CN109402243A

CN109402243A - 一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法及试剂

Info

Publication number: CN109402243A
Application number: CN201811419215.1A
Authority: CN
Inventors: 朱发明; 许先国; 应燕玲; 洪小珍; 陈舒; 马开荣; 何吉
Original assignee: ZHEJIANG BLOOD CENTER
Current assignee: ZHEJIANG BLOOD CENTER
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2019-03-01

Abstract

快速、准确的一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，包括步骤：(1)制备基因分型样本的人基因组DNA；(2)提供扩增引物，用聚合酶链反应同步扩增所述基因组DNA中5个血型系统12个抗原对应的基因序列；(3)将步骤(2)得到的扩增产物作双酶切纯化；(4)提供测序引物，将步骤(3)所得纯化产物分别作测序PCR反应；(5)将步骤(4)所得测序反应产物作醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)所得序列经软件分析，确定其血型抗原基因型；所述扩增引物和测序引物为序列号1‑14的，所述方法所用试剂具有所述扩增引物和测序引物。本发明用于种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型。

Description

一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法及试剂

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种同步检测5个红细胞血型系统12个主要抗原基因分型的分子生物学检测方法及该方法所用的试剂。

背景技术

个体红细胞血型抗原具有遗传多态性，到2018年11月已发现的人红细胞血型系统有36个，超过350多种抗原。准确的识别个体红细胞血型有助于精准血型的配合。

传统的鉴定红细胞血型的方法是基于抗原抗体凝集的血型血清学技术，该技术在ABO、RhD血型鉴定中得到广泛应用，优点是操作简单易行、试剂成本低廉。但血型血清学技术有其局限性，主要表现为：1)检测需要新鲜的红细胞，不利于标本的长期保存；2)有近期输血史的待检者样本，往往混入ABO/RhD同型但其他血型不相同的输入性红细胞，影响ABO/RhD血型以外的其他血型抗原的准确鉴定；3)多种血型变异体样本，应用单纯的血型血清学技术，往往存在分型错误的风险；4)ABO、RhD以外的血型抗体试剂，普遍产量低、价格昂贵，不利于大样本的检测；5)某些血型抗原缺乏相应的商品化抗体试剂，如Dombrock、Colton、Diego等血型系统的大部分抗原，都没有商品化抗体试剂可售。血型基因分型技术是弥补血型血清学技术缺陷的有效方法，早期的血型基因分型多采用等位基因特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)，但这个方法准确性较低，后来又发展了荧光定量溶解曲线、固相芯片杂交、液相Luminex、测序分型(PCR-SBT)等技术。其中以PCR-SBT技术的准确性最高，但除了ABO、RhD等血型建立了PCR-SBT方法，大部分的血型系统尚未有PCR-SBT方法进行基因分型，而且现有的PCR-SBT血型基因分型方法，往往一次只能对一种血型进行鉴定，检测通量较低。因此，建立一种同步检测多个血型系统多个抗原的PCR-SBT分型方法具有重要价值。

发明内容

本发明要解决现有技术中人类红细胞血型抗原基因分型检测通量低，耗时大，准确率不高等问题，为此提供本发明的一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法及试剂，由此解决了5个红细胞血型系统中12个抗原准确定型的问题，发挥PCR-SBT技术对多个血型基因分型的高通量、高准确性的特点，可准确鉴定个体红细胞血型。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案其主题一是一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，二是所述分型方法所用试剂。

本发明一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，其特殊之处在于该方法对12个血型抗原进行基因分型，并包括以下步骤：

(1)制备基因分型样本的人基因组DNA；

(2)提供扩增引物，用聚合酶链反应同管、同步扩增所述基因组DNA中5个血型系统12个抗原对应的基因序列；

(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；

(4)提供测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物分别进行测序PCR反应，所述测序引物与步骤(2)相应的扩增引物相同；

(5)将步骤(4)得到的测序反应产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；

(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其血型抗原基因型；

步骤(2)中的扩增引物与步骤(4)中相应的测序引物相同，这些引物为：

(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：

KEL-F:5’-GAG GGA GAT GGA GAT GGA AA-3’

KEL-R:5’-GAC TGG TGT GTG TGG AGA GG-3’

(2)Duffy血型系统Fy^a、Fy^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

FY-F:5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’

FY-R:5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’

(3)Duffy血型系统Fy(a-b-)无效表型(Fy^a和Fy^b抗原均阴性)编码基因的扩增和测序引物：

FYN-F:5’-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3’

FYN-R:5’-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3’

(4)Kidd血型系统Jk^a、Jk^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

JK-F:5’-CTT TCA ATC CCA CCC TCA GT-3’

JK-R:5’-CTC AAT AGG CTC CTG CCT TC-3’

(5)Dombrock血型系统Do^a、Do^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO1-F:5’-ACA GGG GCC ACC ATT CGA TT-3’

DO1-R:5’-TGT GCT CAG GTT CCC AGT TG-3’

(6)Dombrock血型系统Hy、Jo^a抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO2-F:5’-ATC GAC TTC GAC TTC GCA CC-3’

DO2-R:5’-ACG TTC ATA CTG CTG TGG AG-3’

(7)Colton血型系统Co^a、Co^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

CO-F:5’-AAG CTC TTC TGG AGG GCA GT-3’

CO-R:5’-GAC ACC TTC ACG TTG TCC TG-3’。

进一步地，所述5个红细胞血型系统分别为Kell、Duffy、Kidd、Dombrock、Colton血型系统，其基因名称分别为KEL、ACKR1、SLC14A1、ART4、AQP1；所述12个抗原分别为K、k、Fy^a、Fy^b、Jk^a、Jk^b、Do^a、Do^b、Hy、Jo^a、Co^a、Co^b；

所述K、k属于Kell血型系统，Fy^a、Fy^b属于Duffy血型系统，Jk^a、Jk^b属于Kidd血型系统，Do^a、Do^b、Hy、Jo^a属于Dombrock血型系统，Co^a、Co^b属于Colton血型系统。

进一步地，

所述步骤(3)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。

本发明一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法所用的试剂，其特殊之处在于：所述试剂具有用于扩增5个血型系统基因的7对引物和用于测序的7对引物，所述用于扩增的引物和用于相应的测序的引物相同，这些引物为：

(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：

KEL-F:5’-GAG GGA GAT GGA GAT GGA AA-3’

KEL-R:5’-GAC TGG TGT GTG TGG AGA GG-3’

(2)Duffy血型系统Fy^a、Fy^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

FY-F:5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’

FY-R:5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’

FYN-F:5’-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3’

FYN-R:5’-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3’

(4)Kidd血型系统Jk^a、Jk^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

JK-F:5’-CTT TCA ATC CCA CCC TCA GT-3’

JK-R:5’-CTC AAT AGG CTC CTG CCT TC-3’

(5)Dombrock血型系统Do^a、Do^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO1-F:5’-ACA GGG GCC ACC ATT CGA TT-3’

DO1-R:5’-TGT GCT CAG GTT CCC AGT TG-3’

(6)Dombrock血型系统Hy、Jo^a抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO2-F:5’-ATC GAC TTC GAC TTC GCA CC-3’

DO2-R:5’-ACG TTC ATA CTG CTG TGG AG-3’

(7)Colton血型系统Co^a、Co^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

CO-F:5’-AAG CTC TTC TGG AGG GCA GT-3’

CO-R:5’-GAC ACC TTC ACG TTG TCC TG-3’。

本发明所述的12个抗原被业内认为是所述5个红细胞血型系统的主要抗原。

本发明中寡核苷酸引物的设计是同管、同步PCR扩增5个血型系统基因的关键，而引物是根据各个血型系统编码基因的序列进行设计。5个血型系统的编码基因从NCBIGenBank数据库中获得，其中Kell血型系统编码基因KEL的GenBank ID为NG_007492.2，Duffy血型系统编码基因ACKR1的GenBank ID为NG_011626.3，Kidd血型系统编码基因SLC14A1的GenBank ID为NG_011775.4，Dombrock血型系统编码基因ART4的GenBank ID为NG_007477.2，Colton血型系统编码基因AQP1的GenBank ID为NG_007475.2。本发明中引物的设计需同时符合以下条件：1)能有效扩增5个血型基因12个抗原相关的DNA序列多态性位点；2)根据NCBI dbSNP数据库信息，上下游引物均避开SNP位点，以防止扩增和测序过程其中一个倍体的漏检；3)7对引物的Tm值接近，以保证同管、同步扩增的效率；4)7对引物之间互不干扰，避免PCR扩增产生非特异性产物，提高特异性产物浓度；5)7对引物的扩增产物长度不同，这样可以从扩增产物的电泳条带判断扩增过程的有效性。通过反复设计和摸索，最后确定7对特异性引物。

本发明中7对引物分别扩增5个血型系统的7个基因片段。其中KEL-F/R引物对扩增KEL基因NG_007492.2序列中的9235-9584位(其中编码k和K抗原的序列多态性位于9496位C或T，即cDNA的c.578C>T突变位点)；FY-F/R引物对扩增ACKR1基因NG_011626.3序列中的6458-6849位(其中编码Fy^b和Fy^a抗原的序列多态性位于6552位A或G，即cDNA的c.125A>G突变位点)；FYN-F/R引物对扩增ACKR1基因NG_011626.3序列中的5762-5950位(其中编码Fy(a+和/或Fyb+)表型和Fy(a-b-)表型的序列多态性位于5881位T或C，即cDNA的c.-67T>C突变位点)；JK-F/R引物对扩增SLC14A1基因NG_011775.4序列中的57427-57861位(其中编码Jk^b和Jk^a抗原的序列多态性位于47530位A或G，即cDNA的c.838A>G突变位点)；DO1-F/R引物对扩增ART4基因NG_007477.2序列中的7774-8013位(其中编码Do^a和Do^b抗原的序列多态性位于7975位A或G，即cDNA的c.793A>G突变位点)；DO2-F/R引物对扩增ART4基因NG_007477.2序列中的7339-7638位(其中编码Hy+和Hy-表型的序列多态性位于7505位G或T，即cDNA的c.323G>T突变位点；编码Jo(a+)和Jo(a-)表型的序列多态性位于7532位C或T，即cDNA的c.350C>T突变位点)；CO-F/R引物对扩增AQP1基因NG_007475.2序列中的63538-63674位(其中编码Co^a和Co^b抗原的序列多态性位于63650位C或T，即cDNA的c.134C>T突变位点)。血型基因和引物的相关信息见表1：

表1：血型基因和引物的相关信息

除了特异性引物设计，多重PCR成分配方(包括各对引物浓度和相互比例、Mg²⁺浓度等)、扩增条件等也是保证5个血型基因7个基因片均能得到同步扩增的关键。本发明通过反复摸索和调整，最终使7个目的基因片段都得到同步有效扩增，片段长度符合预期，产物浓度接近，非特异性扩增产物少，符合进一步测序分型的要求(扩增产物的琼脂糖凝胶电泳见图1)。7个基因片段同步扩增及产物纯化后，再利用这14条引物分别进行双向测序PCR、毛细管PAGE电泳和序列分析。结果显示：5个血型系统12个抗原均能得到清晰的序列图谱，并根据目的位点的序列多态性将样本进行精确的基因分型，见图2～图8。

本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了5个红细胞血型系统12个抗原准确定型的问题，发挥PCR-SBT技术对多个血型基因分型的高通量、高准确性的特点，可准确鉴定个体红细胞血型。

附图说明

图1为本发明中7对引物的PCR扩增电泳图谱。第1～4孔为4个随机样本的多重PCR扩增片段(每孔自上而下分别为JK、FY、KEL、DO2、DO1、FYN、CO等7个扩增片段)，第5孔为DNAmarker(分子量分别为500、400、300、200、150、100、50bp)。

图2为Kell血型系统KEL基因测序部分图谱，箭头所指为k和K对应的c.578C>T多态性位点，该样本为c.578C/C纯合子，对应抗原kk，表型为K-k+。

图3为Duffy血型系统ACKR1基因测序部分图谱，箭头所指为Fy^b和Fy^a对应的c.125A>G多态性位点，该样本为c.125G/G纯合子，对应抗原Fy^aFy^a，表型为Fy(a+b-)。

图4为Duffy血型系统ACKR1基因测序部分图谱，箭头所指为Fy(a+和/或b+)和Fy(a-b-)对应的c.-67T>C多态性位点，该样本为c.-67T/T纯合子，对应表型为Fy(a+和/或b+)。

图5为Kidd血型系统SLC14A1基因测序部分图谱，箭头所指为Jk^b和Jk^a对应的c.838A>G多态性位点，该样本为c.838G/G纯合子，对应抗原Jk^aJk^a，表型为Jk(a+b-)。

图6为Dombrock血型系统ART4基因测序部分图谱，箭头所指为Do^a和Do^b对应的c.793A>G多态性位点，该样本为c.793G/G纯合子，对应抗原Do^bDo^b，表型为Do(a-b+)。

图7为Dombrock血型系统ART4基因测序部分图谱，左边箭头所指为Hy+和Hy-对应的c.323G>T多态性位点，该样本为c.323G/G纯合子，对应抗原Hy+Hy+，表型为Hy+。右边箭头所指为Jo(a+)和Jo(a-)对应的c.350C>T多态性位点，该样本为c.350C/C纯合子，对应抗原Jo(a+)Jo(a+)，表型为Jo(a+)。

图8为Colton血型系统AQP1基因测序部分图谱，箭头所指为Co^a和Co^b对应的c.134C>T多态性位点，该样本为c.134C/C纯合子，对应抗原Co^aCo^a，表型为Co(a+b-)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。

本实施具体以献血者的血液本进行5个血型系统12个抗原的基因分型为例，对本发明内容做详细说明。本发明的同步检测5个血型系统12个主要抗原的基因分型方法包括以下步骤：

1、制备人基因组DNA，作为后续步骤的多重PCR扩增模板。

取待检全血200μl，按照QuickGene DNA whole blood kit试剂盒说明书提取基因组DNA，利用分光光度计测定基因组DNA浓度和纯度。

2、合成针对5个血型系统12个主要抗原的7对扩增引物，具体引物序列见发明内容中的基因序列，此处不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至50μM。

准备LA Taq酶(TaKaRa)、10×PCR缓冲液(内含Mg²⁺，TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、纯水，与步骤1所制备的PCR扩增模板，按表2所述体系配制PCR扩增体系。7对引物均加入同一PCR体系，进行同管、同步扩增。

表2：步骤2中PCR扩增体系配方

PCR扩增体系配方	体积(μl)
		10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl<sub>2</sub>)	2.5
dNTP(2.5mmol/L)	3.0
		引物KEL-F和KEL-R	各0.4
引物FY-F和FY-R	各0.4
		引物FYN-F和FYN-R	各0.2
引物JK-F和JK-R	各0.4
		引物DO1-F和DO1-R	各0.2
引物DO2-F和DO2-R	各0.4
		引物CO-F和CO-R	各0.4
LA Taq酶(5U/μl)	0.2
		H<sub>2</sub>O	12.0
DNA模板(40ng/μl)	2.5
		总体系	25.0

用PCR仪(ABI 9700)按以下程序扩增：

95℃预变性5min，DNA双链充分解开；95℃变性30s，61℃退火30s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸30s，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。

3、扩增产物的双酶切纯化。

将检测样本所扩增片段，各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。图1为4个随机样本的多重PCR产物电泳结果，每个样本均能得到7个特异性扩增片段。

在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶(SAP，1U/μl，Promega)和核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ，5U/μl，TaKaRa)，利用SAP的核苷酸5′端去磷酸化功能以及Exo-Ⅰ的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在剩余的23μl扩增产物体系中加入SAP 1μl和Exo-Ⅰ2μl，37℃酶切反应30min，80℃酶失活15min。

4、利用14条测序引物(引物序列与PCR扩增引物相同)，对PCR产物进行测序PCR。

将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入25μl纯水稀释，混匀，将14条测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDye terminator v3.1sequencing kit(美国ABI公司)试剂按照表3配制反应体系：

表3：步骤4中测序PCR反应体系配方

测序PCR反应体系配方	体积(μl)
		5×缓冲液	1.5
BigDye mix	1.0
		测序引物	1.0
DNA(稀释后的PCR产物)	2.0
		H<sub>2</sub>O	4.5
总体积	10.0

其中测序引物为14条测序引物中的任意一条，每个样本均进行14个测序反应(即7个扩增片段分别进行正向、反向测序)。

用PCR仪(ABI 9700)按以下程序进行测序反应：预变性96℃1min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。然后冷却至12℃。

5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤4中测序PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化：直接在PCR产物中加入1μl EDTA(1.25μM)和25μl醋酸钠(3M)/无水乙醇(1：40)混合液，混匀，3000g离心30min；去除上清，加入50μl 75％乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。

6、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对。根据所测序基因的目标位点的序列多态性结果，确定各血型系统主要抗原或表型对应的基因型。图2-8分别为本发明的其中一个血液检测样本所分析的7个基因片段的部分测序图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。

序列表

<110> 浙江省血液中心

<120> 一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法及试剂

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggagatg gagatggaaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactggtgtg tgtggagagg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccccctcaa ctgagaactc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggctgagc cataccagac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaggccagt gacccccata 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catggcaccg tttggttcag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctttcaatcc caccctcagt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcaataggc tcctgccttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acaggggcca ccattcgatt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtgctcagg ttcccagttg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atcgacttcg acttcgcacc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgttcatac tgctgtggag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagctcttct ggagggcagt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacaccttca cgttgtcctg 20

Claims

1.一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，其特征在于：所述方法对5个人类红细胞血型系统的12个抗原进行同步基因分型，所述方法包括以下步骤：

(1)制备基因分型样本的人基因组DNA；

(2)提供扩增引物，用聚合酶链反应同步扩增所述基因组DNA中5个血型系统12个抗原对应的基因序列；

(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；

(4)提供测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物分别进行测序PCR反应；

(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：

KEL-F:5’-GAG GGA GAT GGA GAT GGA AA-3’

KEL-R:5’-GAC TGG TGT GTG TGG AGA GG-3’

(2)Duffy血型系统Fy^a、Fy^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

FY-F:5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’

FY-R:5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’

FYN-F:5’-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3’

FYN-R:5’-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3’

(4)Kidd血型系统Jk^a、Jk^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

JK-F:5’-CTT TCA ATC CCA CCC TCA GT-3’

JK-R:5’-CTC AAT AGG CTC CTG CCT TC-3’

(5)Dombrock血型系统Do^a、Do^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO1-F:5’-ACA GGG GCC ACC ATT CGA TT-3’

DO1-R:5’-TGT GCT CAG GTT CCC AGT TG-3’

(6)Dombrock血型系统Hy、Jo^a抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO2-F:5’-ATC GAC TTC GAC TTC GCA CC-3’

DO2-R:5’-ACG TTC ATA CTG CTG TGG AG-3’

(7)Colton血型系统Co^a、Co^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

CO-F:5’-AAG CTC TTC TGG AGG GCA GT-3’

CO-R:5’-GAC ACC TTC ACG TTG TCC TG-3’。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述5个红细胞血型系统分别为Kell、Duffy、Kidd、Dombrock、Colton血型系统，其基因名称分别为KEL、ACKR1、SLC14A1、ART4、AQP1,所述12个抗原分别为K、k、Fy^a、Fy^b、Jk^a、Jk^b、Do^a、Do^b、Hy、Jo^a、Co^a、Co^b。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。

4.一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法所用的试剂，其特征在于：所述试剂具有用于扩增5个血型系统基因的7对引物和用于测序的7对引物，所述用于扩增的引物和用于相应的测序的引物相同，这些引物为：

(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：

KEL-F:5’-GAG GGA GAT GGA GAT GGA AA-3’

KEL-R:5’-GAC TGG TGT GTG TGG AGA GG-3’

(2)Duffy血型系统Fy^a、Fy^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

FY-F:5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’

FY-R:5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’

FYN-F:5’-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3’

FYN-R:5’-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3’

(4)Kidd血型系统Jk^a、Jk^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

JK-F:5’-CTT TCA ATC CCA CCC TCA GT-3’

JK-R:5’-CTC AAT AGG CTC CTG CCT TC-3’

(5)Dombrock血型系统Do^a、Do^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO1-F:5’-ACA GGG GCC ACC ATT CGA TT-3’

DO1-R:5’-TGT GCT CAG GTT CCC AGT TG-3’

(6)Dombrock血型系统Hy、Jo^a抗原编码基因的扩增和测序引物：

DO2-F:5’-ATC GAC TTC GAC TTC GCA CC-3’

DO2-R:5’-ACG TTC ATA CTG CTG TGG AG-3’

(7)Colton血型系统Co^a、Co^b抗原编码基因的扩增和测序引物：

CO-F:5’-AAG CTC TTC TGG AGG GCA GT-3’

CO-R:5’-GAC ACC TTC ACG T 。