KR100804310B1 - 소 근내지방도 관련 ｆａｂｐ4 유전자를 이용한 ｄｎａ마커 - Google Patents

소 근내지방도 관련 ｆａｂｐ4 유전자를 이용한 ｄｎａ마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한우의 주요 경제형질인 육질, 특히 근내지방도에 관여하는 DNA 표지인자 발굴에 관한 것으로서, 한우의 도체형질을 지배하는 유전적 자질을 예측하고 판정하는 DNA 표지인자를 개발하여 조기 선발 및 개체 평가의 정확성 제고를 기하여 한우 개량 등에 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서는 동물의 체내의 지방세포에서 발현되어 유리지방산과의 결합을 통해 지방산을 중성지방의 형태로 구조적 변화를 이끌면서 지방세포에 전달하는 역할을 하는 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein, FABP4)을 암호화하는 유전자에서 17개의 유전자 구조변이(Single nucleotide polymorphism)들을 발굴하였고, 이중 서로 독립적으로 존재하는 3좌위의 구조변이가 한우의 근내지방도에 각각 유의적인 영향을 미치고 있음을 통계분석을 통하여 밝혀냄으로써, 한우 개체의 선발에 이용하여 한우의 개량 및 고급육 생산 등에 활용이 가능하였다.
한우, 근내지방도, 유전적 표지인자, 지방산 결합 단백질, PCR-RFLP

Description

소 근내지방도 관련 ＦＡＢＰ4 유전자를 이용한 ＤＮＡ 마커{DNA marker of adipocyte-fatty acid binding protein gene related the intramuscular fat content in beef cattle}
도 1은 한우 FABP4(Adipocyte-Fatty Acid Binding Protein) 유전자 구조변이 부위를 보여주는 모식도이다.
도 2는 한우 FABP4 유전자의 염기서열을 보여주는 모식도이다.
본 발명은 한우에서의 개체별 유전적 차이를 확인하기 위한 것으로 근내지방도, 등지방두께 및 등심지방함량 등의 육질형질에 영향을 미치는 요인에 관여하는 유전적 표지인자(genetic marker)의 개발과 그 사용 방법에 관한 것이다.
지방세포(adipocyte)에서 발현되는 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein, FABP4)은 동물의 지방세포에서 특이적으로 발현하는 단백질로서 유리지방산과 결합하여 지방산을 중성지방의 형태로 축적시키는 지방세포로 전달하는 역할 을 한다. 가축이 사료를 섭취한 후 사료에 존재하는 지방은 소화·분해·흡수되는 과정에서 지방산으로 전이가 일어나고, 이들 유리 지방산들이 근육세포 및 지방세포 등에 유입되어 에너지원 또는 저장형태로 축적하게 된다. 이때 유리지방산형태로 존재하는 긴사슬 지방산은 지방산 결합 단백질과 결합하여 세포내 지방산화의 주요 표적 기관인 미토콘드리아로 유입되고, 이곳에서 지방산합성체계의 기본물질인 동시에, 다른 장쇄지방산합성의 전구물질로 사용되게 된다.
근내지방도는 쇠고기 산업에 있어서 가장 중요한 경제형질 중 하나로서, 쇠고기의 풍미, 다즙성, 연도 등을 결정한다. 따라서, 근내지방 연관 유전적 표지인자 탐색에 대한 연구가 국제적으로 활발하게 이루어지고 있다. 최근, 돼지에 있어서 심장(Heart)-지방산 결합 단백질(H-FABP)이 돼지의 근내지방도와 밀접하게 연관이 있다는 다수의 연구결과가 보고되어 있다. 특히, 소에 있어서 FABP4는 염색체 14번에 IL7 마커와 17 cM 떨어진 위치에 존재하고 있으며, 이 좌위는 근내지방도와 연관된 QTL 영역인 것으로 보고되었다.
이에 본 발명자들은 근육내 지방세포 분화시에 활발하게 활성화되는 FABP4가 유리지방산을 세포내로 전달하여 근육내 지방을 축적하는데 비교적 크게 작용하여 근내지방도를 조절하고 고기의 육질을 조절하는 것으로 판단하고 FABP4를 암호화하는 유전자의 구조변이를 찾아내어, 이들 변이가 한우의 육질 등 경제적 주요 형질에 미치는 효과를 분자유전학적 분석 및 양적유전학적 통계분석에 의하여 구명하여 DNA 표지인자를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 한우의 성장률, 육량 및 육질 등에 관련된 DNA 표지인자를 발굴하고 그 표지 인자를 이용하여 한우 개체들의 정확한 유전적 자질을 판단하여 선발하는 방법 및 한우의 개량에 활용하는데 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 근내지방도에 유의적인 FABP4 유전자의 17개의 변이 부위들을 검출하기 위한 DNA 표지인자를 제공하되, 이들 변이들이 3개의 연관집단으로 구성됨에 따라 3개의 연관집단을 대표할 수 있는 좌위로 엑손 첫 번째 염기를 1번으로 하여 2775번째 Hpy188I (C⇒G), 3474번째 RsaI (A⇒T) 및 3632번째 NlaIII (A⇒G) 3좌위 변이부위 및 이 좌위를 검출하기 위한 DNA 표지인자를 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에서는 한우 FABP4 유전자에서 검출된 17개의 유전자 변이 부위를 선발한 다음 이들의 연관군을 확인하였고, 이들 중 대표적인 변이를 활용 근내지방도에 유의적인 영향을 미치는가를 찾고자 하였다.
도 1은 서열번호 7의 한우 FABP4 유전자에서 변이된 17개 부위를 각각 보여주고 있다. 이를 보다 상세히 살펴보면, 유전자의 1번 엑손 첫번째 염기를 1번으로 하였을 때, 611번째 염기인 A가 G로 치환되고, 633번째 염기인 A가 G로 치환되며, 1003번째 염기인 C가 T로 치환되고, 1055번째 염기인 T가 C로 치환되며, 1151번째 염기인 A가 G로 치환되고, 1610번째 염기가 결실 또는 삽입되며, 2207번째 염기인 G가 T로 치환되고, 2775번째 염기인 C가 G로 치환되며 , 2930번째 염기인 A가 G로 치환되고, (3191)번째 염기가 TA 반복서열 부위를 가지고 있는 Microsatellite(TA) 좌위, 3474번째 염기인 A가 T로 치환되고 , 3632번째 염기인 A가 G로 치환되며 , 3652번째 염기인 G가 C로 치환되고, 3686번째 염기인 T가 C로 치환되며, 3707번째 염기인 T가 C로 치환되고, 3955번째 염기인 T가 C로 치환되며, 4163번째 염기인 A가 G로 치환된다.
본 발명에서는 상기 FABP4 유전자의 17개 유전자 변이 부위의 연관군들 중 각 연관을 대표하는 2775번째 Hpy188I (C⇒G), 3474번째 RsaI (A⇒T) 및 3632번째 NlaIII (A⇒G) 3좌위 변이부위가 근내지방도에 유의적임을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 한우의 성장률, 육량 및 육질 등에 관련된 유전적 표지인자를 발굴하고 그 표지 인자를 이용하여 한우 개체들의 정확한 유전적 자질을 판단하여 선발하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
1) 서열번호 7의 한우 FABP4 유전자로부터 발견되고 도 1에 도시된 17개의 SNP 좌위 판독을 이용하여 연관군의 유전자형을 판별하는 단계;
2) 서열번호 1 내지 서열번호 6의 PCR 프라이머를 이용하여 서열번호 7의 한우 FABP4 유전자를 주형으로 94℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 2분간 확장하는 사이클을 35회 실시하고, 마지 막으로 72℃에서 10분간 더 반응시켜 PCR 증폭하는 단계;
상기에서 PCR 반응 과정을 살펴보면, 94℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 2분간 확장하는 사이클을 35회 실시하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 더 반응시킨다.
3) 상기 증폭산물을 제한효소 Hpy188I, RsaI 및 NlaIII로 절단하여 전기영동을 실시하는 단계; 및
4) 상기 전기영동 결과물에 대한 사진 및 이미지를 확보하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계.
본 발명에 의한 상기 소 FABP4 유전자의 17개 변이들을 이용하여 연관군의 유전자형을 판별하는 것으로 대표적인 Hpy188I (C⇒G), RsaI (A⇒T) 및 NlaIII (A⇒G) 3좌위에 대한 DNA 표지인자 판별 방법으로는 제한효소 절편길이 다양성(Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 분석, 이형접합자 분석(heteroduplex analysis), 단일 나선의 구조적 다형성(single strand conformational polymorphism, SSCP) 및 테크맨 프로브법(Taqman probe method)을 들 수 있다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 자세하게 설명한다. 그러한 실시예 또는 시험예들은 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이지, 이러한 실시예 또는 시험예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
PCR 증폭에 사용한 FABP4 유전자 분석용 프라이머는 한우 후대검정우 24두로부터 얻은 FABP4 유전자의 전장염기서열 분석 결과를 근거로 제작하여 사용하였다.
한우 FABP4 유전자 변이좌위의 연관군, 치환염기, 주변염기서열 및 확인 가능 제한효소
연관군 좌위 치환염기 주변염기서열 확인가능 제한효소
1 611 A ⇒ G ttccttRaaagtc MseI
1 633 A ⇒ G tttgRcttaa -
1 1003 C ⇒ T agacttYtgacta Hpy188I
1 1055 T ⇒ C atattaYaggact -
1 1151 A ⇒ G tcctatRtggtgc -
1 1610 Indel indel T -
1 2207 G ⇒ T atgtggKttttgt -
1 2775 C ⇒ G ttttccSaactat Hpy188I
2 2930 A ⇒ G gatgaaRtcactcc Tsp45I
MS 3191 (TA)n (TA)n -
2 3474 A ⇒ T gctaagWacctca RsaI
2 3632 A ⇒ G aaactcRtggatg FatI, NlaIII, BssSI, CviAII
3 3652 G ⇒ C ggtgctSgtgagt BssSI, Hpy188III, BsiHKAI
2 3686 T ⇒ C agatttYagtgct -
2 3707 T ⇒ C cataatYgttatc Tsp509I
2 3955 T ⇒ C tttgtgYctccct -
2 4163 A ⇒ T agagcRtaagcc -
한우 FABP4 유전자의 프라이머 염기서열
프라이머 서열
AFABP-인트론I-F 5'-TTG TGC CTT GGG TGT TCT TT-3' (서열번호 1)
AFABP-인트론I-R 5'-TGG TTT GCT ATA GGC AGC AG-3' (서열번호 2)
AFABP-인트론II-F 5'-TGT TGT TTT TGG CAT TCA TTG-3' (서열번호 3)
AFABP-인트론II-R 5'-TAC TGC TGG GGG CAC AGT AT-3' (서열번호 4)
AFABP-엑손III-F 5'-TTG TGC CTT GGG TGT TCT TT-3' (서열번호 5)
AFABP-엑손III-R 5'-TGG TTT GCT ATA GGC AGC AG-3' (서열번호 6)
게놈 DNA의 분리 추출은 MagExtractor Genomic DNA 정제 키트(Toyobo, Japan)를 이용하여 한우 583두의 혈액으로부터 수행하였다. 한우 지방세포-지방산 결합 단백질 유전자내의 각각 독립된 3좌위에 대한 PCR 반응을 위하여 2 ㎕의 PCR 반응 완충액(100 mM 트리스-HCl, pH 8.3; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2), 2 ㎕의 2.5 mM dNTPs, 1 ㎕의 프라이머(10 pmole), 게놈 DNA 1 ㎕(100ng), 0.5 U의 Taq DNA 폴리머라아제(Promega, USA)를 넣고 최종 부피가 20 ㎕되게 조정하였다. PCR 수행은 PTC-225 tetrad PCR machine (MJ Research, Inc.)을 이용하여, 94℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 2분간 확장하는 사이클을 35회 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 더 반응시켰다. PCR이 끝난 후 5㎕의 PCR 증폭산물을 2%의 아가로오스 겔(agarose gel)을 이용하여 증폭여부를 확인하였다.
한우 개체별 유전자형 결정은 PCR-RFLP 방법을 이용하였는데, 개체별 PCR 증폭산물에서 5 ㎕씩을 각각 취하여 제한효소 Hpy188I(NEB), RsaI(Promega) 및 NlaIII(NEB)로 65℃ 및 37℃에서 각각 증폭산물을 완전히 절단 반응시켰다. 절단된 DNA 단편을 확인하기 위하여 2.5% 아가로오스 겔을 이용하여 전기영동을 실시하였고, EtBr 염색법으로 DNA 밴드를 검출하여 각 개체의 유전자형을 판정하였다.
한우 개체별 유전자형의 판정은 도 1에서와 같이 인트론 1에 존재하는 C->G SNP의 경우 제한효소 Hpy188I에 의해 절단되어 328 bp 와 154 bp를 갖는 유전자형은 CC형으로 230 bp, 154 bp 및 98 bp를 갖는 유전자형은 GG형으로 그리고, 328 bp, 230 bp 및 154 bp를 갖는 유전자형은 GC형으로 판정하였다. 아울러 인트론 2의 A->T SNP 및 엑손 3의 A->G (Met->Val) SNP는 도 1과 같이 유전자형을 판정하였다.
한우의 FABP4의 독립된 3개 SNP 좌위에 대한 유전자형에 따른 유전적 능력 차이를 규명하기 위해 혈통기록 및 환경요인 등을 고려한 아래와 같은 분석모형에 의한 유전능력 평가결과의 형질별 육종가(breeding value) 및 표현형 기록치를 이용하여 관련성 분석을 실시하였다.
Figure 112006050071003-pat00001
여기서,
Figure 112006050071003-pat00002
: 표현형 능력기록,
Figure 112006050071003-pat00003
: 전체 평균,
Figure 112006050071003-pat00004
:
Figure 112006050071003-pat00005
번째 연도-계절효과,
Figure 112006050071003-pat00006
: 성별 효과,
Figure 112006050071003-pat00007
: 도축일령에 대한 공변이,
Figure 112006050071003-pat00008
: 임의오차(random error)이다.
조사된 162두의 육종가 기록에 대해 FABP4 유전자형의 효과를 추정하기 위하여 SAS 8.1 Package/PC를 이용하여 아래와 같은 일반선형모형(Generalized Linear Model)을 적용한 최소제곱법(Least Squares Method)으로 통계 분석을 실시하였다.
Figure 112006050071003-pat00009
여기서,
Figure 112006050071003-pat00010
: 육종가(breeding value),
Figure 112006050071003-pat00011
: 전체평균,
Figure 112006050071003-pat00012
: 유전자형 효과,
Figure 112006050071003-pat00013
: 임의오차(random error)이다.
한우 FABP4 유전자의 유전자형별 후대검정우 도체형질의 육종가 분석 결과
SNP 유전자형 두수 도체중 배장근단면적 등지방두께 근내지방도
Hpy188I (C->G) CC 232 1.9489±0.8163 0.6481±0.2274 -0.0032±0.0078 0.0102±0.0409 a
GC 288 0.5135±0.7327 0.5197±0.2041 0.0084±0.0070 0.0842±0.0368 ab
GG 54 -0.5038±1.6920 1.0182±0.4714 0.0012±0.0161 0.2334±0.0849 b
RsaI (A->T) AA 242 2.3678±0.7929 0.6536±0.2226 -0.0015±0.0076 0.0024±0.0404 a
AT 274 0.2476±0.7509 0.5126±0.2109 0.0082±0.0072 0.1044±0.0383 ab
TT 56 -0.3939±1.6404 1.0538±0.4606 0.0141±0.0157 0.2410±0.0837 b
Nla III (A->G) AA 56 0.5996±1.6692 0.8054±0.4641 0.0258±0.0158 -0.0348±0.0843 a
AG 250 0.5398±0.7900 0.3190±0.2196 -0.0053±0.0075 0.0158±0.0399 a
GG 270 1.5362±0.7602 0.8472±0.2113 0.0064±0.0072 0.1537±0.0384 b
a, b : 다른 표기 사이에는 유의적인 차이가 인정됨(p<0.05).
한우 FABP4 유전자의 유전자형별 후대검정우 도체형질의 표현형 분석 결과
SNP 유전자형 두수 도체중 배장근단면적 등지방두께 근내지방도
Hpy188I (C->G) CC 232 311.737±0.669 a 74.152±0.491 7.234±0.196 1.920±0.085 a
GC 288 313.778±0.592 ab 74.827±0.435 7.345±0.173 2.001±0.075 ab
GG 54 315.069±1.304 b 76.112±0.958 7.219±0.382 2.335±0.165 b
RsaI (A->T) AA 242 312.325±0.676 a 74.070±0.499 7.288±0.199 1.882±0.087 a
AT 274 314.191±0.599 b 74.996±0.442 7.326±0.176 2.042±0.077 ab
TT 56 315.181±1.274 b 76.040±0.941 7.399±0.376 2.309±0.163 b
NlaIII (A->G) AA 55 310.348±1.304 a 74.841±0.963 7.733±0.384 1.866±0.167 a
AG 250 313.186±0.631 b 74.126±0.466 7.176±0.186 1.889±0.081 ab
GG 270 313.765±0.617 b 75.194±0.456 7.314±0.182 2.161±0.079 b
a, b : 다른 표기 사이에는 유의적인 차이가 인정됨(p<0.05).
통계분석 결과 표 3 및 표 4에서 보는 바와 같이 FABP4 유전자내의 독립된 3좌위와 육종가 및 표현형기록치와 관련성 분석하였다. 그 결과, 육종가에서 FABP4의 유전자형 중 Hpy188I 제한효소 절단 유전자형인 GG, RsaI의 TT 및 NlaIII의 GG형에서 근내지방도와 통계학적인 유의차를 얻었고, 특히, 표 4에서 보여지는 바와 같이 표현형기록치와 관련성 분석결과, Hpy188I (C⇒G), RsaI (A⇒T) 및 Nla III (A⇒G) 3좌위의 유전자형에서 동시에 도체중이 무거워지면서, 근내지방도가 우수해지는 효과가 있는 것으로 분석되었다(p<0.05). 그러므로 한우에 있어서 육량 및 육질 개량을 위한 우수 송아지 및 종축의 선발에 이 유전자형을 유전적 표지인자로 사용 가능함을 보여 준다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 밝혀진 한우의 도체중과 근내지방도에 유의적인 효과를 가지는 FABP4 (Adipoctye-Fatty Acid Binding Protein) 유전자의 독립된 3좌위인 Hpy188I (C⇒G), RsaI (A⇒T) 및 NlaIII (A⇒G)의 유전자형을 이용하여 한우 개체별 유전적 자질을 판정함으로써 비육 밑소의 조기 선발, 육종가의 정확한 추정 등에 활용이 가능하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1) 서열번호 7의 한우 FABP4 유전자로부터 발견되고 도 1에 도시된 17개의 SNP 좌위 판독을 이용하여 연관군의 유전자형을 판별하는 단계;
2) 서열번호 1 내지 서열번호 6의 PCR 프라이머를 이용하여 서열번호 7의 한우 FABP4 유전자를 주형으로 94℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 2분간 확장하는 사이클을 35회 실시하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 더 반응시켜 PCR 증폭하는 단계;
3) 상기 증폭산물을 제한효소 Hpy188I, RsaI 및 NlaIII로 동시에 처리하여 절단한 후 전기영동을 실시하는 단계; 및
4) 상기 전기영동 결과물에 대한 사진 및 이미지를 확보하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계;
를 포함하는 유전적 자질을 판단하기 위한 DNA 표지인자를 선발하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 4) 단계에서 제한효소 절편길이 다양성(Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 분석, 이형접합자 분석(heteroduplex analysis), 단일 나선의 구조적 다형성(single strand conformational polymorphism, SSCP) 및 테크맨 프로브법(Taqman probe method) 중 하나 이상의 과정을 더 거침으로써 개체별 유전자형을 결정함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 의한 방법으로 선발되고,
지방세포(adipocyte)에서 발현되는 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein, FABP4) 유전자의 변이 부위 중 도 1에 도시된 Hpy188I (C⇒G), RsaI (A⇒T) 및 NlaIII (A⇒G) 3좌위를 인지하도록 제작된 DNA 표지인자.
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