CN112126688B

CN112126688B - 猪olr1基因中与繁殖性状相关的复等位基因分子标记及应用

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Publication number: CN112126688B
Application number: CN202010980723.8A
Authority: CN
Inventors: 乔木; 武华玉; 彭先文; 梅书棋; 吴俊静; 周佳伟; 张宇; 徐忠; 孙华; 刘贵生; 董斌科; 宋忠旭; 赵海忠; 李良华; 李梓芃
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: CN112126688A

Abstract

本发明公开了一种猪OLR1基因中与繁殖性状相关的复等位基因分子标记及应用，其中所述繁殖性状为总产仔数性状和产活仔数性状；所述分子标记位于猪OLR1基因第四内含子的部分DNA序列中，分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在该序列的第122bp处存在A>C，A>T，C>T三种类型的碱基突变；本发明还提供了扩增该分子标记的引物对及其应用。本发明首次发掘了猪OLR1基因中与猪繁殖性状相关的复等位基因分子标记g.61808357A>C或A>T或C>T，为猪的总产仔数性状和产活仔数性状标记辅助选择育种提供了一个新的分子育种标记，实现了对猪繁殖性状进行早期筛选，筛选方法简单快速。

Description

猪OLR1基因中与繁殖性状相关的复等位基因分子标记及应用

技术领域

本发明涉及猪分子标记技术领域，具体涉及一种猪OLR1基因中与繁殖性状相关的复等位基因分子标记及应用。

背景技术

猪的产仔数，包括总产仔数和产活仔数，是直接关系到养猪业的经济收益的重要经济性状，提高猪产仔数对提高养猪业的总体经济效益意义重大。但由于其遗传力低(0.1左右)，导致母猪繁殖性状常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，发展了常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以有效地加快猪产仔数性状的选择进展。因此，寻找控制猪产仔数性状的关键分子遗传标记，并将其用于分子标记辅助育种，对提高猪产仔数具有重要意义。

复等位基因(multiple allelism)是指同源染色体上同一位置上的等位基因的数目在两个以上，任何一个杂合的二倍体个体都只存在复等位基中的二个不同的等位基因。复等位基因是由基因突变形成的，它在同一位点存在两个以上的单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphsim，SNP)，因此可以用作分子标记。复等位基因在植物中比较常见，在人中常见的为ABO血型，在家畜中十分少见。

OLR1基因(oxidized low-density lipoprotein receptor1,OLR1)具有结合、氧化低密度脂蛋白的作用。大量研究表明，它与人类的心脑血管疾病形成有关；在脂肪细胞分化和增殖过程中有一定作用；此外，OLR1基因与脂肪沉积、牛的乳脂率、牛肉品质等性状相关。而有关OLR1基因对繁殖性能的影响还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种猪OLR1基因中与繁殖性状相关的复等位基因分子标记及应用，本发明发掘了OLR1基因第四内含子中与猪总产仔数和产活仔数性状关联的复等位基因分子标记，为猪繁殖性状的分子标记辅助育种提供了一种新的分子标记。

本发明的目的之一在于提供一种与猪繁殖性状相关的复等位基因分子标记，所述分子标记位于猪OLR1基因的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，在该序列的第122bp处存在A>C，A>T，C>T三种类型的碱基突变。

进一步的，所述序列中第122bp处的A或C或T的碱基多态性位点，表现为AA、AC、CC、AT或TC五种基因型，其中A等位基因为优势等位基因。

本发明的目的之二在于提供一种上述复等位基因分子标记在猪总产仔数性状和产活仔数性状标记辅助选择中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种用于扩增所述复等位基因分子标记的引物对，包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的目的之四在于提供一种上述引物对在猪总产仔数性状和产活仔数性状标记辅助选择中的应用。

本发明的目的之五在于提供一种猪的选育方法，包括：

S1、提取猪的基因组DNA；

S2、以步骤S1得到的基因组DNA作为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到复等位基因分子标记并纯化；

S3、对步骤S2纯化后的复等位基因分子标记进行测序分析，保留该序列第122bp处携带A等位基因和C等位基因的个体，淘汰携带T等位基因的个体。

进一步的，步骤S1中，从待测猪的耳缘组织中提取基因组DNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次发掘了猪OLR1基因中与猪繁殖性状相关的复等位基因分子标记(g.61808357A>C或A>T或C>T)，即在猪OLR1基因第四内含子的部分DNA序列中的某一个位点上存在3种SNP分子标记，该复等位基因分子标记可以作为猪繁殖性状的分子标记，具体为总产仔数性状和产活仔数性状的分子标记，为猪繁殖性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记，实现了对猪繁殖性状进行早期筛选，筛选方法简单快速。

附图说明

图1为本发明的技术路线示意图；

图2为本发明实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中标记：泳道M：DL2000Marker；泳道1-4为黑猪中的PCR扩增片段，片段大小为175bp；

图3为本发明实施例1中g.61808357A>C或A>T或C>T位点的测序图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1猪OLR1基因SNP检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立

1、猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和湖北天之力优质猪育种有限公司联合培育的黑猪，该黑猪是以恩施黑猪、梅山猪和湖北白猪为亲本培育的杂交后代。猪基因组DNA的提取采用Invitrogen公司生产的动物组织基因组DNA提取试剂盒(PureLink^TM Pro 96Genomic DNA Purification Kit,K182104A)，按该试剂盒说明书进行提取。对提取出的DNA进行浓度和质量检测，置于-20℃下保存备用。

2、猪OLR1基因SNP遗传标记检测片段的获得

(1)PCR扩增

根据猪OLR1基因的基因组序列(GenBank ID：NC_010447.5)中的SNP遗传标记检测序列(如SEQ ID NO.1所示)设计一对引物，扩增多态性位点的片段。引物如下：

上游引物：CCTCGGTGGAAGAGCATT

下游引物：CCACAGAACCAAAGGGAT

利用上述引物，以黑猪基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分为：基因组DNA 100ng、PCR mix 25μL、上述上下游引物各1μL、加ddH₂O补至总体积50μL。

PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图2所示。其中第一泳道为Marker，其余泳道均为PCR产物，PCR产物的大小为175bp。

(2)PCR产物纯化

用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤对上述PCR产物进行纯化。

3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用Chromas软件进行分析，结果如附图3所示，发现在该序列中的第122bp存在A>C、A>T和C>T三种等位基因突变，上述突变引起OLR1基因的多态性。将其命名为g.61808357A>C、A>T、C>T

实施例2分子标记在黑猪中的多态性分布检测

本实施例在500只黑猪中检测猪OLR1基因第四内含子g.61808357A>C、A>T、C>T位点的多态性分布规律，检测结果如表1所示。

表1 OLR1基因g.61808357A>C、A>T、C>T位点多态性分布规律

由表1的结果：在黑猪中OLR1基因g.61808357A>C、A>T、C>T位点表现为AA、AC、CC、AT或TC五种基因型，其中A等位基因频率为0.8，是优势等位基因，通过卡方检验发现g.61808357A>C、A>T、C>T位点在黑猪中均符合哈代温伯格平衡P＝0.76(P>0.05)。

实施例3分子标记与猪繁殖性状的关联分析

为了确定猪OLR1基因g.61808357A>C、A>T、C>T位点与猪繁殖性状的差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，并分析此多态位点的不同基因型与猪的繁殖性状的相关性，具体为总产仔数性状和产活仔数性状的相关性。采用SAS统计软件(SASInstitute Inc,Version 9.1)GLM程序进行不同SNP基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ij＝μ+G_i+F_j+e_ij；

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(i＝AA,AC,CC,AT,TC)；F_j为猪场综合效应；e_ij为残差效应。

在黑猪中进行不同基因型与总产仔数和产活仔数性状间的关联分析，统计分析结果如表2所示。

表2 OLR1基因g.61808357A>C、A>T、C>T位点与猪繁殖性状的关联分析

注：表中性状均值组成为平均数±标准差，a和b表示差异极显著(P<0.01)

由表2可以看出，在黑猪中，g.61808357A>C、A>T、C>T位点的AC、AA和CC基因型个体的总产仔数和产活仔数都极显著高于TC和AT基因型个体(P<0.01)，TC和AT基因型个体都含有T等位基因，可能是导致总产仔数和产活仔数比较低的原因，其中AC基因型个体的总产仔数最高，CC基因型个体的产活仔数最高，因此A和C等位基因是优势等位基因，在育种中应予以保留携带这些优势等位基因的个体，淘汰携带有T等位基因的个体，从而有利于提高群体的总产仔数和产活仔数。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 猪OLR1基因中与繁殖性状相关的复等位基因分子标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (122)..(122)

<223> n=a或c或t

<400> 1

cctcggtgga agagcatttg ttcgagatgc agagtaggta cctgtttttt agtctggcct 60

ggccactgat tacatgcatg tccttggatg gacagggtat ggtgggtctc taggctccag 120

cnggcatgtc tataaaacca tccagaagat ggcaaagatc cctttggttc tgtgg 175

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctcggtgga agagcatt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccacagaacc aaagggat 18

Claims

1.一种与猪繁殖性状相关的复等位基因分子标记，其特征在于，所述分子标记位于猪OLR1基因的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在该序列的第122bp处存在A>C，A>T，C>T三种类型的碱基突变。

2.根据权利要求1所述的一种与猪繁殖性状相关的复等位基因分子标记，其特征在于，所述序列中第122bp处的A或C或T的碱基多态性位点，表现为AA、AC、CC、AT或TC五种基因型，其中A等位基因为优势等位基因。

3.如权利要求1所述的复等位基因分子标记在猪总产仔数性状和产活仔数性状标记辅助选择中的应用。

4.一种用于扩增权利要求1所述的复等位基因分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

5.权利要求4所述的引物对在猪总产仔数性状和产活仔数性状标记辅助选择中的应用。

6.一种猪的选育方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、提取猪的基因组DNA；

S2、以步骤S1得到的基因组DNA作为模板，采用如权利要求4所述的引物对进行PCR扩增，得到如权利要求1所述的复等位基因分子标记并纯化；

7.如权利要求6所述的选育方法，其特征在于，步骤S1中，从待测猪的耳缘组织中提取基因组DNA。