KR101289576B1

KR101289576B1 - 한우 육량 관련 분자마커 개발

Info

Publication number: KR101289576B1
Application number: KR1020110114887A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 신성철; 허재필; 이종현; 하정화
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2013-07-24
Also published as: KR20130049865A

Abstract

본 발명은 한우의 등지방두께(backfat thickness)과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자 마커를 이용한 한우 육량형질 진단 방법에 관한 것으로서, 등지방두께가 얇은 한우의 유전적 자질을 예측하고 판정하는 등지방두께 연관 분자표지를 개발하여 이를 이용한 우수 한우의 조기선발 및 개체 평가의 정확성을 제고하는 데 활용 가능한 유전자 진단방법을 제공하기 위한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 한우 PON1 (paraoxonase 1) 유전자의 인트론 6번 영역 내에 존재하는 특정 SNP를 이용하여 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 기법으로 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 DNA marker를 검출함으로써 이들 가운데 TC 유전자형을 가진 개체들을 TT 및 CC 유전자형을 가진 개체들에 비해 유전적으로 등지방두께가 얇은 한우 개체로 진단하여 판별하는 방법을 제공한다.

Description

한우 육량 관련 분자마커 개발 {Development of molecular marker related to meat quantity in Hanwoo}

본 발명은 분자유전학적 분석기법인 PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism; 제한효소절편다형)분석을 통하여 한우 PON1 (paraoxonase 1) 유전자의 특정 SNP(단일염기다형)를 이용한 한우 육량형질 관련 분자마커를 개발함으로써, 이를 이용하여 유전적으로 등지방두께가 얇은 한우를 진단하여 판별할 수 있는 기술을 제공한다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)은 1986년 Kary Mullis에 의해서 처음 소개되었다. PCR 방법의 개발로 인해 소량의 DNA를 이용하여 표적유전자의 상태를 알 수 있게 해 주는 혁명적인 것이라 할 수 있다. 1953년 Watson과 Crick에 의해 DNA 나선 구조의 해명으로 시작된 DNA 분자생물학의 세계는 20년 후 제한효소의 발견과 그에 따른 DNA Cloning법, 염기서열 결정법의 개발로 새로운 발전을 맞게 되었다. 최근의 분자 유전학 기법의 발달은 DNA수준에서의 유전자 marker의 개발이 가능한 방향으로 발달되어 왔다.

가축의 유전 및 육종학 분야에서도 DNA의 다형성을 이용하여 유전자를 marker gene으로 육종개량에 활용하고 있다. DNA의 다형성은 중요한 경제형질을 결정하는 주요 유전자와 양적형질(QTL; quantitative trait loci)에 의한 marker의 개발을 가능하게 하며, 연관 분석(linkage analysis), 유전자 지도(genetic map), 친자 감별(parenetage testing), 품종간의 구별(distingtion of breeds), 가계도 분석(pedigree analysis), 유전적 다양성(divergence) 및 연관성(relationship) 등을 분석할 수 있는 강력한 장치로서 이용되어 왔다. 특히, DNA marker를 이용한 선발육종 기술은 전통적인 선발육종법의 한계를 넘어 획기적으로 가축의 유전능력을 증진시키는 방법으로 이용되고 있다. 이러한 유전공학적 기법에는 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) 및 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)등이 있다. 이 중에서도 제한효소 처리에 의한 DNA 단편의 다형 현상을 분석하는 기법인 RFLP 기법은 재현성이 우수하고, 효율성이 높아 유전자 진단 방법으로 유용하게 사용되고 있다.

　따라서, 본 발명에서는 PCR-RFLP 기법을 이용하여 한우 육량 형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자표지를 검출하여 우량 한우 조기 진단에 활용할 수 있는 기술을 제공한다.

1990년대 이후 쇠고기의 소비증가가 가속화되고 있으며, 쇠고기 수입 또한 지속적으로 증가 되고 있는 추세에 있다. 따라서 국내산 쇠고기의 국제경쟁력 향상 및 제고를 위해서는 한우육의 품질 고급화 개선을 통해 소비자 선호에 부흥하고 또한, 육생산량을 높여 경제성을 높이는 기술이 시급한 실정이다. 따라서, 한우의 경쟁력을 높이기 위해서는 한우의 주요 경제형질에 대한 능력개량이 가장 확실한 경쟁력의 확보 수단이라 할 수 있다. 현재 우리나라 축산물 등급판정은 한우 육량등급 판정의 경우 도체중량(carcass weight), 도체율(dressing percentage), 등지방 두께(backfat thickness) 및 배최장근단면적(M. longissimus dorsi area)등의 도체성적 항목을 이용하여 A, B, C 및 등외등급으로 육량등급을 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 특히 등지방두께는 육량 등급을 결정하는데 매우 지대한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 등지방두께가 얇을수록 등심단면적이 넓어져 육량 증대 효과를 기대할 수 있기 때문에 한우의 경제성을 높이려면 유전적으로 등지방두께가 얇은 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육 관리하는 것이 중요하다. 가축의 육종개량에 있어 종래의 양적 유전학적 방법은 가축의 표현형적 기록에 의존해왔다. 즉, 후보종모우는 혈통기록과 체형 발달 등의 당대 기록으로 우선 선발하고 빈우와의 교배에 의해 생산되는 후대 검정우를 사육, 도축하여 도체 및 육질형질들을 기록하고 가축이 사육되어진 환경 요인들을 최대한 배제하면서 가축의 진정한 육종가를 추정해 내기 위한 가장 적절한 통계 모델식을 고안하여 종축을 선발하게 되는데 이러한 표현형적 관찰치를 측정하는 데는 많은 시간이 소요되므로 종축의 선발을 지연하게 되어 세대 간격이 길어지고 많은 두수의 후보 종축을 사육하게 되므로 사료비, 시설투자비 및 유지비, 인건비 등의 경제적 비용과 과도한 노동력이 소요된다. 이와 같은 매우 비효율적인 방법으로 인해 보다 과학적이고 신속하게 우수한 육량등급의 비육우를 조기에 선발하고 사육하기 위한 한우 육량등급 판정 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명은 최첨단 분자육종 기술을 이용한 한우 육량형질 연관 유전자 분자표지를 개발하고 이를 이용하여 유전적으로 육량이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발할 수 있는 기술을 개발하고자 수행하였다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 연구 개발한 결과, 소의 4번 염색체에 존재하는 PON 1 (paraoxonase 1) 유전자를 한우의 육질 및 육량형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 등지방두께와 밀접하게 연관되어 있는 분자마커를 발굴하고 이를 이용한 우량 한우 진단 방법을 발명하였다.

PON 1 유전자는 고밀도 지단백질에 부착하여 HDL(High-density lipoprotein)과 LDL(Low-density lipoprotein)이 산화되는 것으로부터 보호하는 작용을 하는 유전자로서 포유류의 성장 신진대사와 생리에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 선행 연구에 따르면, 육우에서 PON1 유전자 다형성이 성장형질과 지육특성에 영향을 미치는 것으로 보고되었으며, 또한 PON1 단백질은 인슐린과 성장호르몬, 리포단백질 분해효소, 그리고 대표적인 비만관련 유전자인 Leptin에 협응하는 기능이 있다. 따라서, 본 발명에서는 이와 같이 포유류의 성장과 지육특성에 영향을 미치는 PON1 유전자를 한우의 육량형질 관련 후보유전자로 최종 선발하여 PON1 유전자의 특정 SNP 유전자형과 한우의 육량형질과의 연관성 분석을 통해 유전적으로 자질이 우수한 한우 개체를 조기에 진단하여 판별할 수 있는 기술을 개발하였다.

더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, 이를 PON1 유전자의 인트론 6번부터 7번 영역을 포함하는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물에 BstE II 제한효소를 첨가하여 절단된 DNA 단편을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동하여 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적과의 연관성 통계분석을 통해 등지방두께와 연관되어 있는 DNA marker를 발굴함으로써 이를 이용하여 유전적으로 등지방두께가 얇은 우수 한우 진단방법을 제공한다.

본 발명에서 PCR로 증폭한 한우 PON1 유전자 인트론 6번 내 특정 SNP (서열번호 1의 231번째 SNP, T↔C 염기치환)으로 인한 DNA 유전자형 마커(TT, TC 및 CC형)를 이용하여 한우 개체의 등지방두께에 대한 도체 육량 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 우량 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, PON1 유전자의 TC 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.

도면 1은 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 PON1 유전자 증폭 영역 내 231번째 T↔C 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker) 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 PON1 유전자 증폭 영역 내 231번째 T↔C 단일염기다형(SNP)에 대한 각 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker)의 염기서열 분석 크로마토그램

상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시 예 1 : 한우 PON1 유전자의 SNP 유전자형 검출

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제

본 발명에 사용한 한우는 국가 후대검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 후보 종모우 집단 총 147두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.

2. 한우 PON1 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출

한우 P0N1 유전자의 intron 6 ~ intron 7번 영역을 포함하는 서열번호 1에 제시한 582 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank 등록번호 NC_007302.4호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.

한우 PON1유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열

유전자명	증폭영역	프라이머 염기서열 (5'-3')	서열번호
PON1	인트론6-인트론7	정방향 F-GCTTTTGCTCGAAGATGCTAAG 역방향 R-TTGCATAGACGATGTGTGTGGT	2 3

PON1 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분 간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 한우 PON1 유전자의 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1에 제시한 바와 같이 총 582 bp 크기의 염기를 검출하였으며, 검출된 이들 증폭 영역 내 염기에서 총 1개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, NCBI GenBank 등록번호 NC_007302.4호의 26,129번째(서열번호 1의 231번째) 염기에서 T↔C 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다. 검출된 서열번호 1의 231번째 T↔C 염기치환에 따른 SNP에 대한 각 검정대상 한우 개체별 SNP 유전자형 분석을 위해 BstE Ⅱ 제한효소를 이용하여 RFLP 분석을 수행하였다.

3. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 PON1 유전자의 SNP 유전자형 마커 분석

검출된 한우 PON1 유전자의 증폭영역 내 231번째 T↔C SNP 부위에 BstE Ⅱ 제한효소 인지부위(5'-G'GTNAC_C-3')가 존재하여 RFLP 기법으로 한우 PON1 유전자의 세 종류 SNP 유전자형(TT, TC 및 CC)에 상응하는 분자표지(DNA marker)를 검출하였다[도면 1 및 도면 2].

한우 PON1 유전자의 RFLP 분석은 5 ㎕의 PCR 증폭산물에 2 unit의 BstE Ⅱ 제한효소를 첨가한 다음 37℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 2% 아가로즈젤에 약 100 volt 전압으로 약 2시간 전기영동하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 즉, TT homo 유전자형을 가진 개체들에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 582 bp 크기를 갖는 총 1개의 DNA 단편이 검출되었고, CC homo 유전자형을 가진 개체들에서는 1개의 제한효소 인지부위가 존재하여 231,351 bp 크기를 갖는 총 2개의 DNA 단편이 검출되었다. 그리고 TC hetero 유전자형을 가진 개체들은 이들 3가지의 DNA 단편이 모두 검출되어 231, 351 및 582 bp 크기를 갖는 DNA band가 검출되었다[도면 1].

이상과 같은 방법으로 한우 후대 검정우 집단 총 147두를 대상으로 분석한 PON1 유전자의 증폭영역 내 231번째 SNP 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현율을 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 T 대립유전자가 약 50.0%, C 대립유전자가 약 50.0%로 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 TT형 25.2%(37두), TC형 49.7%(73두), 그리고 CC형 25.2%로(37두) TT,CC 유전자형이 낮고, TC 유전자형이 가장 높은 것으로 분석되었다.

실시 예 2. 한우 PON1 유전자의 DNA marker 유전자형과 육질 및 육량 형질과의 연관성 통계 분석

본 발명을 통해 검출된 한우 PON1 유전자의 SNP 유전자형이 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적 및 육종가 추정치에 미치는 효과를 추정하기 위해 SASⓐ9.1 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan′s Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다.

그 결과 한우 PON1 유전자의 인트론 6번 영역 내 T↔C 염기치환에 의한 SNP (서열번호 1의 231번째) 유전자형은 한우의 등지방두께 육종가추정치와의 유의적 연관성이 입증되었다(P<0.05). 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 TC 유전자형을 가진 개체들이 TT 및 CC 유전자형을 가진 개체들에 비해 등지방두께 육종가추정치가 유의적으로 낮은 것으로 나타났다(P<.05).

한우 PON1 유전자의 DNA marker 유전자형과 육량 및 육질형질과의 연관성 통계분석 결과

육량 및 육질형질	SNP 유전자형			P-value
육량 및 육질형질	TT	TC	CC	P-value
도체중 육종가추정치	3.573±1.465	2.084±1.086	2.537±1.444	0.695
등심단면적 육종가추정치	0.799±0.400	0.323±0.297	0.185±0.395	0.507
근내지방도 육종가추정치	-0.022±0.014	-0.029±0.011	-0.033±0.014	0.877
등지방두께 육종가추정치	0.192±0.097^a	-0.066±0.072^b	0.111±0.096^a	0.038

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 PON1 유전자의 증폭영역 내 231번째 T↔C SNP 유전자형은 한우의 육질등급 판정에 있어 매우 중요한 항목인 등지방두께에 대한 유의적 연관성이 입증되어 본 분자표지를 이용하여 유전적으로 등지방두께가 얇은 한우를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 DNA 분자표지로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

표 2에서, ^a,b: 서로 다른 부호 간에는 유의차가 있음(P<0.05).
도면 1에서, M: 100 bp DNA size marker; TT, TC, CC: 본 발명의 PON1 유전자 SNP 에 의한 각각의 DNA marker 유전자형; 582bp, 351bp, 231bp: RFLP분석을 통해 검출된 DNA 단편의 크기.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머(primer)에 의해 PCR (Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응) 증폭된 한우 PON1 (paraoxonase 1) 유전자 증폭산물에 BstE II 제한효소를 처리하는 과정을 포함하는 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형) 분석법으로 서열번호 1에 제시한 한우 PON1 유전자 염기서열 231번째 T↔C 염기치환에 따른 검사대상 한우 개체별 분자표지(DNA marker)를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형(TT, CT 및 CC)을 분석하여 유전적으로 등지방두께가 얇은 한우를 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 등지방두께 연관 분자마커를 이용한 한우 육량형질 진단 방법
청구항 1에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 GCTTTTGCTCGAAGATGCTAAG의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 2의 정방향 프라이머와 5'에서 3' 방향으로 TTGCATAGACGATGTGTGTGGT의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용하여 한우 PON1 유전자를 PCR로 증폭하는 것을 특징으로 하는 한우 등지방두께 연관 분자마커를 이용한 한우 육량형질 진단 방법
청구항 1에 있어서,
PCR-RFLP 분석법으로 검출된 한우 PON1 유전자의 세 가지 분자표지(DNA marker) 유전자형(TT, TC 및 CC) 가운데 TC 유전자형을 나타내는 한우개체를 TT 및 CC 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 등지방두께가 얇은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 등지방두께 연관 분자마커를 이용한 한우 육량형질 진단 방법