KR101258186B1

KR101258186B1 - 흑모색 돼지 품종의 식별방법

Info

Publication number: KR101258186B1
Application number: KR1020090107166A
Authority: KR
Inventors: 전진태; 임현태; 서보영; 종타오; 정은지; 유채경; 이길주
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2013-04-30
Also published as: KR20110050261A

Abstract

본 발명은 흑모색 돼지 품종의 식별을 위한 일배체형 및 이를 이용하여 돼지 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 흑모색 돼지의 품종에 따라 달라지는 KIT 유전자 지역의 일배체형을 새롭게 발굴하고, 이를 이용하여 한국재래돼지 품종과 서구형 품종을 식별해내는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 한국재래돼지를 신속하게 식별할 수 있는 바, 유통 상에 발생할 수 있는 품종 혼동을 제어할 수 있다.

흑모색 돼지, 품종, 식별, 프라이머, haplotype

Description

흑모색 돼지 품종의 식별방법{Method For Discriminating Breeds Of Pig With Black Coat Colour}

본 발명은 흑모색 돼지 품종의 식별을 위한 일배체형 및 이를 이용하여 돼지 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 흑모색 돼지의 품종에 따라 달라지는 KIT 유전자 지역의 일배체형을 새롭게 발굴하고, 이를 이용하여 한국재래돼지 품종과 서구형 품종을 식별해 내는 방법에 관한 것이다.

돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔으며, 우리나라의 경우 돼지고기 중 특정 부위만을 선호하는 경향을 가지고 있다. 현재 돼지고기의 경우 특정부위를 포함해 수입이 되고 있는 상황이고, 또한 국내에서 생산되는 돼지고기는 수많은 브랜드가 만들어져 브랜드육으로 판매되고 있다. 하지만 돼지고기는 육안으로 식별이 불가능하다는 점을 악용하여 일부 부도덕한 유통업자들이 수입육 (냉장 및 냉동육) 및 비 브랜드육 등을 브랜드육으로 둔갑 유통시키고, 수입산 흑모색 돈육이 제주산 흑돼지로 둔갑하는 사례가 증가하고 있다. 따라서 둔갑유 통을 방지하기 위한 과학적인 감식기법이 전무한 상황으로 과학적 감식기법 개발을 통한 건전한 유통문화 정착이 절실히 요구되는 실정이다. 세계 각국에서는 유전자원으로서 재래가축에 대한 보존 및 활용의 가치를 인식하면서 (Notter, J. Anim. Sci. 77:61-69, 1999) 가축들의 품종 형성, 유전적 특성, 유전적 다양성, 타 품종간의 유연관계 등의 분석연구를 수행하여 왔다. 소의 품종집단에 대해서는 혈액단백질, 유단백질, 마이크로세틀라이트 (microsatellites), 미토콘드리아 DNA (mitochondrial DNA), 등 다양한 유전적 표지인자들을 활용한 연구들이 수행되어 왔다. 쇠고기의 경우 2007년부터 생산이력제 시범사업의 일환으로 DNA 마커를 이용한 개체판별 사업이 시행되었으나, 아직 돼지고기 생산이력에 관련된 연구 등이 국내에서 미비하여 산업에 직접 활용 가능한 기술이 개발되지 못하고 있어 브랜드육의 신뢰성을 높이고 정확한 부정육 식별을 위하여 돼지에 적합한 개체 식별 방법 개발이 필요하다.

인도의 동부 지방에서는 돼지가 사육되어 온지 9000년 정도 되었으며, 돼지 사육의 역사는 오래전부터 여러 지방에서 사육되어졌다고 보고되었다. 일반적으로 유럽품종과 아시아 품종들은 각 대륙의 야생 멧돼지 (Sus scrofa)에서 유래되었으며, 현재까지 존재하고 있는 품종은 200 여종 이며, 최근 FAO (Finance and Accounts Office)에서 발표한 결과에 따르면 아시아품종이 30%, 유럽품종이 33% 정도임이 보고되었다. 이 품종들 사이에 표현형의 차이는 모색, 크기, 체형 등이 있다.

모색에 관련된 유전자 중 KIT 유전자는 mast/stem cell growth factor receptor로 불리우며, 기능은 돼지, 소, 말 그리고 개의 모색을 결정하는 결정적 유전자라고 보고되었다. KIT은 hematopoietic 줄기 세포의 표면에 cytokine receptor로 발현하며, 다른 형태의 세포로도 발현된다. 단백질의 형태로는 mast cell growth factor의 transmemberance receptor로 3가지가 존재하고, KIT에 포함되어 있는 extracellular domain은 5종류의 immunoglobulin domain을 비롯하여, single transmembrane domain, juxtamembrane domain, 그리고 intracellular protein kinase domain으로 이루어져 있다. KIT은 멜라닌 세포분화의 제어, 생존, 사멸, 증식 등 생존에 필수적인 요인으로 역할을 하고 있다. KIT 유전자 변이는 소화기관 기질종양, 비만세포병, 얼룩백색증 등에 연관되어있다. 선행연구에 따르면 KIT유전자는 유럽돼지품종에서 모색의 표현형을 결정하는 4개의 주 대립유전자를 동정하였다. i (wild-type) allele은 야생 및 열성형으로 멧돼지와 유색품종에서 나타나며, I ^P는불완전 우성형으로 patch 표현형을 가지며, I ^Be allele 은 belt형 표현형이며, I allele (I ¹, I ², I ³, I ^L) 은 완전우성으로 전체가 백색인 품종 Landrace와 Large White 우성 백색 품종에서 나타난다고 보고하였다. patch 형과 우성 백색 모두 KIT 유전자의 구조적변이에 의함과 동시에 KIT 유전자 반복수 변이를 가지고 있다고 보고하였다. 백색 belt형 표현형은 KIT에서는 아직 알려지지 않은 유전자 변이로 야생형 대립유전자 i 와는 연관되어 있지 않다고 보고되었다. 그러나 모색과 연관된 KIT 유전자에 관한 연구는 중국 돼지에 대하여는 제한적으로 행해졌으며, 한국재래돼지에 관한 연구는 더욱 빈약한 실정이다. 따라서 한국재래돼지와 서구형 품종의 돼지를 식별할 수 있는 방법이 절실히 필요하다.

삭제

이에 본 발명자들은 돼지의 모색 관련 KIT 유전자에 대한 기존 연구 영역을 확대하여 백색과 흑모색의 구분뿐만 아니라, 단일염기다형성의 조합으로 나타나는 haplotype의 형태로 흑모색 품종 간에, 보다 구체적으로 국내에서 주로 사육되는 Berkshire, Hampshire와 한국재래돼지의 품종 식별 방법을 연구하여 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 흑모색 돼지의 품종 식별을 위한 일배체형 (haplotype)을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 흑모색 돼지 품종의 식별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 흑모색 돼지의 품종 식별용 프라이머를 제공하는 것이다.

삭제

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 서열번호 35 내지 44의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드들로 구성된 군으로부터 1이상 선택된, 흑모색 돼지의 품종 식별을 위한 일배체형 (haplotype)을 제공한다.
상기 일배체형 중 서열번호 35 내지 37 및 41의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드들로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 일배체형은 한국재래돼지 품종과 연관된 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기의 흑모색 돼지의 품종 식별을 위한 일배체형을 검사하고자 하는 시료의 일배체형과 비교하는 것을 특징으로 하는 흑모색 돼지 품종의 식별방법을 제공한다.
상기 식별방법은, (1) 흑모색 돼지로부터 채취한 시료로부터 DNA를 분리한 후, 상기 분리한 DNA의 KIT 유전자에 특이적인 프라이머 쌍들을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 증폭된 PCR산물을 정제한 후 SNP의 종류를 파악하는 단계; (3) 상기 (2) 단계에서 파악된 SNP로부터 일배체형을 추정한 후 계통유전학적으로 분류하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 추정 및 분류된 일배체형을 서열번호 35 내지 44의 염기서열로 표시되는 일배체형과 비교하는 단계; 를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 식별방법에서 (1) 단계의 시료는 흑모색 돼지의 혈액 또는 모근으로부터 채취하는 것이 바람직하다.
또한 식별방법에서 (1) 단계의 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 34로 표시되는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
또한 상기 (2) 단계의 SNP 는 염기서열분석, pyrosequencing, MALDI 또는 oligonucleotide ligation assay 방법으로 파악되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 1쌍 이상 선택되는, 흑모색 돼지의 KIT 유전자에 특이적인, 흑모색 돼지의 품종 식별을 위한 프라이머를 제공한다.

삭제

본 발명에 의하면 돼지 품종을 구별할 수 있는 일배체형을 확립함으로써, 이를 이용하여 신속하고 효과적으로 한국재래 돼지를 식별할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 식별방법을 한국 흑돼지 브랜드육의 식별에 적용함으로써 유통 상에 발생하는 부정행위를 제어할 수 있으며, 브랜드에 대한 소비자의 신뢰도를 상승시켜 생산농가의 소득 증대에 도움을 줄 수 있다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드들로 구성된 흑모색 돼지의 품종 식별을 위한 일배체형 (haplotype)에 관한 것이다.
상기 일배체형은 서열번호 35 내지 44의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드들로 구성된 군으로부터 1 이상 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "일배체형 (haplotype)"은 개체로부터 단일 유전자에 대한 복수의 다형성 및 개체마다 상이한 다수의 다형성 부위에서 변이의 특정 조합을 말한다. 상기 일배체형은 각각의 단일염기다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편들의 조합 또는 복수의 단일염기다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 전자의 경우에는 각 단편이 10-2159개의 염기를 포함할 수 있고, 후자의 경우에는 2159개 이상의 염기를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 돼지 품종 특이 일배체형을 개발하여 최종적으로 흑돼지 품종 중 한국 재래돼지의 품종 식별을 가능케 하였다. 보다 구체적으로는, 총 17쌍의 프라이머를 사용하여 KIT 유전자의 21개의 exon 지역을 PCR 증폭한 후, 서구형 흑모색 품종인 Berkshire, Hampshire와 아시아형인 한국 재래돼지에 특이적인 SNP를 새롭게 발굴하였다. 또한 SNP의 서열을 바탕으로 각 품종의 Haplotype을 제작하였다. Haplotype 분석은 단일 마커에 의한 분석보다 더 정확하다고 보고된 바 있다.
Haplotype의 빈도 수 계산법은 전체 Haplotype에 Hetero가 나타날 수 있는 가능성을 곱한 값에서 분석 결과로 나온 Haplotype에 해당하는 두수를 나누어 계산한 결과값이다. 유전적 연관성에 의한 흑모색 품종 간 연관관계는 Network software version 4.5.1.0. (http://fluxus-engineering.com)(Bandelt et al., Mol Biol Evol 16:37-48, 1999)을 이용하여 추정하였으며, 제작된 network는 도 2와 같다. network를 이용한 계통분류학적 재건은 조상별 유형과 잠재적인 유형을 추측가능하고, 진화된 가지와 변화 또한 평가할 수 있는 장점이 있으며, 다양한 양상의 자료를 제공하였다. 본 발명에서 제작된 Haplotype은 서열번호 35 내지 44의 염기서열을 갖으며, 보다 자세한 내용은 표 3에 나타난 바와 같다.
따라서 서열번호 35 내지 37 및 41의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드들로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 일배체형은 한국재래돼지 품종과 연관된 것임을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 돼지 품종 특이적인 일배체형을 검사하고자 하는 시료의 일배체형과 비교하는 것을 특징으로 하는 흑모색 돼지 품종의 식별방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로 상기 식별방법은 (1) 흑모색 돼지로부터 채취한 시료로부터 DNA를 분리한 후, 상기 분리한 DNA의 KIT 유전자에 특이적인 프라이머 쌍들을 이용하여 증폭하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 증폭된 산물을 정제한 후 SNP의 종류를 파악하는 단계; (3) 상기 (2) 단계에서 파악된 SNP로부터 일배체형을 추정한 후 계통유전학적으로 분류하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 추정 및 분류된 일배체형을 서열번호 35 내지 44의 염기서열로 표시되는 일배체형과 비교하는 단계;를 포함한다.
상기 (1) 단계의 시료는 흑모색 돼지의 혈액 또는 모근으로부터 채취된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 시료부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사 증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머"는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합체) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15-25 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
상기 (1) 단계의 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 1쌍 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 SNP 부위는 표 2와 같다.
다형성 부위를 증폭하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR증폭, 리가아제 체인 반응, 중합효소 리가아제 체인 반응, Gap-LCR, 리페어 체인 반응, 3SR 및 NASBA을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭에 따라 증폭한다.
염기를 결정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 서열분석 (sequencing), PCR-SSCP (single stranded conformation polymorphism) 분석, PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석, 대립형질 (allele) 특이적 혼성화 방법, DNA 칩 방법, ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) 방법 및 면역블랏 (immunoblot) 방법, SNaPShot 분석 방법, TDGS(Twodimensional Gene Scanning), Taq-Man? 및 TOGATM 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, SNP 분석은 염기서열분석, pyrosequencing, MALDI 또는 oligonucleotide ligation assay 방법으로 분석될 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 1쌍 이상 선택되는, 흑모색 돼지의 KIT 유전자에 특이적인, 흑모색 돼지의 품종 식별을 위한 프라이머에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명의 실시예에서는, 돼지의 KIT 유전자에 관하여 총 5개의 단일염기다형성을 동정하였다. Haplotype은 크게 서구품종과 아시아품종으로 식별 가능하였으며, mtDNA 분석 결과와 일치하였다. Berkshire와 Hampshire 품종의 모색은 한국재래돼지와 같이 흑모색이다. 이들 세 품종은 기존의 유전자형 분류 방법에 의하면, 모두 KIT 유전자형은 i/i 이고 MC1R 유전자형은 E^D1/E^D1, E^D1/E^D2, E^D2/E^D2 로써 백색 품종인 Landrace, Large White 및 Duroc과는 식별이 가능하나, 흑모색 품종 내에서의 품종 세부 식별은 불가능하였다. 본 발명을 통하여 서구형 흑모색 품종인 Berkshire, Hampshire와 아시아형인 한국 재래돼지를 구분함으로써 보다 구체적으로 흑모색 품종의 식별이 가능한 품종 특이 haplotype을 개발하여 최종적으로 흑돼지 품종 중 한국재래돼지의 품종식별을 가능케 하였다.
실시예 1: KIT 유전자 번역지역내의 SNP의 발굴
KIT 유전자의 21개의 exon 지역에서 총 17쌍의 프라이머 (primer)를 제작하였다. primer에 대한 정보는 하기 [표 1]과 같다.

돼지 KIT 유전자의 SNP 지역 증폭을 위한 17쌍의 primer 서열 및 조건

Primer Name	Sequence	Product size	TM	서열번호
KIT_E1F	5′-GGAACGTGGAAAGGAGCT-3′	205bp	66℃	1
KIT_E1R	5′-CAGCCACCTCTTCTGACAC-3′			2
KIT_E2F	5′-ACCCTTGCACCATAAATAGC-3′	498bp	59℃	3
KIT_E2R	5′-GACTCAGCCATCTATATGTC-3′			4
KIT_E3F	5′-TCAGATTCGTTAACCACTGC-3′	447bp	64℃	5
KIT_E3R	5′-TGGCATATCCGCTGATCTA-3′			6
KIT_E4F	5′-CGAAAGGCCATACAGTGAG-3′	362bp	50℃	7
KIT_E4R	5′-TGTATGAAAGCAACTATACC-3′			8
KIT_E5F	5′-TCCCCCCGGGACTGCAGAGATTT GGGAATTATG-3′	548bp	59℃	9
KIT_E5R	5′-CGCGGATCCTCAACCTACTACTT CTAAGGTGG-3′			10
KIT_E6F	5′-GAAGACATAAGATGGTGATA-3′	385bp	53℃	11
KIT_E6R	5′-CTAATATCCATGAGGACGCAGG-3′			12
KIT_E7F	5′-CCAAAGCAGGCGTGTATTT-3′	344bp	55℃	13
KIT_E7R	5′-GGTCAAAATTATCATGAAGCAG-3′			14
KIT_E8F	5′-GTCATCTTCAGCCTCAAGAAAG-3′	313bp	54℃	15
KIT_E8R	5′-TCTGAAAACATATTTGAAATTC-3′			16
KIT_E9F	5′-GGCAAATAATTTTTCTTCTAG-3′	293bp	54℃	17
KIT_E9R	5′-GGATGTTTAGGCTCTGCCTG-3′			18
KIT_E10-11F	5′-CTTGACTCCTGCCATGATG-3′	536bp	64℃	19
KIT_E10-11R	5′-CTAGAACAAAGGAAGCTACCG-3′			20
KIT_E12-13F	5′-GTCCCTGATTCCTTTATTGG-3′	486bp	60℃	21
KIT_E12-13R	5′-GCTTATCATCAAGGATGGTC-3′			22
KIT_E14F	5′-GCATGTGAATGGCCGTGATC-3′	322bp	50℃	23
KIT_E14R	5′-ATCAGCCTTGATTGCAAACC-3′			24
KIT_E15-16F	5′-CAAAGTCAGCCTCTTATGTGA-3′	910bp	52℃	25
KIT_E15-16R	5′-CTACGGCTCTAAAATGCTCC-3′			26
KIT_E17F	5′-TGGCACCATATAACATAGGC-3′	325bp	60℃	27
KIT_E17R	5′-GGTGTGCATTATGAAACTCAC-3′			28
KIT_E18-19F	5′-GCAGCAGGAGCAGTATCTAC-3′	482bp	63℃	29
KIT_E18-19R	5′-GAACCCAGATGTTGAAGGTT-3′			30
KIT_E20F	5′-GGTGTACACCCAAAGACAG-3′	217bp	63℃	31
KIT_E20R	5′-CTGTTCAAGGCGTTCCAAGC-3′			32
KIT_E21F	5′-ACTTGCGATTCTGGACCTGC-3′	271bp	63℃	33
KIT_E21R	5′-GAATGGCAGTAGGTCGGTGC-3′			34

PCR은 25 ng의 genomic DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.5 mM MgCl₂, 10 pmole primer, 150 μM dNTPs, 그리고 1 unit의 Taq polymerase (GenetBio, Korea), 증류수를 첨가하여 최종 부피가 25 ㎕로 반응하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후 94℃에서 20초, anealing 온도는 50 ~ 66℃에서 40초, 72℃에서 60초 신장을 1 cycle로 하여 35회 반복수행 하였으며, 72℃에서 5분간 최종 신장시킨 후 8℃에서 종료하였다. 모든 반응은 PTC-200 Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc., USA)에서 수행하였으며. 증폭된 PCR산물은 Gel Extraction Kit (Qiagen, Netherland)을 이용하여 gel purification을 실시하였다. 이를 주형으로 Direct sequencing을 하여 염기서열 분석을 하였다. DNA sequencing은 Applied Biosystems 3130 DNA sequencer (PE Applied biosystems, USA)를 이용하였다. Sequencing된 SNP의 비교 그림은 도 1에서 나타난 바와 같다. 분석된 결과는 Sequencher version 4.7 software (Gene Codes Corporation, USA)를 이용하여 전체 서열을 정렬한 후 Clustal W(Thompson et al.1994)를 이용하여, 한국재래돼지, Berkshire, Hampshire의 서열을 염기정렬 하였다. 각 exon별로 정렬하여 비교된 SNP는 하기 [표 2]와 같다.

발굴된 SNP의 품종별, Exon별 요약

Sample
ID

Exon 번호 (codon/nucleotide position)

2
(40/
120)¹

2
(78/
234)

3
(135/
405)²

3
(163/
489)²

3
(164/
492)²

3
(173/
518)²

3
(174/
522)²

3
(182/
546)²

3
(184/
552)²

3
(195/
583)

5
(274/
821)³

5
(276/
828)³

6
(336/
1008)³

9
(488/
1464)³

12
(621/
1863)²

13
(633/
1899)

14
(662/
1986)²

15
(733/
2199)²

18
(834/
2502)³

19
(867/
2601)

19
(887/
2661)²

19
(893/
2678)³

20
(916/
2748)

J105

G

T

C

T

A

T

G

A

G

A

G

Y

R

S

Y

C

Y

C

Y

J16

G

T

C

T

A

T

G

A

G

A

G

R

Y

R

S

Y

C

Y

C

Y

J17

G

T

C

T

A

T

G

A

G

A

G

C

G

C

T

C

T

J23

G

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C

T

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T

G

A

G

A

G

R

Y

R

S

Y

C

Y

C

Y

J26

G

T

C

T

A

T

G

A

G

A

G

T

A

G

T

C

J28

G

T

C

T

A

T

G

A

G

A

G

C

G

C

T

C

T

K-23

G

T

C

T

A

T

G

A

G

A

G

Y

R

S

Y

C

Y

C

Y

K-27

G

T

C

T

A

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G

A

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A

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T

A

G

T

C

K-31

G

T

C

T

A

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G

A

G

A

G

Y

R

S

Y

C

Y

C

Y

K5-10

K

W

M

Y

R

Y

S

M

G

R

C

R

C

Y

B-143

T

A

C

G

C

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C

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C

Y

B-144

T

A

C

G

C

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A

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C

R

C

Y

B-145

T

A

C

G

C

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C

Y

B-146

T

A

C

G

C

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C

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C

Y

B-171

T

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C

Y

B-173

T

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T

C

B-175

T

A

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G

C

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A

C

T

C

B-178

T

A

C

G

C

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Y

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Y

C

Y

B-177

T

A

C

G

C

A

G

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C

R

C

Y

T

C

Y

B-942

T

A

C

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C

G

C

T

C

T

H-3-4

T

A

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C

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C

A

C

T

C

H-69-3

T

A

C

G

C

G

A

G

C

A

C

T

C

* 품종구분: 한국재래돼지(K, J); Berkshire(B); Hampshire(H)
* 염기서열구분: K,T/C; W,T/A; M,C/A; Y,C/T; R,A/G; S,C/G
* 1, 2, 3 SNP는 기존에 보고된 서열이며, 그 외의 밑줄의 기울임 꼴로 표시된 서열은 본 실시예에서 새로이 발굴한 SNP 서열이다.
1: Naohiko et al., J Anim Sci, 79: 303-313, 2008
2: Lai et al,. J Hered, 98(1): 84-87, 2007
3: Marklund et al., Genome Res, 8(8): 826-833, 1998
실시예 2: 발굴된 SNP을 이용한 품종 특이 haplotyope의 발굴
상기 [표 2]에서와 같이 동정된 SNP의 서열을 바탕으로 PHASE version 2.1 software (http://www.stat.washington.edu/stephens/software.html)(Stephens et al., American J of Human Genet, 2001; Stephens and Donnelly, American J of Human Genet, 2003; Crawford et al., Nature Genetics 2004; Stephens and scheet, American J of Human Genet, 2005)에 SNP를 Homo나 Hetero의 형태로 입력하여 각 품종의 Haplotype을 제작하였다. 제작된 Haplotype은 하기 [표 3]에 나타난 바와 같으며, 총 10종류의 Haplotype으로 한국재래돼지 (K1, K2, K3와 K7), Berkshire (K4, K5, K8, K9와 K10)와 Hampshire (K6) 간에는 품종 특이적 haplotype이 존재하고 있어 품종식별이 가능하다. Haplotype 분석은 단일 마커에 의한 분석보다 더 정확하다고 보고된 바 있다. Haplotype의 빈도 수 계산법은 전체 Haplotype에 Hetero가 나타날 수 있는 가능성을 곱한 값에서 분석 결과로 나온 Haplotype에 해당하는 두수를 나누어 계산한 결과 값이다. 유전적 연관성에 의한 흑모색 품종 간 연관관계는 Network software version 4.5.1.0. (http://fluxus-engineering.com) (Bandelt et al., Mol Biol Evol 16:37-48, 1999)을 이용하여 추정하였으며, 제작된 network는 도 2와 같다. network를 이용한 계통분류학적 재건은 조상별 유형과 잠재적인 유형을 추측가능하게하고, 진화된 가지와 변화 또한 평가할 수 있는 장점이 있으며, 다양한 양상의 자료를 제공하였다. 결과적으로, 서구형 흑돼지와 한국재래돼지는 유전적으로 확연히 구분이 되면 이런 특성은 haplotype의 품종 다양한 형태의 이적 차이를 잘 반영하고 있는 것이다. 즉, 한국재래돼지 haplotype들은 서구형 흑돼지 haplotype과는 확연히 구분되는 별도의 군집을 형성하고 있어 기원이 다름을 나타내고 있다.
흑돼지 여부는 대한민국 특허 10-2007-0104192에 나타난 기술과 MC1R의 유전자형에 E^D 또는 E^D12 를 포함하는 여부를 파악하여 판정하는 기존의 기술로 잘 판별할 수 있다. 일차로 흑돼지 여부가 판정된 미지의 흑돼지 고기 또는 혈액시료에 대한 한국재래돼지 여부에 관한 분석과 판정은 하기 [표 3]의 표준 haplotype에 대한 비교를 통하여 확인할 수 있었다. 판정과정은 미지의 시료로부터 DNA를 분리하고 17쌍의 PCR 프라이머 ([표 1])를 이용하여 haplotype을 구성하는 KIT 유전자 지역을 증폭하였다. 이후 증폭된 PCR 산물은 정제 후 염기서열분석 (ABI sequencer) 또는 single base extension 후 pyrosequencing, MALDI를 이용한 질량분석 infinium assay를 이용하는 방법과 oligonucleotide ligation assay 등의 방법에 의하여 SNP의 종류를 파악하였다. 이들 SNP들은 PHASE software을 이용하여 haplotype을 추정하였다. 추정된 haplotype은 Network software를 이용하여 계통유전학적으로 분류하고 한국재래돼지 군집에 포함되는 haplotype을 갖고 있는지 여부를 파악하여 한국재래돼지 여부를 결정하였다. 한국재래돼지의 군집에 속하는 haplotype을 두 개 갖는 경우 한국재래돼지 순종, 하나는 한국재래돼지형 하나는 서구형 haplotype을 갖은 경우 한국재래돼지와의 교잡종, 2개 모두 서구형을 갖는 경우 Birkshire와 Hampshire를 포함하는 서구형 흑돼지로 분류할 수 있었다.

Haplotype, 연관된 품종 정리 및 frequency 값

Haplotypes		품종	Haplotype 빈도 (%)	서열번호
K1	GTCTAATGAGAGGGCGCCCTTCT	한국재래돼지	50	35
K2	GTCTAATGAGAGGGTAGTCCCCC	한국재래돼지	30	36
K3	GTCTAATGAGAGGATAGTCCCCC	한국재래돼지	15	37
K4	TAACGGCCCGAGAACACCCCCTC	Berkshire	35	38
K5	TAACGGCCCGAGAATAGTCCCTC	Berkshire	5	39
K6	TAACGGCCCGGAGGCACCTCCCC	Hampshire	100	40
K7	TAACGGCCCGGAAACACCCCCTC	한국재래돼지	5	41
K8	TAACGGCCCAAGGGCGCCCTTCT	Berkshire	45	42
K9	TAACGGCCCAAGGACACCCCTCC	Berkshire	5	43
K10	TAACGGCCCAAGAACACCCCCTC	Berkshire	10	44

이상에 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다는 후술할 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

도 1은 실시예-1에서 발굴된 SNP (C/T)의 염기서열의 분석비교 예시를 나타낸 것이다.

도 2는 흑돼지 품종별 haplotype의 유전적 연관성을 나타낸 그림이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Method For Discriminating Breeds Of Pig With Black Coat Colour <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggaacgtgga aaggagct 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cagccacctc ttctgacac 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acccttgcac cataaatagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gactcagcca tctatatgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcagattcgt taaccactgc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tggcatatcc gctgatcta 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgaaaggcca tacagtgag 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgtatgaaag caactatacc 20 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tccccccggg actgcagaga tttgggaatt atg 33 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgcggatcct caacctacta cttctaaggt gg 32 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaagacataa gatggtgata 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctaatatcca tgaggacgca gg 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccaaagcagg cgtgtattt 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtcaaaatt atcatgaagc ag 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtcatcttca gcctcaagaa ag 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tctgaaaaca tatttgaaat tc 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggcaaataat ttttcttcta g 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggatgtttag gctctgcctg 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cttgactcct gccatgatg 19 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ctagaacaaa ggaagctacc g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtccctgatt cctttattgg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcttatcatc aaggatggtc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gcatgtgaat ggccgtgatc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 atcagccttg attgcaaacc 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 caaagtcagc ctcttatgtg a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ctacggctct aaaatgctcc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tggcaccata taacataggc 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ggtgtgcatt atgaaactca c 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gcagcaggag cagtatctac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gaacccagat gttgaaggtt 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ggtgtacacc caaagacag 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ctgttcaagg cgttccaagc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 acttgcgatt ctggacctgc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gaatggcagt aggtcggtgc 20 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 35 gtctaatgag agggcgccct tct 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 36 gtctaatgag agggtagtcc ccc 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 37 gtctaatgag aggatagtcc ccc 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 38 taacggcccg agaacacccc ctc 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 39 taacggcccg agaatagtcc ctc 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 40 taacggcccg gaggcacctc ccc 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 41 taacggcccg gaaacacccc ctc 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 42 taacggccca agggcgccct tct 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 43 taacggccca aggacacccc tcc 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 44 taacggccca agaacacccc ctc 23

Claims

서열번호 35 내지 37, 및 41의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드들로 구성된 군으로부터 선택된, 한국 재래종 흑모색 돼지의 품종 식별을 위한 일배체형 (haplotype).
삭제
삭제
(1) 흑모색 돼지로부터 채취한 시료로부터 DNA를 분리한 후, 상기 분리한 DNA의 KIT 유전자에 특이적인 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34의 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계;

(2) 상기 (1) 단계에서 증폭된 PCR산물을 정제한 후 SNP의 종류를 파악하는 단계;

(3) 상기 (2) 단계에서 파악된 SNP로부터 일배체형을 추정한 후 계통유전학적으로 분류하는 단계; 및

(4) 상기 (3) 단계에서 추정 및 분류된 일배체형을 제 1항의 일배체형과 비교하는 단계;

를 포함하는 한국 재래종 흑모색 돼지 품종의 식별방법.
제 4항에 있어서,

상기 (1) 단계의 시료는 흑모색 돼지의 혈액 또는 모근으로부터 채취된 것을 특징으로 하는, 한국 재래종 흑모색 돼지 품종의 식별방법.
삭제
제 4항에 있어서,

상기 (2) 단계는 상기 (2)단계는 염기서열분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) 또는 OLA(Oligonucleotide Ligation Assay) 방법으로 분석되는 것을 특징으로 하는, 한국 재래종 흑모색 돼지 품종의 식별방법.
삭제