KR101549974B1

KR101549974B1 - Snp 검사를 이용한 육량형 한우 개체 분별 방법

Info

Publication number: KR101549974B1
Application number: KR1020130080834A
Authority: KR
Inventors: 이성진; 이승규
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-09-03
Also published as: KR20150007029A

Abstract

본 발명은 육량에 따른 한우 개체를 분별하는 방법에 관한 것으로, 한우의 FABP4 유전자에 존재하는 단일염기다형성(SNP)를 기반으로 하여, 한우 개체를 육량의 경제형질에 따라 효과적으로 분별할 수 있다.

Description

SNP 검사를 이용한 육량형 한우 개체 분별 방법{Method for predicting meat quantity traits of Hanwoo with single nucleotide polymorphism typing}

본 발명은 한우의 FABP4 유전자 내에 존재하는 단일염기다형성 마커를 기반으로 하여 육량형 한우 개체를 분별하는 방법에 관한 것이다.

인간의 경제적 능력이 발달함에 따라, 육류에 대한 소비가 지속적으로 증가하고 있다. 하지만, 육류의 소비 경향에 있어서 양보다 질을 선호하는 경향이 강해져 우수한 육질의 고급육이 요구되고 있는 추세다. 또한 최근에 축산물 수입 개방으로 인한 값싼 수입 쇠고기와의 경쟁력을 키우기 위해서는 한우의 도체 품질을 높이는 것이 우선적으로 요구되는 실정이다. 따라서 한우의 고급화를 위한 육질과 육량을 증가시키는 노력이 경주되고 있는데, 이와 관련된 유전자 마커의 연구도 활발히 진행되고 있다.

과거에는 개체 선발시 경제형질들의 표현형을 측정하여 그 측정값을 기초로 하여 선발 및 개량하였다. 하지만, 최근 분자유전학 기술의 발달로 인해 여러 가지 도체형질 관련 유전자 마커(Marker) 연구함으로써, DNA 분자 수준에서 유전자 구조와 기능의 분석을 통해 육질 및 육량의 표현형에 영향을 미치는 표지유전자를 발굴할 수 있게 되었다. 이렇게 발굴된 유전자 마커를 이용함으로 이전의 표현형에 의존하여 선발하는 개량 방법보다 보다 정확하게 개체의 경제형질을 측정할 수 있게 되었다.

여러 가지 DNA 마커 중 하나인 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 하나의 염색체 내 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기서열들 중 하나의 염기서열에서 나타나는 일반적인 돌연변이로, 인간의 경우 약 3백만 개의 SNP이 존재하며, 이것은 약 500~1000 염기 당 1개 정도로 나타난다. 이러한 SNP로 인하여 각 개인의 피부, 머리카락 색깔, 성장률 등 외형적인 표현형뿐만 아니라 질병감수성 같은 개개인의 차이와 같은 유전적 특성이 다르게 나타난다. 즉, 인간뿐 아니라 다른 동물들에서의 유전자 내 SNP도 각각의 개체에 대한 표현형을 다르게 나타나도록 만드는 것이다. 따라서, 소의 경제형질 표현형과 관련된 SNP을 발굴하고 표현형과의 연관성과 관련한 연구가 진행되고 있으며, 특히 지방세포의 분화 및 수송, 체지방 축적과 지질대사와 관련된 유전자 또는 성장관련 유전자 등 다양한 형질과 관련된 유전자의 SNP을 탐색하여 한우뿐만 아니라 여러 가지 소에서 생산되는 쇠고기의 양과 품질을 향상시키고자 하는 연구가 활발히 진행중에 있다.

FABP4(Fatty Acid Binding Protein 4) 유전자는 지방조직에서 발현되며, PPAR(Peroxisome Proliferator-Activated Receptors)와 상호작용을 하여 HSL(Hormone-Sensitive Lipase)과 결합한다고 알려져 있으며, 세포 내 지질대사와 항상성에 있어서 중요한 유전자로 알려져 있다. 이러한 FABP4 유전자는 호르몬감수성 지방질가수분해효소와 직접적인 상호작용으로 붙게 되어, 지질의 가수분해작용과 세포 내 지방산을 수송한다고 보고되어 있다. 또한 쥐에서 FABP4유전자는 비만과 관련된 후보 유전자로 알려져 있다. 특히 백색 지방세포에서 분비되는 16kDa 단백질인 렙틴은 음식물 섭취의 조절, 에너지 소비, 몸 전체의 에너지 균형과 연관되어 있기 때문에, FABP4 유전자가 지방세포의 항상성과 지질대사에 있어서 매우 중요한 유전자인 것으로 보고되고 있는 것이다.

최근의 연구에 따르면 Wagyu x Limousin F2 교잡우에서 FABP4 유전자변이는 육질향상과 관련된 근내 지방도와 피하지방 두께에서 유의적인 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에서는 지방세포와 관련된 FABP4 유전자를 대상으로 한우의 육질향상 및 양적형질에 있어서 효과가 있는지 알아보기 위해 유전자형 분석과 PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restricted Fragment Length Polymorphism) 방법을 통해, SNP(Single Nucleotide Polymorphism)을 확인하고 분석하여 도체형질과의 연관성을 통계적으로 분석하고, 이를 통하여 한우선발에 있어서 중요한 마커로써 활용할 수 있는지를 밝혀내고자 하였다.

대한민국 특허출원 제10-2011-0015011호에는, "한우 GPD1 유전자의 5번 영역 내에 존재하는 특정 SNP를 이용하여 PCR-RFLP 기법으로 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 단일염기다형성 마커를 검출함으로써 이들 가운데 가장 바람직한 유전자형(CC형)을 가진 개체를 유전적으로 근내지방도와 도체중이 우수한 한우 개체로 진단할 수 있는 방법"이 기재되어 있다.

본 발명에서는 한우의 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein, FABP4) 중 존재하는 SNP을 기반으로 하여 육량에 따른 한우의 경제형질을 쉽게 분별할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 한우의 FABP4 유전자에 대해 FABP4 유전자의 7516번 염기를 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계; 상기 증폭산물 중 7516번 염기의 단일염기다형성(SNP)을 분석하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계; 상기 유전자형 결정 후, FABP4 유전자의 7516번 염기가 대립유전자 모두에서 CC로 변형된 한우를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 육량이 우수한 한우 개체 분별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 한우의 FABP4 유전자에 대해 FABP4 유전자의 7516번 염기를 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계; 상기 증폭산물을 제한효소 MspA1I로 처리하여 절단한 후 전기영동을 실시하는 단계; 및, 상기 전기영동 결과물에 대한 사진 또는 이미지를 확보하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계; 상기 유전자형 결정 후, FABP4 유전자의 7516번 염기가 대립유전자 모두에서 CC로 변형된 한우를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 육량이 우수한 한우 개체 분별 방법을 제공한다.

RFLP(restriction fragment length polymorphism)는 1980년 데이비드 보스테인(David Bostein)과 그의 동료들이 제한효소(restriction endonuclease)로 가계지도를 작성하던 중 처음 발견되었다. 그들은 DNA 상의 특정 부위에 점 돌연변이(point mutation)가 생겨 제한효소로 절단하였을 때 나타나는 절편들의 길이가 개인마다 다양하게 나타나는 현상을 관찰하였다.

사람의 게놈(genome-유전자의 집합) 내에서 단일 염기쌍의 변이는 상당히 빈번하게 나타나는데, 연구에 따르면 단백질을 암호화하지 않는 유전자 부위에 있어 매 100~200 염기마다 한 염기는 점 돌연변이가 생성되며 질병과는 연관이 없이 개인차를 나타내는 표지로 사용될 수 있다고 한다. 실제 인간끼리의 유전자를 분석한 결과 약 1000개의 염기서열마다 한 개씩 염기가 서로 다르다는 것을 발견하였고, 이것을 단일염기다형성이라고 한다. 영어로는 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)라고 약칭한다. 즉, SNP에 의해 RFLP 현상이 나타나게 되는 것이다. 이러한 점 돌연변이는 특정 제한 효소(restriction enzyme)가 인지하는 부위에 변화를 가져올 수 있고, 그 결과 제한 효소로 절단된 유전자의 길이에 변화를 가져올 수 있다. 이러한 RFLP 현상은 비단 점 돌연변이뿐만 아니라 특정 부분의 결실에 의해서도 야기될 수 있다. 이러한 RFLP는 일반적으로 특정 부위의 염기서열 부분을 PCR방법으로 증폭한 후 제한효소를 사용하여 절단하고 그 절단된 산물을 전기영동으로 분리 및 확인한다. 예를 들어 갑이라는 사람의 경우 A 제한 효소에 의해 인식되어 잘려질 수 있는 부위가 전체 DNA에 10개가 있다고 가정하면 갑의 DNA를 A 제한 효소로 자르게 되면 11개의 DNA 조각이 나타나게 된다. 반면 을이라는 사람의 경우 A 제한 효소로 잘려지는 10개 가운데 한 개에서 점 돌연변이가 생기게 된다면 을의 DNA를 A 제한효소로 자를 경우 10개의 DNA 조각이 나타나게 된다. 이러한 차이를 이용해 현재 RFLP는 범죄자의 유전자 감식이나, 친자 확인 등에 사용되고 있다. 친자 확인을 예로 들면 자식은 부모로부터 유전자 하나씩을 물려받아 대립 유전자를 형성하기 때문에, 이론적으로 자식의 DNA를 특정 제한 효소로 자르고 부모의 DNA 또한 동일한 제한 효소로 자를 경우 자식의 DNA는 부모 양쪽의 DNA 조각의 특성을 나타내야 한다. 만일 부모 양쪽에서 나타나는 특성이 보이지 않는다면, 친자식이 아닐 개연성이 높다. RFLP 분석법은 유전자 변이를 확인하는데 매우 간단하고, 비용이 적게 소요되며, 소규모 실험에 적합하기 때문에 많이 사용되고 있다.

한편, FABP4(Fatty Acid Binding Protein 4)는 지방조직에서 발현되며, PPAR(Peroxisome Proliferator-Activated Receptors)와 상호작용을 하여 HSL(Hormone-Sensitive Lipase)과 결합한다. 또한 세포 내 지질대사와 항상성에 있어서 중요한 역할을 하는 유전자로 알려져 있다. 이러한 FABP4 유전자는 호르몬감수성 지방질가수분해효소와 직접적인 상호작용으로 붙게 되어 지질의 가수분해작용과 세포 내 지방산을 수송한다고 보고되어 있다.

소의 FABP4 유전자는 14번 염색체의 QTL 부분에 위치해 있고 총 길이는 4391bp 이루어져 있으며, 4개의 엑손(exon)과 3개의 인트론(intron)으로 구성되어 있다(Michal J. J., Zhang Z. W., Gaskins C. T. & Jiang Z. 2006. The bovine fatty acid binding protein 4 gene is significantly associated with marbling and subcutaneous fat depth in Wagyu x Limousin F2 crosses. Animal Genetics, 37, 400-402). 본 발명에서는 상기와 같은 특징이 있는 소 FABP4 유전자의 발현 양상을 비교 분석하고, 유전자 내 SNP를 이용하여 한우 경제형질과의 연관성을 분석함으로써, 고급육 생산을 위해 활용 가능한 DNA 마커를 개발하고, 이를 바탕으로 육량에 따른 경제형질에 의한 한우 분별법을 완성하고자 한 것이다.

본 발명의 방법을 구현하기 위해, 본 발명은 하기 실험에서 총 319두의 한우 거세우의 고기를 시료로 하였다. 실험에 사용된 프라이머는 기존에 보고된 NCBI Genebank (NC_007312.4)에 등록된 정보를 활용하여 FABP4 유전자의 7417~7868(AAFC01136716) 부분이 증폭되도록 제작하여 PCR을 수행하였다.

FABP4의 SNP는 MspA1I 제한효소를 사용한 PCR-RFLP 방법으로 한우 거세우 집단의 유전자형 분석을 실행하였다. 유전자형 분석결과, 한우 거세우 319두에서 CC 유전자형(genotype)이 49.60%, CG 유전자형(genotype)이 41.13%, 그리고 GG 유전자형(genotype)은 9.27%로 나타났으며, C 대립유전자(Allele)는 70.16%, G 대립유전자(Allele)는 29.84%로 나타났다. FABP4 유전자의 도체 성적자료를 이용하여 SNP와 연관성을 분석한 결과, 도체중(p<0.01) 및 배최장근 단면적 유의적인 상관관계가 있는 것으로 나타났다.

이상의 실험 결과로부터, FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP는 한우에서 육량에 따른 경제형질을 평가할 수 있는 DNA 마커로써 사용할 수 있는 이용가치가 높은 것으로 판단되었다.

따라서, 본 발명의 방법을 이용할 경우 육량에 따른 한우의 경제형질을 효과적으로 분별할 수 있고, 본 발명에 덧붙여 기존에 알려진 다른 SNP를 이용할 경우, 더욱 다양하고 구체적으로 한우의 육량에 따른 경제형질을 분석할 수도 있을 것이다.

한편, 본 발명의 육량이 우수한 한우 개체 분별 방법에 있어서, 상기 증폭산물은 바람직하게 한우 개체의 FABP4 전체 유전자 중 7417부터 7868까지의 유전자가 증폭되어 회수된 것이 좋다. 제한효소 절편의 분석시 피절단 유전자의 크기가 너무 크면, 분석시 시간만 많이 소요될 뿐, 그 효용성의 증가는 거의 없어 바람직하지 않다. 또한, 피절단 유전자의 크기가 너무 작으면, 절편 간의 분석 경계가 모호하여 분석시 오류가 날 수 있기 때문이다.

본 발명의 방법을 이용할 경우 한우의 육량에 따른 경제형질을 효과적으로 평가할 수 있어, 한우 육종 등에 광범위하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 사료 등의 사육 환경 변화에 따른 육량의 변화를 지속적으로 추적 관찰함으로써, 우수한 도체중을 갖는 한우를 사육할 수도 있다.

도 1은 PCR 산물을 MspA1I로 처리한 샘플의 아가로스 겔 전기영동 사진이다. CC 유전자형(genotype)은 2개의 절편(352bp and 100bp)을 보여주고, CG 유전자형(genotype)은 3개의 절편(452bp, 352bp and 100bp)을 보여주며, GG 유전자형(genotype)은 1개의 절편(452bp)을 보여준다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

하기 실시예 및 실험들에서는 지방세포와 관련된 FABP4 유전자를 대상으로 한우의 양적형질에 있어서 효과가 있는지 알아보기 위해 유전자형 분석과 PCR-RFLP (Polymerase chain reaction-Restricted Fragment Length Polymorphism) 방법을 통해 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 확인하고, 분석하여 도체형질과의 연관성을 통계적으로 분석하였다.

하기 실험에서 경제형질과 관련된 성적에 대한 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP의 유전자형 분석에서 대립유전자 빈도는 Cervus Ver. 2.0 program(Marshall T. C., Slate J., Kruuk L. E. B. & Pemberton J. M. 1998. Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations. MolEcol. 7:639-655)을 이용하였고, 통계분석은 SAS 9.2 Package(SAS Institute, Inc. Cary, NC, USA)를 이용하여 PROC GLM 방법으로 통계 분석하였으며, SNP 유전자형 효과의 유의성이 나타난 형질에 대해서는 Duncan's multiple range test에 의한 유전자형별 유의성 검정을 실시하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음의 수학식 1과 같았다.

[수학식 1]

Y_ij=μ+G_i+Ma_j+ε_ij

여기서, Y_ij는 도체형질 관측치, μ는 형질의 전체평균, G_i는 유전자형 효과, Ma_j는측정 나이의 회귀변수, ε_ij는 임의오차를 나타낸다.

[ 실시예 1: 한우 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP 유전자형 분석]

본 실험에 이용된 조직 샘플은 축산물품질평가원에 등록된 2009년에서 2010년까지 도축된 한우 거세우 319두를 선정하여 채취한 것으로, genomic DNA를 채취해 하기 실험에서 사용하였다. 본 실험에서 g.7516G>C는 SNP로서, 유전체(genomic DNA) 상 FABP4 유전자의 7516번째 염기가 G에서 C로 바뀌는 것을 의미한다.

한우 FABP4 유전자의 SNP 실험을 위해 기존에 보고된 Michal 등(Michal J. J., Zhang Z. W., Gaskins C. T. & Jiang Z. 2006. The bovine fatty acid binding protein 4 gene is significantly associated with marbling and subcutaneous fat depth in Wagyu x Limousin F2 crosses. Animal Genetics, 37, 400-402)의 논문에서 g.7516G>C의 프라이머를 GenBank(Accession No. NC_007312.4)에서 확인한 후, PCR을 실시하였다. 실험에 이용된 한우 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP의 프라이머 염기서열 정보는 표 1에 제시한 바와 같다. 표 1은 FABP4 유전자 영역의 증폭을 위해 사용된 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머를 나타낸다.

[표 1]

PCR 증폭 실험을 수행하기 위해 GeneAmp^ⓡ PCR System 9700 (Applied BiosystemsTM, USA)을 이용하여 다음 조건으로 실험하였다. PCR 반응은 주형(template) DNA 25ng, 프라이머는 각 각 10pmol, dNTP는 각각 2.5mM, MgCl₂ 2.0mM, 그리고 Taq DNA 폴리머라아제 2.5U을 첨가하여, 총 PCR 혼합물을 20㎕로 맞추었다. 증폭을 위한 PCR 조건은 최초 94℃에서 10분간 최초변성을 하고, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초씩 총 32cycle을 반복하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 확장을 하여 DNA를 증폭하였다.

이후, 개체별 PCR 증폭산물을 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하고 전기영동을 통해 유전자형을 분석하였다. PCR 증폭산물 10㎕, MspA1I(Promega, USA) 5U, 10X Buffer 2㎕, Acetylated BSA 2㎍을 넣고 총량이 20㎕가 되도록 하였다. 만들어진 혼합물은 37℃에서 1시간 활성화하여 PCR-RFLP를 이용하여 절단한 뒤, 이로 얻어진 DNA 단편을 확인하기 위해 EtBr 1 drop이 첨가된 1.5% 아가로스 겔로 전기 영동하여 UV 상에 나타난 DNA 절편 양상을 분석하여 유전자형을 결정하였다.

분석 결과는 도 1과 같이 나타났다. MspAI1 제한효소 인지부위의 존재 유무에 따라 인지부위가 없는 CC 유전자형은 452bp의 1개의 절편을 가지고, 인지 부위가 1개 있는 GG 유전자형은 352bp, 100bp의 2개의 절편을 보였으며, CG 유전자형은 C와 G 대립유전자(Allele)를 모두 공유하므로 452bp, 352bp 그리고 100bp로 3개의 절편을 가지는 것을 볼 수 있었다.

본 실험에서 샘플로 사용된 한우 거세우 319두의 조직 및 혈액시료의 CC 유전자형은 각각 49.60%로 가장 출현율이 높았고, GG 유전자형에서 9.27%로 가장 낮은 출현율을 보였다. 또한 SNP의 대립유전자 빈도에서 한우 거세우의 C 대립유전자는 70.16%, G 대립유전자는 29.84%로 나타나, C 대립유전자가 다소 높게 나타났음을 알 수 있었다(표 2).

[표 2]

[ 실시예 2: 한우 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP 유전자형과 경제형질과의 상관관계 분석]

FABP4 유전자의 SNP인 g.7516G>C가 한우의 주요 경제형질에 미치는 영향을 규명하기 위하여 상기에서 확인된 SNP 유전자형과 경제형질과의 연관성 분석을 실시하였다.

조직시료에서 사용된 경제형질은 도체중(Carcass weight. CW), 배최장근단면적 (Longissimus muscle area. LMA) 등 2개의 항목으로 한우 거세우 319에 대해 각각 연관성 분석을 하였다.

도체특성 측정치는 축산물품질평가원의 기준에 따라 도체중량은 도축장 경영자가 측정하여 제출한 도체우 한 마리 중량을 이용하였으며, 배최장근단면적은 등급판정부위인 소를 도축한 후 2등 분할된 왼쪽 반도체의 마지막등뼈(흉추)와 제1허리뼈(요추) 사이를 절개한 후 배최장근의 등심쪽 적개면에서 가로 세로가 1cm 단위로 표시된 면적자를 이용하여 배최장근 단면적을 cm²단위로 측정(배최장근 주위의 배다열근. 두반극근, 배반극근 제외)한 측정치로 결정하였다.

분석 결과로서, 한우 거세우의 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP 유전자형과 경제형질 간의 연관성 분석 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

도체중(CW)에서 CC 유전자형의 평균 및 표준오차는 408.95 ± 4.27kg, CG 유전자형은 393.48 ± 5.57kg으로 나타났으며, GG 유전자형은 371.11 ± 16.14kg으로 나타나, CC 유전자형이 CG 유전자형이나 GG 유전자형보다 높은 평균 도체중을 보여주었으며, 유의적인 연관성을 나타냈다(p< 0.01).

마지막으로 배최장근 단면적(LMA)에서는 CC 유전자형의 평균 및 표준오차는 90.34 ± 1.01cm²로 나타났고, CG 유전자형은 65.78±0.21cm²로 나타났으며, GG 유전자형은 77.43 ± 3.50cm²로 나타나, 배최장근 단면적 역시 CC 유전자형이 CG 유전자형이나 GG 유전자형보다 높은 평균을 보여 주었으며, 유전자형 간의 높은 유의적인 차이를 보여주었다(p< 0.001).

Claims

한우의 FABP4 유전자에 대해 FABP4 유전자의 7516번 염기를 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계;
상기 증폭산물 중 7516번 염기의 단일염기다형성을 분석하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계; 및
상기 유전자형 결정 후, FABP4 유전자의 7516번 염기가 대립유전자 모두에서 CC로 변형된 한우를 선별하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 육량이 우수한 한우 개체 분별 방법.
한우의 FABP4 유전자에 대해 FABP4 유전자의 7516번 염기를 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계;
상기 증폭산물을 제한효소 MspA1I로 처리하여 절단한 후 전기영동을 실시하는 단계;
상기 전기영동 결과물에 대한 사진 또는 이미지를 확보하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계; 및
상기 유전자형 결정 후, FABP4 유전자의 7516번 염기가 대립유전자 모두에서 CC로 변형된 한우를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 육량이 우수한 한우 개체 분별 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 증폭산물은,
한우 개체의 FABP4 전체 유전자 중 7417부터 7868까지의 유전자가 증폭되어 회수된 것을 특징으로 하는 육량이 우수한 한우 개체 분별 방법.