CN110331193B - 一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体kir3dl2基因分型的pcr-sbt方法及试剂 - Google Patents
一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体kir3dl2基因分型的pcr-sbt方法及试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR‑SBT方法。本发明还涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了KIR3DL2精确分型的问题，发挥PCR‑SBT对KIR3DL2分型操作简便、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法。本发明还涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)属于免疫球蛋白样超家族，主要表达于NK细胞和T细胞表面，通过与靶细胞表面的HLA-I类分子(配基)相互作用传导抑制或者激活信号，从而调节NK细胞和T细胞的抑制和杀伤活性，在肿瘤免疫、清除老化变异细胞、抗感染免疫、母胎耐受、器官移植和自身免疫性疾病等生理病理过程中起着重要的作用。KIR3DL2属于抑制性KIR基因，研究显示这些抑制性KIR基因具有高度遗传多态性，分析明确其在人群中的分布对于研究调控NK细胞功能具有重要的意义。
KIR3DL2基因位于第19号染色体，由9个外显子编码。目前实验室检测KIR3DL2基因常见的分型技术为PCR-SSP、PCR-SSOP和PCR-SBT方法，前两种方法只能提供低分辨的结果，尚无法确定其等位基因型；PCR-SBT的方法可以提供高分辨的结果，但是由于KIR基因的特殊性，同一个基因座位上可能同时存在一个以上的等位基因，而且KIR基因家族具有高度相似性，KIR高分辨检测存在一定的难度，目前国外仅有少数实验室开展KIR3DL2基因的高分辨研究工作。现有的PCR-SBT方法只是针对KIR3DL2基因部分外显子，随着KIR3DL2新等位基因的不断发现，先前的方法如不及时进行改进和提升，则存在着漏检和错检的可能。因此有必要系统建立一种针对KIR3DL2基因编码区全长序列的高分辨分型的方法来解决目前的问题。
本发明提供了一种针对KIR3DL2基因全部编码区序列进行扩增和测序的PCR-SBT方法，最终获得准确的KIR3DL2高分辨分型的结果。
发明内容
针对现有技术中KIR3DL2基因分型技术的缺陷，本发明的第一个目的在于提供了一种用于人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL2基因的PCR-SBT高分辨测序分型方法，本发明所提供的方法可以对KIR3DL2基因全部编码区序列进行分析，获得准确的KIR3DL2等位基因分型结果，解决了现有KIR3DL2基因分型技术存在的问题。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：
(1)设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；
(2)制备人基因组DNA；
(3)分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；
(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；
(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；
所述步骤(1)中PCR扩增引物序列分别为：
KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：
5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：
E1F 5'-GTCGTCAGCATGGYGTGC-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：
F3 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'；
所述步骤(3)中4组PCR反应体系包括：
第1组扩增KIR3DL2基因第1号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，5UTR和I2R各0.2μl，引物0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl；
第2组扩增KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的反应体系：10×LA buffer2.5μl；2.5mM dNTP 2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，E1F和i6R各0.2μl；5U/μlLA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl；
第3组扩增KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的反应体系：10×LA buffer2.5μl；2.5mM dNTP 2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，F3和E9R各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl；
第4组扩增KIR3DL2基因第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，E7F和3UTR各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中PCR反应程序包括3组，分别为：
第1组用于扩增第1号外显子和第9号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，66℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；
第2组用于扩增第2号外显子至第6号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃退火45s，72℃延伸8min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；
第3组用于扩增第6号外显子至第9号外显子的反应程序：94℃预变性1min，98℃变性10s，68℃延伸10min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(5)中寡核苷酸测序引物序列分别如下：
5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
i1SF1 5'-CTGTTCTTGGCAGCAGGTA-3'
i2R2 5'-GTCTCACCCCAGTCTTCAC-3'
i2F2 5'-CTTAGAAAGYGGAAATGGGAG-3'
i3R2 5'-ACAGTKATTCTTCCCACCACA-3'
i3F1 5'-AAGACAAATGGAGGGACCTG-3'
i4R1 5'-CCTCACCGAGTCAGTCTCT-3'
i4F1 5'-GGAAATAGACATGAAGAGAGT-3'
i5SR1 5'-GTCTTCGTGTTCTCTCTGCA-3'
i5SF1 5'-AGGGTCCAACATTAGATAACA-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
i6F1 5'-GTCAATCAAGAAATGAGACAA-3'
i7R2 5'-GCAATGGTCTGTGAGCTGAA-3'
i7SF1 5'-GGAGACAGAATCAATGGGAT-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(4)中双酶切纯化所需的两种酶分别为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种针对人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL2基因全部编码区序列的PCR-SBT基因分型试剂。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂，所述试剂由用于扩增KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子的8条PCR扩增引物和用于测序分析的18条寡核苷酸测序引物组成；所述PCR扩增引物序列分别为：
KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：
5'-UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：
E1F 5'-GTCGTCAGCATGGYGTGC-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：
F3 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：
3'-UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
所述寡核苷酸测序引物序列分别如下：
5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
i1SF1 5'-CTGTTCTTGGCAGCAGGTA-3'
i2R2 5'-GTCTCACCCCAGTCTTCAC-3'
i2F2 5'-CTTAGAAAGYGGAAATGGGAG-3'
i3R2 5'-ACAGTKATTCTTCCCACCACA-3'
i3F1 5'-AAGACAAATGGAGGGACCTG-3'
i4R1 5'-CCTCACCGAGTCAGTCTCT-3'
i4F1 5'-GGAAATAGACATGAAGAGAGT-3'
i5SR1 5'-GTCTTCGTGTTCTCTCTGCA-3'
i5SF1 5'-AGGGTCCAACATTAGATAACA-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
i6F1 5'-GTCAATCAAGAAATGAGACAA-3'
i7R2 5'-GCAATGGTCTGTGAGCTGAA-3'
i7SF1 5'-GGAGACAGAATCAATGGGAT-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'。
与现有技术相比，本发明的创新点和积极效果是：
(1)本发明中扩增引物设计是长片段PCR扩增的关键，有关扩增引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本发明所设计的扩增引物是参照IPD-KIR基因数据库，所有扩增引物的设计均避开突变点，以免因为等位基因的漏检而导致分型错误。KIR3DL2基因组全长约16kb，编码区包括9个外显子，加之KIR3DL2基因序列与其他KIR基因高度同源，因此扩增难度较大。本发明在扩增引物设计时，采取分段重叠扩增的策略，将全长序列分为4组进行扩增，由于第6内含子序列较长，因此我们在第6内含子上游和起始端分别设计了引物序列，分别扩增了第2号外显子至第6号外显子的片段和第6号外显子至第9号外显子的片段，这种重叠扩增可以有效保证KIR3DL2基因全长的拼接，同时考虑到第1号外显子和第9号外显子的多态性位点，我们又分别在5'-UTR和3'-UTR位置进行了引物设计，分别扩增了第1号外显子和第9号外显子，这样通过4对扩增引物保证了KIR3DL2基因全长序列的扩增。
(2)本发明对KIR3DL2基因编码区全长包括9个外显子，分别采用正反双向测序引物进行测序分析，获得了KIR3DL2基因编码区全长序列多态性特征，并通过与IPD-KIR数据库进行比对，实现对样本KIR3DL2等位基因的精确分型。随着DNA序列分析仪的普及，PCR-SBT技术广泛应用于临床检测，如骨髓移植的HLA、KIR测序分型、临床输血中ABO疑难血型的鉴定等。获得的所有KIR3DL2基因编码区全长序列精确信息在KIR等位基因分型、基因多态性检测、群体遗传学方面等方面的应用受到广泛重视。
(3)本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，可以用于KIR3DL2基因的高分辨分型，发挥PCR-SBT方法对KIR3DL2基因分型操作简便，结果精确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明对个体的KIR3DL2基因分组PCR扩增的电泳图谱，M为DNA分子MarkerDL2000；1-2为1号样本和2号样本第1外显子PCR扩增示意图，3-4为1号样本和2号样本第2号外显子至第6号外显子PCR扩增示意图，5-6为1号样本和2号样本第6号外显子至第9号外显子PCR扩增示意图，7-8为1号样本和2号样本第9号外显子PCR扩增示意图。
图2a为1号样本KIR3DL2基因第1号外显子至第4号外显子测序图谱，图2b为第5号外显子至第9号外显子测序图谱，等位基因型为KIR3DL2*00201。
图3a为2号样本KIR3DL2基因第1号外显子至第4号外显子测序图谱，图3b为第5号外显子至第9号外显子测序图谱，等位基因型为KIR3DL2*00701。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。
本实施具体以献血者的血液为检测样本进行人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL2基因分型为例对本发明内容做详细说明。
本发明的PCR-SBT方法包括以下步骤：
1、合成8条扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，具体引物序列见发明内容和序列表中的基因序列，此处不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至50μM。
2、制备1个人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
取待检全血200μl，按照QuickGene DNA whole blood kit S试剂盒说明书提取基因组DNA，利用分光光度计测定基因组浓度和纯度。
3、4组PCR扩增引物同时扩增KIR3DL2基因第1外显子至第9外显子。
准备LA-Taq酶(TaKaRa)、10×LA buffer、MgCl2、dNTP(Lot：CBG4301A，TaKaRa)、纯水，与步骤2所制备的PCR扩增DNA模板，每个样本按表1所述体系配制4组PCR扩增体系。
表1
上表中，第1组PCR扩增KIR3DL2第1号外显子，第2组PCR扩增KIR3DL2第2号外显子至第6号外显子，第3组PCR扩增KIR3DL2第6号外显子至第9号外显子，第4组PCR扩增KIR3DL2第9号外显子。
用PCR仪(ABI9700)按以下程序扩增：
第1组PCR反应程序为：94℃预变性2min，DNA双链充分解开；98℃变性10s，66℃退火45s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸1min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
第2组PCR反应程序为：94℃预变性2min，DNA双链充分解开；98℃变性10s，68℃退火45s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸8min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
第3组PCR反应程序为：94℃预变性2min，DNA双链充分解开；98℃变性10s，66℃退火45s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸1min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
第4组PCR反应程序为：94℃预变性2min，DNA双链充分解开；98℃变性10s，66℃退火45s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸1min，延长所需扩增片段，反应35个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
图1为本发明检测样本的KIR3DL2基因PCR扩增的电泳图谱，M为DNA分子MarkerDL2000；1-4分别为人DNA样本第1组PCR扩增第1号外显子、第2组PCR扩增第2号至第6号外显子、第3组PCR扩增第6号至第9号外显子、第4组PCR扩增第9号外显子。
4、扩增产物的双酶切纯化。
将检测样本所扩增片段，各取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶(SAP，1U/μl，Lot：M820A，Promega)和核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ，5U/μl，Lot：CK11011B，TaKaRa)，利用虾碱性磷酸酶(SAP)的核苷酸5′端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ)的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在20μl扩增产物体系中加入SAP 1μl和Exo-Ⅰ2μl，37℃，进行30min酶切反应，80℃下15min酶失活。
5、PCR产物进行测序反应。
将步骤3中纯化之后的PCR产物加入20μl纯水稀释，混匀，将18条寡核苷酸测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDye terminator v3.1sequencing kit(美国ABI公司)试剂按照表2配制反应体系。
表2
| 5×缓冲液 | 2.0 |
| BigDye mix | 1.0 |
| 测序引物1 | 1.0 |
| DNA | 2.0 |
| H<sub>2</sub>O | 4.0 |
| 总体积 | 10.0 |
其中，当DNA为第1组PCR产物(第1号外显子)时，寡核苷酸测序引物1为5UTR、I2R中任意一条；DNA为第2组PCR产物(第2外显子至第6外显子)时，测序引物1为i1SF1、i2R2、i2F2、i3R2、i3F1、i4R1、i4F1、i5SR1、i5SF1、i6R1中任意一条；DNA为第3组PCR产物(第6外显子至第9外显子)时，测序引物1为i6F1、i7R2、i7SF1、E9R中任意一条；DNA为第4组PCR产物(第9外显子)时，测序引物1为E7R、3UTR中任意一条。
所测样本以扩增纯化的片段1:1稀释后作为模板，分别进行18个测序反应，用PCR仪(ABI9700)按以下程序扩增：预变性96℃1min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。然后冷却至12℃。
6、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤5中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1μl EDTA(1.25μM)和25μl醋酸钠(3M)/无水乙醇(1：40)混合液，充分混匀，3000g离心30min；去除上清，加入50μl75％乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。
7、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，确定KIR3DL2的基因型，结果显示了检测样本KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子的全部序列。图2a为1号样本KIR3DL2基因第1号外显子至第4号外显子测序图谱，图2b为第5号外显子至第9号外显子外显子测序图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶，样本全编码区测序结果显示，其基因分型结果为KIR3DL2*00201。图3a为2号样本KIR3DL2基因第1号外显子至第4号外显子测序图谱，图3b为第5号外显子至第9号外显子测序图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶，样本全编码区测序结果显示，其基因分型结果为KIR3DL2*00701。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省血液中心
<120> 一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法及试剂
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctcatgca aggtagaaag a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggggamgg actcacccat ga 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgtcagca tggygtgc 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agacaggccc tcattcacag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcacccac agaaccaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttcacccac agaaccaagc 20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcctcctc ctcttctttc tccttt 26
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagaaggctg aaagatagtc tga 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcctcatgca aggtagaaag a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggggamgg actcacccat ga 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgttcttgg cagcaggta 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtctcacccc agtcttcac 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttagaaagy ggaaatggga g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acagtkattc ttcccaccac a 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagacaaatg gagggacctg 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctcaccgag tcagtctct 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggaaatagac atgaagagag t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtcttcgtgt tctctctgca 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agggtccaac attagataac a 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agacaggccc tcattcacag 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtcaatcaag aaatgagaca a 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcaatggtct gtgagctgaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggagacagaa tcaatgggat 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttcacccac agaaccaagc 20
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
catcctcctc ctcttctttc tccttt 26
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cagaaggctg aaagatagtc tga 23
Claims (4)
1.一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：
(1)设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；
(2)制备人基因组DNA；
(3)分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；
(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；
(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；
所述步骤(1)中PCR扩增引物序列分别为：
KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：
5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：
E1F 5'-GTCGTCAGCATGGYGTGC-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：
F3 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'；
所述步骤(3)中4组PCR反应体系包括：
第1组扩增KIR3DL2基因第1号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，5UTR和I2R各0.2μl，引物0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl；
第2组扩增KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP 2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，E1F和i6R各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl；
第3组扩增KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP 2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，F3和E9R各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl；
第4组扩增KIR3DL2基因第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5mM dNTP2.0μl；25mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50μM，E7F和3UTR各0.2μl；5U/μl LA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；以H2O 15.6μl补足至25μl；
所述步骤(5)中寡核苷酸测序引物序列分别如下：
5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
i1SF1 5'-CTGTTCTTGGCAGCAGGTA-3'
i2R2 5'-GTCTCACCCCAGTCTTCAC-3'
i2F2 5'-CTTAGAAAGYGGAAATGGGAG-3'
i3R2 5'-ACAGTKATTCTTCCCACCACA-3'
i3F1 5'-AAGACAAATGGAGGGACCTG-3'
i4R1 5'-CCTCACCGAGTCAGTCTCT-3'
i4F1 5'-GGAAATAGACATGAAGAGAGT-3'
i5SR1 5'-GTCTTCGTGTTCTCTCTGCA-3'
i5SF1 5'-AGGGTCCAACATTAGATAACA-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
i6F1 5'-GTCAATCAAGAAATGAGACAA-3'
i7R2 5'-GCAATGGTCTGTGAGCTGAA-3'
i7SF1 5'-GGAGACAGAATCAATGGGAT-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'；
所述步骤(5)中测序PCR反应体系为：
5×buffer 2.0μl；Bigdye mix 1.0μl；寡核苷酸测序引物浓度3.2μM，选择18条寡核苷酸测序引物中任意一条，1.0μl；纯化后PCR产物以纯水进行1:1稀释后总计2.0μl；以H2O4.0μl补足至10μl；
所述步骤(5)中测序PCR反应程序为：
96℃预变性1min，96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环，然后冷却至12℃。
2.根据权利要求1所述的人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR反应程序包括3组，分别为：
第1组用于扩增第1号外显子和第9号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，66℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；
第2组用于扩增第2号外显子至第6号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃退火45s，72℃延伸8min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；
第3组用于扩增第6号外显子至第9号外显子的反应程序：94℃预变性1min，98℃变性10s，68℃延伸10min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃。
3.根据权利要求1所述的人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述步骤(4)中双酶切纯化所需的两种酶分别为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
4.一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂，其特征在于：所述试剂由用于扩增KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子的8条PCR扩增引物和用于测序分析的18条寡核苷酸测序引物组成；所述PCR扩增引物序列分别为：
KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：
5'-UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：
E1F 5'-GTCGTCAGCATGGYGTGC-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：
F3 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：
3'-UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
所述寡核苷酸测序引物序列分别如下：
5UTR 5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'
I2R 5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'
i1SF1 5'-CTGTTCTTGGCAGCAGGTA-3'
i2R2 5'-GTCTCACCCCAGTCTTCAC-3'
i2F2 5'-CTTAGAAAGYGGAAATGGGAG-3'
i3R2 5'-ACAGTKATTCTTCCCACCACA-3'
i3F1 5'-AAGACAAATGGAGGGACCTG-3'
i4R1 5'-CCTCACCGAGTCAGTCTCT-3'
i4F1 5'-GGAAATAGACATGAAGAGAGT-3'
i5SR1 5'-GTCTTCGTGTTCTCTCTGCA-3'
i5SF1 5'-AGGGTCCAACATTAGATAACA-3'
i6R 5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'
i6F1 5'-GTCAATCAAGAAATGAGACAA-3'
i7R2 5'-GCAATGGTCTGTGAGCTGAA-3'
i7SF1 5'-GGAGACAGAATCAATGGGAT-3'
E9R 5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'
E7F 5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'
3UTR 5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'。
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