KR101953840B1 - 서양종꿀벌 계통 판별을 위한 rflp 분석용 프라이머 세트 - Google Patents

서양종꿀벌 계통 판별을 위한 rflp 분석용 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서양종꿀벌 계통 판별을 위한 RFLP 분석용 프라이머 세트 또는 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트를 활용함으로써 단일염기다형성 특성을 갖는 서양종꿀벌 계통의 유전자 판별을 용이하게 하여, 농가에서의 질병 저항성이 우수한 꿀벌의 유지 및 관리에 도움을 줄 수 있다.

Description

서양종꿀벌 계통 판별을 위한 RFLP 분석용 프라이머 세트 {The primer set of RFLP methods for determining Apis mellifera species using analysis of single nucleotide polymorphism}
본 발명은 서양종꿀벌 계통(품종) 판별을 위한 RFLP 분석용 프라이머 세트 또는 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
육종에 사용되는 기존의 분자마커로는 RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism) 등이 있다. 이들 마커들은 대부분 게놈상의 DNA 염기서열간의 다형성(polymorphism)을 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 통해 쉽게 확인할 수 있다는 기술적 공통성을 가지고 있으나 계통간 변이가 극이 미미한 꿀벌의 계통간 차이를 구별하기 위한 분자마커로는 부적절하다. 최근, 집단유전학(population genetics) 분야에서는 생물집단의 유전적 구조와 다양성 연구를 위해서 microsatellite를 가장 많이 이용하고 있다. Microsatellite는 매우 특이적인 locus specificity를 보이며 개체간 형태적 변이가 다양하고 전체 게놈에 무작위적으로 풍부하게 산재해 있으면서도 유전자좌가 공동우성으로 후세대에 유전된다는 특성을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 SGB(Sequence Based Genotyping) 분석을 이용하여 서양종꿀벌(Apis mellifera)의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커를 발굴하고 이를 이용하여 질병저항성 꿀벌의 계통 판별에 이용할 수 있는 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석용 유전자 특이적 분자마커를 개발하고자 하였다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0057536호 (서양종꿀벌 특이적 초위성체 분자 마커 및 이를 이용한 서양종꿀벌 품종 판별 방법, 2016.05.24. 공개) 대한민국 등록특허 제10-1151757호 (대한한국 연안 해파리류의 종 판별 방법과 이에 따른 해파리류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ 칩 및 키트, 2012.05.24. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1289576호 (한우 육량 관련 분자마커 개발, 2013.07.18. 등록) 대한민국 공개특허 제10-2008-0022563호 (분자마커 이용 고능력 한우 진단 방법, 2008.03.11. 공개) 대한민국 등록특허 제10-1311249호 (배추 노균병에 대한 성체식물 저항성을 부여하는 유전자좌, 및 이와 연관된 분자 표지, 2013.09.12. 등록) 대한민국 공개특허 제10-2010-0117170호 (배추의 유전자적 다중대립인자 웅성불임 유전자 Ｍｓ의 마커 및 이의 용도, 2012.05.23. 등록) 대한민국 공개특허 제10-2010-0112019호 (징거미새우의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머, 2010.10.18. 공개) 대한민국 등록특허 제10-1406720호 (차세대 염기서열 분석법을 위한 융합 프라이머의 설계방법 그리고 이러한 융합 프라이머 및 차세대 염기서열 분석법을 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법, 2014.06.05. 등록)
본 발명의 목적은 서양종꿀벌 계통 판별을 위한 RFLP 분석용 프라이머 세트 또는 이를 함유하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머, 및, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 함유하는 서양종꿀벌 계통 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머, 및, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머를 함유하는 서양종꿀벌 계통 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 프라이머 세트를 포함하는 서양종꿀벌 계통 판별용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석용 조성물인 것을 특징으로 한다.
이에 본 발명은 상기 프라이머 세트, 계통판별용 서양종꿀벌의 유전자 시료 및 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석용 조성물을 혼합하는 단계; 및, 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하고 분석하는 단계;를 포함하는 서양종꿀벌 계통 판별법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기의 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머, 및, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 함유하는 서양종꿀벌 계통 판별용 프라이머 세트(제1세트)에 관한 것이며, 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 서양종꿀벌 계통 판별용 조성물에 관한 것이다.
서열번호 1 : AAATTATATCTTCTTCTGAA
서열번호 2 : AATATATTTATAGATTTGATTC
본 발명은 또한 하기의 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머, 및, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머를 함유하는 서양종꿀벌 계통 판별용 프라이머 세트(제2세트)에 관한 것이며, 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 서양종꿀벌 계통 판별용 조성물에 관한 것이다.
서열번호 3 : AAGAGTGAAAATGGTGAGAC
서열번호 4 : TTTTACACATCAAAAATTGAC
이 때 상기 서양종꿀벌 계통 판별용 조성물에는 제1세트 또는 제2세트 각각을 포함할 수 있으며, 제1세트 및 제2세트가 모두 포함될 수 있다. 제1세트와 제2세트가 모두 포함될 경우, 각각의 프라이머 세트에 대해 꿀벌 유전자를 별도로 분석하여 동일한 결과가 나오는지 확인함으로써, 서양종꿀벌 계통 판별의 검증이 보다 더 정확하게 수행될 수 있다.
RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 수행하기 위해, 본 발명의 프라이머 세트, 계통판별용 서양종꿀벌의 유전자 시료 및 DNA 중합효소를 혼합할 때, RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석용 조성물을 포함시키는 것이 바람직한데, 상기 조성물에는 DNA 중합효소, 제한효소, dNTPs(deoxynucleoside triphospates), 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 멸균수 등이 포함될 수 있다. 본 발명에서 제한효소로는 AseI 및 MlyI을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 계통판별용 서양종꿀벌의 유전자 시료는 게놈 DNA일 수 있다.
본 발명은 서양종꿀벌 계통 판별을 위한 RFLP 분석용 프라이머 세트 또는 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트를 활용함으로써 단일염기다형성 특성을 갖는 서양종꿀벌 계통의 유전자 판별을 용이하게 하여, 농가에서의 질병 저항성이 우수한 꿀벌의 유지 및 관리에 도움을 줄 수 있다.
도 1은 꿀벌의 질병저항성 능력을 테스트 하는 방법을 나타낸다. 자세하게는 꿀벌이 번데기에서 성충으로 우화하기 전 봉개된 상태의 봉판(Brood comb)에 높이 10cm 직경 7cm의 알루미늄 원통을 이용해 액체질소를 부어 일정한 범위내의 번데기를 죽이는데, 이때 질병저항성이 높은 형질을 가지고 있는 봉군은 빠른 시간 내에 죽은 번데기를 제거하는 꿀벌은 Hygienic, 질병저항성이 낮은 형질을 가지고 있는 봉군은 정해진 시간 내에 죽은 번데기를 제거하지 못하는 꿀벌은 Non-hygienic으로 표기하여 사진으로 제시하였다.
도 2는 꿀벌 계통 별로 질병저항성 능력을 그래프로 표현한 것으로서, Capped rate는 죽은 번데기의 봉개된 밀납을 제거한 비율, Uncapped rate는 죽은 번데기의 봉개된 밀납을 제거하지 않은 비율, Removal rate는 죽은 번데기를 제거한 비율을 나타내며, Hygienic behavior는 죽은 번데기를 제거하거나 봉개된 밀납을 제거한 비율을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 확인한 SNP 1 및 2의 마커에 대한 프라이머 세트를 이용하여 RFLP 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 질병저항성 꿀벌 계통의 선별>
본 실험에 사용한 꿀벌 계통 시료는 농촌진흥청과 예천 곤충연구소에서 공동으로 선발 육성 중인 6계통의 서양종 꿀벌(Apis mellifera) A, C, D, E, F, G이다. 꿀벌 계통 별로 청소행동을 통한 질병저항성 표현형을 보이는 벌집 상태의 기준은 도 1에 나타내었다.
도 1의 사진 중, Brood comb은 번데기 상태의 봉판에 높이 10cm 직경 7cm의 알루미늄 원통을 이용해 질병저항성 능력을 테스트할 범위를 지정한 것이다. 이 때, 원통내에 액체질소를 부은 후 질병저항성을 가지는 형질의 표현형(Hygienic)과 질병저항성을 가지지 않는 형질의 표현형(Non-hygienic)으로 꿀벌군을 구분하였는데, Hygienic은 벌집을 덮고 있는 밀납을 제거한 후 죽은 유충을 모두 제거하여 벌집을 위생적으로 유지하고 있는 상태, Non-hygienic은 벌집의 밀납은 제거하지 않아 죽은 유충이 제거되지 않아 벌집이 비위생적으로 유지되고 있는 상태를 찍은 것이다.
한편, 이렇게 표현되는 벌집의 상태를 표 1 및 도 2에 나타내었다.
Inbred Line Hygienic status 24h (%) 48h (%)
capped removal uncapped capped removal uncapped
A Non-hygienic 27.2 64.0 8.8 27.0 68.4 4.7
C Hygienic 10.9 84.8 4.4 1.9 97.0 1.1
D Hygienic 5.4 86.0 8.6 3.1 94.9 2.0
E Non-hygienic 51.9 37.2 10.9 28.3 67.1 4.7
F Hygienic 1.8 97.4 0.8 1.3 98.4 0.3
G Non-hygienic 46.0 40.5 13.5 35.3 54.0 10.7
Control Non-hygienic 61.4 32.0 6.6 35.4 64.0 0.6
도 2는 꿀벌 계통 별로 질병저항성 능력을 나타내는 표 1의 결과를 그래프로 표현한 것으로서, Capped rate는 죽은 번데기의 봉개된 밀납을 제거한 비율, Uncapped rate는 죽은 번데기의 봉개된 밀납을 제거하지 않은 비율, Removal rate는 죽은 번데기를 제거한 비율을 나타내며, Hygienic behavior는 죽은 번데기를 제거하거나 봉개된 밀납을 제거한 비율을 나타내었다. 이 때 각 결과를 참고하면 질병저항성 형질을 가지는 꿀벌 계통은 C, D, F 인 것으로 확인된다.
<실시예 2. 서양종꿀벌로부터 게놈 DNA 분리>
서양종 꿀벌(Apis mellifera) A, C, D, E, F, G 각각에 대해, DNeasy Blood and Tissue kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 꿀벌의 게놈 DNA를 추출 및 분리하였고, -20℃에 보관하였다. 게놈 DNA의 품질(quality)은 1% 아가로즈 젤(agarose gels)과 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 통해 확인하였다.
<실시예 3. 서열 기반 유전형질(Sequence Based Genotyping) 분석의 수행>
꿀벌의 품종을 Disease-resistant strain, Disease-susceptible strain으로 나누어 SGB(Sequence Based Genotyping)을 실시하였다. SGB 분석은 Illumina NextSeq500을 통해 수행하였고, SGB 결과 총 602,061,894개 sequence(195 Giga-bp) 가 생성되었으며, GC 함량은 31%이었다.
Sample No.
Sample		 Total bases
(Gb)		 Q score >30 rate* Mapped reads Average overall alignment rate
Disease-resistant
strain		 20 105 75 344,752,153 86.10
Disease-susceptible strain 20 90 68 294,139,801 88.82
Total 40 195 - 638,891,954 -
* Quality scores are defined as a property that is logarithmically related to the base calling error probabilities (P)2; 30 Q
이렇게 분석된 시료들을 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석을 하였다. SNP는 SBG 분석을 통해 mapping된 read가 특정 위치에서 Reference와는 다른 염기로 치환되어 있는 변이를 말하며, SNP 외에도 Insert, Deletion과 같은 변이가 나타나는데 이 둘을 함께 묶어 DIP(Deletion/Insert polymorphism)라 칭한다. 서열 중간 중간에 일어나는 변이의 원인은 DNA 복제과정에서의 오류에 의한 돌연변이 때문이다. 이러한 변이의 일부는 나아가 아미노산의 변이, 단백질의 변이로 이어져, 유전자의 기능에 영향을 미치게 되고, 개체간에 유전적 차이가 일어나는 원인이 된다. SBG 결과로 얻어진 많은 read들의 SNP를 확인하기 위해서는 우선 read들을 Reference에 Mapping하여야 한다. 이 Mapping 작업에는 Bowtie, BWA, Maq, CLC, Keygene Pipeline 등 다양한 소프트웨어가 존재하는데, 본 실험에서는 SBG 분석을 위해 Keygene Pipeline을 사용하였다. 또한 이후의 SNP 확인을 위한reference mapping은 BWA 프로그램을 사용하였다.
SNP detection을 위해, SBG Mapping을 통해 얻은 potential SNP들이 모두 유전적으로 의미를 갖는 variation이라고 보기는 어렵기 때문에 mapping된 read들의 depth, variation call rate (frequency) 등을 고려한 적정 기준을 세워 filtering을 진행하였다. variation frequency에 의해 SNP는 homozygous와 heterozygous, 두 가지 type으로 나뉘는데, homozygous는 해당 position에 mapping된 거의 모든 read들에서 variation이 일어난 경우이고, heterozygous는 그 read들의 일부에서만 variation이 일어난 경우이다. 때문에 일정 기준 이하의 frequency를 갖는 SNP들은 Heterozygous로 보고 filtering 해낸 후, homozygous SNP만을 significant SNP로 취하였다. 또한 frequency가 높더라도 variation이 일어난 위치에 mapping된 read의 수(depth)가 너무 적은 경우엔 significant SNP라고 보기 어렵기 때문에 filtering 하여 significant 한 SNP site를 탐색하였다. 이렇게 분석된 SNP의 차이는 본 실험에서 사용된 꿀벌의 계통(품종)을 확인할 수 있는 품종을 구별할 수 있는 maker로 사용될 수 있는데, SNP는 개체의 특정 위치의 염기서열은 차이를 보이는 것을 활용하여 각 품종 별로 클러스터링을 할 수 있어 각 품종간의 차이를 결정짓는 maker로 사용가능하기 때문이다.
이 같은 방법을 이용하여 질병저항성 꿀벌 계통에 대한 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 영역내 genome annotation 결과는 표 3에 나타내었고, 단일염기다형성 특성이 나타난 유전자를 2종 선별하여 표 4에 나타내었다.
SNP categoriesa Disease-resistant strain Disease-resistant strain
Counts Percent Counts Percent
Exon 143,282 4.39 117,141 5.06
Transcript 202 0.01 170 0.01
Splice site Splice region variant 6,116 0.19 4,054 0.18
Splice acceptor variant 166 0.01 135 0.01
Splice donor variant 690 0.02 615 0.03
Intron Intron variant 924,610 28.30 637,524 27.53
Intergenic Intergenic variant 1,111,364 34.02 801,648 34.61
Downstreambgenevariant 507,791 15.54 354,226 15.29
Upstreambgenevariant 524,152 16.05 366,116 15.81
UTR 5 prime UTR variant 12,074 0.37 8,984 0.39
3 prime UTR variant 36,309 1.11 25,515 1.10
Figure 112017110223797-pat00001
*GB54886, GB53064 : Hymenoptera Genome Database의 bee base number
다음으로는 이 SNP 1 및 2 마커 유전자를 확인할 수 있는 질병저항성 꿀벌 계통 특이 SNP 마커에 대한 프라이머 세트를 합성하였고 이에 대한 정보를 하기 표 5에 나타내었다.
SNP Primer Sequence (5' to 3') *Amplicon Size (bp) Annealing temp (℃)
SNP 1 SNP 1-F(서열번호 1): AAATTATATCTTCTTCTGAA
SNP 2-R(서열번호 2): AATATATTTATAGATTTGATTC		 317 48
SNP 2 SNP 2-F(서열번호 3): AAGAGTGAAAATGGTGAGAC
SNP 2-R(서열번호 4): TTTTACACATCAAAAATTGAC		 234 48
또한 RFLP 분석을 위해 SNP typing을 위한 사용된 제한효소 정보는 표 6에 나타내었다.
Figure 112017110223797-pat00002
<실시예 4. RFLP 분석 결과>
PCR-RFLP를 수행하기 위해, 먼저 본 발명에서 제작된 프라이머 세트를 이용하여 각 꿀벌 품종 10개체씩의 해당 SNP 영역을 증폭하였으며, 이후 증폭된 해당 SNP 영역의 PCR 산물 10 ㎕, 표 6의 제한효소 1 ㎕, 10x reaction buffer 2 ㎕, 증류수 7 ㎕를 모두 혼합 후 37℃에서 약 1시간 30분 동안 방치하였다. PCR-RFLP 결과 확인을 위해 전기영동을 100 volts에서 약 30분 동안 수행하여 품종 간 절단 패턴을 확인하였다. 이와 같이 본 발명에서 합성한 프라이머 세트를 이용하여 각 꿀벌 품종들에 대해 RFLP를 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
이 때, 시료로 사용한 꿀벌의 DNA는 Disease-resistant strain는 D line, Disease-susceptible strain은 E line을 사용하였다.
도 3을 참고하면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RFLP 수행 시, Disease-resistant strain(D line)과 Disease-susceptible strain(E line)의 구별이 명확하게 확인된다. 즉, 감수성 품종 특이 제한효소를 처리하여 저항성 품종의 PCR 증폭산물은 절단되지 않고, 감수성 품종만 절단 되는 패턴이 확인된다.
따라서 본 발명의 단일염기다형성을 인식하는 프라이머 세트를 통해 RFLP 분석만으로도 벌집의 상태를 위생적으로 유지하는 습성을 가져 우수한 질병저항성을 유지할 수 있는 꿀벌 계통을 쉽게 분석할 수 있게 되었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> The primer set of RFLP methods for determining Apis mellifera species using analysis of single nucleotide polymorphism <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Apis mellifera <400> 1 aaattatatc ttcttctgaa 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Apis mellifera <400> 2 aatatattta tagatttgat tc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Apis mellifera <400> 3 aagagtgaaa atggtgagac 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Apis mellifera <400> 4 aatatattta tagatttgat tc 22

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머, 및, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 함유하는 제1프라이머 세트; 및,
    서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머, 및, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머를 함유하는 제2프라이머 세트;
    를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 서양종꿀벌 계통 중에서 청소 행동습성에 의해 질병 저항성을 갖는 계통의 판별용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석용 조성물인 것을 특징으로 하는 서양종꿀벌 계통 중에서 청소 행동습성에 의해 질병 저항성을 갖는 계통의 판별용 조성물.
  5. 제1항의 조성물 중 제1프라이머 세트와 제2프라이머 세트 각각과,
    청소 행동습성에 의해 질병 저항성을 갖는 계통을 판별하기 위한 서양종꿀벌의 유전자 시료, 및,
    DNA 중합효소, dNTPs(deoxynucleoside triphospates), 마그네슘을 포함하는 반응완충액 및 멸균수가 함유된 조성물을 혼합하여 유전자를 증폭하고 제한효소로서 AseI와 MlyI를 처리하여 RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 수행하고 분석하는 단계;
    를 포함하여 2종의 프라이머 세트를 모두 이용하여 서양종꿀벌의 계통 중에서 청소 행동습성에 의해 질병 저항성을 갖는 서양종꿀벌의 계통을 판별하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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ANDREAS SPÖTTER ET AL. JOURNAL OF HEREDITY, 2016, 220-227
IRENE MUNOZ ET AL. PLOS ONE 10(4): E0124365
NCBI PROBE NO. PR012729616
NCBI REFERENCE SEQUENCE: XM_393658.6
김혜경 등. JOURNAL OF APICULTURE 32(3) : 147_154 (2017)

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