CN109554448B - 一种人类红细胞血型系统abo抗原的多重pcr-sbt基因分型方法及试剂 - Google Patents
一种人类红细胞血型系统abo抗原的多重pcr-sbt基因分型方法及试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种用于人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR‑SBT基因分型方法。本发明还涉及一种人类红细胞血型系统ABO抗原基因分型的多重PCR‑SBT试剂。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了ABO抗原系统快速准确定型的问题，发挥多重PCR‑SBT对ABO基因定型操作高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种用于人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法。本发明还涉及一种人类红细胞血型系统ABO抗原基因分型的多重PCR-SBT试剂。
背景技术
人类ABO抗原是ABO血型系统中重要的抗原，ABO基因位于9号染色体(9q34.1～34.2)，由A、B和O三个复等位基因控制，包含长度大小从28～688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，总长大约为18～20kb。其基因编码产物是糖基转移酶，这些转移酶控制ABO血型抗原的生物合成，从而决定其血型。
目前的ABO血型基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR-序列特异性引物)，但该方法需要进行多管扩增，并且PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的ABO血型进行基因分型，对于一些特殊的亚型或存在的新突变位点则难以明确。同时PCR-SSP还存在判读易混淆所导致分型错误的分险。而现有的ABO血型PCR-SBT(PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术)分型方法虽然可以克服前者的缺陷和局限性，但现阶段的ABO血型PCR-SBT分型方法最大的缺陷是操作过程非常繁琐，工作量大，难以实现高通量操作。ABO基因不同区域的扩增有不同的扩增条件，不仅需要的样本量大，同时增加了试剂耗材的消耗，且需要占用更多的仪器设备资源。扩增引物和测序引物无共通性，从扩增的几管反应直接放大到测序的十几管反应，工作量巨大。这些缺陷直接导致了ABO基因分型无法实现高通量的精准分型，难以适应将来越来越高的医疗需求。
多重PCR(Multiplex PCR)是在同一个反应中同时扩增两个或多个位点的聚合链式反应。它具有提高效率，避免样品浪费，快速周转时间，并可大大节约实验成本的优点。建立ABO基因分型的多重PCR-SBT方法，可以克服上述局限性和不足，达到快速且准确地确认献血者和临床患者的ABO血型。实现快速、简便而精准化的血型诊断，将有效提高输血安全。
发明内容
针对现有技术中ABO基因分型的缺陷，给血型诊断过程中带来的困难，本发明的第一个目的在于提供了一种用于人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，本发明所提供的方法大大缩短了实验时间，节约了实验成本，提高了实验效率，在保证ABO基因正确分型的基础上，使ABO基因分型可以实现高通量，克服了现有血型分型技术中的缺陷。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，所述方法对ABO抗原基因全部1-7号外显子进行分组多重PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：
(1)设计并合成多重PCR扩增引物，其包含ABO抗原基因特异性序列和通用接头序列；
(2)制备人基因组DNA；
(3)两组多重PCR反应扩增人基因组DNA中ABO抗原基因1-7号外显子序列；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；
(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；
(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：
优选地，所述步骤(1)中多重PCR扩增引物序列分别为：
ABO基因1号外显子扩增引物：
ABO-E1F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAACGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
ABO-E1R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTCGGCGGTAGGTGCTGAAAATA-3’
ABO基因2号外显子扩增引物：
ABO-E2F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT GTAAAGTGGGGCAGGTGAGA-3’
ABO-E2R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC TGATACTTGGGGAGCTCAGG-3’
ABO基因3号外显子扩增引物：
ABO-E3F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG ACCAACAGGCAGTCTTCGTT-3’
ABO-E3R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG TGTAGGGGTGAGAGCAAAGG-3’
ABO基因4号外显子扩增引物：
ABO-E4F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGTTGCCCTAAATCCTGCTCCTA-3’
ABO-E4R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATCGCTGCAGGACAATTCTGTGA-3’
ABO基因5号外显子扩增引物：
ABO-E5F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT GTCAATGCCCAGTCATGGTT-3’
ABO-E5R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC GGAAACCGCCCTCTAATACC-3’
ABO基因6号外显子扩增引物：
ABO-E6F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGGMAGAAGCTGAGTGGAG-3’
ABO-E6R 5’-CAGGAAACAGCTATGACCC CTACCMTCTGGGAGGACAA-3’
ABO基因7号外显子扩增引物：
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’。
优选地，所述步骤(3)中两组多重PCR反应体系包括：
第1组4重PCR反应体系为：2×GC buffer 10μl；2.5mM dNTP 1.6μl；50mM所述扩增引物ABO-E1F 0.12μl+ABO-E1R 0.12μl、ABO-E2F 0.08μl+ABO-E2R 0.08μl、ABO-E3F 0.08μl+ABO-E3R 0.08μl、ABO-E4F 0.08μl+ABO-E4R 0.08μl；5U/μl LA Taq酶0.1μl，100ng/μlDNA 2.0μl；以H2O 5.58μl补足至20μl；
第2组3重PCR反应体系为：2×GC buffer 10μl；2.5mM dNTP 1.6μl；50mM所述扩增引物ABO-E5F 0.08μl+ABO-E5R 0.08μl、ABO-E6F 0.2μl+ABO-E6R 0.2μl、ABO-E7F 0.12μl+ABO-E7R 0.12μl；5U/μl LA Taq酶0.1μl，100ng/μl DNA 2.0μl；以H2O 5.5μl补足至20μl。
优选地，所述步骤(3)中两组多重PCR反应程序均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，反应30个循环；72℃，延伸10min；然后冷却至12℃。
优选地，所述步骤(5)中寡核苷酸测序引物序列分别如下：
M13F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
pDC316F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG-3’
pDC316R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG-3’
pCMVF-BD 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3’
pCMVR 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC-3’
pCMV5F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAAC-3’
pCMV5R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTC-3’
ABO-E7-1R 5’-GTAGAAATCGCCCTCGTCCT-3’
ABO-E7-2F 5’-AGGTGGATTACCTGGTGTGC-3’
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’。
优选地，所述步骤(4)中双酶切纯化所需的两种酶分别为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型试剂。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型试剂，其特征在于：所述试剂由用于扩增人类血型系统ABO抗原基因1-7号外显子的14条多重PCR扩增引物和用于测序分析的12条寡核苷酸测序引物组成；所述多重PCR扩增引物序列分别为：
ABO基因1号外显子扩增引物：
ABO-E1F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAACGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
ABO-E1R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTCGGCGGTAGGTGCTGAAAATA-3’
ABO基因2号外显子扩增引物：
ABO-E2F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT GTAAAGTGGGGCAGGTGAGA-3’
ABO-E2R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC TGATACTTGGGGAGCTCAGG-3’
ABO基因3号外显子扩增引物：
ABO-E3F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG ACCAACAGGCAGTCTTCGTT-3’
ABO-E3R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG TGTAGGGGTGAGAGCAAAGG-3’
ABO基因4号外显子扩增引物：
ABO-E4F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGTTGCCCTAAATCCTGCTCCTA-3’
ABO-E4R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATCGCTGCAGGACAATTCTGTGA-3’
ABO基因5号外显子扩增引物：
ABO-E5F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT GTCAATGCCCAGTCATGGTT-3’
ABO-E5R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC GGAAACCGCCCTCTAATACC-3’
ABO基因6号外显子扩增引物：
ABO-E6F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGGMAGAAGCTGAGTGGAG-3’
ABO-E6R 5’-CAGGAAACAGCTATGACCC CTACCMTCTGGGAGGACAA-3
ABO基因7号外显子扩增引物：
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’；
所述寡核苷酸测序引物序列分别如下：
M13F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
pDC316F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG-3’
pDC316R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG-3’
pCMVF-BD 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3’
pCMVR 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC-3’
pCMV5F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAAC-3’
pCMV5R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTC-3’
ABO-E7-1R 5’-GTAGAAATCGCCCTCGTCCT-3’
ABO-E7-2F 5’-AGGTGGATTACCTGGTGTGC-3’
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’。
与现有技术相比，本发明的创新点和积极效果是：
1、本发明中扩增引物设计是多重PCR扩增的关键，有关扩增引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据Genebank(序列号：AC000397)中人类ABO血型基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而设计获得的。所有扩增引物的设计均避开突变位点，以免因位点的漏检而导致分型的错误。ABO基因序列长，外显子多，扩增难度较大。本发明在扩增引物设计时，既要考虑突变位点的漏检，同时也考虑了实验条件的统一优化和简便性。对ABO基因的7个外显子分成两组多重PCR扩增，一组包含1-4号外显子，另一组包含5-7号外显子，扩增引物的巧妙设计保证了各对扩增引物能在同一退火温度下达到有效扩增。并同时针对1号外显子GC含量高，扩增难度大的问题，本发明在多重PCR的扩增体系中，引入了GC缓冲液，促使两组PCR扩增过程中，扩增体系的统一性和扩增条件的统一性，大大简化了实验操作流程，提高工作效率，同时大大缩减了实验成本，与常规的PCR方法相比较，操作步骤缩减1/3，反应时间约为原来的1/4，效率提高了3-4倍左右，成本缩减了1/3，同时所得结果可保证ABO基因7个外显子的有效扩增。
2、为后续测序步骤的简化方便，我们在设计扩增引物时，创新性的加入通用接头(除7号外显子扩增引物ABO-E7F和ABO-E7R外)。正向扩增引物5’端依据后续组合情况分别连接有M13载体正向序列上的18个碱基序列TGTAAAACGACGGCCAGT、pCMVF-BD正向序列上的20个碱基序列TCTAAAAGCTGCGGAATTGT、pDC316正向序列上的18个碱基序列ACGTGGGTATAAGAGGCG，pCMV5正向序列上的20各个碱基TTCCAAAATGTCGTAATAAC。反向扩增引物5’端分别连接有M13载体反向序列上的18个碱基序列CAGGAAACAGCTATGACC，pCMV反向序列上的20个碱基序列TCCAAACTCATCAATGTATC，pDC316反向序列上的18个碱基序列CGATGCTAGACGATCCAG，pCMV5反向序列上的20个碱基序列ATTATAGAGGACACCTAGTC。(接头引物可以互换，但同一组内应不同)。测序引物的设计能保证清晰准确测得所扩增片段的序列，通过对这些序列进行双向测序，从而保证样本进行精确的基因分型。同时降低了约1/3的测序成本，提高50％的测序效率。
3、本发明通过对ABO血型系统抗原基因1-7号外显子进行分组多重PCR-SBT测序分析，获得ABO抗原基因分型的寡核苷酸序列，精确地对其基因进行定型。随着DNA序列分析仪的普及，PCR-SBT技术广泛应用于临床检测，高通量地获得ABO抗原的所有编码序列信息，在疑难血型基因分型、基因多态性检测、频率调查分析等方面的应用将受到广泛重视。
4、本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了ABO抗原系统快速准确定型的问题，发挥多重PCR-SBT对ABO基因分型操作，同时实现高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明对两个个体的ABO抗原基因两组多重PCR检测方法的扩增电泳图谱，M为DNA分子Marker DL2000；1-2为人DNA样本第1组4重PCR扩增1-4号外显子；3-4为人DNA样本第2组3重PCR扩增5-7号外显子。
图2为1号样本ABO基因1-7号外显子测序全部图谱。
图3为2号样本ABO基因1-7号外显子测序全部图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。
本实施具体以献血者的血液为检测样本进行人类血型系统ABO抗原基因的分型为例对本发明内容做详细说明。
本发明的分组多重PCR-SBT方法包括以下步骤：
1、合成14条扩增引物和12条寡核苷酸测序引物，具体引物序列见发明内容和序列表中的基因序列，此处不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至50μM。
2、制备2个人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
取待检全血200μl，按照QuickGene DNA whole blood kit S试剂盒说明书提取基因组DNA，利用分光光度计测定基因组浓度和纯度。
3、2组多重PCR同步扩增ABO基因1-7号外显子。
准备LA Taq酶(TaKaRa)、2×GC bufferⅠ(内含Mg2+，Lot：A2801A，TaKaRa)、dNTP(Lot：CBG4301A，TaKaRa)、纯水，与步骤2所制备的PCR扩增DNA模板，每个样本按表1所述体系配制2组PCR扩增体系。
表1
上表中，引物1-8分别代表不同的ABO外显子扩增引物：第1组4重PCR扩增ABO基因外显子1-4，第2组3重PCR扩增外显子5-7。
用PCR仪(ABI9700)按以下程序扩增：
95℃预变性5min，DNA双链充分解开；95℃变性30s，60℃退火30s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸1min，延长所需扩增片段，反应30个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。图1为本发明对2个个体的ABO抗原基因2组多重PCR检测方法的扩增电泳图谱，M为DNA分子Marker DL2000；1-2为人DNA样本第1组4重PCR扩增1-4号外显子；3-4为人DNA样本第2组3重PCR扩增5-7号外显子。
4、扩增产物的双酶切纯化。
将检测样本所扩增片段，各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶(SAP，1U/μl，Lot：M820A，Promega)和核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ，5U/μl，Lot：CK11011B，TaKaRa)，利用虾碱性磷酸酶(SAP)的核苷酸5′端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ)的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在20μl扩增产物体系中加入SAP 1μl和Exo-Ⅰ2μl，37℃，进行30min酶切反应，80℃下15min酶失活。
5、PCR产物进行测序反应。
将步骤3中纯化之后的PCR产物加入20μl纯水稀释，混匀，将12条寡核苷酸测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDye terminator v3.1sequencing kit(美国ABI公司)试剂按照表2配制反应体系。
表2
| 5×缓冲液 | 1.5 |
| BigDye mix | 1.0 |
| 测序引物1 | 1.0 |
| DNA | 2.0 |
| H<sub>2</sub>O | 4.5 |
| 总体积 | 10.0 |
| 5×缓冲液 | 1.5 |
其中，当DNA为第1组PCR产物(1-4号外显子)时，寡核苷酸测序引物1为M13F、M13R、pDC316F、pDC316R、pCMVF-BD、pCMVR、pCMV5F、pCMV5R中任意一条；但DNA为第2组PCR产物(5-7)时，测序引物1为pCMVF-BD、pCMVR、M13F、M13R、ABO-E7-1R、ABO-E7-2F、ABO-E7F、ABO-E7R中任意一条。
所测样本以扩增纯化的片段1:1稀释后作为模板，分别进行16个测序反应，用PCR仪(ABI9700)按以下程序扩增：预变性96℃1min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。然后冷却至12℃。
6、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤5中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1μl EDTA(1.25μM)和25μl醋酸钠(3M)/无水乙醇(1：40)混合液，充分混匀，3000g离心30min；去除上清，加入50μl75％乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。
7、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，确定ABO抗原的基因型，结果显示了检测样本ABO基因1-7号外显子的全部序列。图2-3分别为1号、2号血液检测样本进行ABO基因分型的测序电泳图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。1号样本全编码区测序结果显示，其突变点为28R、261G/del、297R、526S、657Y、703R、796M、803S、930R，基因分型结果为B310/O01。2号样本全编码区测序结果显示，其突变点为106K、188R、189Y、220Y、261G/del、297R、467Y、646W、681R、771Y、829R，基因分型结果为A102/O02。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省血液中心
<120> 一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法及试剂
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttccaaaatg tcgtaataac gccgtccctt cctagcag 38
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attatagagg acacctagtc ggcggtaggt gctgaaaata 40
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 38
<212> DNA
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<400> 4
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 6
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<212> DNA
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<211> 40
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<400> 10
tccaaactca tcaatgtatc ggaaaccgcc ctctaatacc 40
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgtgggtat aagaggcg 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgatgctaga cgatccag 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tctaaaagct gcggaattgt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tccaaactca tcaatgtatc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttccaaaatg tcgtaataac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
attatagagg acacctagtc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtagaaatcg ccctcgtcct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aggtggatta cctggtgtgc 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aggastcgct caggacagg 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccrgttctgc taaaaccaag 20
Claims (5)
1.一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，其特征在于：所述方法对ABO抗原基因全部1-7号外显子进行分组多重PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：
(1)设计并合成多重PCR扩增引物，其包含ABO抗原基因特异性序列和通用接头序列；
(2)制备人基因组DNA；
(3)两组多重PCR反应扩增人基因组DNA中ABO抗原基因1-7号外显子序列；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；
(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；
(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；
所述步骤(1)中多重PCR扩增引物序列分别为：
ABO基因1号外显子扩增引物：
ABO-E1F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAACGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
ABO-E1R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTCGGCGGTAGGTGCTGAAAATA-3’
ABO基因2号外显子扩增引物：
ABO-E2F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT GTAAAGTGGGGCAGGTGAGA-3’
ABO-E2R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC TGATACTTGGGGAGCTCAGG-3’
ABO基因3号外显子扩增引物：
ABO-E3F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG ACCAACAGGCAGTCTTCGTT-3’
ABO-E3R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG TGTAGGGGTGAGAGCAAAGG-3’
ABO基因4号外显子扩增引物：
ABO-E4F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGTTGCCCTAAATCCTGCTCCTA-3’
ABO-E4R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATCGCTGCAGGACAATTCTGTGA-3’
ABO基因5号外显子扩增引物：
ABO-E5F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT GTCAATGCCCAGTCATGGTT-3’
ABO-E5R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC GGAAACCGCCCTCTAATACC-3’
ABO基因6号外显子扩增引物：
ABO-E6F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGGMAGAAGCTGAGTGGAG-3’
ABO-E6R 5’-CAGGAAACAGCTATGACCC CTACCMTCTGGGAGGACAA-3’
ABO基因7号外显子扩增引物：
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’
所述步骤(3)中两组多重PCR反应体系包括：
第1组4重PCR反应体系为：2×GC buffer 10μl；2.5mM dNTP 1.6μl；50mM所述扩增引物ABO-E1F 0.12μl+ABO-E1R 0.12μl、ABO-E2F 0.08μl+ABO-E2R 0.08μl、ABO-E3F 0.08μl+ABO-E3R 0.08μl、ABO-E4F 0.08μl+ABO-E4R 0.08μl；5U/μl LA Taq酶0.1μl，100ng/μl DNA2.0μl；以H2O 5.58μl补足至20μl；
第2组3重PCR反应体系为：2×GC buffer 10μl；2.5mM dNTP 1.6μl；50mM所述扩增引物ABO-E5F 0.08μl+ABO-E5R 0.08μl、ABO-E6F 0.2μl+ABO-E6R 0.2μl、ABO-E7F 0.12μl+ABO-E7R 0.12μl；5U/μl LA Taq酶0.1μl，100ng/μl DNA 2.0μl；以H2O 5.5μl补足至20μl。
2.如权利要求1所述的人红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，其特征在于：所述步骤(3)中两组多重PCR反应程序均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，反应30个循环；72℃，延伸10min；然后冷却至12℃。
3.如权利要求1所述的人红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，其特征在于：所述步骤(5)中寡核苷酸测序引物序列分别如下：
M13F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
pDC316F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG-3’
pDC316R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG-3’
pCMVF-BD 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3’
pCMVR 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC-3’
pCMV5F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAAC-3’
pCMV5R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTC-3’
ABO-E7-1R 5’-GTAGAAATCGCCCTCGTCCT-3’
ABO-E7-2F 5’-AGGTGGATTACCTGGTGTGC-3’
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’。
4.如权利要求1所述的人红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，其特征在于：所述步骤(4)中双酶切纯化所需的两种酶分别为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
5.一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型试剂，其特征在于：所述试剂由用于扩增人类血型系统ABO抗原基因1-7号外显子的14条多重PCR扩增引物和用于测序分析的12条寡核苷酸测序引物组成；所述多重PCR扩增引物序列分别为：
ABO基因1号外显子扩增引物：
ABO-E1F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAACGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’
ABO-E1R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTCGGCGGTAGGTGCTGAAAATA-3’
ABO基因2号外显子扩增引物：
ABO-E2F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT GTAAAGTGGGGCAGGTGAGA-3’
ABO-E2R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC TGATACTTGGGGAGCTCAGG-3’
ABO基因3号外显子扩增引物：
ABO-E3F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG ACCAACAGGCAGTCTTCGTT-3’
ABO-E3R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG TGTAGGGGTGAGAGCAAAGG-3’
ABO基因4号外显子扩增引物：
ABO-E4F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGTTGCCCTAAATCCTGCTCCTA-3’
ABO-E4R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATCGCTGCAGGACAATTCTGTGA-3’
ABO基因5号外显子扩增引物：
ABO-E5F 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT GTCAATGCCCAGTCATGGTT-3’
ABO-E5R 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC GGAAACCGCCCTCTAATACC-3’
ABO基因6号外显子扩增引物：
ABO-E6F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGGMAGAAGCTGAGTGGAG-3’
ABO-E6R 5’-CAGGAAACAGCTATGACCC CTACCMTCTGGGAGGACAA-3
ABO基因7号外显子扩增引物：
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’；
所述寡核苷酸测序引物序列分别如下：
M13F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
pDC316F 5’-ACGTGGGTATAAGAGGCG-3’
pDC316R 5’-CGATGCTAGACGATCCAG-3’
pCMVF-BD 5’-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3’
pCMVR 5’-TCCAAACTCATCAATGTATC-3’
pCMV5F 5’-TTCCAAAATGTCGTAATAAC-3’
pCMV5R 5’-ATTATAGAGGACACCTAGTC-3’
ABO-E7-1R 5’-GTAGAAATCGCCCTCGTCCT-3’
ABO-E7-2F 5’-AGGTGGATTACCTGGTGTGC-3’
ABO-E7F 5’-AGGASTCGCTCAGGACAGG-3’
ABO-E7R 5’-CCRGTTCTGCTAAAACCAAG-3’。
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