CN116397033A - 与猪繁殖性状基因nck1相关的snp分子标记、引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪繁殖性状基因NCK1相关的SNP分子标记、引物对及其应用，涉及猪分子标记技术领域。所述繁殖性状为总产仔数、产活仔数和健仔数性状；所述分子标记位于猪NCK1基因第1号内含子中，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在该序列的第109bp处存在一处A109‑G109碱基突变。本发明还提供了一种用于扩增上述分子标记的引物对以及利用上述分子标记进行选育的方法。本发明首次发掘了猪NCK1基因中的一个SNP分子标记与猪的总产仔数、产活仔数和健仔数性状相关，因此可用于猪标记辅助选择育种，即提供了猪NCK1基因中一个SNP分子标记在猪繁殖性状的标记辅助育种的新用途，实现了对猪繁殖性状的早期筛选，筛选方法简单快速。
Description
技术领域
本发明涉及猪分子标记技术领域，具体涉及一种与猪繁殖性状基因NCK1相关的SNP分子标记、引物对及其应用。
背景技术
中国是猪生产大国，无论是生猪养殖规模还是猪肉消费量均居世界第一。繁殖性状是生猪产业的重要经济性状，繁殖能力的高低直接影响猪场的生产和经济效益。然而由于繁殖力属于低遗传力性状，其遗传力在0.06～0.3之间。目前能够利用并阐明其对繁殖性状影响机制的关键基因仍然不足。因此，寻找控制猪繁殖性状的关键分子遗传标记，并将其用于分子标记辅助育种，对提高猪的繁殖性状，增加经济效益具有重要意义。
酪氨酸激酶衔接蛋白1(NCK1)最初发现于任黑色素瘤细胞中，是具有与Scr同源性2、3(SH2、SH3)结构域的细胞内信号转导蛋白。NCK1通SH2结构域与酪氨酸激酶受体或者磷酸酪氨酸对接蛋白结合，通过SH3结构域募集下游G蛋白从而调节细胞骨架重排，细胞增殖、迁移等多种生物过程。
研究表明NCK1能够激活G蛋白Rho亚家族成员Racl，而Rac1蛋白在细胞增殖和骨架调整中发挥重要作用，PAK1是Rac1下游主要的信号蛋白，且Rac1/PAK1是参与血管形成的重要通路。也有研究表明，Rac1可以激活基质金属蛋白酶2(MMP2)。
然而，关于NCK1基因能否提高母猪的繁殖性能，这一分子机制尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供了一种与猪繁殖性状基因NCK1相关的SNP分子标记、引物对及其应用，本发明发掘了NCK1基因第1内含子中一个SNP与猪繁殖性状关联，可作为猪繁殖性状筛选和猪选育的分子标记。
第一方面，本发明提供了一种与猪繁殖性状基因NCK1相关的SNP分子标记，所述繁殖性状为总产仔数、产活仔数和健仔数性状；所述分子标记位于猪NCK1基因第1号内含子中，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在该序列的第109bp处存在一处A109-G109碱基突变。
进一步的，序列SEQ ID NO.1中第109bp处的A或G碱基多态性位点，表现为AA、AG或GG三种基因型，其中A等位基因为优势等位基因。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和/或猪育种中的应用。
第三方面，本发明提供了一种用于扩增如第一方面所述的分子标记的引物对，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的引物对在猪繁殖性状筛选和/或猪育种中的应用。
第五方面，本发明提供了一种利用如第一方面所述的SNP分子标记进行快速选育的试剂盒，包含如第三方面所述的引物对。
第六方面，本发明提供了一种猪繁殖性状筛选和/或猪选育的方法，包括以下步骤：
S1、提取猪的基因组DNA；
S2、以步骤S1得到的基因组DNA作为模板，采用如权利要求4所述的引物对进行PCR扩增，得到如权利要求1所述的分子标记并纯化；
S3、对步骤S2纯化后的分子标记进行测序分析，保留该序列第109bp处携带有A等位基因的个体，淘汰携带有G等位基因的个体。
进一步的，步骤S1中，从待测猪的耳缘组织中提取基因组DNA。
进一步的，步骤S2中，PCR反应体系50μL，体系中各组分为：基因组DNA 100ng、PCRmix 25μL、上述上下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL；PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明首次发掘了猪NCK1基因中的一个SNP分子标记与猪的繁殖性状，具体为总产仔数、产活仔数和健仔数性状相关，因此可将该分子标记用于筛选猪繁殖性状和选育，即提供了猪NCK1基因中一个SNP分子标记在猪繁殖性状的标记辅助育种的新用途，实现了对猪繁殖性状的早期筛选，筛选方法简单快速。
附图说明
图1为本发明实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-3为猪中的扩增片段，片段大小为241bp；
图2为本发明实施例1中g.109A>G位点的的测序图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1猪NCK1基因SNP检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立
1、猪基因组DNA的提取
猪基因组DNA的提取采用Invitrogen公司生产的动物组织基因组DNA提取试剂盒(PureLinkTMPro 96Genomic DNA Purification Kit,K182104A)，按该试剂盒说明书进行猪基因组DNA提取。对提取出的DNA进行浓度和质量检测，置于-20℃下保存备用。
2、猪NCK1基因SNP遗传标记检测片段的获得
(1)PCR扩增
根据猪NCK1基因的基因组序列中的SNP遗传标记检测序列，设计一对引物，扩增多态性位点的片段。
其中，该SNP遗传标记检测序列的核苷酸序列为：
TGATTGGCGTATTTCACTTAGCATAATGACATTGTAGTATGTCCTTTTTTTTTTTGGCTGCCGTGTGGCACATGGGGTTCCATTGGAGCTGCAGATCAGATCCGAGCTACAGCTGCAGCCAGAACTGCAGCTGTGGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGTGCCAGGAGATTGAACCTGTGTCCCAGCGCTCCCAAGACGCCACTGATCCGGTTGTGCCACAACTCCTGTAGCACGTCCTT，如SEQ ID NO.1所示。
设计的引物如下：
上游引物：5'TGATTGGCGTATTTCACTTAG 3'，如SEQ ID NO.2所示。
下游引物：5'AAGGACGTGCTACAGGAGTTG 3'，如SEQ ID NO.3所示。
利用上述引物，以猪基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分为：基因组DNA 100ng、PCR mix 25μL、上述上下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL。
PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图1所示，其中泳道M为DL2000 Marker，泳道1-3为猪中的扩增片段，扩增片段大小为241bp。
(2)PCR产物纯化
用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒对上述PCR扩增产物进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。
3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记
将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用DNA Star软件进行分析，结果如附图2所示，发现在SEQID NO.1所示的该序列中的第109bp存在一处A109–G109等位基因突变，即g.109A>G，上述突变引起NCK1基因的多态性。
实施例2分子标记在猪中的多态性分布检测
本实施例在465头具有头胎产仔数性状的猪中检测猪NCK1基因g.109A>G位点的多态性分布规律，检测结果如表1所示。
表1NCK1基因g.109A>G位点多态性分布规律
由表1结果可知：在猪中NCK1基因g.109A>G位点表现为AA、AG和GG三种基因型，其中GG基因型个体较多，且G等位基因频率为64.5％。
实施例3分子标记与猪繁殖性状的关联分析
为了确定猪NCK1基因g.109A>G位点与猪繁殖性状差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，并分析此多态位点的不同基因型与猪总产仔数、产活仔数和健仔数性状的相关性。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行不同SNP基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yij＝μ+Gi+Fj+eijk；
Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表TT、TC和CC基因型，显性效应用1，-1和1分别代表GG、GC和CC基因型)；Fj为猪场综合效应；eijk为残差效应。
在猪中进行不同基因型与繁殖性状间的关联分析，统计分析结果如表2所示：
表2NCK1基因g.109A>G位点与猪繁殖性状的关联分析
注：表中性状均值组成为平均数±标准差，A和B表示差异显著(P<0.05)，*表示差异显著(P<0.05)
由表2说明在猪中，g.109A>G位点的AA基因型个体的总产仔数、产活仔数和健仔数都显著高于AG和GG基因型个体(P<0.05)，且加性效应达到极显著水平(P<0.05)，因此A等位基因是优势等位基因。
实施例4NCK1基因SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和/或猪选育上的应用
NCK1基因内含子上的SNP分子标记g.109A>G位点与猪繁殖性状显著相关，A等位基因的加性效应达到显著水平。因此，在选育猪的过程中可以通过该SNP分子标记辅助选择繁殖性能好的AA型或AG型个体，在育种中应予以保留携带此优势等位基因的个体，从而有利于提高群体的生产性能。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种与猪繁殖性状基因NCK1相关的SNP分子标记，其特征在于，所述繁殖性状为总产仔数、产活仔数和健仔数性状；所述分子标记位于猪NCK1基因第1号内含子中，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在该序列的第109bp处存在一处A109-G109碱基突变。
2.根据权利要求1所述的与猪繁殖性状基因NCK1相关的SNP分子标记，其特征在于，序列SEQ ID NO.1中第109bp处的A或G碱基多态性位点，表现为AA、AG或GG三种基因型，其中A等位基因为优势等位基因。
3.如权利要求1或2任一项所述的SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和/或猪育种中的应用。
4.一种用于扩增如权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求4所述的引物对在猪繁殖性状筛选和/或猪育种中的应用。
6.一种利用如权利要求1所述的SNP分子标记进行快速选育的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求4所述的引物对。
7.一种猪繁殖性状筛选和/或猪选育的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取猪的基因组DNA；
S2、以步骤S1得到的基因组DNA作为模板，采用如权利要求4所述的引物对进行PCR扩增，得到如权利要求1所述的分子标记并纯化；
S3、对步骤S2纯化后的分子标记进行测序分析，保留该序列第109bp处携带有A等位基因的个体，淘汰携带有G等位基因的个体。
8.根据权利要求7所述猪繁殖性状筛选和/或猪育种猪选育的方法，其特征在于，步骤S1中，从待测猪的耳缘组织中提取基因组DNA。
9.根据权利要求7所述猪繁殖性状筛选和/或猪育种猪选育的方法，其特征在于，步骤S2中，PCR反应体系50μL，体系中各组分为：基因组DNA100ng、PCR mix 25μL、上述上下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL；PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117757959A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 海南省农业科学院三亚研究院(海南省实验动物研究中心) | 一种与母猪难产性状相关的snp分子标记及应用 |
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2023
- 2023-03-23 CN CN202310291058.5A patent/CN116397033A/zh active Pending
Cited By (1)
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| CN117757959A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 海南省农业科学院三亚研究院(海南省实验动物研究中心) | 一种与母猪难产性状相关的snp分子标记及应用 |
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