CN111996264B

CN111996264B - 一种猪snp分子标记在猪繁殖性状筛选和猪育种中的应用

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Publication number: CN111996264B
Application number: CN202010982529.3A
Authority: CN
Inventors: 乔木; 武华玉; 彭先文; 周佳伟; 张宇; 吴俊静; 梅书棋; 徐忠; 孙华; 刘贵生; 董斌科; 宋忠旭; 赵海忠; 李良华; 李梓芃
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: CN111996264A

Abstract

本发明公开了一种猪SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和猪育种中的应用，其中所述繁殖性状为总产仔数性状和产活仔数性状；所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在该序列的第70bp处存在一处T>C碱基突变。本发明还提供了一种用于扩增上述分子标记的引物对以及利用上述分子标记进行选育的方法。本发明首次发掘了猪OLR1基因中的一个SNP分子标记与猪的总产仔数性状和产活仔数性状相关，因此可用于猪标记辅助选择育种，即提供了猪OLR1基因中一个SNP分子标记在猪繁殖性状的标记辅助育种的新用途，实现了对猪繁殖性状的早期筛选，筛选方法简单快速。

Description

一种猪SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和猪育种中的应用

技术领域

本发明涉及猪分子标记技术领域，具体涉及一种猪SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和猪选育中的应用。

背景技术

猪的繁殖性状中，总产仔数性状以及产活仔数性状与养猪业的经济收益直接相关，是一种重要的经济性状，提高猪的总产仔数和产活仔数对提高养猪业的总体经济效益意义重大。然而由于猪的遗传力低(0.1左右)，导致母猪繁殖性状的常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，将常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合，可以有效地加快猪繁殖性状的选择进程。因此，寻找控制猪繁殖性状的关键分子遗传标记，并将其用于分子标记辅助育种，对提高猪的繁殖性状，增加经济效益具有重要意义。

用于MAS的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)标记等。SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。

OLR1基因(oxidized low-density lipoprotein receptor1,OLR1)具有结合、氧化低密度脂蛋白的作用。大量研究表明，该基因在人体中与人类的心脑血管疾病形成有关，并且在人体的脂肪细胞分化和增殖过程中也有一定作用；此外，OLR1基因与脂肪沉积、牛的乳脂率、牛肉品质等性状相关。而有关OLR1基因对繁殖性能的影响还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种猪SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和猪育种中的应用，本发明发掘了OLR1基因第四内含子中某一SNP与猪繁殖性状关联，可作为猪繁殖性状筛选和猪选育的分子标记。

本发明的目的之一在于提供一种猪SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和/或猪育种中的应用，其中所述繁殖性状为总产仔数性状和产活仔数性状；所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在该序列的第70bp处存在一处T>C碱基突变。该分子标记位于猪OLR1基因第四内含子的部分序列中，该序列长度为238bp，该SNP的rs号为rs45433252。

进一步的，序列SEQ ID NO.1中第70bp处的T或C碱基多态性位点，表现为TT、TC或CC三种基因型，其中T等位基因为优势等位基因。

本发明的目的之二在于提供一种用于扩增上述分子标记的引物对，包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的目的之三在于提供一种上述引物对在猪繁殖性状筛选和/或猪育种中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种猪的选育方法，包括：

S1、提取猪的基因组DNA；

S2、以步骤S1得到的基因组DNA作为模板，采用上述引物对进行PCR扩增得到所述分子标记并纯化；

S3、对步骤S2纯化后的分子标记进行测序分析，保留该序列第70bp处携带有T等位基因的个体，淘汰携带有C等位基因的个体。

进一步的，步骤S1中，从待测猪的耳缘组织中提取基因组DNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次发掘了猪OLR1基因中的一个SNP分子标记(rs45433252)与猪的繁殖性状，具体为总产仔数性状和产活仔数性状相关，因此可将该分子标记用于筛选猪繁殖性状和选育，即提供了猪OLR1基因中一个SNP分子标记在猪繁殖性状的标记辅助育种的新用途，实现了对猪繁殖性状的早期筛选，筛选方法简单快速。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-3为黑猪中的扩增片段，片段大小为238bp；

图2为本发明实施例1中g.61808176 T>C位点的的测序图谱；

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1猪OLR1基因SNP检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立

1、猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和湖北天之力优质猪育种有限公司联合培育的黑猪，该黑猪是以恩施黑猪、梅山猪和湖北白猪为亲本培育的杂交后代。猪基因组DNA的提取采用Invitrogen公司生产的动物组织基因组DNA提取试剂盒(PureLink^TM Pro 96Genomic DNA Purification Kit,K182104A)，按该试剂盒说明书进行猪基因组DNA提取。对提取出的DNA进行浓度和质量检测，置于-20℃下保存备用。

2、猪OLR1基因SNP遗传标记检测片段的获得

(1)PCR扩增

根据猪OLR1基因的基因组序列(GenBank ID：NC_010447.5)中的SNP遗传标记检测序列(如SEQ ID NO.1所示)设计一对引物，扩增多态性位点的片段。引物如下：

上游引物：5'AGCCGGGAGAACTGCTTG 3'

下游引物：5'AGACCCACCATACCCTGT 3'

利用上述引物，以黑猪基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分为：基因组DNA 100ng、PCR mix 25μL、上述上下游引物各1μL、加ddH₂O补至总体积50μL。

PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图1所示，其中泳道M为DL2000 Marker，泳道1-3为黑猪中的扩增片段，扩增片段大小为238bp。

(2)PCR产物纯化

用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒对上述PCR扩增产物进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。

3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用Chromas软件进行分析，结果如附图2所示，发现在该序列中的第70bp存在一处T>C等位基因突变，即g.61808176 T>C，上述突变引起OLR1基因的多态性，

实施例2分子标记在黑猪中的多态性分布检测

本实施例在355只黑猪中检测猪OLR1基因g.61808176 T>C位点的多态性分布规律，检测结果如表1所示。

表1 OLR1基因g.61808176 T>C位点多态性分布规律

由表1结果可知：在黑猪中OLR1基因g.61808176 T>C位点表现为TT、TC和CC三种基因型，其中TT基因型个体较多，且T等位基因频率为95.9％，因此T等位基因是优势等位基因。

实施例3分子标记与猪繁殖性状的关联分析

为了确定猪OLR1基因g.61808176 T>C位点与猪繁殖性状差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，并分析此多态位点的不同基因型与猪总产仔数和产活仔数性状的相关性。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行不同SNP基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ij＝μ+G_i+F_j+e_ij；

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表TT、TC和CC基因型，显性效应用1，-1和1分别代表TT、TC和CC基因型)；F_j为猪场综合效应；e_ij为残差效应。

在黑猪中进行不同基因型与总产仔数和产活仔数性状间的关联分析，统计分析结果如表2所示：

表2 OLR1基因g.61808176 T>C位点与猪繁殖性状的关联分析

注：表中性状均值组成为平均数±标准差，A和B表示差异极显著(P<0.01)，^**表示差异极显著(P<0.01)

由表2可以看出，在黑猪中，g.61808176 T>C位点的TT基因型个体的总产仔数和产活仔数都极显著高于TC和CC基因型个体(P<0.01)，且加性效应达到极显著水平(P<0.01)，因此T等位基因是优势等位基因，在育种中应予以保留携带此优势等位基因的个体，从而有利于提高群体的总产仔数和产活仔数性状。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种猪SNP分子标记在猪繁殖性状筛选和猪育种中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 238

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (70)..(70)

<223> r=t或c

<400> 1

agccgggaga actgcttgtc tttggatgcc caactgctga agattaatag cacagacgat 60

ctggtgagtr tttatgcatg tgtgttgggc tgaaatattg gcttataggg aaataagtca 120

gatctaggtc ctcggtggaa gagcatttgt tcgagatgca gagtaggtac ctgtttttta 180

gtctggcctg gccactgatt acatgcatgt ccttggatgg acagggtatg gtgggtct 238

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccgggaga actgcttg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agacccacca taccctgt 18

Claims

1.一种用于检测猪SNP分子标记的试剂在猪繁殖性状筛选和/或猪育种中的应用，其特征在于，所述繁殖性状为总产仔数性状和产活仔数性状，所述猪育种为选育高总产仔数和高产活仔数的猪只；所述分子标记的核苷酸序列如序列SEQ ID NO.1所示，序列SEQ IDNO.1中第70bp处的T或C碱基多态性位点，表现为TT、TC或CC三种基因型，其中TT基因型个体的总产仔数和产活仔数都高于TC和CC基因型的个体；所述试剂包括用于扩增所述分子标记的引物对；

所述猪的品种是以恩施黑猪、梅山猪和湖北白猪为亲本培育的杂交后代黑猪。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中T等位基因为优势等位基因。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种猪选育方法，其特征在于，所述猪选育具体为选育高总产仔数和高产活仔数的猪只，所述方法包括：

S1、提取猪的基因组DNA；

S2、以步骤S1得到的基因组DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增，得到如权利要求1所述的分子标记并纯化；

S3、对步骤S2纯化后的分子标记进行测序分析，保留如SEQ ID NO.1所示序列的第70bp处携带有T等位基因的个体，淘汰携带有C等位基因的个体；所述猪是以恩施黑猪、梅山猪和湖北白猪为亲本培育的杂交后代黑猪。

5.如权利要求4所述的猪选育方法，其特征在于，步骤S1中，从待测猪的耳缘组织中提取基因组DNA。