扩增纯化的片段为模板，分别进行18个反应，用PCR仪(ABI9700)按以下程序扩增：96℃预变性1min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。测序引物浓度为1.6μM，稀释的上述纯化后DNA模板2μl。
5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。
将步骤4中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1μl EDTA(1.25μM)和25μl醋酸钠(3M)/无水乙醇(1∶40)混合液，混匀，3000g离心30min；去除上清，加入75％乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。
6、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，按照Blood Group AntigenGene Mutation Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi？cmd＝bgmut/systems)数据库序列确定ABO血型的基因型。
如图2、3、4所示，图2的样本1为正反定型符合的正常AB血型基因型结果，图3的样本2和图4的样本3为两例正反定型不符个体AB血型基因型结果，即用血清学方法难以判断其血型的疑难血型。3730测序仪毛细管电泳图谱分析结果显示，样本1基因为261G/G、297A/G(R)、467C/T(Y)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/C、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、930A/G(R)，基因型定为A102/B101。样本2基因为261G/G、297G/G、526G/G、657T/T、700C/G(S)、703A/A、796A/A、803C/C、930A/A，基因型定为B(A)02/B101。样本3基因为261G/del、297A/G(R)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/G(S)、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、930A/G(R)，基因型定为B(A)02/O01。其中前面的数字代表碱基序列位置，括号中字母代表所对应杂合碱基的缩写。样本1表现为正反定型符合的正常AB型。样本2和样本3的表现为正反定型不符的A2B。AB型可分为A1B和A2B两种亚型，本实施例中此两例正反定型不符样本所表现的A2B型属于一种罕见亚型，可引起正反定型不符，难以判断其正确的血型，而大部分人群表现为普通A1B型。对三例样本的测序图谱比较分析，B(A)02等位基因700位碱基为G，703位碱基为A；A102、O01基因700位碱基为C，703位碱基为G；B101基因700位碱基为C，703位碱基为A，可见其700位G是其特征碱基，作为罕见基因B(A)02的一个标志。本实施例将疑难血型准确的加以定型。
所以，采用本发明提供的ABO血型基因分型的PCR-SBT方法可以通过对ABO血型所有外显子进行全长序列测序，获得ABO血型相关外显子的全长和部分内含子寡核苷酸序列，可以精确地对其基因型进行分型，从而解决了ABO亚型的鉴定、疑难血型的判定、新突变位点的发现、基因之间的重组现象、基因多态性检测等问题，可发挥PCR-SBT对ABO基因定型操作高通量，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
序列表
<110>浙江省血液中心
<120>一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法及试剂
<130>
<160>48
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gtaaaacgac ggccaggccg tcccttccta gcag 34
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
caggaaacag ctatgaccga ggagaggctg gagac 35
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gagggtgagt gatgtgatt 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
actggcaaga gggactaag 19
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ctgctaaaac caagggcg 18
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ctgcccacag tgaattgaga 20
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gtaaaacgac ggcca 15
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
caggaaacag ctatgac 17
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
accaccctcc tgcccacc 18
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
acagaaggtc ccagaaccaa ga 22
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gggtcacctg gatacctctg g 21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cctctgttgg gaccactctt g 21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
atcgccacag tgatggttgt t 21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
cctgggctca agtgattctc c 21
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ttttatgtcg ggctcaaatc ac 22
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gttcccgcag gtccaatgt 19
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gctgcatgaa tgacctttcc 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tctgctgctc tragccttcc 20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
aaaccaacca gaggcaaatg 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
cctgtccctt tgttctccaa 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
gggtagagac ccaggcagtg 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctctgcaccc tagagcttcc 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
cccagacacc aaaggaagtg 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ccaccatgaa gtgcttctcc 20
<210>25
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
gtaaaacgac ggccaggccg tcccttccta gcag 34
<210>26
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
caggaaacag ctatgaccga ggagaggctg gagac 35
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
gagggtgagt gatgtgatt 19
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
actggcaaga gggactaag 19
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
ctgctaaaac caagggcg 18
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
ctgcccacag tgaattgaga 20
<210>31
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gtaaaacgac ggcca 15
<210>32
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
caggaaacag ctatgac 17
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
accaccctcc tgcccacc 18
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
acagaaggtc ccagaaccaa ga 22
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
gggtcacctg gatacctctg g 21
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
cctctgttgg gaccactctt g 21
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
atcgccacag tgatggttgt t 21
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
cctgggctca agtgattctc c 21
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
ttttatgtcg ggctcaaatc ac 22
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
gttcccgcag gtccaatgt 19
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gctgcatgaa tgacctttcc 20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
tctgctgctc tragccttcc 20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
aaaccaacca gaggcaaatg 20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
cctgtccctt tgttctccaa 20
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
gggtagagac ccaggcagtg 20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
ctctgcaccc tagagcttcc 20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
cccagacacc aaaggaagtg 20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
ccaccatgaa gtgcttctcc 20
Claims (2)
1.一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)制备基因组DNA；
(2)设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中ABO基因外显子1、外显子2-4、外显子5-7的三个片段，其中1号外显子采用含GC缓冲液的PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(4)设计测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；
(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；
所述步骤(2)中，三个片段扩增的反应体系和反应程序如下：
外显子1扩增体系，以25μl计，包括：2×GC buffer I 12.5μl、2.5mM dNTP 2μl、每条引物终浓度均为0.5μmol/L、La-Taq DNA聚合酶1.0U、100ng/μl DNA模板2.5μl，余量以纯水补足；
外显子2-4扩增体系，以25μl计，包括：10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP2μl，每条引物终浓度均为0.5μmol/L，Mg2+终浓度2.0mmol/L，La-Taq DNA聚合酶1.0U，100ng/μl DNA模板2.5μl，余量以纯水补足；
外显子5-7扩增体系，以25μl计，包括：10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP2μl，每条引物终浓度均为0.5μmol/L，Mg2+终浓度2.0mmol/L，La-Taq DNA聚合酶1.0U，100ng/μl DNA模板2.5μl，余量以纯水补足；
扩增程序为：
1号外显子扩增：94℃预变性1min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，67.5℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸35s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
2-4号外显子扩增：94℃预变性5min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，61℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸5min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
5-7号外显子扩增：94℃预变性5min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，63.8℃退火30s，引物结合到模板上，72℃延伸3min30s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸；
所述步骤(2)和步骤(4)中的引物分别为3对寡核苷酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增ABO血型基因的1号外显子、2-4号外显子以及5-7号外显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分析；
所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下：
1号外显子扩增引物：
M13-E1F：5’-GTAAAACGACGGCCAGGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
M13-E1R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’
2-4号外显子扩增引物：
E24F2：5’-GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’
E24R1：5’-ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’
5-7号外显子扩增引物：
E57F：5’-CTGCTAAAACCAAGGGCG-3’
E7R：5’-CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3’
所述18条寡核苷酸测序引物序列如下：
外显子1片段的测序引物：
M13F：5’-GTAAAACGACGGCCA-3’
M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
外显子2-4片段的测序引物：
518F：5’-accaccctcctgcccacc-3’
252F：5’-acagaaggtcccagaaccaaga-3’
171F：5’-gggtcacctggatacctctgg-3’
682F：5’-cctctgttgggaccactcttg-3’
306F：5’-atcgccacagtgatggttgtt-3’
441F：5’-cctgggctcaagtgattctcc-3’
955F：5’-ttttatgtcgggctcaaatcac-3’
外显子5-7片段的测序引物：
I6F：5’-GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3’
I6R：5’-GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’
E7F：5’-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3’
5IR：5’-AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’
5IF：5’-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’
6IF1：5’-GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3’
6IR1：5’-CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’
6IF2：5’-CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3’
6IR2：5’-CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’；
所述步骤(4)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
2.一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法所用的试剂，其特征在于它包括3对寡核苷酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增ABO血型基因的1号外显子、2-4号外显子以及5-7号外显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分析；
所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下：
1号外显子扩增引物：
M13-E1F：5’-GTAAAACGACGGCCAGGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
M13-E1R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’
2-4号外显子扩增引物：
E24F2：5’-GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’
E24R1：5’-ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’
5-7号外显子扩增引物：
E57F：5’-CTGCTAAAACCAAGGGCG-3’
E7R：5’-CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3’
所述18条寡核苷酸测序引物序列如下：
外显子1片段的测序引物：
M13F：5’-GTAAAACGACGGCCA-3’
M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
外显子2-4片段的测序引物：
518F：5’-accaccctcctgcccacc-3’
252F：5’-acagaaggtcccagaaccaaga-3’
171F：5’-gggtcacctggatacctctgg-3’
682F：5’-cctctgttgggaccactcttg-3’
306F：5’-atcgccacagtgatggttgtt-3’
441F：5’-cctgggctcaagtgattctcc-3’
955F：5’-ttttatgtcgggctcaaatcac-3’
外显子5-7片段的测序引物：
I6F：5’-GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3’
I6R：5’-GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’
E7F：5’-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3’
5IR：5’-AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’
5IF：5’-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’
6IF1：5’-GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3’
6IR1：5’-CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’
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6IR2：5’-CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’。
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