CN109022594B - 一种与肉牛饲料转化效率有关的牛ahsg基因snp标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与肉牛饲料转化效率有关的牛AHSG基因SNP标志物，该标志物为AHSG基因chr1:198654887位点C‑T的突变。本发明还提供了用于检测所述的SNP标志物的特异性引物。利用本发明所提供的方法可以通过对牛AHSG基因单碱基多态的判断获得肉牛料肉比性状的优劣，从而为肉牛的育种工作提供指导，选育具有最低料肉比的TT型肉牛进行育种和培养。

Description

一种与肉牛饲料转化效率有关的牛AHSG基因SNP标志物

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种肉牛饲料转化率性状相关的SNP标志物检测方法及其应用。

背景技术

我国肉牛产业高速发展，在畜牧业中所占的产值比重逐年增高，已为畜牧业的支柱产业。肉牛养殖已成为农民增收的主要途径。系统分析我国牛肉生产成本等诸多因素，饲料转化效率为关键因素之一。饲料成本占养殖成本比例最大且可调控，因此提高饲料效率，降低饲养成本，能够提升整个生产体系的效率，使养殖业利润得到增加。

料肉比是反映饲料转化效率的可遗传性状，独立于生产水平、体格大小等性状，被认为是测定饲料利用效率的主要参考方法。饲料转化效率高的动物料肉比低或者为负值，饲料效率越高的动物，其料肉比越低。选择低料肉比水平的家畜能够在不影响动物的生长速度和繁殖性能以及肉质性状的前提下，提高饲料的利用率，降低饲养成本，减少动物的粪便排放以及碳排放，从而实现减少饲料成本，降低空气污染，提高养殖业利润。因此找到影响料肉比的基因标记，结合表型进行标记辅助选择有着非常重要的意义。

SNP为第三代遗传标志，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。具有数量多、分布广泛、高频率、低突变率等优点，适于快速、规模化筛查，现已应用于基因组分析、生物信息自动化检测、简单和复杂疾病的遗传研究、畜牧育种遗传标记研究等。牛α2-HS糖蛋白基因(AHSG)与骨密度、大小以及糖脂代谢等密切相关，但目前还没有就该基因的单核苷酸多态性与饲料效率(料肉比)相关性的报道。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种与肉牛饲料转化效率有关的牛AHSG基因SNP标志物及其检测方法，依据多态性进行肉牛饲料利用效率的判定。

本发明的技术方案如下：

本发明的发明人研究了草原红牛资源群体，测定了料肉比等生产性状，对AHSG(NCBI登录号：NC_019458.2)基因设计引物进行长片段PCR扩增，PCR产物胶回收后于金唯智生物有限公司Sanger测序平台进行测序和NCBI-Blast筛选SNPs，结果在基因组位置为1号染色体正链198654887的位点找到一个C-T的突变，对应AHSG基因的CDS区(外显子7的871bp处)发生CCC(脯氨酸)-CCT(脯氨酸)的同义突变。

以该SNP位点上下游序列为模板设计基因分型引物(F1和F2)，利用PCR测序的方法进行基因分型，利用SPSS 22.0统计软件对不同基因型所对应的料肉比性状均值进行差异显著性检验。

CC型纯合子的料肉比为6.01±0.98，CT型杂合子的料肉比为7.30±2.88，TT型纯合子的料肉比为5.26±0.60，结果显示TT型纯合子的料肉比性状显著低于杂合子CT(P<0.05)，低于CC型纯合子。

由此，得到一种与牛料肉比性状有关的牛AHSG基因SNP标志物，该标志物为AHSG基因chr1:198654887位点(外显子7的871bp处)C-T的突变。

本发明的检测方法具体通过以下技术方案实现：

本发明还提供了一种用于检测所述的SNP标志物的特异性引物，所述的引物包括上游引物和下游引物：

1、所述的上游引物(F1)为：5'-AACGGTCCTCTTTCCTCCAGC-3'；

所述的下游引物(F2)为：5'-TGTGCCAAACCATCTCATCTCC-3'；

2、本发明所述的基因检测引物的PCR反应体系为：取2×Taq Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH₂O补齐至20μL。

本发明所述的基因检测引物的PCR反应条件为：94℃5min，94℃ 30s，59℃退火30s，72℃24s，72℃8min，4℃保存。从第二步开始到第四步45个循环。

3、提取肉牛样品的基因组DNA，并将基因组保存于-20℃～-15℃。

4、以步骤(3)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增草原红牛基因，所述的PCR包括上游引物：5'-AACGGTCCTCTTTCCTCCAGC-3'和下游引物：5'-TGTGCCAAACCATCTCATCTCC-3'；

5、PCR反应体系为：取2×Taq Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH₂O补齐至20μL。PCR反应条件为94℃ 5min，94℃ 30s，59℃退火30s，72℃24s，72℃8min，4℃保存。从第二步开始到第四步45个循环。

6、反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min；

7、确定目的条带后将剩余样品进行胶回收送到测序公司测序。

获得牛AHSG基因chr1:198654887位点上下游共369bp的序列：AACGGTCCTCTTTCCTCCAGCCTGTGATTCCGCAGCCCCAGCCCGACGGCGCCGAGGCTGAGGCCCCAAGCGCTGTGCCGGACGCAGCTGGGCCTACGCCTTCTGCAGCTGGCCCGCC[C/T]GTGGCCTCCGTGGTGGTGGGGCCAAGCGTGGTAGCAGTTCCCCTGCCGCTGCACCGAGCACACTACGACTTGCGCCACACTTTCTCCGGGGTGGCCTCAGTGGAGTCATCCTCGGGAGAAGCGTTCCACGTGGGCAAAACACCCATAGTGGGGCAGCCTAGCATTCCTGGAGGTCCAGTCCGCCTTTGCCCAGGGAGAATCAGATACTTCAAGATCTAGAAGATGGTCGGAGATGAGATGGTTTGGCACA，其中[C/T]所标注的位置为SNP位点。

本发明还提供所述的肉牛料肉比性状相关的基因的检测引物在制备检测肉牛料肉比性状相关基因的试剂盒中应用，所述的试剂盒包括上游引物：5'-AACGGTCCTCTTTCCTCCAGC-3'和下游引物：5'-TGTGCCAAACCATCTCATCTCC-3'。

本发明还提供了所述SNP标志物或所述引物在肉牛育种中的应用。所述应用包括：通过利用所述特异性引物对牛AHSG基因chr1:198654887位点(外显子7的871bp处)的基因型进行检测，选择与最低料肉比性状相关的TT型肉牛进行培育。

本发明的有益之处在于：本发明提供了一种与肉牛饲料转化效率有关的牛AHSG基因SNP标志物，该标志物为AHSG基因chr1:198654887位点C-T的突变。本发明还提供了用于检测所述的SNP标志物的特异性引物。利用本发明所提供的方法可以通过对牛AHSG基因单碱基多态的判断获得肉牛料肉比性状的优劣，从而为肉牛的育种工作提供指导，选育具有最低料肉比的TT型肉牛进行育种和培养。

附图说明

图1：用本发明设计的引物对草原红牛基因组DNA扩增得到369bp的特异性扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测的结果；其中M泳道为标准分子量Marker，其余1-5代表被检测的5个不同的肉牛个体PCR产物。

图2：草原红牛AHSG基因测序图和峰图。

具体实施方式

实施例：草原红牛AHSG基因多态性分析及与料肉比性状的连锁分析

本发明利用已克隆得到的AHSG基因序列(NCBI登录号：NC_019458.2)，设计特异性引物，克隆包括全部第7外显子的部分DNA序列，以草原红牛肝组织DNA为试验样品，利用Sanger测序技术对AHSG基因多态性检测，根据测序得到的不同基因型与料肉比性状数据结合进行分析，为优质草原红牛育种工作提供理论依据。

引物设计：以草原红牛AHSG基因DNA序列为参照，根据常规引物要求设计引物1对，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，目的片段长度为369bp。引物序列：

AHSG基因exon7PCR扩增上游引物序列(F1)：5'-AACGGTCCTCTTTCCTCCAGC-3'

AHSG基因exon7PCR扩增下游引物序列(F2)：5'-TGTGCCAAACCATCTCATCTCC-3'

通过梯度PCR试验确定最佳试验温度，在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×r Taq Mix 10μL，上下游引物各0.5μL，DNA 1μL，用ddH₂O补齐至20μL。

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s；设置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸24s，从第二步开始35个循环；72℃延伸8min；4℃保存。取5μLPCR产物，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min。根据条带亮度及清晰度确定最终退火温度。

利用已经确定的退火温度，对草原红牛DNA样品进行PCR试验。在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×r Taq Mix 10μL，上下游引物各0.5μL，DNA 1μL，用ddH₂O补齐至20μL。

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s；设置59℃梯度退火30s；70℃延伸24s，从第二步开始35个循环；72℃延伸8min；4℃保存。

取每个样品的PCR产物5μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳。电压为130V，电泳约20min后，选择目的条带单一的样品进行纯化。

对条带单一的PCR产物进行纯化，试验采用AxyPrep PCR纯化试剂盒。

在PCR反应液中，加入3个体积的Buffer PCR-A(若Buffer PCR-A不足100uL，加至100uL)；混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管(试剂盒内提供)中，12000×g离心1min，弃滤液。

将制备管置回2mL离心管，加700uL Buffer W2，12 000×g离心1min，弃滤液。

将制备管置回2mL离心管，加400uL Buffer W2，12 000×g离心1min。

将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入25uL去离子水，室温静置1min。12 000×g离心1min洗脱DNA。

将洗脱好的DNA样品送到金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序。

用本发明设计的引物对草原红牛基因组DNA扩增得到369bp的特异性扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，见图1，其中M泳道为标准分子量Marker，其余为被检测的PCR产物。

测序后，与NCBI提供的原序列比对发现，在基因组位置为1号染色体正链198654887的位点找到一个C-T的突变，对应AHSG基因的CDS区(外显子7的871bp处)发生CCC(脯氨酸)-CCT(脯氨酸)的同义突变，氨基酸没有发生变化。基因型分为三个种，分别是CC型，CT型及TT型。基因型频率分别为0.65、0.32、0.03；等位基因C、T的基因频率分别为0.81与0.19。

表1草原红牛AHSG基因exon7的基因型频率、基因频率统计表

参照基因分型得到各个体的基因型，结合草原红牛资源群体的表型记录，利用SPSS 22.0统计软件进行基因型与料肉比性状的关联分析，结果显示TT型纯合子的料肉比性状显著低于杂合子CT型(P<0.05)，低于CC型纯合子。如表2所示。

表2不同基因型个体间料肉比性状差异显著性检验结果

注：不同小写字母间表示差异显著(P<0.05)

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种检测与肉牛饲料转化效率有关的SNP的引物在肉牛育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

预扩增 PCR：提取草原红牛的基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物为特异性引物，通过PCR反应扩增草原红牛基因；

鉴定 PCR：进行Sanger测序，鉴定PCR扩增产物，判定SNP位点的基因型；

选育具有最低料肉比的TT型肉牛进行育种和培养；

所述扩增草原红牛基因为牛AHSG基因chr1:198654887位点上下游共369bp的序列：AACGGTCCTCTTTCCTCCAGCCTGTGATTCCGCAGCCCCAGCCCGACGGCGCCGAGGCTGAGGCCCCAAGCGCTGTGCCGGACGCAGCTGGGCCTACGCCTTCTGCAGCTGGCCCGCC[C/T]GTGGCCTCCGTGGTGGTGGGGCCAAGCGTGGTAGCAGTTCCCCTGCCGCTGCACCGAGCACACTACGACTTGCGCCACACTTTCTCCGGGGTGGCCTCAGTGGAGTCATCCTCGGGAGAAGCGTTCCACGTGGGCAAAACACCCATAGTGGGGCAGCCTAGCATTCCTGGAGGTCCAGTCCGCCTTTGCCCAGGGAGAATCAGATACTTCAAGATCTAGAAGATGGTCGGAGATGAGATGGTTTGGCACA，其中[C/T]所标注的位置为SNP位点；

所述的上游引物为：5'-AACGGTCCTCTTTCCTCCAGC-3'；

所述的下游引物为：5'-TGTGCCAAACCATCTCATCTCC-3'。

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