CN105713970A - 基于kiss-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于KISS?1基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。所述的分子标记为猪KISS?1基因片段，所述的猪KISS?1基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS?1基因的核苷酸序列中第41位，所述的多态性位点具有G/T碱基的变异。本发明猪KISS?1基因第1外显子存在一个突变位点，该位点位于猪KISS?1基因的核苷酸序列中第41位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。

Description

基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及动物分子育种领域，尤其涉及一种基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。
背景技术
分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，利用与育种性状相关的各种标记代替以表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，可克服直接选择的弊端，提高选择的准确性和缩短世代间隔。
总产仔数、产活仔数等猪的繁殖性状是重要的经济性状，直接关系到养猪业的经济效益。
KISS-1基因是LeeJH等于1996年利用消减杂交的方法研究人黑瘤素细胞不同转移能力时发现并命名，具有抑制肿瘤转移作用。人KISS-1基因被定位于1q32-41，包含4个外显子和3个内含子，前2个外显子不翻译。KISS-1基因的编码产物为kisspeptin，是G蛋白偶联受体54(Gprotein-coupledreceptor54,GPR54)的配体，并组成KISS-1/GPR54系统。越来越多的研究表明，KISS-1/GPR54系统在哺乳动物初情期的启动中起关键作用，kisspeptin对下丘脑-垂体-性腺轴具有重要调控作用。目前，尚未见KISS-1基因与猪繁殖性能关联分析的报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记，为猪的分子育种提供新的思路，本发明的另一个目的是提供所述分子标记的检测方法和应用。
技术方案：本发明所述的一种基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记，它为猪KISS-1基因片段，所述的猪KISS-1基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS-1基因的核苷酸序列中第41位，所述的多态性位点具有G/T碱基的变异。
猪KISS-1基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述的多态性位点，与猪总产仔数、产活仔数紧密相关，可利用该位点开发与猪繁殖性状相关的分子标记。本发明中，描述多态性位点的位置时，以基因的转录起始点核苷酸位置为1bp，上游为负，下游为正，顺次记数，第41bp位是指KISS-1基因的转录起始点开始的第41bp位，该位点处于SEQIDNO.4所示序列的第341bp位。
本发明所述的猪KISS-1基因片段如SEQIDNO.1所示。当然，本发明所述的猪KISS-1基因片段也可以为包含如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的DNA片段。根据检测方法，可以选择合适长度的能够包含多态性位点的DNA片段。
本发明还提供了所述分子标记的检测方法，包括：
(1)根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；
(2)以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
(3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
步骤(3)中，可对PCR产物进行测序或电泳分析，判断多态性位点的碱基类型。
优选的，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。利用该引物，可采用PCR-SSCP的方法准确方便的检测多态性位点的类型。
本发明还提供了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
具体的，猪可以为小梅山猪、枫泾猪或大白猪。繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明研究发现，猪KISS-1基因第1外显子存在一个突变位点(即多态性位点)，该位点位于猪KISS-1基因的核苷酸序列中第41位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
附图说明
图1为实施例1中PCR-SSCP检测结果；
图2为实施例1中AA和BB基因型个体PCR产物测序结果；
图3为实施例1中AA和BB基因型个体的氨基酸比对结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
实施例1
2013年采集106头小梅山猪、42头枫泾猪和70头大白猪的耳样；同时整理了江苏农林职业技术学院小梅山猪育种中心2004年～2012年期间上述106头小梅山母猪的生产档案，共有698窝仔猪记录，主要收集产仔年份、胎次、TNB、NBA等指标。耳样(约0.15g)用耳号钳采集，-20℃冻存。用常规的酚氯仿抽提法提取猪基因组DNA，对基因组DNA进行OD值测定，计算其浓度，并用ddH2O稀释至终浓度为100ng/μL，原液-20℃保存，稀释液4℃保存，稀释液作为PCR扩增的模板。
第一步：根据GenBank公布的猪KISS-1基因全序列(登录号：NC_010451.2)，确定猪KISS-1基因第1外显子区域。
第二步：采用Primer5.0软件设计1对引物，扩增第1外显子区域。引物为：KISS-1.1。上游引物序列为：5’-gggctgttcacctcttgtct-3’(SEQIDNO.2)，下游引物序列为：5’-ggcccaaagaaagaacatca-3’(SEQIDNO.3)，扩增区域为-107bp-73bp(SEQIDNO.1)，扩增产物长度180bp。
第三步：PCR-SSCP检测。
PCR扩增。PCR扩增反应体系为20μL，包括：10×Buffer2.0μL，25mMMg2+2.2μL，10mMdNTPs0.8μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板1μL(100ng)，5U·μL-1Taq酶0.2μL，ddH2O11.8μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；31个循环(94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min)；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。
SSCP检测程序为：2.5μLPCR扩增产物和7.5μL上样缓冲液混匀，98℃变性10min，然后冰浴10min。变性后的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶120V电泳12h，银染，拍照保存。基因型分型结果见图1，图1中，泳道1、2、4的基因型为AA，泳道3、5、10、13的基因型为BB，泳道6-9，11，12的基因型为AB。
第四步：将AA和BB基因型个体的PCR扩增产物送上海生工生物公司进行测序，测序结果见图2。氨基酸比对结果显示：G41T导致缬氨酸(Val)变为苯丙氨酸(Phe)，即V5F，见图3。
第五步：分析该位点在不同猪群中的分布情况。结果参见表1，3个猪群中共检测到3种基因型与2个等位基因，小梅山猪与枫泾猪中等位基因B为优势基因，基因频率分别为0.675、0.905，大白猪中，等位基因A为优势基因，基因频率为0.843；经χ2检验，小梅山猪在KISS1-3位点上偏离哈代-温伯格平衡状态(P＝0.006)，而枫泾猪与大白猪则处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。
表13个猪群KISS-1基因G41T位点的基因型频率与等位基因型频率
第六步：SPSS软件关联分析该突变位点与繁殖性状间的关系。结果参见表2，1～2胎小梅山母猪中，AB型个体的TNB与NBA最高，分别为11.68头、11.10头，比AA与BB型个体分别高0.68头与0.39头(P>0.05)、0.50头与0.45头(P>0.05)。2胎以上小梅山母猪中，AB型个体的TNB为12.62头、比AA型个体高2.74头(P<0.01)，比BB型个体高0.27头(P>0.05)；AB型个体的NBA为11.93头，比AA、BB型个体分别高2.58头(P<0.01)、0.40头(P>0.05)。所有胎次的小梅山母猪中，AB型个体的TNB为12.39头、比AA型个体高2.18头(P<0.01)，比BB型个体高0.31头(P>0.05)；AB型个体的NBA为11.72头，比AA、BB型个体分别高1.97头(P<0.01)、0.40头(P<0.05)。3个阶段中，3种基因型个体的TNB与NBA均表现出相同的趋势：AB>BB>AA。
表2KISS-1基因G41T位点与小梅山猪繁殖性状的关联分析
注：N为窝数；TNB为总产仔数；NBA为产活仔数
结果提示：猪KISS-1基因G41T位点杂合子繁殖性能优于纯合子，在选种时应加强杂合子的选留。

Claims (8)

1.一种基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，它为猪KISS-1基因片段，所述的猪KISS-1基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS-1基因的核苷酸序列中第41位，所述的多态性位点具有G/T碱基的变异。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的猪KISS-1基因片段包含如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述的猪KISS-1基因片段如SEQIDNO.1所示。
4.一种根据权利要求1～3任一项所述的基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记的检测方法，其特征在于，包括：
(1)根据权利要求1～3任一项所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；
(2)以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
(3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
6.一种根据权利要求1～3任一项所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，猪为小梅山猪、枫泾猪或大白猪。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
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