KR101307087B1

KR101307087B1 - 단일염기다형성 마커를 이용한 고품질 우량 한우 진단 방법

Info

Publication number: KR101307087B1
Application number: KR1020110015011A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 신성철; 허재필
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2013-09-11
Also published as: KR20120095594A

Abstract

본 발명은 한우의 근내지방도와 도체중 형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 단일염기다형성 마커를 이용한 고품질 우량 한우 진단 방법에 관한 것으로서, 육질 및 육량 형질이 우수한 한우의 유전적 자질을 예측하고 판정하는 유전적 분자표지를 개발하여 조기 선발 및 개체 평가의 정확성을 제고하는 데 활용 가능한 유전자 진단방법을 제공하기 위한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 한우 GPD1 유전자의 5번 영역 내에 존재하는 특정 SNP를 이용하여 PCR-RFLP 기법으로 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 단일염기다형성 마커를 검출함으로써 이들 가운데 가장 바람직한 유전자형(CC형)을 가진 개체를 유전적으로 근내지방도와 도체중이 우수한 한우 개체로 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

단일염기다형성 마커를 이용한 고품질 우량 한우 진단 방법{Diagnosis method of high quality meat using the SNP marker in Hanwoo}

본 발명은 분자유전학적 분석기법인 PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism)분석을 통하여 한우 육질 및 육량형질과 밀접하게 연관되어 있는 GPD1 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1) 유전자의 특정 단일염기다형성 마커(Single nucleotide polymorphic marker)를 이용하여 유전적으로 근내지방도(marbling score)와 도체중(carcass weight) 형질이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발할 수 있는 기술을 제공한다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)은 1986년 Kary Mullis에 의해서 처음 소개되었다. PCR 방법의 개발로 인해 소량의 DNA를 이용하여 표적유전자의 상태를 알 수 있게 해 주는 혁명적인 것이라 할 수 있다. 1953년 Watson과 Crick에 의해 DNA 나선 구조의 해명으로 시작된 DNA 분자생물학의 세계는 20년 후 제한효소의 발견과 그에 따른 DNA Cloning법, 염기서열 결정법의 개발로 새로운 발전을 맞게 되었다. 최근의 분자 유전학 기법의 발달은 DNA수준에서의 유전자 marker의 개발이 가능한 방향으로 발달되어 왔다.

가축의 유전 및 육종학 분야에서도 DNA의 다형성을 이용하여 유전자를 marker gene으로 육종개량에 활용하고 있다. DNA의 다형성은 중요한 경제형질을 결정하는 주요 유전자와 양적형질(QTL; quantitative trait loci)에 의한 marker의 개발을 가능하게 하며, 연관 분석(linkage analysis), 유전자 지도(genetic map), 친자 감별(parenetage testing), 품종간의 구별(distingtion of breeds), 가계도 분석(pedigree analysis), 유전적 다양성(divergence) 및 연관성(relationship) 등을 분석할 수 있는 강력한 장치로서 이용되어 왔다. 특히, DNA marker를 이용한 선발육종 기술은 전통적인 선발육종법의 한계를 넘어 획기적으로 가축의 유전능력을 증진시키는 방법으로 이용되고 있다. 이러한 유전공학적 기법에는 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) 및 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)등이 있다. 이 중에서도 제한효소 처리에 의한 DNA 단편의 다형 현상을 분석하는 기법인 RFLP 기법은 재현성이 우수하고, 효율성이 높아 유전자 진단 방법으로 유용하게 사용되고 있다.

　따라서, 본 발명에서는 PCR-RFLP 기법을 이용하여 한우 육질 및 육량 형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자표지를 검출하여 고품질 우량 한우 조기 진단에 활용할 수 있는 기술을 제공한다.

1990년대 이후 쇠고기의 소비증가가 가속화되고 있으며, 쇠고기 수입 또한 지속적으로 증가 되고 있는 추세에 있다. 따라서 국내산 쇠고기의 국제경쟁력 향상 및 제고를 위해서는 한우육의 품질 고급화 개선을 통해 소비자 선호에 부흥하고 또한, 육생산량을 높여 경제성을 높이는 기술이 시급한 실정이다. 따라서, 한우의 경쟁력을 높이기 위해서는 한우의 주요 경제형질에 대한 능력개량이 가장 확실한 경쟁력의 확보 수단이라 할 수 있다.

쇠고기의 육질 특성은 근내지방도(marbling), 육색(meat color), 지방색(fat color), 조직감(meat texture) 및 성숙도(meat firmness)등이 있다. 이들 육질을 나타내는 특성 중에서 근내지방이 가장 높게 평가되고 있다. 근내지방은 근육지방중 1, 2차 근속 사이에 있는 지방을 말하며 일명 '마블링(Marbling)' 또는 '상강지방(霜降脂肪)'으로 불려지기도 하는데 붉은 살코기에 지방이 들어 있는 모양이 마치 서리가 내린 것처럼 보이거나 대리석 같기 때문이다. 근내지방은 고기의 품질(육질)을 결정하는 중요한 요소로 고기의 맛과 밀접한 관계가 있다. 또한, 한우 육량등급 판정의 경우 도체중(carcass weight), 도체율(dressing percentage), 등지방 두께(backfat thickness) 및 배최장근단면적(M. longissimus dorsi area)등의 도체성적 항목을 이용하여 A, B, C 및 등외등급으로 육량등급을 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 특히 도체중은 육량 등급을 결정하는데 매우 지대한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 따라서, 한우의 육질 품질과 경제성을 향상시키려면 유전적으로 근내지방도가 우수하고 도체중이 높은 우량 한우 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육 관리하는 것이 매우 중요하다.

따라서 본 발명에서는 한우의 육질 및 육량형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자의 분자표지를 탐색하여 이를 이용한 고품질 우량 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 기술을 제공한다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 연구 개발한 결과, 소의 5번 염색체에 존재하는 GPD1 유전자를 한우의 육질 및 육량형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 근내지방도 및 도체중 형질과 밀접하게 연관된 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 개발하고 이를 이용한 고품질 우량 한우 진단 방법을 발명하였다. 본 발명에서 이용한 한우 GPD1 유전자는 FAS (fatty acid synthase) 유전자와 더불어 adipose tissue 지방발생의 marker gene으로 연구되어졌으며, 골격근에서 weight loss에 반하여 인슐린을 향상시켜 triglyceride의 합성을 저하시키는 기능을 지니고 있다. 또한 GPD1 전사체의 발현증가는 비만의 증가와 연관하며, 근육의 증대 및 지방합성에 관여하는 것으로 보고되어 있어 새로운 한우 경제형질 관련 후보유전자로 주목받고 있다.

따라서 본 발명에서는 GPD1 유전자를 한우 경제형질 관련 후보유전자로 최종 선정하고, GPD1 유전자의 특정 SNP를 이용한 PCR-RFLP 분석 및 육량 및 육질관련 형질과의 연관성 통계 분석을 통해 육질 및 육량과 밀접하게 연관되어 있는 단일염기다형성 마커를 개발하여 유전적으로 근내지방도가 우수하고 도체량이 높은 우량 한우 조기 진단 및 선발할 수 있는 방법을 발명하였다. 더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, 이를 GPD1 유전자의 엑손 5번 영역을 포함하는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물에 Hae Ⅲ 제한효소를 첨가하여 절단된 DNA 단편을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적과의 연관성 통계분석을 통해 근내지방도 및 도체중 육종가추정치와 연관되어 있는 단일염기다형성 마커를 발굴함으로써 이를 이용하여 유전적으로 근내지방도와 도체중이 높은 우량 한우 진단 방법을 제공한다.

한우 GPD1 유전자 엑손 5번 영역의 증폭영역 내 534번째 C↔T 염기치환으로 인한 단일염기다형성 마커(CC,CT 및 TT형)를 이용하여 한우 개체의 근내지방도 및 도체중에 대한 도체 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 고능력 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, GPD1 유전자의 CC 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.

도면 1은 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 GPD1 유전자 증폭 영역 내 534번째 C↔T 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker) 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 GPD1 유전자 증폭 영역 내 534번째 C↔T 단일염기다형(SNP)에 대한 각 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker)의 염기서열 분석 크로마토그램

상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시 예 1 : 한우 GPD1 유전자의 SNP 유전자형 검출

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제

본 발명에 사용한 한우는 국가 후대검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 후보 종모우 집단 총 309두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 mM EDTA)에 용해하여 -20 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.

2. 한우 GPD1 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출

한우 GPD1 유전자의 exon 5번 영역을 포함하는 서열번호 1에 제시한 699bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank 등록번호 NC007303.4호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.

한우 GPD1 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열

유전자명	유전자 좌위	프라이머 염기서열(5'-3')	서열번호
GPD1	intron 3 - intron 5	정방향 F-CTCAGTTGGGGTAAAAGGCAC 역방향 R-GAGTGATCCTGGCTTTGCTTC	2 3

GPD1 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2 ㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20 ㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 64℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 간의 사이클을 총 30회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 한우 GPD1 유전자의 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1에 제시한 바와 같이 총 699 bp 크기의 염기를 검출하였으며, 검출된 이들 증폭 영역 내 염기에서 총 2개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, NCBI GenBank 등록번호 NC007303.4호의 2,766번째(서열번호 1의 534번째) 염기에서 C↔T 염기치환에 따른 SNP를 검출하였으며. 2,844번째(서열번호 1의 612번째) 염기에서도 C↔T 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다 검출된 이들 SNP 가운데 2,766번째(서열번호 1의 534번째) C↔T 염기치환에 따른 SNP에 대한 각 검정대상 한우 개체별 SNP 유전자형에 분석을 위해 Hae Ⅲ 제한효소를 이용하여 RFLP 분석을 실시하였다.

3. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 GPD1 유전자의 단일염기다형성 마커 유전자형 분석

검출된 한우 GPD1 유전자의 증폭영역 내 534번째 CT SNP 부위에 Hae Ⅲ 제한효소 인지부위(5'-GG^↓CC-3')가 존재하여 RFLP 기법으로 한우 GPD1 유전자의 세 종류 SNP 유전자형(CC, CT 및 TT)에 상응하는 단일염기다형성 마커를 검출하였다[도면 1 및 도면 2].

한우 GPD1 유전자의 RFLP 분석은 5 ㎕의 PCR 증폭산물에 2 unit의 Hae Ⅲ 제한효소를 첨가한 다음 37℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 2% 아가로즈젤에 약 100 volt 전압으로 약 2시간 전기영동하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 즉, CC 호모 유전자형을 가진 개체들에서는 4개의 제한효소 인지부위가 존재하여 61, 62, 74, 106 및 396 bp 크기를 갖는 총 5개의 DNA band가 검출되었고, TT 호모 유전자형을 가진 개체들에서는 4개의 제한효소 인지부위 존재하여 62, 74, 106 및 497 bp 크기를 갖는 총 4개의 DNA band가 검출되었다. 그리고 CT 헤테로 유전자형을 가진 개체들은 이들 5가지의 DNA 단편이 모두 검출되어 61, 62, 74, 106, 396 및 497 bp 크기를 갖는 DNA band가 검출되었다[도면 1].

이상과 같은 방법으로 한우 후대 검정우 집단 총 309두를 대상으로 분석한 GPD1 유전자의 증폭영역 내 534번째 SNP 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현율을 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 C 대립유전자가 약 57.3%, T 대립유전자가 약 42.7%로 C 대립유전자 출현빈도가 T 대립유전자에 비해 높게 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 CC형 27.5%(85두), CT형 59.6%(184두), 그리고 TT형 12.9%로(40두) TT 유전자형이 가장 낮고, CT 유전자형이 가장 높은 것으로 분석되었다.

실시 예 2. 한우 GPD1 유전자의 DNA marker 유전자형과 육질 및 육량 형질과의 연관성 통계 분석

본 발명을 통해 검출된 한우 GPD1 유전자의 SNP 유전자형이 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적 및 육종가추정치에 미치는 효과를 추정하기 위해 SAS8.2 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan's Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다.

그 결과 한우 GPD1 유전자의 엑손 5번 영역 내 C↔T 염기치환에 의한 SNP 부위(서열번호 1의 534번째)의 유전자형은 한우의 근내지방도 육종가추정치 및 도체중 육종가추정치와의 유의적 연관성이 입증되었다(P<.05). 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 근내지방도 육종가추정치에서 CC 유전자형을 가진 개체들이 CT 및 TT 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 0.208 및 0.663 정도 유의적으로 높게 나타났ㅇ으며(P<.05), 도체중 육종가추정치에서도 CC 유전자형을 가진 개체들이 CT 및 TT 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 2.554 및 7.851 정도 유의적으로 높게 나타났다<.05).

한우 GPD1 유전자의 단일염기다형 마커 유전자형과 육량 및 육질형질과의 연관성 통계분석 결과

육량 및 육질형질	SNP marker 유전자형			P-value
육량 및 육질형질	CC	CT	TT	P-value
생체중/kg	549.756±7.448	546.067±5.055	525.789±10.941	0.175
도체중/kg	317.195±4.585	313.325±3.112	298.263±6.735	0.064
등지방두께/cm	0.699±0.045	0.779±0.030	0.684±0.066	0.218
배최장근단면적/cm²	79.853±1.253	77.022±0.850	74.105±1.841	0.348
근내지방도/1-7	3.317±0.260	3.146±0.176	2.473±0.381	0.181
도체중 육종가추정치	4.221±1.423^a	1.677±0.966^ab	-3.630±2.090^b	0.009
배최장근단면적 육종가추정치	1.480±0.510	0.754±0.346	-0.503±0.750	0.093
근내지방도 육종가추정치	0.579±0.131^a	0.371±0.089^ab	-0.084±0.192^b	0.019
등지방두께 육종가추정치	0.113±0.068	0.168±0.046	0.153±0.100	0.798

a,b : 서로 다른 부호 간에는 유의차가 있음(p<.05).

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 GPD1 유전자의 증폭영역 내 534번째 CT SNP 유전자형은 한우의 육질 및 육량등급 판정에 있어 매우 중요한 항목인 근내지방도 및 도체중에 대한 유의적 연관성이 입증되어 본 단임염기다형성 마커를 이용하여 유전적으로 근내지방도가 우수하고 도체중이 높은 육량 생산이 우수한 한우를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 DNA 분자표지로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

도면 1에서, M: 100 bp DNA size marker; CC, CT, TT: 본 발명의 GPD1 유전자 SNP 에 의한 각각의 단임염기형성 마커 유전자형; 61, 62, 74, 106, 396, 497 bp: DNA 단편의 크기
도면 2에서, CC, CT, TT : 본 발명의 GPD1 유전자 SNP에 의한 염기서열 분석 크로마토그램에 대한 각각의 단일염기다형성 마커 유전자형

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PCR-RFLP 분석법으로 검출된 한우 GPD1 유전자의 세 가지 단일염기다형성 마커(SNP marker) 유전자형(CC, CT 및 CC) 가운데 CC 유전자형을 나타내는 한우 개체를 CT 및 TT 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 근내지방도와 도체중이 높은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 단일염기다형성 마커를 이용한 고품질 우량 한우 진단 방법