KR100935293B1 - 티엔에프알파 유전자를 이용한 한우 육량형질 연관단일염기다형마커 개발 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한우 육량 형질에 관여하는 유전자 표지인자 개발에 관한 것으로서, 특히 한우의 도체중과 등심단면적에 관한 유전적 잠재능력을 조기에 예측하고 판정하는 유전자 표지인자(SNP marker)를 개발하여 한우의 육종개량 사업에 활용하기 위한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 한우의 근내 지방축적 및 비만과 연관되어 있는 TNFα (tumor necrosis factor alpha)유전자의 특정 단일염기다형(SNP)을 이용하여 PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism; 단일쇄형태구조다형성) 분석을 통해 도체중이 높고 등심단면적은 넓은 우량 한우를 조기에 판정하고 선발할 수 있는 단일염기다형마커(SNP marker) 개발에 관한 내용을 포함하고 있다. 본 발명의 기술을 이용하여 육량이 우수한 우량 한우의 조기선발 도구로 활용함으로써 보다 효율적이고 경제적인 육종개량이 가능하고, 나아가 한우 생산농가의 경영개선 및 소득증대 효과를 가져 올 수 있을 것이다.
한우, 도체중 및 등심단면적 연관 DNA 표지인자, TNFα 유전자, 단일염기다 형마커(SNP marker), PCR-SSCP 분석
Description
도면 1은 본 발명에서 PCR-SSCP 기법으로 검출한 한우 TNFα 유전자의 각 유전자형별 단일염기다형마커(SNP marker) 전기영동 사진 및 단일염기다형(SNP) 염기서열 분석 크로마토그램
본 발명은 한우의 육량 형질과 관련된 한우 개체별 유전적 차이를 비교 검출하기 위한 것으로서, 한우 도체중과 등심단면적에 관련된 유전자의 구조변이 탐색으로 육량 향상을 위한 유전적 표지인자(SNP marker)를 개발하여 우량 한우를 조기에 판정하고 선발하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 가축의 육종개량에 있어 종래의 양적 유전학적 방법은 가축의 표현형적 기록에 근거로 한다. 즉, 후보종모우는 혈통기록과 체형 발달 등의 당대기 록으로 우선 선발하고 빈우와의 교배에 의해 생산되는 후대 검정우를 사육, 도축하여 성장 및 도체 형질등을 기록하고 가축이 사육되어진 환경 요인들을 최대한 배제하면서 가축의 진정한 육종가를 추정해 내기 위한 가장 적절한 통계 모델식을 고안하여 종축을 선발하게 되는데, 이러한 표현형적 관측치를 측정하는 데는 많은 시간이 소요되므로 종축의 선발을 지연하게 되어 세대 간격이 길어지고 많은 두수의 후보 종축을 사육하게 되므로 사료비, 시설 투자비 및 유지비, 인건비 등의 경제적 비용과 필요 이상의 노동력이 소요된다.
한편, 가축의 표현 형질을 지배하는 것은 환경에 의해서도 지배되어 지지만, 동일한 환경에서 사육된 어떤 한 집단에서도 표현 형질마다 개체간 차이가 존재한다. 이는 결국 개체가 지니는 유전자 수준의 차이에 기인 되며, 유전공학, 분자생물학 및 주변관련 과학기술의 급속한 발전으로 가축의 표현 형질 중 경제 형질에 관여하는 유전체의 정보를 이해하여 조기 선발에 의한 세대 간격 단축, 선발강도, 선발의 정확도 등의 향상시켜 연간 유전적 개량량을 증대시킬 수 있는 유전적 표지인자 개발 연구가 시도되고 있다.
본 발명에서 이용한 TNFα 유전자는 cytokine의 일종으로써 아직 그 역할이 분명하게 밝혀지지는 않았지만, 주로 단구와 대식 세포에서 생산되며 비만과 연관된 인슐린 내성과 당뇨에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 특히 최근에 일본의 쿠시 코마슈가 보고한 논문에 따르면 TNFα 유전자는 인슐린의 작용을 방해하여 당뇨병을 유발하는 resistin과 함께 인슐린 저항성 발생에 주 역할을 하는 것으로 일본 화우(Japanese black steer)를 대상으로 한 실험결과 밝혀졌다. 인슐린 저항성이 발생하면 혈장 내에 증가된 인슐린이 지방세포의 지방분해 증가를 유발하여 자유지방산이 간으로의 유입을 증가시키고 간세포 내에서는 지방산의 합성증가와 지방산의 산화를 저해시켜 결과적으로 간에서 자유지방산의 유입이 많아지고 초저밀도 리포 단백질(very low-density lipoprotein, VLDL)의 생산과 배출이 적어짐으로써 중성지방의 축적이 일어나게 된다.
따라서, 본 발명은 우리나라 고유의 소 품종이자 유일한 쇠고기 생산자원인 한우를 대상으로 근내 지방축적 및 비만과 관련된 TNFα 유전자의 염기구조 변이를 이용하여 육량이 우수한 우량 한우를 조기에 판정하고 선발할 수 있는 기술을 개발하여 우리나라 한우 사육 농가를 보호하고 나아가 한우산업의 국제 경쟁력을 강화에 기여할 수 있는 첨단 분자육종 기술을 제공한다.
본 발명은 한우의 지방축적 및 비만과 관련된 TNFα 유전자를 이용하여 우리나라 재래 소 품종인 한우를 대상으로 단일염기다형(SNP) 탐색 및 발굴을 통해 유전자의 구조적 차이를 규명하고, 한우의 육량 등급 판정에 매우 중요한 영향을 미치는 육량 및 육질 형질과의 연관성 통계 분석을 통해 육량과 밀접하게 연관된 SNP marker를 개발하여 도체중은 높고 등심단면적은 넓은 한우를 조기에 식별하고 선발할 수 있는 분자육종 기술을 개발하기 위함이다.
다음의 실시 예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다.
실시 예 1 : 한우 TNFα 유전자의 SNP 유전자형 검출
1. 공시재료 및 DNA 분리 정제
본 발명에 사용한 한우는 국가 후대검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 후보 종모우 집단을 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer(10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.
2. 한우 TNFα 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출
한우 TNFα 유전자 5'-flanking 영역에서 184 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank 등록번호 AF011926호에 등록된 염기서열 정보 301번째부터 484번째까지의 염기서열을 참고로 하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 [표 1]에 제시하였다.
유전자 | 프라이머 염기서열(5'- 3') | 증폭단편의 크기(bp) | 증폭영역 |
TNFα | F - AAGGCTGGGGACTAGAGAACA R - AAGGGAATGTGACTCCCCAA | 184 | 5'-flanking |
TNFα 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 mL 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20 ㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 그리고 72℃에서 50초간의 사이클을 총 30회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 7분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. 증폭산물은 2.5% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다.
그 다음 AB1 310 Genetic Analyzer 염기서열 분석 장치를 이용하여 한우 TNFα 유전자의 DNA 증폭산물을 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 1개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, 서열번호 1의 90번째 염기에서 T↔C 염기치환에 의한 한우 TNFα 유전자의 5'-flanking 영역 내 SNP를 검출하였다.
3. PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism, 단일쇄형태구조다형성) 기법에 의한 한우 TNFα 유전자의 SNP 유전자형 분석
본 발명의 검정대상 한우를 대상으로 상기 염기서열 분석을 통해 검출된 TNFα 유전자 5'-flanking 영역 내 SNP에 대한 각각의 SNP marker 유전자형을 분석하기 위해 서열번호 2 와 3의 primer를 이용하여 모두 PCR로 증폭하고, SSCP 분석을 수행하였다.
PCR-SSCP 분석은 각 PCR증폭 산물 2 ㎕에 8 ㎕의 formamide dye (98% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylen cyanol)를 첨가하고 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 ice에 5분간 보관하여 reannealing을 방지한 다음 12% (49:1) non-denaturation polyacylamide gel을 이용하여 250 volt에서 약 4-6시간 동안 전기영동을 실시 한 후, silver staining (Bassam et al., 1991)법으로 SSCP의 DNA band를 검출하고 각 banding pattern에 따른 SSCP 유전자형을 결정하였다[도면 1]. 그 다음 [도면 1]에 제시한 바와 같이 TNFα 유전자의 SSCP 분석을 통하여 검출한 각 유전자형 marker의 염기서열을 크로마토그램으로 분석 비교하여 각각의 SSCP marker 유전자형에 상응하는 TT, TC 및 CC 형 등 총 3종류의 SNP marker 유전자형을 판정하였다.
TNFα 유전자 5'-flaking 영역의 각 SNP에 대한 대립유전자 빈도와 유전자형 출현율을 분석한 결과 T 와 C 대립유전자빈도는 각각 42%와 58%로 C 대립유전자 빈도가 높게 나타났으며, SSCP 분석을 통해 검출한 SNP marker 유전자형의 출현율은 TT형 20.4%, TC형 38.1% 및 CC형 41.5%로 CC homo 형이 가장 높고, TT homo형이 가장 낮게 나타났다.
실시 예 2 : 한우 TNFα 유전자 5'-flanking 영역의 SNP marker와 육량 및 육질 관련 형질과의 연관성 분석
한우 TNFα 유전자 5'-flanking 영역의 SNP marker 유전자형이 육량 및 육질관련 형질 도체측정치와 육종가 추정치에 미치는 효과를 규명하기 위하여 SASⓐ8.2 Package/PC를 이용하여 PROC GLM으로 통계 처리하였으며, 유전자형의 효과 중 유의성이 인정된 형질들에 대해 DMRT (Duncan`s Multiple Range Test) 방법으로 각 유전자형의 least square means간의 차이에 대한 유의성 검정을 실시하였다.
본 발명을 통해 검출된 TNFα 유전자 5'-flanking 영역의 PCR 증폭 영역 내 90번째 SNP(T↔C)에 대한 각각의 SNP 유전자형과 한우의 각종 육량 및 육질형질 간의 연관성을 통계 분석한 결과 [표 2]에서 보는 바와 같이 도체중과의 유의적 연관성이 입증되었으며(P<0.05), 또한 도체중 육종가 추정치와 등심단면적 육종가 추정치에서도 유의적 연관성이 입증되었다(P<0.05). 즉, TT homo 유전자형을 가진 개체들의 도체중이 TC hetero 및 CC homo 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 17.086 kg(5.3%) 및 14.251 kg(4.4%)정도 높게 나타났으며, 도체중 육종가 추정치에서도 TT homo 유전자형을 가진 개체들이 TC hetero 및 CC homo 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 5.631 및 4.923정도 높은 것으로 나타났다. 또한 등심단면적 육종가에서도 TT homo 유전자형을 가진 개체들이 TC hetero 및 CC homo 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 2.078 및 1.539정도 높은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때 TNFα 유전자 5'-flanking 영역에서 검출된 SNP는 한우의 도체중과 도체중 육종가 추정치 및 등심단면적 육종가 추정치와의 유의적 연관성이 입증되었고, 본 발명의 SSCP 분석기법을 통해 검출된 SNP marker의 특정 유전자형(TT homo형)을 이용하여 도체중은 높고 등심단면적은 넓은 우수한 한우 개체를 조기에 판정하고 선발할 수 있어 우량 한우 선발을 통한 한우의 육종개량 사업에 활용할 수 있을 것이다.
육량 및 육질형질 | SNP marker 유전자형 | P-value | ||
TT | TC | CC | ||
생체중/kg | 562.666±9.248 | 539.016±6.485 | 541.607±6.768 | 0.096 |
도체중/kg | 324.233±5.911a | 307.147±4.145b | 309.982±4.326b | 0.046* |
도체율/% | 57.600±0.281 | 56.932±0.197 | 57.183±0.205 | 0.154 |
등지방두께/cm | 0.646±0.050 | 0.618±0.035 | 0.675±0.036 | 0.533 |
등심단면적/cm² | 77.166±1.488 | 73.803±1.043 | 75.482±1.089 | 0.169 |
근내지방도/1~7 | 2.300±0.225 | 1.852±0.158 | 2.178±±0.165 | 0.190 |
도체중 육종가 | 7.879±1.829a | 2.248±1.283b | 2.956±1.339b | 0.036* |
등심단면적 육종가 | 1.990±0.621a | -0.088±0.436b | 0.451±0.455b | 0.025* |
* P<0.05
a,b : 서로 다른 부호 간에는 통계적 유의차가 인정됨(P<0.05).
이상의 실시 예를 통하여 명백한 바와 같이 한우 TNFα 유전자 5'-flanking 영역 내 SNP에 대한 SNP marker를 이용하여 한우 각각의 품종 개체의 육량 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 도체중과 등심단면적이 우수한 우량 한우의 조기 진단 및 선발과 더불어 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, 본 발명의 기술을 이용하여 국가적으로는 보증 종모우 및 종빈우의 선발, 사육농가에서는 비육 밑소 및 육량이 우수한 우량 송아지 조기 진단 통한 선발 등에 산업적 활용을 통해 나아가 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 가지고 PCR-SSCP 분석 기법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 다수의 시료를 대상으로 SNP 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있는 기술로서 산업적 실용화가 가능하다.
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<120> Development of single nucleotide polymorphism marker associated
meat quantity trait using tumor necrosis factor alpha gene
polymorphism in Korean cattle
<130> 9
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 184
<212> DNA
<213> Bos taurus
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(184)
<223> Tumor necrosis factor alpha (TNFa) gene of Hanwoo, promoter
region
<220>
<221> variation
<222> (90)
<223> SNP : T/C
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> Forward primer bind
<220>
<221> primer_bind
<222> (165)..(184)
<223> Reverse primer bind
<400> 1
aaggctgggg actagagaac accagaggca tttcaggaga cctggtcaca cacacagggg 60
ctctcaaggg cagtgctgtc tccaggaagt tggagggaga agggattctt tggggataca 120
tggccataca caggaactct gaaggggggg tctccgtgca aaagttgggg agtcacattc 180
cctt 184
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Bos taurus
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> Forward primer(5'-3')
<400> 2
aaggctgggg actagagaac a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> Reverse primer(5'-3')
<400> 3
ttggggagtc acattccctt 20
Claims (3)
- 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머(primer)에 의해 증폭된 한우 TNFα (tumor necrosis factor alpha)유전자의 PCR 증폭산물을 이용하는 PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism; 단일쇄형태구조다형성) 분석법으로 서열번호 1에 제시한 한우 TNFα 유전자 염기서열 90번째 T↔C 염기치환(SNP)에 따른 개체별 단일염기다형마커(SNP marker)를 검출하고 각각의 유전자형(TT, TC 및 CC)을 분석하여 유전적으로 도체중이 높고 등심단면적은 넓은 한우를 예측하여 판정하는 방법
- 청구항 1에 있어서,5'에서 3' 방향으로 AAGGCTGGGGACTAGAGAACA의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 2의 정방향 프라이머(Forward primer)와 5'에서 3' 방향으로 AAGGGAATGTGACTCCCCAA의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 3의 역방향 프라이머(Reverse primer)를 이용하여 한우 TNFα 유전자 5'-flanking 일부 영역을 PCR로 증폭하여 SSCP 분석을 수행하는 것을 특징으로 하는 도체중이 높고 등심단면적은 넓은 한우를 예측하여 판정하는 방법
- 청구항 1에 있어서,PCR-SSCP 분석법으로 검출된 TNFα 유전자의 세 가지 단일염기다형마커 유전자형(TT, TC 및 CC) 가운데 TT 유전자형을 나타내는 한우 개체를 TC 및 CC 유전자형 마커를 나타내는 한우 개체에 비해 상대적으로 도체중이 높고 등심단면적은 넓은 한우로 예측하여 판정하는 방법
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